kỹ thuật phát hiện kháng nguyên kháng thể

Kỹ thuâât phát hiêân Kháng nguyên-Kháng thể trong Vi sinh Y học Khoa Vi sinh vật-Viện VSPDQĐ... Các loại liên kết KN-KT • Liên kết ion: KN-KT mang điêên tích khác nhau elect

Kỹ thuâât phát hiêân Kháng nguyên-Kháng thể

trong Vi sinh Y học

Khoa Vi sinh vật-Viện VSPDQĐ

Ý nghĩa của kỹ thuâât miễn dịch

trong vi sinh y học

• Chẩn đoán bêânh nhiễm trùng:

+ Chẩn đoán trực tiếp: phát hiêên trực tiếp VSV hoăêc môêt phần cấu trúc kháng nguyên

+ Chẩn đoán gián tiếp: Phát hiêên KT đăêc hiêêu kháng KN đã biết

• Nghiên cứu dịch tễ:

+ Phát hiêên sự lưu hành của bêênh qua điều tra KT trong côêng đồng

• Định loại vi sinh vâât:

+ Phát hiêên kháng nguyên VSV (VD: )

+ Xác định typ huyết thanh (VD: )

• Đáp ứng miễn dịch của cơ thể đối với VSV

+ Sau khi tiêm văc xin dự phòng

+ Xác định hiêêu lực đáp ứng miễn dịch bảo vêê

+ Kỹ thuâêt xử dụng chủ yếu là định lượng

Các loại liên kết KN-KT

• Liên kết ion: KN-KT mang điêên tích khác nhau

(electrostatic bonds)

• Liên kết Hydro: lực hút của nguyên tử Hydro mang điêên

tích khác nhau và ở giữa (hydrogen bonds)

• Liên kết hấp dẫn liên phân tử (Van der Waals )

• Liên kết lực ố thủy (hydrophobic bonds)

Bản chất sự kết hợp KN- KT

• Kết hợp đăêc hiêêu KN – KT:

KT chỉ kết hợp với kháng nguyên đã kích

thích cơ thể sinh ra chúng

+

Kết hợp ái tính

Ái lực cao Ái lực thấp Không có ái lực

• Phụ thuôêc vào cấu trúc không gian của KN-KT

• Cấu trúc không gian phù hợp thì liên kết càng cao

Kết hợp kháng nguyên kháng thể

(Háo tính)

• Sự kết hợp của nhiều vị trí KN với nhiều loại kháng thể

• Khi KN kích thích cơ thể sẽ sinh ra nhiều loại KT

Phản ứng chéo

Xảy ra khi một kháng thể kết hợp với hơn 1 kháng nguyên

Tỷ lệ kết hợp KN-KT

I.Các phản ứng ngưng kết

1.Ngưng kết trên lam kính (nhỏ giọt KT và KN, VD:xác

định VK đuờng ruột)

2.Ngưng kết định lượng trong ống nghiệm ( pha loãng

các nồng độ HT, VD: dùng để chuẩn độ hiệu giá KT)

3.Ngưng kết hạt latex: Hạt latex được gắn KN để phát

hiện KT (VD trong phat hiện Giang mai)

4 Phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu thụ động

(dùng để định lượng KT)

1.Ngưng kết trên lam kính

Lam kính đã ủ ấm 37oC, nhỏ một giọt kháng huyết thanh vàmột giọt KN (Vi khuẩn), sẽ xuất hiện đám ngưng kết nếu KT

đặc hiệu với KN

2 Ngưng kết trong ống nghiệm

1

Hiệu giá KT là độ pha loãng huyết thanh lớn nhất mà phản ứng còn

dương tính (trong sơ đồ hiệu giá là 1/160)

1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 1/1280

• Định lượng bằng đơn vị UI/ ml huyết thanh

• Định lượng bằng µg, ng, pg / ml huyết thanh

• Xác định đôêng lực kháng thể: mẫu được xét nghiêêm ở 2 thời điểm khác nhau.

Động lực kháng thể bằng H1, H2

Thời gian H1

H2

Hiệu giá KT

3.Phản ứng ngưng kết thụ động

ứ ng dụng để phát hiện KT đối với KN hòa tan và phát hiện KT đối với KN của

vi rút.

4.Phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu (HI)- Invitro

Phản ứng ngưng kết

• Sự kết hợp KN hữu hình với KT tạo KN-KT

i Xác dịnh nhóm máu hoặc KT đối với KN nhóm máu

ii Đánh giá tình trạng nhiễm khuẩn

II Phản ứng kết tủa

1 Phản ứng kết tủa: KN-KT tạo thành hạt

a Phản ứng kết tủa trên môi trường lỏng

cb

b Phản ứng kết tủa trên gel agarose

c Phản ứng kết tủa trên gel agarose

trong ống nghiêêm (oudin)

KT hòa đều Trong thạch

Đường tủa Gel thạch

KTb

a

Kỹ thuật khuếch tán trong ống nghiệm a: Khuếch tán đơn, b: Khuếc tán kép

III.Phản ứng trung hòa in Vivo:

- Phản ứng trung hòa trên chuôêt lang

- Phản ứng trung hòa trên da thỏ

- Phản ứng trung hòa virus in vivo

VI Kỹ thuâât khuyếch tán

Khuyếch tán đơn (mancini)

V Phản ứng kết hợp bổ thể:

Âm tính: Hồng cầu tan thành dung dịch đỏ đều

Dương tính: Hồngcầu lắng xuống thành một chấm

nhỏ

KT (-)

KHC HC

KN KT BT

a trong huyết thanh có KT, b: trong huyết thanh

không có kháng thể

a

b

VI.Phản ứng dùng KN-KT đánh dấu

1 Miễn dịch huỳnh quang trực tiếp (FA)

2 Miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (IFA)

Soi kính hiển vihuỳnh quang

HQKKTKT

KN

Miễn dịch gắn men

Elisa: Enzyme-linked immunosorbent

Sơ đồ minh họa nguyên lý của kỹ thuật sắc ký miễn dịch: 1: Bản sắc ký với

KN được cố định và KKT gắn màu phân bố đều, 2: KT trong huyết thanh

Kết hợp với KKT gắn màu vầ di chuyển, 3: Phức hợp KT –KKT gắn màu kết hợp với

KN tạo thành vạch màu

KTT gắn màu Kháng thể

KN vi sinh vật

3

Kỹ thuâêt sắc ký miễn dịch ( immunochromographic)

Nhâên định đánh giá kết quả

phản ứng KN-KT

• Định tính hoăêc bán định lượng:

+ Dương tính/ âm tính

+ Dương tính (++++); (+++); (++);(+); (+/-)

Western blotting

Hiêên tượng dương tính giả

và âm tính giả

• Dương tính giả: phản ứng cho kết quả dương tính,

nhưng trong mẫu thực chất không có KN hoăêc KT cần tìm

• Âm tính giả; Phản ứng cho kết quả âm tính, nhưng thực chất trong mẫu có Kn hoăêc KT cần tìm

• Hạn chế kết quả dương tính, âm tính giả của môêt thử nghiêêm

+ Tuân thủ theo hướng dẫn của bôê sinh phẩm

+ Điều kiêên phản ứng tối ưu.

+ Phát hiêên tác nhân sinh học nên thử nghiêêm tối thiểu

02 kỹ thuâêt theo 02 nguyên lý khác nhau

• Cần theo dõi đôê nhâêy, đôê đăêc hiêêu, ngưỡng phát hiêên của sinh phẩm thương mại hóa.

The end