Khảo Sát Các Đột Biến Gen Ở Bệnh Nhân Ung Thư Phổi Không Tế Bào Nhỏ Bằng Phương Pháp Giải Trình Tự Gen Thế Hệ Mới (Full Text).Pdf

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐẶNG HUỲNH ANH THƯ KHẢO SÁT CÁC ĐỘT BIẾN GEN Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ PHỔI KHÔNG TẾ BÀO NHỎ BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI[.]

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

ĐẶNG HUỲNH ANH THƯ

KHẢO SÁT CÁC ĐỘT BIẾN GEN Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ PHỔI KHÔNG TẾ BÀO NHỎ BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

TP HỒ CHÍ MINH, Năm 2023

Năm 2023

MỤC LỤC

Danh mục chữ viết tắt i

Danh mục đối chiếu thuật ngữ Anh – Việt ii

Danh mục các bảng iii

Danh mục các hình iv

Danh mục các biểu đồ, sơ đồ v

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Tổng quan về ung thư phổi không tế bào nhỏ 4

1.2 Vai trò của đột biến gen trong ung thư phổi không tế bào nhỏ 11

1.3 Các phương pháp xác định đột biến gen 19

1.4 Một số nghiên cứu về đột biến gen ở bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ 30

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36

2.1 Thiết kế nghiên cứu 36

2.2 Đối tượng nghiên cứu 36

2.3 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 36

2.4 Cỡ mẫu nghiên cứu 36

2.5 Xác định các biến số nghiên cứu 38

2.6 Phương pháp, công cụ đo lường, thu thập số liệu 39

2.7 Quy trình nghiên cứu 59

2.8 Phương pháp phân tích dữ liệu 61

2.9 Đạo đức trong nghiên cứu 61

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 63

3.1 Một số đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng ở bệnh nhân UTPKTBN 64 3.2 Xác định tỉ lệ các đột biến gen (EGFR, ALK, ROS1, BRAF, KRAS, NRAS) bằng phương pháp NGS mô u và mối liên quan giữa các đột biến gen với một số đặc điểm lâm sàng cảu bệnh nhân 66

3.3 So sánh sự tương đồng trong phát hiện đột biến gen EGFR giữa NGS mô u với ddPCR và EGFR Cobas V2 76

3.4 So sánh sự tương đồng trong phát hiện các đột biến gen giữa NGS

sinh thiết lỏng với NGS mô u, ddPCR và EGFR Cobas V2 79

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 84 4.1 Một số đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng ở bệnh nhân UTPKTBN 84

4.2 Xác định tỉ lệ các đột biến gen (EGFR, ALK, ROS1, BRAF, KRAS,

NRAS) bằng phương pháp NGS mô u và mối liên quan giữa các đột

biến gen với một số đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân 86

4.3 So sánh sự tương đồng trong phát hiện đột biến gen EGFR giữa NGS mô u với ddPCR và EGFR Cobas V2 99

4.4 So sánh sự tương đồng trong phát hiện các đột biến gen giữa NGS

sinh thiết lỏng với NGS mô u, ddPCR và EGFR Cobas V2 103

KẾT LUẬN 111 KIẾN NGHỊ 113 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

LỜI CAM ĐOAN

Đây là một nhánh của công trình nghiên cứu “Xây dựng quy trình phát hiện đột biến gen từ mẫu sinh thiết lỏng bằng công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới với ứng dụng trong chẩn đoán

và điều trị ung thư” thuộc sở khoa học công nghệ TP Hồ Chí Minh theo quyết định số 1276/QĐ-SKHCN ngày 25/12/2017

Tôi xin cam đoan các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực và khách quan

Tác giả luận án

Đặng Huỳnh Anh Thư

EGFR : Epidermal Growth Factor Receptor

EML4 : Echinoderm Microtubule-Associated Protein-Like 4

FFPE

IASLC

: Formalin fixed, paraffin embedded

: International Association for the Study of Lung Cancer LBL

PCR : Polymerase Chain Reaction

TBL : Tumor Biopsy Lung

TKI : Tyrosine Kinase Inhibitor

DANH MỤC ĐỐI CHIẾU THUẬT NGỮ ANH - VIỆT

American Thoracic Society : Hội lồng ngực Hoa Kỳ

American Joint Committee On

: Thụ thể yếu tố phát triển biểu bì

Formalin fixed paraffin embedded

International Association for the

Study of Lung Cancer

: Mô cố định bằng paraffin : Hiệp hội quốc tế nghiên cứu về ung thư phổi

Limits of Detection

Mutant Allele Fraction

National Comprehensive Cancer

Network

Next-Generation Sequencing

: Giới hạn phát hiện : Tần suất alen đột biến : Mạng lưới Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ

: Giải trình tự gen thế hệ mới Polymerase Chain Reaction : Phản ứng khuếch đại chuỗi

Tyrosine Kinase Inhibitor : Chất ức chế Tyrosine Kinase

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1 Phân nhóm giai đoạn UTPKTBN theo AJCC VII 9

1.2 Tóm tắt các thuốc nhắm trúng đích và đích trên tế bào ung thư phổi 10

1.3 Các phương pháp phát hiện đột biến gen trong UTPKTBN 25

2.1 Các biến số sử dụng trong nghiên cứu 38

2.2 Các dòng tế bào mang đột biến được khảo sát trong nghiên cứu 52 2.3 Thông tin chứng dương Tru-Q1 52

3.1 Đặc điểm về giới tính 64

3.2 Đặc điểm về tiền sử hút thuốc lá 65

3.3 Tỉ lệ phân bố đột biến theo exon trên gen EGFR 68

3.4 Tỉ lệ các loại đột biến gen EGFR 68

3.5 Tỉ lệ các loại đột biến gen KRAS 70

3.6 Tỉ lệ các loại đột biến đồng thời của gen EGFR và KRAS 71

3.7 Mối liên quan giữa các loại đột biến gen và giới tính 72

3.8 Mối liên quan giữa các loại đột biến gen và tuổi 73

3.9 Mối liên quan giữa các loại đột biến gen và hút thuốc lá 74

310 Mối liên quan giữa các loại đột biến gen và phân loại mô học 75

3.11 So sánh sinh thiết mô NGS và ddPCR 76

3.12 Kết quả NGS và ddPCR của 30 mẫu sinh thiết mô trong phát hiện đột biến L858R, T790M, del19 77

3.13 So sánh sinh thiết mô NGS và Cobas trong phát hiện đột biến EGFR 78

3.14 So sánh sinh thiết lỏng NGS và ddPCR 79

3.15 Kết quả NGS và ddPCR của 34 mẫu sinh thiết lỏng trong phát hiện đột biến L858R, T790M, del19 80

3.16 So sánh sinh thiết lỏng NGS và EGFR Cobas V2 trong phát hiện

đột biến EGFR 81

3.17 So sánh sinh thiết lỏng NGS và sinh thiết mô NGS 82 4.1 Tỉ lệ các đột biến gen trong một số nghiên cứu 89 4.2 Phân tích các trường hợp không tương đồng giữa NGS mô u và

DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang 1.1 Các con đường truyền tín hiệu nội bào khởi nguồn từ EGFR 12

1.2 Sơ đồ các biến thể dung hợp ALK ở UTPKTBN 15

1.3 Con đường truyền tín hiệu của đột biến ROS1 16

1.4 Các biến thể dung hợp gen ROS1 ở UTPKTBN 17

1.5 Giải trình tự gen thế hệ mới bằng tổng hợp (Illumina) 27

2.1 Hệ thống máy giải trình tự Nextseq 550 (Ilumina/Mỹ) 40

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ

3.1 Nhóm tuổi của bệnh nhân nghiên cứu 64

3.2 Phân loại giai đoạn bệnh 65

3.3 Phân bố bệnh nhân theo phân loại mô học khối u 66

3.4 Tỉ lệ các đột biến gen trong UTPKTBN 67

3.5 Tỉ lệ phân bố đột biến theo exon trên gen KRAS 69

3.6 Tỉ lệ các loại đột biến của gen BRAF 71

Sơ đồ Tên sơ đồ Trang 2.1 Quy trình nghiên cứu 60

3.1 Quy trình thực hiện xét nghiệm đột biến gen 63

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư phổi (UTP) là ung thư phổ biến về tỉ lệ mắc và là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong liên quan đến ung thư Việt Nam có tỉ lệ mắc UTP cao hơn tỉ lệ mắc trung bình trên toàn thế giới (14,5% so với 11% tổng số ca mới) mặc dù có cùng mức tỉ lệ tử vong theo dữ liệu Globocan năm 2020 [101] Ngoài ra, ở Việt Nam, UTP là ung thư nguy hiểm nhất ở nam giới và đứng hàng thứ hai các nguyên nhân gây tử vong do ung thư ở phụ nữ [75] UTP chia làm 2 nhóm: ung thư phổi tế bào nhỏ và ung thư phổi không tế bào nhỏ, trong đó 80-85% là ung thư phổi không tế bào nhỏ (UTPKTBN) Đa số UTP được phát hiện ở giai đoạn muộn, mặc dù có nhiều tiến bộ trong điều trị nhưng tỉ lệ sống còn 5 năm chỉ khoảng 10 - 15%, vì vậy tiên lượng ở các bệnh nhân UTP còn xấu [20] Với giai đoạn muộn, điều trị chủ yếu dùng các phương pháp điều trị toàn thân như hóa chất, điều trị đích Tuy nhiên, việc ứng dụng liệu pháp điều trị đích phụ thuộc vào khả năng nhận dạng phân tử mục tiêu trên tế bào ung thư, đó là các gen liên quan đến sự phát triển khối u

Kể từ năm 2018, Hiệp hội Ung thư Lâm sàng Hoa Kỳ (ASCO) đã

khuyến cáo xét nghiệm các đột biến gen EGFR, ALK , ROS1 và BRAF, KRAS

trong thực hành lâm sàng cho bệnh nhân UTPKTBN vì sự hiện diện các gen này dự đoán được tính nhạy của các nhóm thuốc ức chế tyrosine

kinase [47] Đột biến cho các gen KRAS, NRAS cũng đã được khuyến cáo do

có giá trị tiên lượng khả năng tái phát và đáp ứng điều trị [107]

Để xác định đột biến trên các gen mục tiêu của điều trị đích, mô u cần sinh thiết bằng các phương pháp xâm lấn Tuy nhiên, việc sử dụng mô u có những hạn chế do sự không đồng nhất và thay đổi theo thời gian của khối u Ngoài

ra, vài khối u nằm ở vị trí không thể sinh thiết mô Sinh thiết lỏng có thể giúp cải thiện những vấn đề trên Sinh thiết lỏng phản ánh đặc tính di truyền của toàn bộ khối u cả nguyên phát và di căn tốt hơn so với sinh thiết mô

Giải trình tự gen Sanger thường được dùng để phát hiện các đột biến

gen tuy nhiên chi phí cao, tốn thời gian và độ nhạy thấp để phát hiện các alen

đột biến ở tần số thấp Kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới (Next- Generation

Sequencing - NGS) xác định được đồng thời đột biến của nhiều gen mục tiêu

không chỉ trên mẫu sinh thiết mô mà còn thực hiện được trên mẫu sinh thiết

lỏng với độ phủ cao và chi phí hợp lý khi cần khảo sát cùng lúc nhiều gen

[103]

Các công trình nghiên cứu tại Việt Nam chủ yếu thực hiện khảo sát đột

biến gen EGFR và KRAS, chưa có công trình nghiên cứu đột biến các gen

ALK, ROS1, BRAF, NRAS trên BN UTPKTBN cả trên mô u và sinh thiết

lỏng Đồng thời cũng chưa có nghiên cứu đánh giá khả năng áp dụng kỹ thuật

NGS trong phát hiện các đột biến gen ở BN UTPKTBN

Do đó thực tế lâm sàng vẫn còn tồn tại các câu hỏi nghiên cứu như sau:

1 Phân bố các đột biến gen EGFR, ALK, ROS1, KRAS, NRAS, BRAF

trong quần thể bệnh nhân UTPKTBN ở Việt Nam như thế nào và mối liên

quan giữa các đột biến gen này với đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân ra sao?

2 Áp dụng NGS trên mô u và sinh thiết lỏng tại Việt Nam có chính xác

không trong phát hiện đột biến gen?

3 Có thể phát hiện các gen đột biến (EGFR, ALK, ROS1, KRAS, NRAS,

BRAF) từ sinh thiết lỏng bằng NGS tại Việt Nam không?

Xuất phát từ những yêu cầu cấp thiết trên, chúng tôi tiến hành nghiên

cứu “Khảo sát đột biến gen ở bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ

bằng phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới” để cung cấp thêm thông

tin về tỉ lệ cũng như mối liên quan của các gen mục tiêu với đặc điểm lâm

sàng của BN UTPKTBN và khả năng ứng dụng NGS trong phát hiện đột biến

gen ở sinh thiết mô và sinh thiết lỏng tại Việt Nam

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Mục tiêu tổng quát:

Khảo sát các đột biến gen ở bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ

bằng phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới

Mục tiêu chuyên biệt:

1 Xác định tỉ lệ đột biến của 6 gen (EGFR, ALK, ROS1, KRAS, NRAS,

BRAF) bằng giải trình tự gen thế hệ mới từ mô u và mối liên quan

giữa các đột biến gen này với một số đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ

2 So sánh sự tương đồng trong phát hiện đột biến EGFR giữa giải trình tự gen thế hệ mới từ mô u với ddPCR và EGFR Cobas V2

3 So sánh sự tương đồng trong phát hiện các đột biến gen giữa giải trình tự gen thế hệ mới sinh thiết lỏng với giải trình tự gen thế hệ

mới mô u, ddPCR và EGFR Cobas V2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ PHỔI KHÔNG TẾ BÀO NHỎ

Hiện tại, ung thư phổi là một trong những bệnh ung thư đứng đầu trên thế giới và tại Việt Nam, cả về số ca bệnh mới mắc và số trường hợp tử vong UTPKTBN chiếm đến 85% các trường hợp UTP [20]

1.1.1 Yếu tố nguy cơ

1.1.1.1 Hút thuốc lá

Hút thuốc lá là yếu tố nguy cơ chính của UTP Nicotine trong khói thuốc thúc đẩy khối u bằng cách ảnh hưởng đến sự tăng sinh tế bào, sự hình thành mạch và ức chế quá trình chết theo chương trình của tế bào [1] Ngừng hút thuốc lá sẽ làm giảm các tổn thương tiền ung thư và giảm nguy cơ phát triển thành UTP Những người hút thuốc lá thụ động có nguy cơ UTP lên tới 20-30% nếu họ tiếp xúc với khói thuốc thường xuyên tại nơi làm việc hoặc ở nhà [106]

1.1.1.2 Tiếp xúc với các tác nhân sinh khối u từ môi trường

Yếu tố nguy cơ do nghề nghiệp phổ biến nhất của UTP là phơi nhiễm mi- ăng Bên cạnh đó, nhiễm phóng xạ radon có liên quan đến 10% các trường hợp UTP, trong khi ô nhiễm không khí đóng vai trò chính trong khoảng 1-2% trường hợp [89] Ngoài ra, việc người bệnh đã có tiền căn bệnh phổi trước đó như bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính, xơ phổi nguyên phát hoặc lao phổi cũng làm tăng tỷ lệ phát sinh UTP Nguyên nhân có thể do những tổn thương gây độc tế bào tái diễn trong thời gian dài sẽ phá vỡ sự cân bằng di truyền trong tế bào

a-1.1.1.3 Tính nhạy cảm di truyền

Các nghiên cứu gần đây tập trung vào cơ chế bệnh sinh cấp độ phân tử

và thu được nhiều kết quả mới và từ đó đề ra các chiến lược mới trong sàng lọc và chẩn đoán, điều trị và tiên lượng bệnh nhân UTPKTBN Trong UTP

các bất thường về gen thường gặp là tình trạng khuếch đại các gen gây ung thư và bất hoạt của các gen ức chế khối u trong bệnh sinh UTPKTBN Các bất thường này gây kích thích tế bào u phát triển và trốn thoát sự kiểm soát chết

tế bào theo chương trình [89]

1.1.1.5 Giới tính

UTP gặp cả hai giới nam và nữ, tỉ lệ mắc của nam và nữ cũng khác nhau ở từng quốc gia Với các nước phát triển như Anh, Pháp, Hoa Kỳ tỉ lệ nam và nữ hút thuốc lá xấp xỉ nhau do đó tỉ lệ mắc UTPKTBN cũng xấp xỉ tương đương nhau giữa hai giới Còn tại Việt Nam, tỉ lệ nữ hút thuốc lá rất thấp nên giữa nam và nữ có sự khác biệt rõ ràng [20]

1.1.2 Lâm sàng

Các triệu chứng lâm sàng thường gặp bao gồm ho, ho ra máu, khạc đàm, khó thở Ngoài ra còn có các triệu chứng do di căn như di căn xương, não, gan, lách Các hội chứng bao gồm hội chứng nội tiết (tiết ADH không phù hợp, hội chứng Cushing, vú to, ), hội chứng huyết học (thiếu máu, tăng bạch cầu ái toan, ) [20]

đó nội soi phế quản giúp lấy bệnh phẩm như chải, rửa phế quản, chọc hút xuyên thành phế quản hay sinh thiết tổn thương, phục vụ cho chẩn đoán tế bào và mô bệnh học Sinh thiết phổi xuyên thành ngực có vai trò đặc biệt quan trọng trong chẩn đoán các u ở ngoại vi, khi mà nội soi phế quản không tiếp cận được [1]

1.1.3.2 Giải phẫu bệnh

- Năm 2011, một phân loại quốc tế được đề nghị cho UTP loại biểu mô tuyến với sự thống nhất của Hội nghiên cứu ung thư phổi quốc tế (IASLC), Hội lồng ngực Hoa Kỳ (ATS) và Hội hô hấp Châu Âu (ERS) dựa trên mẫu sinh thiết nhỏ và tế bào học [111] Đây chính là cơ sở của sự ra đời phân loại

mô học mới của Tổ chức y tế thế giới (TCYTTG) (2015) [110] theo đó UTPKTBN được chia thành 7 phân nhóm nhỏ như sau:

 Ung thư biểu mô vảy (squamous cell carcinoma)

 Ung thư biểu mô tuyến (adenocarcinoma)

 Ung thư biểu mô tế bào lớn (large cell carcinoma)

 Ung thư biểu mô tuyến vảy (adenosquamous cell carcinoma)

 Ung thư biểu mô dạng sarcoma (sarcomatoid carcinoma)

 U carcinoid

 Ung thư biểu mô týp tuyến nước bọt

Ung thư biểu mô tuyến chiếm 40% tổng số UTPKTBN UTBM tuyến

là loại ung thư gặp ở cả hai giới, và phổ biến ở nữ UTBM tuyến thường được tìm thấy ở những người không hút thuốc Đây cũng là loại UTP phổ biến nhất

ở những người dưới 45 tuổi Loại ung thư này thường ở khu vực ngoại vi của phổi nên có xu hướng phát hiện muộn hơn so với các loại UTP khác

Ung thư biểu mô tế bào vảy chiếm 25-30% tổng số ca UTPKTBN và có liên quan chặt chẽ với tiền sử hút thuốc lá Vị trí ung thư thường gặp ở trung

tâm phổi gần phế quản gốc Bệnh thường gặp ở nam giới nhiều hơn so với

nữ, phát triển chậm và do vị trí của nó nên thường được phát hiện sớm hơn các loại ung UTP khác

Ung thư biểu mô tế bào lớn chiếm 5-10% UTPKTBN Loại ung thư này thường xảy ra ở các vùng bên ngoài của phổi, có xu hướng phát triển và lây lan nhanh hơn so với hai loại trên, điều này khiến cho việc điều trị trở nên khó khăn Các khối u biểu mô tế bào lớn có liên quan chặt chẽ với việc hút thuốc

lá và có xu hướng phát triển nhanh là một thách thức lớn trong điều trị

1.1.4 Các giai đoạn UTPKTBN

Phân loại TNM 7 [58]

T: U nguyên phát

• T0: Không có bằng chứng về u nguyên phát

• T1: Kích thước lớn nhất của khối u ≤ 3 cm, được bao quanh bởi nhu

mô phổi hoặc lá tạng màng phổi, không có bằng chứng về xâm lấn vượt quá đoạn gần của phế quản thuỳ T1a: Kích thước lớn nhất ≤ 2 cm; T1b: 2 cm < kích thước lớn nhất ≤ 3 cm

• T2: 3 cm < kích thước lớn nhất ≤ 7 cm hoặc bất kỳ nhưng xâm lấn phế quản gốc, cách ngã ba khí phế quản (carina) ≥ 2 cm; xâm lấn lá tạng màng phổi; gây xẹp phổi hoặc viêm phổi tắc nghẽn lan đến rốn phổi nhưng chưa lan toàn bộ phổi Gồm: T2a: 3 cm < kích thước lớn nhất ≤ 5 cm; T2b: 5 cm < kích thước lớn nhất ≤ 7 cm

• T3: Kích thước lớn nhất > 7 cm hoặc xâm lấn một trong các thành phần: thành ngực (bao gồm cả khối u rãnh liên thuỳ trên); cơ hoành; thần kinh hoành; màng phổi trung thất; màng ngoài tim hoặc xâm lấn phế quản gốc, cách carina < 2 cm nhưng chưa tới carina hoặc

gây ra xẹp phổi, viêm phổi do tắc nghẽn trên toàn bộ phổi hoặc có các nốt riêng biệt trên cùng 1 thuỳ phổi

• T4: Khối u kích thước bất kỳ nhưng xâm lấn: trung thất, tim, mạch máu lớn, khí quản, thần kinh quặt ngược thanh quản, thực quản, thân đốt sống, carina, các nốt khối u khác ở thuỳ phổi khác cùng bên

N: Hạch vùng

• No: Không có di căn hạch vùng

• N1: Di căn hạch cạnh phế quản và hoặc hạch trong phổi, hạch rốn phối cùng bên, bao gồm cả sự xâm lấn trực tiếp

• N2: Di căn hạch trung thất cùng bên và hạch dưới carina

• N3: Di căn hạch rốn phổi đối bên, hạch trung thất đối bên, hạch cơ bậc thang cùng hoặc đối bên, hạch thượng đòn

Bảng 1.1 Phân loại giai đoạn UTPKTBN theo AJCC VII [34]

Giai đoạn IIA

Chiến lược đầu tiên trong điều trị UTP đó là bỏ thuốc lá nếu bệnh nhân

có hút thuốc lá, thuốc lào Vì thuốc lá được xem là yếu tố nguy cơ chính gây UTP Điều trị UTPKTBN hiện nay là đa mô thức Lựa chọn phương pháp điều trị cho BN UTPKTBN phụ thuộc vào chẩn đoán giai đoạn bệnh và nhiều

yếu tố khác như: tuổi, tình trạng có đột biến gen ALK, EGFR, ROS1, BRAF,

KRAS… Phẫu thuật, xạ trị, hóa chất, điều trị đích đã trở nên phổ biến trong

điều trị UTPKTBN [1]

Phẫu thuật được chỉ định rộng rãi trong trường hợp khối u khu trú, chưa

có di căn và thể trạng bệnh nhân đủ đáp ứng cho cuộc phẫu thuật Các bệnh nhân giai đoạn 0, I, II được chỉ định phẫu thuật [1]

Hóa chất để điều trị UTPKTBN thường được chọn lựa để điều trị trước khi xạ trị với mục đích làm giảm bớt kích thước khối u hoặc sau khi phẫu thuật nhằm hạn chế di căn hoặc phối hợp song song với xạ trị nếu bệnh nhân

không thể phẫu thuật Tuy nhiên, tác dụng phụ cũng rất hay gặp tùy thuộc từng loại hóa chất, liều dùng và thời gian kéo dài điều trị [1]

Xạ trị được khai thác triệt để trong điều trị UTPKTBN trên cả hai phác đồ: đơn lẻ hay phối hợp với phẫu thuật hoặc hóa chất Hiệu quả điều trị của xạ trị tăng rõ rệt khi phối hợp với hóa chất nhưng đồng thời các tác dụng phụ cũng tăng lên đáng kể Đặc biệt xạ trị bằng sóng cao tần dưới sự hướng dẫn của CT scan là một chọn lựa cho những khối u phổi vùng rìa và gần với thành ngực [1]

Điều trị đích dựa trên những đột biến trong UTPKTBN, các mục tiêu

được nhắm vào là thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGFR), thụ thể của yếu

tố tăng sinh mạch (VGFR), đột biến gen ALK, BRAF, ROS1 và RET, MET…

là mục tiêu tiềm năng cho các liệu pháp điều trị đích trong tương lai [77]

Bảng 1.2 Bảng tóm tắt các thuốc nhắm trúng đích và đích trên tế bào ung

thư phổi [77]

TT Đích trên TB

ung thư phổi Thuốc nhắm trúng đích Tác dụng

1 VEGF Bevacizumab (Avastin) Ức chế tăng sinh mạch

Ức chế sự sự phát triển, tăng sinh của TB ung thư, ức chế tăng sinh mạch, chống di căn Kích hoạt tế bào ung thư apoptosis

Cetuximab Nimotuzumab

4 EGFR có đột

biến T790M

Osimertinib (Tagrisso)

Ngăn chặn tế bào ung thư phát triển và phân chia

7 Đột biến gen

BRAF

Dabrafenib (Tafinlar) Trametinib (Mekinist)

Ngăn chăn hoạt động của MEK, ngăn sự phát triển và di căn của tế bào ung thư

1.2 VAI TRÒ CỦA ĐỘT BIẾN GEN TRONG UNG THƯ PHỔI KHÔNG TẾ BÀO NHỎ

1.2.1 Đột biến gen EGFR

Gen EGFR, nằm trên cánh ngắn nhiễm sắc thể số 7, tại locus 7p12, dài

110 kb và được chia thành 28 exon Đột biến gen EGFR xảy ra ở giai đoạn rất sớm và có tỉ lệ cao trong UTPKTBN EGFR là một thụ thể tyrosine kinase và

EGF trên bề mặt các tế bào có nguồn gốc biểu mô

Sự kích hoạt domain tyrosine kinase dẫn đến kích thích một loạt các con đường tín hiệu: PI3K/AKT/mTOR, RAS/RAF//MAPK và JAK/STAT Các con đường này kích hoạt sự điều hòa chức năng của một số lượng lớn gen gây ung thư, ví dụ như sự tăng sinh tế bào, sự biệt hóa, sự di căn

Đột biến gen EGFR đã được xác định ở UTPKTBN với tỉ lệ từ 10-20%

trên bệnh nhân ở châu Âu, châu Mỹ và 30-60% trên bệnh nhân thuộc chủng

tộc Đông Á, người Việt Nam có tỉ lệ đột biến EGFR chiếm 64,2% [88] Đột biến gen EGFR chiếm tỉ lệ cao ở nhóm người không hút thuốc lá, ở UTBM

tuyến so với các phân nhóm mô bệnh học khác của UTPKTBN, ở nữ giới so với nam giới và ở nhóm bệnh nhân Đông Á so với các chủng tộc khác

Hình 1.1 Các con đường truyền tín hiệu nội bào khởi nguồn từ EGFR

“Nguồn: Mitsudomi T, 2010” [59]

Khoảng 10 - 60% bệnh nhân UTPKTBN có đột biến ở exon 18-21 trên

gen EGFR Exon 18-21 mã hóa vùng tyrosine kinase, khiến cho protein

EGFR luôn trong trạng thái hoạt hóa không phụ thuộc vào yếu tố tăng trưởng

EGF Exon 18–21 là nơi đột biến trong EGFR thường xảy ra, tạo ra sự nhạy

cảm với các chất ức chế tyrosine kinase (TKI) Các đột biến này tạo ra protein

EGFR có ái lực mạnh với thuốc điều trị đích, do đó bệnh nhân UTPKTBN

mang đột biến gen EGFR thường đáp ứng tốt với thuốc điều trị đích [80]

Phổ biến nhất là mất đoạn ở exon 19 (khoảng 45%), phần lớn các trường hợp bao gồm các axit amin từ codon L747 đến E749 (đột biến LREA), thông thường nhất là E746-A750del Đột biến mất đoạn ở exon 19 là nhóm

đột biến nhạy với EGFR TKI [93]

Đột biến phổ biến thứ hai ở EGFR là đột biến sai nghĩa ở exon 18, 19 và

21 Trong đó phổ biến nhất là L858R, đây là đột biến điểm ở exon 21 dẫn đến

sự thay đổi leucine thành arginine ở codon 858 (khoảng 40%) Bên cạnh đó,

có những đột biến sai nghĩa ở exon 18 như G719 (G719A, C hoặc S); ở exon

21 như N826S, A839T, K846R, L861Q, G863D nhưng chiếm tỉ lệ thấp hơn

Đột biến ở exon 18 và 21 phần lớn là các đột biến nhạy với EGFR TKI [90]

Ngoài ra, còn có một loạt đột biến khác ít phổ biến hơn như đột biến

lặp đoạn, thêm đoạn và đột biến điểm tại exon 20 trên gen EGFR Exon 20

chứa hầu hết là các đột biến làm cho tế bào UTP kháng lại với thuốc điều trị đích như đột biến điểm T790M, V769L, S768I và các đột biến thêm đoạn [90]

Các chất EGFR TKI là các phân tử tổng hợp có trọng lượng phân tử

thấp, có nguồn gốc từ nhóm quinazoline, có vai trò ngăn chặn vị trí gắn kết ATP của vùng tyrosine kinase nội bào, từ đó ngăn chặn sự tự phosphoryl hóa

của EGFR và các con đường tín hiệu xuôi dòng Thuốc EGFR TKI có 3 thế

hệ: thế hệ 1 gồm gefitinib (Iressa) và erlotinib (Tarceva), thế hệ 2 là afatinib (Gilotril), thế hệ 3 là osimertinib hoặc AZD9291 (Tagrisso) Đáp ứng của

EGFR TKI với các loại đột biến EGFR khác nhau Erlotinib là một chất ức

chế tyrosine kinase được chấp thuận điều trị cho bệnh nhân UTPKTBN Vai trò của Erlotinib được chứng minh trong các nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng về điều trị bước 1, điều trị bước 2,3 sau thất bại với hóa chất và điều trị duy trì sau khi điều trị hóa chất ổn định đối với UTPKTBN có đột biến

EGFR [48] Gefitinib và afatinib cũng được chấp thuận cho việc điều trị

bước 1, 2 ở những bệnh nhân UTPKTBN giai đoạn tiến triển hoặc di căn có

đột biến gen EGFR gồm đột biến mất đoạn ở exon 19 và là đột biến ở exon

21 (đột biến L858R) [76] Những trường hợp UTPKTBN có đột biến gen

EGFR được điều trị bằng gefitinib hoặc erlotinib luôn phát triển khả năng

kháng lại các EGFR TKI này Cơ chế phổ biến nhất (khoảng 50%) và được

xác định sớm nhất là người bệnh có mang đột biến kháng thuốc T790M

(thay thế Threonine bằng methionine ở vị trí acid amin 790) ở exon 20 Đột

biến này gây nên hiện tượng trơ do ảnh hưởng bởi sự thay đổi cấu hình tại nơi gắn kết với TKI [65] Các đột biến gây kháng thuốc khác ít gặp hơn đã được xác định là đột biến L747S, D761Y, T854A, S768I và V769L… [18] Nhóm thuốc TKI thế hệ thứ 3 như osimertinib có hiệu quả cho bệnh nhân

ung thư phổi có đột biến EGFR T790M và bệnh trầm trọng hơn sau khi điều trị với các thuốc EGFR TKI khác [76]

1.2.2 Đột biến gen ALK (dung hợp gen EML4 -ALK)

EML4 (Echinoderm microtubule associated protein like 4) - ALK

(Anaplastic Lymphoma Kinase) là đột biến dung hợp đầu tiên được tìm thấy ở

UTPKTBN vào năm 2007 Gen ALK mã hóa tổng hợp protein thụ thể kinase lymphoma kinase (ALK) Đột biến dung hợp EML4-ALK xuất hiện trong

UTPKTBN với tần suất thấp 1-7%, chủ yếu ở người trẻ tuổi không hút thuốc

lá hoặc tiền sử có hút và hiện tại đã bỏ thuốc Alectinib, crizotinib là các

thuốc trúng đích cho bệnh nhân có đột biến gen ALK Đột biến này kích hoạt

con đường RAS/MEK/ErK và PI3K/AKT, do đó thúc đẩy quá trình tăng sinh

tế bào và chống lại chết theo chương trình [39]

Có ít nhất chín biến thể dung hợp EML4- ALK được tìm thấy ở UTPKTBN, bao gồm V1, V2, V3a/b, V4, V5a/b, V6, V7, “V4”, “V5” Các biến thể này mang phần exon 20 của gen ALK mã hóa tyrosine kinases kết hợp với các exon khác của gen tổng hợp EML4 (bao gồm các exon 2, 6, 13,

14, 15, 18 và 20) Biến thể 1 là sự dung hợp với exon 13; biến thể 2 là sự dung hợp với exon 20, biến thể 3a và 3b là sự dung hợp với exon 6a và 6b; biến thể 4 là sự dung hợp với exon 13 (với sự chèn vào 11 nucleotide chưa biết nguồn gốc (màu xanh đậm) bắt đầu tại nucleotide 50 của exon 20); biến thể 5a và 5b là sự dung hợp với exon 2 (biến thể 5b có sự chèn vào của 117

nucleotide từ intron 19); biến thể 6 là sự dung hợp với exon 13 (với sự thêm vào của 69 nucleotide từ intron 19 (màu xanh đậm); biến thể 7 là sự dung hợp với exon 14 (bắt đầu tại nucleotide 13 ở exon 20); biến thể “V4” là sự dung hợp với exon 15 (bắt đầu tại nucleotide 21 ở exon 20) và “V5” là sự dung hợp với exon 18 Trong đó ghi nhận 2 biến thể phổ biến nhất là biến thể 1 (E13-A20) và biến thể 3 (E6a/b-A20) [44]

Hình 1.2 Sơ đồ các biến thể dung hợp gen ALK ở UTPKTBN

“Nguồn: Horn L, 2009” [44]

1.2.3 Đột biến gen ROS1

ROS1 là một thụ thể tyrosine kinase có cấu trúc tương đồng với protein ALK; nằm trên NST 6q22 và lần đầu tiên được phát hiện vào năm 1986 Gen ROS1 có 47 exon, mã hóa cho protein dài 2347 amino acid Đây là protein

tích hợp màng RTK type I, chứa 3 vùng domain: một domain ngoại bào, một domain xuyên màng và một domain tyrosine kinase [23]

ROS1 tham gia vào nhiều con đường tín hiệu để thực hiện hoạt động

biến đổi của nó PLCγ, MAP kinase, IRS1 (phân tử tín hiệu đến PI3K), VAV3, STATS, cytoskeleton và các protein tương tác giữa các tế bào có thể

tương tác với ROS1 và quá trình phosphoryl hóa các protein này bởi ROS1 có

thể kích hoạt các con đường gây ung thư tương ứng [19]

Hình 1.3: Con đường truyền tín hiệu của đột biến ROS1

“Nguồn: Chin L.P, 2012” [23]

Sự tái sắp xếp gen thụ thể tyrosine kinase ROS1 đã được mô tả ở

UTPKTBN, chiếm tỉ lệ 2% và crizotinib là thuốc TKI được lựa chọn đầu tay

cho BN có đột biến ROS1[18] Nhiều biến thể dung hợp ROS1 được tìm thấy

ở UTPKTBN, trong đó hai biến thể phổ biến nhất bao gồm sự dung hợp giữa

đầu 5’ SLC34A2 với đầu 3’ của ROS1 (18%) và sự dung hợp giữa đầu 5’ của CD74 và đầu 3’ của ROS1 (41%) [27]

Hình 1.4 Các biến thể dung hợp gen ROS1 ở UTPKTBN

“Nguồn: Chin L.P, 2012” [23]

1.2.4 Đột biến gen KRAS

Họ gen RAS (gồm HRAS, NRAS và KRAS) là những gen có tỉ lệ đột

biến cao trong các bệnh ung thư ở người Protein RAS chia làm hai nhóm chính: yếu tố thay đổi guanine nucleotide (Guanine Nucleotide Exchange Factors – GEFs) và protein kích hoạt GTPase (GTPase- Activating Proteins - GAPs) GEFs chịu trách nhiệm cho việc chuyển đổi GDP thành GTP, trong khi đó GAPs kích thích sự thủy phân GTP Một khi được kích hoạt bởi các yếu tố kích thích ngoại bào, protein RAS sẽ kích hoạt các con đường ở phía

“hạ lưu” (downstream), bao gồm RAF/MEK/ERK và PI3K)/AKT)/mTOR, kích hoạt sự tăng sinh và phát triển của tế bào [108]

Trong UTPKTBN, KRAS là một trong những gen gây ung thư bị đột

biến chiếm tỉ lệ cao với chủ yếu là dạng đột biến thay thế một nucleotid tại codon 12 và 13 Các đột biến acid amin đơn vị trí G12 và G13 thường gặp

nhất Các đột biến KRAS được xác định chiếm khoảng 15 - 25%, chủ yếu gặp

ở người da trắng và có tiền sử hút thuốc lá [61]

Trong UTPKTBN, KRAS có ý nghĩa là yếu tố tiên lượng xấu, bệnh nhân có đột biến KRAS cho thấy thời gian sống thêm và thời gian sống thêm

bệnh không tiến triển đều thấp hơn đáng kể so với các bệnh nhân không có

đột biến KRAS Tuy nhiên đột biến KRAS không phải là yếu tố để loại trừ việc

điều trị thuốc EGFR TKI [63]

Năm 2021 FDA đã phê duyệt sotorasib để điều trị cho BN UTPKTBN

giai đoạn cuối có đột biến G12C của gen KRAS [63]

1.2.5 Đột biến gen NRAS

NRAS là một ATPase tương tự như KRAS, được xác định trong các

dòng tế bào u nguyên bào thần kinh và là thành viên thứ ba của gia đình RAS

sau KRAS và HRAS RAS GTPase điều khiển sự tăng trưởng tế bào, tăng sinh

và biệt hóa thông qua các con đường RAF/MEK/ERK và PI3K)/AKT)/mTOR [61]

Đột biến sinh dưỡng NRAS chiếm khoảng 1% ở bệnh nhân UTPKTBN,

thường được tìm thấy ở UTBM tuyến và ở những người có tiền sử hút thuốc Đột biến sai nghĩa dẫn đến thay thế amino acid ở vị trí 61 có trong phần lớn

trường hợp mang đột biến NRAS, bao gồm: Q61K (10-25%), Q61L (25-50%),

Q61R (17-19%), Q61H (3%) Đột biến ngay tại vị trí 12, bao gồm: G12C,

G12R, G12S, G12A, G12D chiếm khoảng 3% trong tổng số đột biến NRAS

[68]

Hiện tại, không có liệu pháp chống NRAS trực tiếp có sẵn, nhưng các

mô hình tiền lâm sàng cho thấy các thuốc ức chế MEK có thể có hiệu quả

1.2.6 Đột biến gen BRAF

BRAF thuộc họ protein kinase-threonine bao gồm ARAF, BRAF và

CRAF (RAF1) Gen BRAF mã hóa thông tin cho protein BRAF có trọng lượng

phân tử 94 kDa là chất có hoạt tính kinase với chức năng truyền tín hiệu nội

bào xuôi dòng phía sau protein KRAS của con đường tín hiệu RAS-MAPK

BRAF là một proto-oncogen, là một tín hiệu điều khiển chuyển tải

serin/threoninprotein kinase có khả năng thúc đẩy sự tăng sinh tế bào và sự

sống còn của tế bào ung thư [56]

Các đột biến soma BRAF đã được tìm thấy trong 1–4% của tất cả

UTPKTBN, phổ biến nhất ở bệnh nhân UTBM tuyến Những đột biến này thường được liên kết với những người có tiền sử hút thuốc trước đây hoặc

hiện tại đang hút thuốc Đối với gen BRAF có hơn 30 loại đột biến khác nhau được mô tả Tuy nhiên hơn 90% đột biến gen BRAF xảy ra ở codon 600

(V600E) chuyển acid amin Glycin thành acid amin Valin Đột biến này gia

tăng hoạt tính kinase xuôi dòng từ protein BRAF đến MEK thúc đẩy phân chia

tế bào ngay cả khi không có tín hiệu phía trước protein BRAF đến Chính cơ chế này làm tăng khả năng kháng thuốc ức chế EGFR của tế bào ung thư [28] Đột biến BRAF V600E ở UTPKTBN thường gặp ở nữ và là yếu tố tiên lượng xấu của bệnh Những thuốc điều trị ung thư gây ra bởi đột biến gen BRAF đã

và đang được phát triển Hai trong số các loại thuốc này, vemurafenib và trametinib đã được FDA phê duyệt để điều trị cho BN UTPKTBN giai đoạn

cuối có đột biến V600E của gen BRAF [67]

1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN

1.3.1 Hóa mô miễn dịch (IHC: immunohistochemistry)

Nhiều nghiên cứu cho thấy có thể sử dụng kháng thể đặc hiệu để phát

hiện đột biến đích đã biết trong UTPKTBN Với đột biến EGFR hiện nay có 2

loại kháng thể đơn dòng có thể phát hiện được đột biến mất đoạn exon 19 ( dòng 6b6) và đột biến điểm L858R (dòng 43b2) với độ nhạy 70 – 100% và độ đặc hiệu lên đến 100% [70] Hóa mô miễn dịch cũng có khả năng chẩn đoán

nhanh chuyển đoạn ALK và ROS1 Kháng thể đơn dòng 5A4 cho độ nhạy

90%, độ đặc hiệu 100% khi so sánh với phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ

(ALK break Apart FISH rearrangement probe Kit) [68] Với kháng thể đơn dòng D4D6, hóa mô miễn dịch giúp phát hiện chuyển đoạn ROS1 với độ

nhạy 100%, độ đặc hiệu 92% [96]

1.3.2 Phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ (FISH: fluorescence in situ)

FISH là phương pháp sử dụng rộng rãi nhất để phát hiện các chuyển

đoạn gen trong ung thư phổi FDA đã phê chuẩn FISH (Vysis ALK probe Kit)

là phương pháp chuẩn để phát hiện chuyển đoạn gen ALK trước khi sử dụng crizotinib [53] FISH cũng được dùng để xác định chuyển đoạn ROS1 và RET

và khuếch đại gen MET

1.3.3 Các kỹ thuật PCR

 Xét nghiệm EGFR Cobas Version 2

Xét nghiệm EGFR sử dụng hệ thống Cobas phiên bản 2 là một phương

pháp tổng hợp chuỗi thời gian thực (real-time PCR) Xét nghiệm được thực hiện trên hệ thống cobas 4800, hệ thống này cung cấp khả năng phát hiện và khuếch đại PCR hiệu suất cao cùng với phần mềm tự động hóa phân tích và

báo cáo kết quả Xét nghiệm EGFR Cobas V2 có thể phát hiện định tính 42 đột biến EGFR khác nhau (phụ lục 3), đa số là những đột biến đã được xác

định có ảnh hưởng đến tính đáp ứng với các thuốc điều trị đích Trong đó có

29 đột biến trên exon 19 nhiều hơn so với các kit khác như kit Qiagen chỉ

phát hiện được 29 đột biến EGFR gồm 19 đột biến trên exon 19, kit

StripAssay (ViennaLab) phát hiện được 30 đột biến Điều này rất có giá trị trong chẩn đoán và điều trị vì tỉ lệ bệnh nhân có đột biến trên exon 19 là cao nhất so với các exon khác [21]

Xét nghiệm EGFR Cobas V2 được cấp chứng nhận chất lượng

CE-IVD cho phép sử dụng trong chẩn đoán, cho kết quả nhanh chóng, độ nhạy

cao, có khả năng phát hiện khi số lượng tế bào mang đột biến là 5% Đây là

xét nghiệm EGFR đầu tiên và duy nhất hiện tại được FDA chấp thuận cho cả

sinh thiết mô và sinh thiết lỏng [109] Một số nghiên cứu lâm sàng lớn như AURA, AURA2, FLAURA, ENSURE, EURTAC và FASTACT2 đã chứng

minh rằng EGFR Cobas V2 là một xét nghiệm chẩn đoán mạnh mẽ và đáng tin cậy để phát hiện các đột biến của gen EGFR từ sinh thiết mô khối u hoặc

từ huyết tương và có thể xác định những bệnh nhân có nhiều khả năng đáp

ứng với liệu pháp ức chế EGFR TKI [21]

 Kỹ thuật PCR vi giọt kỹ thuật số (ddPCR: digital droplet PCR) [69]

PCR vi giọt kỹ thuật số (ddPCR) là PCR thế hệ thứ ba, sau Real-time PCR Kỹ thuật này khắc phục những hạn chế của Real-time PCR, cho phép định lượng chính xác các phân tử DNA, RNA mục tiêu Với độ nhạy, độ chính xác và độ lặp lại cao, ddPCR được ứng dụng ngày càng nhiều trong các lĩnh vực sau [50],[105]:

- Đánh giá chất lượng thư viện trước khi giải trình tự NGS

- Thẩm định kết quả giải trình tự NGS cho những đột biến ở tần số thấp

- Phát hiện và xác định tỉ lệ của các cfDNA trong sinh thiết lỏng

- Nghiên cứu biểu hiện gen, đặc biệt với những mẫu khó như tế bào đơn (single cell) hoặc mẫu mô đúc trong paraffin (FFPE)

- Phát hiện các gen mang đột biến hiếm, xuất hiện ở tỉ lệ thấp trong các mẫu khối u ung thư phức tạp hoặc mẫu liên quan đến bệnh di truyền

- Chẩn đoán di truyền không xâm lấn dựa trên máu mẹ

Quy trình PCR kỹ thuật số của Bio-Rad bao gồm 5 bước sau [29],[43] : (1) Chuẩn bị phản ứng PCR: Việc chuẩn bị phản ứng ddPCR tương

tự như phản ứng PCR thông thường Phản ứng cũng bao gồm các thành phần

cơ bản như enzyme Taq polymerase, mồi, dNTP, … và bổ sung thêm chất phát quang EvaGreen hoặc mẫu dò huỳnh quang TaqMan Các mẫu DNA sẽ được bổ sung vào các phản ứng này Tổng thể tích cuối cùng của phản ứng là

20 μL Cũng giống như khi chạy PCR, bên cạnh các phản ứng cho mẫu xét nghiệm, kỹ thuật viên thường chạy thêm các phản ứng chứng dương (chứa

DNA mục tiêu) và phản ứng chứng âm (không chứa DNA mục tiêu)

(2) Tạo vi giọt: Bằng một thiết bị đặc biệt của hãng Bio-Rad gọi là Droplet Genrator, một phản ứng 20 μL ở trên sẽ được phân chia ngẫu nhiên thành 20.000 vi giọt có thể tích khoảng 1 nL Mỗi vi giọt này chứa đầy đủ các thành phần của 1 phản ứng Real-time PCR như trên Các phân tử DNA sẽ được phân bố ngẫu nhiên vào các vi giọt này

(3) Nhân bản DNA có trong vi giọt: Tất cả 20.000 vi giọt được tạo

ra từ 1 phản ứng ban đầu sẽ được chuyển vào 1 giếng trong đĩa PCR 96 giếng

và được đặt vào máy PCR thông thường Khi chương trình luân nhiệt diễn ra, DNA có trong mỗi vi giọt sẽ được nhân bản như một phản ứng PCR thông thường Tín hiệu huỳnh quang tạo ra do mẫu dò hoặc chất phát quang sẽ được tích tụ trong từng vi giọt, tùy vào số lượng DNA mục tiêu được phân bố vào

vi giọt

(4) Đọc tín hiệu trong vi giọt: Sau khi phản ứng PCR kết thúc, các vi giọt sẽ được phân tích bởi một thiết bị đọc huỳnh quang của hãng Bio-Rad Thiết bị này hoạt động theo cơ chế giống như flow cytometer Từng vi giọt trong mỗi ống chứa ở bước 3 sẽ được hút vào đường ống của thiết bị và lần lượt đi qua các đầu đọc tín hiệu huỳnh quang Cường độ tín hiệu của mỗi màu huỳnh quang có trong mỗi vi giọt sẽ được đầu đọc ghi nhận lại Hiện tại, máy đọc vi giọt của Bio-Rad đọc được 3 loại màu huỳnh quang khác nhau

(5) Phân tích dữ liệu: Kết quả đọc của tất cả vi giọt được tạo ra từ từng phản ứng ban đầu sẽ được chuyển sang phần mềm phân tích trên máy vi tính Đối với từng phản ứng 20 μL ban đầu, kết quả được phân tích bao gồm:

- Tổng số vi giọt (droplet) tạo ra được từ 20 μL phản ứng ban đầu, bao gồm

vi giọt dương tính và vi giọt âm tính

- Tổng số vi giọt dương tính (chứa DNA mục tiêu và có cường độ tín hiệu huỳnh quang cao hơn hẳn so với những vi giọt trong phản ứng chứng âm)

- Tổng số vi giọt âm tính (không chứa DNA mục tiêu và có cường độ tín hiệu huỳnh quang ngang ngửa với những vi giọt trong phản ứng chứng âm)

Dựa vào số lượng vi giọt dương tính và tổng số vi giọt tạo ra từ mỗi phản ứng ban đầu, phần mềm sẽ áp dụng mô hình phân phối Poisson để tính

ra nồng độ DNA mục tiêu có trong 20 μL thể tích phản ứng ban đầu

1.3.4 Giải trình tự gen

 Giải trình tự gen Sanger

Đây là phương pháp sớm nhất được sử dụng phát hiện đột biến gen

EGFR và KRAS Trình tự DNA được giải trình tự trực tiếp ngay sau khi được

khuếch đại bằng PCR Kỹ thuật gồm 2 giai đoạn:

Giai đoạn đầu gọi là giai đoạn phản ứng giải trình tự : đoạn DNA cần được giải trình tự được sử dụng như trình tự khuôn cho phản ứng giải trình tự bắt đầu từ vị trí gắn mồi Hỗn hợp của deoxy- và dideoxynucleotid được sử dụng trong phản ứng với nồng độ sao cho các dideoxynucleotid sẽ gắn vào mỗi vị trí mà các deoxynucleotid thường gắn trên đoạn DNA đang được tổng hợp Sự gắn của các dideoxynucleotid sẽ làm gián đoạn quá trình kéo dài các đoạn DNA được tổng hợp, kết quả sẽ tạo ra hỗn hợp các sợi DNA có kích thước khác nhau Nucleotid tận cùng trên mỗi sợi DNA được xác định bằng

cách chạy một phản ứng hỗn hợp nhưng từng loại dideoxynucleotid được đánh dấu bằng các chất phát huỳnh quang đặc hiệu khác nhau

Giai đoạn kế gọi là giai đoạn điện di giải trình tự: sản phẩm sau phản ứng giải trình tự sẽ được dùng điện di độ phân giải cao (điện di bản gel polyacrylamide hay điện di mao quản) để sắp xếp các đoạn trình tự dài ngắn khác nhau theo kích thước (ngắn trước, dài sau dù chỉ cách nhau có một nucleotide) và chính nhờ trình tự này mà biết được thứ tự sắp xếp các nucleotide của đoạn DNA Đọc trình tự bằng máy giải trình tự tự động sử dụng bảng gel polyacrylamide Máy gồm 2 phần: phần dùng điện di gel, phần phát hiện các vạch điện di Các vạch điện di được các con mắt cảm quang phát hiện khi đi qua chùm tia laser và phát sáng lên Tín hiệu được mắt cảm quang truyền về máy tính để hiển thị thành các đỉnh cường độ sáng Sau đó, trình tự gen của mẫu nghiên cứu sẽ được đối chiếu với trình tự gen tham chiếu trên ngân hàng gen thế giới (GenBank) và được phân tích để xác định vùng hoặc điểm đột biến

Kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi cách đây nhiều năm và dần được thay thể bằng các kỹ thuật phức tạp và chất lượng cao hơn

 Giải trình tự thế hệ mới

Giải trình tự gen thế hệ mới là phương thức giải trình tự đồng thời và lượng lớn các đoạn ngắn nucleotide Đây là một cuộc cách mạng về công nghệ giải trình tự vì nếu giải trình tự Sanger chỉ cho phép giải trình tự không quá 1500 bps, thì giải trình tự thế hệ mới cho phép giải được từ 8 Gbases 600 Gbases, có nghĩa là cho phép giải trình tự nguyên bộ gen Cùng một thời điểm, máy giải trình tự gen thế hệ mới có khả năng tạo hàng triệu đến hàng tỷ dòng nên sẽ giải được hàng triệu đến hàng tỷ mảnh DNA cùng lúc Giải trình tự gen thế hệ mới có thể phát hiện đồng thời nhiều loại đột biến

như: đột biến điểm, mất đoạn, chuyển đoạn, khuếch đại gen hay mất nhiều gen

Bảng 1.3: Các phương pháp phát hiện đột biến gen trong UTPKTBN [55]

Loại đột biến Giải

trình tự Sanger

Hóa mô miễn dịch (IHC)

FISH Multiplex

PCR

Giải trình tự gen thế

hệ mới (NGS)

(cần kiểm chứng lại bằng FISH)

có gắn cộng hóa trị với các oligo và chính các oligo này bắt cặp bổ sung với các adaptor đặc hiệu mà đã được gắn với các đoạn

DNA trong thư viện được tạo ban đầu Bề mặt này được thiết kế để gắn các mạch DNA sao cho thuận lợi cho việc tiếp xúc với các enzyme cũng như tạo sự ổn định cho các mạch khuôn DNA này Pha khuếch đại tạo ra tối đa 1.000 bản sao từ một mạch khuôn ban đầu [55] Công nghệ giải trình tự bằng

cơ chế tổng hợp sử dụng 4 nucleotide đánh dấu phát huỳnh quang để giải trình

tự hàng chục triệu cụm cluster trên bề mặt flow cell Mỗi chu kỳ giải trình tự, một deoxynucleoside triphosphate (dNTP) đã đánh dấu được thêm vào chuỗi nucleic acid Các dNTP này bị khóa ở vị trí 3’-OH, do đó, sau mỗi lần một dNTP được gắn vào mạch thì việc gắn dNTP tiếp theo bị ức chế trong một khoảng thời gian đủ dài (1 chu kỳ) để máy ghi nhận tín hiệu huỳnh quang từ dNTP được gắn vào, sau đó một loại enzyme được thêm vào để gỡ khóa tại vị trí 3’-OH và cho phép tiếp tục gắn nucleotide tiếp theo Vì tất cả 4 dNTP (A,

T, G, C) đều bị khóa ở vị trí 3’-OH giúp ghi nhận chính xác tín hiệu của từng nucleotide, đặc biệt là dễ dàng giải trình tự các homopolymer [53] Ưu điểm nổi bật nhất của NGS đó là giải trình tự song song hàng triệu phân tử DNA khác nhau, cho phép phát hiện nhiều đột biến ở nhiều gen vì vậy giúp giảm giá thành giải trình tự xuống đáng kể, có thể đạt đến $0,1 cho mỗi 1 triệu nucleotide so với mức giá $2.400 của phương pháp giải trình tự Sanger truyền thống

Hình 1.5: Giải trình tự gen thế hệ mới bằng tổng hợp (Illumina)

“Nguồn: Mardis E.R, 2012” [55]

1.3.5 Sinh thiết lỏng

Hiện nay kỹ thuật xét nghiệm đột biến gen dựa trên mẫu mô u được xem là tiêu chuẩn vàng Tuy nhiên có một số khó khăn khi xét nghiệm từ mẫu sinh thiết như bệnh nhân già yếu, không đủ sức khoẻ để sinh thiết, vị trí u không thể sinh thiết, bệnh nhân không còn u sau một thời gian điều trị hoặc bệnh nhân không đồng ý sinh thiết Sinh thiết lỏng (liquid biopsy) là một phương pháp mới với rất nhiều ưu điểm so với phương pháp sinh thiết mô u truyền thống và đang dần được sử dụng rộng rãi trong lâm sàng Sinh thiết lỏng dựa trên sự phát hiện các đột biến sinh dưỡng đặc hiệu của mô ung thư, hiện diện trên những phân mảnh DNA tự do được phóng thích từ tế bào ung thư vào máu ngoại biên DNA tự do trong máu (cfDNA) lần đầu tiên được phát hiện vào năm 1987 bởi Mandel và Metails Nhiều nghiên cứu chứng minh rằng, cfDNA có kích thước khoảng 166 bp và được cho là kết quả của

quá trình chết theo chương trình hoặc hoại tử của tế bào [30] cfDNA có thời gian bán hủy ngắn (1,5 giờ) và nồng độ có thể khác nhau tùy theo khối u và diễn tiến bệnh cfDNA phản ánh hầu như toàn bộ những bất thường về gen có trong khối u ban đầu Người ta phát hiện rằng, nồng độ cfDNA ở bệnh nhân ung thư lớn hơn bốn đến tám lần so với nồng độ của cfDNA ở người bình thường [37]

Mặt khác, sinh thiết lỏng phản ánh đặc tính di truyền của toàn bộ khối u (cả nguyên phát và di căn) tốt hơn so với sinh thiết mô Nguyên nhân do việc

sử dụng mô u có những hạn chế trong quá trình đánh giá sự phát triển và xác định kiểu gen của khối u do sự không đồng nhất và thay đổi theo thời gian của khối u Số liệu ước tính cho thấy 63-69% trong tổng số đột biến sinh dưỡng không tìm thấy ở mọi vùng khối u Sự không đồng nhất khối u có thể dẫn đến việc đánh giá không hoàn chỉnh cấu trúc gen của khối u và là thách thức lớn cho việc theo dõi tiến trình điều trị [74]

Một ưu điểm lớn nhất của sinh thiết lỏng chính là dễ dàng thu mẫu trong quá trình theo dõi tiến trình điều trị và có vai trò phát hiện những đột biến mới

do kết quả của việc kháng thuốc Bởi vì, trong sinh thiết lỏng, mẫu máu chủ yếu được sử dụng làm nguồn mẫu để phân tích DNA khối u lưu hành trong máu (circulating tumor DNA – ctDNA) Bên cạnh đó, việc sinh thiết mô thường xuyên trong tiến trình điều trị sẽ gây ảnh hưởng lớn đến sức khỏe của bệnh nhân từ các biến chứng thủ thuật Ngoài ra, vài khối u nằm ở vị trí không thể nào sinh thiết mô được [25]

Tuy nhiên, việc phát hiện ctDNA từ cfDNA ở bệnh nhân ung thư gặp nhiều thử thách lớn Một thử thách lớn đó chính là phân biệt ctDNA từ cfDNA ở bệnh nhân ung thư Một điều rõ ràng rằng, ctDNA mang các đột biến hiện diện trong bộ gen của các tế bào ung thư chứ không hiện diện ở các

tế bào bình thường Do vậy, hiện nay, các phương pháp giải trình tự có thể phân biệt ctDNA một các dễ dàng nếu ctDNA chiếm một số lượng lớn trong máu của bệnh nhân ung thư Tuy nhiên, ctDNA chỉ chiếm tỷ lệ nhỏ trong tổng số cfDNA ở bệnh nhân ung thư, gây khó khăn cho việc phát hiện đột biến sinh dưỡng từ huyết tương Nồng độ này thay đổi phụ thuộc vào dạng ung thư, giai đoạn bệnh và kích thước khối u; thông thường kích thước mô u càng lớn, lượng ctDNA được phóng thích càng nhiều Ở bệnh nhân ung thư giai đoạn tiến triển, tần suất đột biến (MAF: mutant allele fraction) có thể ở khoảng 1%, nghĩa là cứ mỗi 100 phân tử cfDNA được phát hiện trong dòng máu, chỉ

có 1 phân tử ctDNA mang đột biến được phóng thích từ tế bào ung thư [40]

Do đó, cần phải lựa chọn các phương pháp chính xác và tối ưu để phân tích ctDNA Trong ung thư phổi, nhiều phương pháp được sử dụng để phân tích ctDNA Các phương pháp dựa trên PCR có thể được sử dụng bao gồm digital PCR và qPCR, ví dụ sử dụng real-time PCR để phân tích đột biến kháng

thuốc T790M ở gen EGFR; kỹ thuật ddPCR phát hiện đột biến mất exon 19 ở

EGFR; bộ kit Cobas (Roche) phát hiện đồng thời 42 đột biến trên 4 exon 18,

19, 20 và 21 của thụ thể EGFR trong bệnh nhân ung thư phổi giai đoạn cuối

[69],[79] Tuy nhiên, hạn chế của phương pháp dựa trên PCR là chỉ phát hiện một số ít đột biến đã biết trước trên một số lượng gen rất giới hạn Bên cạnh

đó, phương pháp dựa trên PCR rất khó để phát hiện sự tái sắp xếp gen (ALK hoặc ROS1), bởi vì các điểm tái sắp xếp thường nằm trên vùng intron rộng mà

không có “điểm nóng” (hot spots) rõ ràng vì thế rất khó khăn trong việc thiết

kế mồi Một phương pháp khác để nhận biết đột biến gen là phương pháp giải trình tự Sanger truyền thống Tuy nhiên phương pháp này không thể được sử dụng cho sinh thiết lỏng vì không đủ độ nhạy để phát hiện những đột biến có tần suất thấp hơn 20%, hơn thế nữa phương pháp Sanger không thể phát hiện những đột biến thêm hoặc mất đoạn và chuyển đoạn

Do đó, một hướng mới hiện nay trong việc xác định đột biến ở mẫu sinh thiết lỏng chính là kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới với độ sâu lớn Hiện nay, việc dùng NGS để phát hiện đột biến từ mẫu sinh thiết lỏng từ bệnh nhân ung thư được sử dụng một cách rộng rãi Nhiều nghiên cứu đã cho thấy việc phát hiện đột biến ở mẫu sinh thiết lỏng dựa trên NGS có tỉ lệ tương đồng từ 60-86% so với mẫu sinh thiết mô ở các bệnh nhân UTPKTBN giai đoạn tiến triển Gần đây, việc dùng NGS với độ sâu lớn để phát hiện các đột biến có tần suất > 1% đã được báo cáo Ngoài ra, việc phát hiện đột biến ở ctDNA bằng NGS cho thấy có độ nhạy và độ đặc hiệu cao khi phát hiện đột biến mất đoạn

ở exon 19, đột biến điểm L858R và T790M ở gen EGFR Sử dụng NGS để phát hiện đột biến dung hợp ở gen ALK cũng đã được báo cáo trong nhiều

nghiên cứu trước đây [64]

1.4 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ ĐỘT BIẾN GEN Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ PHỔI KHÔNG TẾ BÀO NHỎ

1.4.1 Các nghiên cứu nước ngoài:

Sasaki H (2005) tình trạng đột biến gen EGFR tương quan đáng kể với

giới tính, hút thuốc lá và các phân nhóm bệnh lý của ung thư phổi [88]

Shim H.S (2011) nghiên cứu cho thấy trong đột biến EGFR, các đột

biến mất đoạn và đột biến điểm, phổ biến nhất trong các exon 19 và 21 với tỉ

lệ tương ứng 61,1% và 31,5% [95]

Nghiên cứu IPASS (2011) cho thấy tỉ lệ đột biến gen EGFR ở BN

UTBM tuyến ở nữ lên tới 76,7% và ở BN không hút thuốc là 92,7% [35]

Wu J.Y (2011) khi nghiên cứu trên 327 BN UTPKTBN cho thấy tỉ lệ

đột biến gen EGFR là 52,0%, gặp nhiều hơn ở nữ giới (p < 0,001) và những

người không hút thuốc (p < 0,01) [112]