Các nghiên cứu về sự hiện diện của các hợp chất này sẽ giúp gợi mở về nhiều hơn hoạt tính sinh học cũng như khả năng ứng dụng cây trà hoa vàng vào phát triển sức khỏe con người.. Từ nhữn
Giới thiệu về cây trà hoa vàng Thạch Châu
Trà hoa vàng, hay còn gọi là Golden Camellia, là một nhóm thực vật đặc biệt thuộc họ Theaceae, với hoa màu vàng đặc trưng Loài này rất hiếm gặp trong tự nhiên, chỉ tồn tại ở miền Nam Trung Quốc và Việt Nam, chủ yếu phân bố ở các rừng lá rộng thường xanh Hiện có hơn 50 loài trà hoa vàng được phát hiện, trong đó gần 40 loài tự nhiên ở Việt Nam Năm 2010, trà hoa vàng được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Trung Quốc công nhận là thực phẩm mới Ngoài việc sử dụng như trà, trà hoa vàng còn được dùng trong y học cổ truyền Trung Quốc để điều trị tăng huyết áp và ung thư Hiện nay, trà hoa vàng thu hút nhiều nghiên cứu nhờ chứa nhiều hợp chất tiềm năng, thể hiện hoạt tính như ức chế ung thư, hạ huyết áp, giảm lipid máu và cholesterol, cũng như ngăn ngừa xơ vữa động mạch Nhiều sản phẩm thương mại từ trà hoa vàng đang được phát triển.
Cây trà hoa vàng, đặc biệt là loài trà Thạch Châu (Pyrenaria jonqueriana P.), có tiềm năng lớn trong nghiên cứu và phát triển tại Việt Nam, nhất là ở vùng Tây Nguyên Loài này thuộc chi Pyrenaria, với nhiều ứng dụng trong y học như giải nhiệt, chữa cảm phong hàn, mát gan, và điều trị các triệu chứng như tê thấp, đau gân, sốt, viêm sưng, xuất huyết, cũng như rửa vết thương Những đặc điểm này mở ra hướng nghiên cứu và ứng dụng mới cho cây trà hoa vàng Thạch Châu trong tương lai.
Cây trà hoa vàng Thạch Châu
Trà hoa vàng Thạch Châu, có tên khoa học là Pyrenaria jongquieriana Pierre ex Laness, được biết đến với ý nghĩa "hạt cứng" trong tiếng Hy Lạp Loại cây này lần đầu tiên được mô tả vào năm 1887 bởi nhà thực vật học Pierre, dựa trên mẫu vật do Harmand thu thập vào năm 1877 Đến năm 2016, trà Thạch Châu đã được đăng ký trình tự mã vạch DNA tại ngân hàng Gen Quốc tế bởi TS Trần Hồ Quang từ Viện Công nghệ sinh học, thuộc Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam.
Tên thường gọi: Thạch Châu, Thạch Châu Trung bộ, chè hạch Jonquier, Thạch Châu Jonquier [6, 7]
Chi Pyrenaria (Thạch Châu) thuộc họ Theaceae (Chè) và có số lượng loài khác nhau tùy theo hệ thống phân loại Theo hệ thống phân loại APG IV, chi Pyrenaria bao gồm 28 loài.
Theo thống kê từ Trung tâm Dữ liệu Thực vật Việt Nam, hiện có 5 loài thuộc chi Pyrenaria được ghi nhận tại nước ta, bao gồm: Pyrenaria garentiana Craib, Pyrenaria jonqueriana Piere, Pyrenaria poilaneana Gagn, Pyrenaria serrata Bl và Pyrenaria chelienesis Hu Các loài này phân bố chủ yếu tại Sapa, Bạch Mã (Huế), Đà Lạt và Quảng Trị.
Trà hoa vàng Thạch Châu (Pyrenaria jonqueriana Piere) là cây thân gỗ cao khoảng 9m, có màu nâu và tiết diện tròn Cây có lá thường xanh, hình mác thuôn, dài từ 5-15cm, với mặt trên nhẵn và màu xanh nõn chuối khi non, xanh đậm khi già Hoa của cây mọc đơn lẻ ở đầu cành, có màu vàng, vàng nhạt hoặc trắng, với 11-13 phiến hoa và bộ nhị dài 0,5-1cm Quả của cây có hình dáng nhã cứng, dài 3,5cm, chứa 1-3 hạt.
9] Hoa nở vào tháng 5-7, có quả tháng 10-12 [10]
Cây trà Thạch Châu phân bố chủ yếu ở các vùng núi cao từ 800 đến 1700m, đặc biệt là ở đông bắc Lào và tỉnh Hải Nam của Trung Quốc Tại Việt Nam, trà Thạch Châu được tìm thấy tại các khu vực núi Vọng Phu, Bạch Mã và Đà Lạt.
Hình 1.1 Một số hình ảnh về cây trà hoa vàng Thạch Châu Pyrenaria jonqueriana Piere.
Thành phần hóa học
Các loài trà hoa vàng trên thế giới
Trà hoa vàng đang thu hút sự chú ý nhờ vào tiềm năng hỗ trợ sức khỏe Các nhà khoa học toàn cầu đang phân tích thành phần hợp chất tự nhiên trong cây để hiểu rõ hơn về hoạt tính sinh học và khả năng ứng dụng của trà hoa vàng trong phát triển sức khỏe con người Nghiên cứu đã xác định các thành phần quan trọng như polyphenol, flavonoid và saponin, cùng với ảnh hưởng của chúng đến khả năng sinh học Các loài trà hoa vàng, chủ yếu thuộc chi Camellia, như Camellia chrysantha và Camellia nitidissima, phổ biến ở Đông Á, đặc biệt là Trung Quốc, nơi nhiều nghiên cứu tiên phong đã được thực hiện Những nghiên cứu này củng cố niềm tin về lợi ích sức khỏe mà trà hoa vàng mang lại.
Nữ hoàng trong các loại trà hoa vàng, Camellia impressinervis, chứa nhiều hợp chất flavonoid, saponin và polysaccharide trong lá và hoa Nghiên cứu cho thấy loài trà này phân bố ở Trung Quốc và miền bắc Việt Nam cũng có các hợp chất tương tự Đặc biệt, nghiên cứu của nhóm Peng (2011) về Camellia chrysantha chỉ ra rằng hoa của loài trà này cũng giàu flavonoids, saponins và polysaccharides.
Năm 2011, L Song và các cộng sự đã nghiên cứu sáu loại trà hoa vàng thuộc chi Camellia, bao gồm Camellia euphlebia, Camellia microcarpa, Camellia nitidissima, Camellia tunghinensis, và Camellia chrysantha, cho thấy chúng có hàm lượng cao các hợp chất phenolic và tiềm năng kháng oxi hóa tốt Nghiên cứu đã phân lập và xác định sự hiện diện của các hợp chất polyphenols như ellagitannin, proanthocyanidin, taxifolin deoxyhexose, apigenin, kaempferol, quercetin, glucosyl isorhamnetin, catechin, (epi) catechin, (epi) polyme afezelechin và platphylloside Đặc biệt, khác với trà xanh, sáu loài trà hoa vàng này không chứa caffein, mặc dù một báo cáo năm 2013 cho thấy trà hoa vàng vẫn có caffein nhưng với hàm lượng rất thấp, từ 33.83 μg/g (C nitidissima) đến 18.02 μg/g (C murauchii), so với trà Camellia sinensis có hàm lượng từ 20-50 mg/g Điều này mở ra hướng ứng dụng trà hoa vàng như một nguồn nguyên liệu thay thế cho các trà chứa caffein nhằm mục đích chống oxy hóa và hỗ trợ sức khỏe.
Bảng 1.1 Hàm lượng polyphenol toàn phần, hàm lượng tannin thủy phân và hàm lượng tannin ngưng tụ của các loài trà hoa vàng ([14] )
Hàm lượng polyphenol toàn phần (molGAE/g)
Hàm lượng proanthocyanidin tổng (molCE/g)
Hàm lượng tannin thủy phân (molEAE/g)
Hàm lượng tannin ngưng tụ (molECE/g)
Flavonoid là nhóm hợp chất tự nhiên quan trọng với cấu trúc phenolic, phổ biến trong thực vật và mang lại nhiều lợi ích sức khỏe như kháng oxi hóa, quét gốc tự do, và hỗ trợ ngăn ngừa bệnh tim mạch và ung thư Trà hoa vàng, đặc biệt từ cây Camellia chrysantha, được xác định là nguồn giàu flavonoid.
5 hợp chất flavonoid gồm (+)-catechin, (-)-epicatechin, quercetin, quercetin-3-O-methyl ether bà kaempferol [18] Trong một báo cáo về cây trà hoa vàng Camellia nitidissima
Nghiên cứu năm 2018 cho thấy loài trà này có hàm lượng flavonoid cao, với 101,45 mg/g ở lá và 217,6 mg/g ở hoa, vượt trội hơn so với một số loài trà hoa vàng khác như Camellia euphlebia (61,88 mg/g), Camellia pubipetala (39,3 mg/g) và Camellia ptilosperma (50,48 mg/g).
Camellia microcarpa chứa 47,85 mg/g các hợp chất flavonoid, bao gồm các dẫn xuất kaempferol, quercetin, rutin, vitexin, luteolin, catechin, epicatechin và proanthocyanidins Sự hiện diện của những nhóm chất này chứng tỏ tiềm năng sinh học của cây trà hoa vàng.
Cây thuộc chi Camellia không chỉ chứa flavonoid mà còn có hàm lượng đáng kể saponin dạng triterpenoid Nghiên cứu về trà hoa vàng cho thấy sự hiện diện của các hợp chất này, với báo cáo từ nhóm nghiên cứu của Tang (2009) chỉ ra rằng lá, hoa và hạt của cây có chứa saponin ở mức cao.
Camellia nitidissima chứa các hợp chất có giá trị lần lượt là 432,4 mg/g, 213,0 mg/g và 135,3 mg/g Saponin cũng được phát hiện trong lá của một số loài trà hoa vàng khác như Camellia chrysanthoides (300,8 mg/g), Camellia impressinervis (362,9 mg/g) và Camellia perpetua (359 mg/g) Năm 2014, Su và các cộng sự đã xác định các triterpenoid có trong Camellia nitidissima, bao gồm ginsenoside Rg1 (6,20-di-O-β-glucosyl-).
In 2016, Qi J isolated ten compounds from Camellia nitidissima, including triterpenoids such as 3β,6α,13β-trihydroxyolean-7-one and 3β-acetoxy-20-lupanol Additionally, notable compounds identified include 20(S)-protopanaxatriol, F1 (20-O-β-D-glucopyranosyl-20(S)protopanaxatriol), and F5 (20(S)-O-protopanaxatriol-20-O-α-L-arabinofuranosyl(1 → 6)-β-D-glucopyranoside).
27 steroidal saponins bao gồm α-spinasteryl-β-D-glucopyranoside và stigmasta-7,22-diene-3-O-[α-L-arabinopyranosyl(1→ 2)]-β-D-galactopyranoside Ginsenoside, một loại saponin triterpenoid hoặc steroid, chủ yếu tồn tại trong các loài thuộc chi Panax (Nhân sâm) và đã được chứng minh có nhiều tác dụng tích cực đối với sức khỏe như hỗ trợ thần kinh, tim mạch, chống tiểu đường và kháng oxy hóa Sự hiện diện của ginsenoside trên cây trà hoa vàng càng khẳng định giá trị của loài cây này.
Hình 1.2 Một số saponin phân lập được từ trà hoa vàng ([21] , [22] , [23] )
Các nhà nghiên cứu còn tìm thấy đa dạng một số thành phần có giá trị khác Ở loài
Camellia chrysantha chứa các thành phần dinh dưỡng quan trọng trong hoa, bao gồm đường hòa tan (39%), chất xơ (30%), protein (5,6%), lipid (1,94%) và tro (5,13%) Hàm lượng vitamin C và vitamin E lần lượt là 90mg/100g và 520mg/100g Tổng hàm lượng axit amin tự do đạt 80,8mg/100g, trong đó praline chiếm 38,7%.
Tỷ lệ các thành phần hóa học trong hoa khác biệt so với lá, cho thấy hoa có tiềm năng lớn trong việc khai thác và sử dụng Nghiên cứu về thành phần hóa học của loài này đã mang lại những kết quả đáng chú ý.
C nitidissima cũng cho thấy sự hiện diện của nhiều nguyên tố vi lượng (N, P, K, Ca,
Mg, Fe, Zn) và amino axit (Asp, Thr, Ser, Glu, Gly) với hàm lượng khác nhau đối với các bộ phận khác nhau của cây [11]
The volatile compounds extracted from the flowers and leaves of various species of yellow tea are diverse in composition and concentration The dry leaves of C tunghinensis, C nitidissima, and C euphlebia contain essential oil concentrations of 0.18%, 0.21%, and 0.13%, respectively The essential oil of Camellia nitidissima primarily consists of linalool (35.8%), phytol (7.9%), cis-geranyl acetone (7.3%), and methyl salicylate (6.8%), while its flowers are rich in α-eudesmol (34.3%), ceudesmol (31.5%), and linalool (11.1%) In contrast, the main components of the oil from Camellia euphlebia include phytol (58%), geranylacetone (5.6%), and n-hexanal (3.3%) The essential oil composition of Camellia tunghinensis differs from the other two species, featuring n-hexanal (17.2%) and 2-pentylfuran.
(10,6%), phytone (7,5%) và geranylacetone (5,0%) Tinh dầu trà hoa vàng còn được chứng minh có hoạt tính kháng khuẩn nhẹ [25]
Nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng trà hoa vàng chứa nhiều nhóm chất quý giá như flavonoid, polyphenol, polysaccharide, saponin, tannin, vitamin và các nguyên tố vi lượng Điều này củng cố niềm tin về tiềm năng sinh học của nhóm thực vật này.
Cây trà hoa vàng Thạch Châu
Trong số các giống trà hoa vàng ở Việt Nam, Pyrenaria jonquieriana là một loài đặc biệt Nhiều loài thuộc chi Pyrenaria, bao gồm trà hoa vàng Thạch Châu, được liệt kê trong sách đỏ IUCN và chỉ phân bố ở một số vùng nhất định Tuy nhiên, nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học tiềm năng của các loài này vẫn còn hạn chế, dẫn đến sự thiếu quan tâm từ các nhà nghiên cứu trong và ngoài nước.
Hoạt tính sinh học
Hoạt tính kháng oxy hóa
Tổng quan về hoạt tính kháng oxi hóa
Stress oxy hóa là hiện tượng mất cân bằng giữa sự hình thành gốc tự do và cơ chế chống lại chúng của cơ thể, liên quan đến lão hóa và một số bệnh lý Gốc tự do là các phân tử không bền, dễ phản ứng do có điện tử chưa ghép đôi, được hình thành từ cả nội sinh và ngoại sinh, như ô nhiễm môi trường và hóa chất độc hại Mặc dù gốc tự do có vai trò trong các hoạt động sinh lý, nhưng khi vượt quá khả năng của chất chống oxy hóa, chúng có thể gây hại cho mô mỡ, DNA và protein, dẫn đến nhiều bệnh lý nghiêm trọng như tim mạch, ung thư và các bệnh thoái hóa.
Chất chống oxi hóa giúp giảm stress oxi hóa bằng cách hình thành các gốc tự do ít hoạt động hơn hoặc ngăn chặn chuỗi phản ứng gây hại cho protein, lipid, carbohydrate và DNA Chúng thường nhường electron cho các gốc tự do, làm cho chúng trở nên trung hòa và giảm khả năng phản ứng.
Chất chống oxy hóa được chia thành hai loại: enzyme và phi enzyme Enzyme chống oxy hóa, như superoxide dismutase (SOD), catalase và glutathione, thường là nội sinh Trong khi đó, các chất chống oxy hóa phi enzyme chủ yếu được cung cấp từ thực phẩm bổ sung, với các ví dụ phổ biến như vitamin C, lipoic acid, beta-caroten, coenzyme Q10 và vitamin E.
Các hợp chất kháng oxi hóa phi enzyme, như vitamin A, C, E, flavonoid và polyphenol, có nguồn gốc từ thực vật và đóng vai trò quan trọng trong việc hỗ trợ và phòng ngừa các bệnh lý như tim mạch và ung thư Sự hiện diện của những hợp chất này trong trà hoa vàng gợi ý về khả năng kháng oxi hóa và lợi ích cho sức khỏe con người.
Các nghiên cứu về hoạt tính kháng oxi khóa trên cây trà hoa vàng
Các nhà nghiên cứu đã thực hiện nhiều khảo sát trên các loài trà hoa vàng khác nhau, cho thấy tiềm năng kháng oxi hóa rõ ràng và thu được nhiều kết quả khả quan.
Trong báo cáo về cây trà hoa vàng Camellia nitidissima Chi., tác giả đã nêu rõ khả năng quét gốc tự do và kháng oxi hóa của dịch chiết lá và hoa Nghiên cứu của Wan (2011) chỉ ra rằng các phân đoạn chloroform, ethyl acetate và n-butanol từ dịch chiết lá đều có khả năng kháng quét gốc tự do, với phân đoạn n-butanol đạt IC50 cao nhất là 37,64 µg/mL đối với DPPH và 14,74 µg/mL đối với ABTS+ Ngoài ra, một nghiên cứu kháng trên hoa cũng đã được thực hiện bởi nhóm Yang.
Nghiên cứu năm 2018 cho thấy dịch chiết ethanol có hoạt tính kháng oxi hóa mạnh nhờ vào các hợp chất polyphenol và flavonoid, trong đó ethyl acetate thể hiện hoạt tính vượt trội với IC50 cho DPPH và ABTS+ lần lượt là 78,80 µg/mL và 64,24 µg/mL Năm 2015, Zhang đã chỉ ra rằng dịch chiết hoa C nitidissima có khả năng cải thiện tình trạng chống oxi hóa gan ở chuột bị tăng lipid máu Báo cáo của Cheng (2016) cũng cho thấy thành phần saponin trong dịch chiết trà hoa vàng C nitidissima có ảnh hưởng đáng kể đến hoạt tính kháng oxi hóa, với giá trị IC50 cho DPPH của polyphenol và saponin lần lượt là 410 µg/mL và 50 µg/mL.
Một nghiên cứu về hoạt tính kháng oxi hóa của sáu loại trà hoa vàng cho thấy tất cả các mẫu khảo sát đều có khả năng kháng oxi hóa.
C impressinervis có hoạt tính vượt trội với giá trị ORAC cao nhất đạt 2270,9 μmol TE/g, trong khi C tunghinensis có ORAC thấp nhất chỉ khoảng 327,1 μmol TE/g Bốn loài còn lại, bao gồm C euphlebia, C microcarpa, C chrysantha và C nitidissima, có giá trị ORAC dao động từ 500-900 μmol TE/g Hoạt tính kháng oxi hóa của các loài trà hoa vàng này được cho là do sự đa dạng của các hợp chất phenolic như ellagitannins, proanthocyanidins, taxifolin deoxyhexose, dẫn xuất apigenin, kaempferol và quercetin Một nghiên cứu khác về tinh dầu chiết xuất từ C euphlebia, C tunghinensis và C nitidissima cho thấy hoạt tính kháng oxi hóa của tinh dầu trà hoa vàng là không đáng kể, với IC50 lần lượt là 42,8 μg/mL, 90,9 μg/mL và 164,8 μg/mL.
g/mL đối với DPPH ( đối chứng Ascorbic acid là 13,2 g/mL) và 102,5 g/mL, 198,3
Nghiên cứu của Bùi Hồng Cường và các cộng sự năm 2017 đã chỉ ra rằng lá trà Thạch Châu có khả năng kháng oxy hóa mạnh, với giá trị ABTS + đạt 321,7 g/mL, so với đối chứng Ascorbic acid là 18,3 g/mL Phương pháp DPPH và superoxide anion được sử dụng để chứng minh tác dụng này, đồng thời lá trà cũng giúp giảm quá trình oxy hóa tế bào gan chuột do CCl4 gây ra Hàm lượng polyphenol và flavonoid trong lá trà Thạch Châu lần lượt là 21,2% và 7,7%, cho thấy tiềm năng của nó trong việc phòng chống các bệnh liên quan đến quá trình oxy hóa trong cơ thể.
Tình trạng kháng kháng sinh và chủng
Sự ra đời của kháng sinh đã mang lại bước tiến lớn trong y học, cứu sống hàng triệu người, nhưng kháng kháng sinh đang đe dọa những thành tựu này và gây rủi ro cho sức khỏe con người Theo WHO, kháng thuốc kháng sinh (AMR) xảy ra khi vi khuẩn, virus, nấm và ký sinh trùng thay đổi, khiến cho việc điều trị nhiễm trùng trở nên khó khăn hơn và gia tăng nguy cơ lây lan, bệnh nặng và tử vong Tỷ lệ đề kháng ciprofloxacin, một kháng sinh phổ biến trong điều trị nhiễm trùng đường tiết niệu, dao động từ 8,4% đến 92,9% đối với Escherichia coli và từ 4,1% đến 79,4% đối với Klebsiella pneumoniae ở các quốc gia báo cáo với GLASS.
Antimicrobial Resistance and Use Surveillance System)
Vi khuẩn Staphylococcus aureus, hay tụ cầu vàng, là vi khuẩn Gram dương thường trú trên da và gây ra nhiều bệnh nhiễm trùng trong cộng đồng cũng như tại các cơ sở y tế Sự xuất hiện của vi khuẩn kháng methicillin (MRSA) đã tạo ra thách thức lớn trong việc điều trị, với nguy cơ tử vong cao hơn 64% so với các chủng nhạy cảm với thuốc, theo báo cáo của WHO Tại Việt Nam, các loại kháng sinh hiện nay không còn hiệu quả chống lại vi khuẩn, bao gồm cả những kháng sinh thế hệ mới như methicillin và vancomycin, với tỷ lệ kháng kháng sinh của MRSA lên tới 13,6%.
Staphylococcus aureus kháng trung gian vancomycin (VISA) và Staphylococcus aureus kháng vancomycin (VRSA) 6,1% [37]
Các bệnh truyền nhiễm do vi khuẩn kháng kháng sinh đang gia tăng, với khoảng 440.000 ca bệnh lao kháng đa kháng sinh và 150.000 ca tử vong mỗi năm trên toàn cầu Do đó, việc phát triển các phương pháp điều trị mới là rất cần thiết Tìm kiếm các chất kháng sinh từ thực vật và kết hợp chúng với các loại kháng sinh hiện có là một giải pháp tiềm năng Thực vật cung cấp một nguồn phong phú các chất chuyển hóa thứ cấp như alkaloids, glycosides, terpenoids, saponins, steroids, flavonoids, tannins, quinones và coumarins.
Nhiều hợp chất từ thực vật có tiềm năng trở thành kháng sinh tự nhiên Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng nhiều loại thực vật chứa các nhóm chất này có khả năng kháng MRSA.
Bảng 1.2 Các hợp chất có trong một số loài thực vật kháng MRSA
Tên khoa học Thành phần các hợp chất Tài liệu tham khảo
Quercus infectoria Tannin, saponin, galic acid và ellagic acid [41-43]
Polygonim molle Tannins, flavonoids, alkaloids [47]
Alnus nepalenis Tannins, triterpenoids, flavonoids, phenols [47]
Nghiên cứu cho thấy tài nguyên thực vật có tiềm năng lớn trong việc nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn đối với chủng MRSA Đặc biệt, cây trà hoa vàng với các hợp chất tương tự có khả năng kháng hoặc hỗ trợ kháng lại vi khuẩn này.
Những nghiên cứu về kháng khuẩn trên trà hoa vàng
Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
Cây trà hoa vàng Thạch Châu và trà hoa vàng nói chung đang cho thấy tiềm năng nghiên cứu và ứng dụng đáng kể, mở ra cơ sở vững chắc cho các nghiên cứu sâu hơn về loại cây này.
Xây dựng phương án và thực hiện đề tài “Nghiên cứu thành phần và hoạt tính cây trà hoa vàng Thạch Châu Pyrenaria jonquieriana, định hướng sản xuất thực phẩm chức năng” với các mục tiêu chính.
- Khảo sát điều kiện chiết cao tổng
- Khảo sát thành phần và hoạt tính sinh học
Nghiên cứu này tập trung vào việc ứng dụng cao trà Thạch Châu từ lá cây trà Pyrenaria jonquieriana, một loại trà hoa vàng, được thu hái tại xã Mê Linh, huyện Lâm Hà, tỉnh Lâm Đồng.
Nghiên cứu được tiến hành tại Phòng thí nghiệm Dược lý – Khoa Y – Đại học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh
Luận văn tập trung vào việc chiết xuất các cao tổng hợp và các cao phân đoạn cần thiết để đạt được mục tiêu nghiên cứu đã đề ra.
- Chuẩn bị và bảo quản nguyên liệu ở các điều kiện thích hợp
- Chiết cao tổng với dung môi thích hợp, tính hiệu suất chiết cao
- Chiết cao phân đoạn từ cao tổng thu được
Nội dung 2: Phân lập và khảo sát thành phần hợp chất có trong cao phân đoạn:
- Sử dụng TLC dò tìm hệ dung môi thích hợp
- Phân lập các hợp chất bằng sắc ký cột
- Phân tích cấu trúc các hợp chất thu được
- Khảo sát hoạt tính sinh học của các hợp chất thu được
Nội dung 3: Nguyên cứu sơ bộ bào chế thực phẩm chức năng từ cao trà Thạch Châu:
- Phối trộn các mẫu cao trà Thạch Châu (các cao tổng và cao phân đoạn)
- Khảo sát hàm lượng các nhóm chất và hoạt tính mẫu cao thu được
- Bào chế sơ bộ cốm hòa tan từ mẫu cao và các tá dược thích hợp
- Định tính, định lượng các thành phần hợp chất
- Khảo sát hoạt tính sản phẩm
Các nội dung nghiên cứu được biểu thị trên sơ đồ Hình 2.1
Hình 2.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu
Hóa chất và thiết bị
Kiểm tra chất lượng sản
Tinh chất Cốm hòa tan
Cao phân đoạn Bào chế
Trong quá trình tiến hành thí nghiệm, các hóa chất và thiết bị cơ bản được sử dụng được liệt kê ở Bảng 2.1 và Mục 2.2.2
Bảng 2.1 Danh mục hóa chất
STT Tên hóa chất Nhà sản xuất Xuất xứ
3 Vanillin Himedia Laboratories Ấn Độ
8 Sodium carbonate Xilong Trung Quốc
9 Acid sulfuric Xilong Trung Quốc
11 Alumi clorua Xilong Trung Quốc
12 Potassium acetate Xilong Trung Quốc
Máy đo UV- VIS : UV1800 của hãng SHIMADZU, Nhật Bản
Tủ sấy: UN110 của hãng Memmert, Đức
Máy cô quay: RV10 của hãng IKA, Đức
Cân sấy ẩm: DBS60-3 của hãng Kern, Đức
Bể ổn nhiệt: WNB của hãng Memmert, Đức.
Phương pháp nghiên cứu
Nguyên liệu lá trà hoa vàng tươi được thu hoạch tại xã Mê Linh, huyện Lâm Hà, tỉnh Lâm Đồng, với tiêu chuẩn là lá già, không bị úa vàng và không có sâu bệnh Sau khi thu hoạch, lá trà được rửa sạch và để ráo, sau đó diệt men bằng hơi nước ở nhiệt độ khoảng 105 °C trong 5 phút Nguyên liệu sau khi diệt men được chia thành hai phần: một phần được bảo quản lạnh ở nhiệt độ 3-4 °C, phần còn lại được phơi khô tự nhiên cho đến khi độ ẩm dưới 13% và bảo quản ở nhiệt độ phòng khoảng 25 °C Nguyên liệu được lưu trữ trong túi zip có chứa gói hút ẩm để duy trì độ ẩm ổn định Quy trình xử lý nguyên liệu được minh họa trong sơ đồ Hình 2.2.
Quy trình xử lý nguyên liệu bao gồm việc đo độ ẩm bằng máy cân sấy ẩm Kern DBS60-3 Nguyên liệu được trải thành lớp mỏng trên đĩa nhôm và sau đó được sấy ở nhiệt độ 120 °C trong máy đo độ ẩm.
Để xác định độ ẩm của nguyên liệu, cần đo độ ẩm dưới 12% cho đến khi khối lượng không đổi Quá trình đo kết thúc khi màn hình hiển thị chữ END, và độ ẩm sẽ được đọc từ màn hình Phép đo được thực hiện lặp lại 3 lần để lấy kết quả trung bình Từ độ ẩm W, khối lượng nguyên liệu khô được tính theo công thức: \$m_{nlk} = m_{cân} \times (100 - W)\$.
Hình 2.3 Sơ đồ quy trình ngâm dầm thu cao tổng
Dựa trên hướng dẫn trong sách “Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ” của cô Nguyễn Kim Phi Phụng, quy trình chiết ngâm dầm được xây dựng với một số điều chỉnh phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm và đặc điểm nguyên liệu Mỗi loại nguyên liệu sau khi phân loại sẽ được chiết ngâm dầm theo quy trình đã được mô tả Nguyên liệu cần được xay thành bột trước khi chiết, và một lượng bột vừa đủ sẽ được lấy để xác định độ ẩm Cụ thể, 50g nguyên liệu sẽ được cân và cho vào bình chứa thủy tinh có nắp đậy, sau đó rót dung môi vào bình theo tỉ lệ 1:5 (w:v), tương ứng với 250 ml dung môi, và giữ yên ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ.
Ngâm dầm Lọc Dịch chiết
- Chiết trong 24 giờ, lặp lại 2 lần
Tỉ lệ 1:5 (w/v) giữa động cơ học và nhiệt được sử dụng để dung môi thẩm thấu vào cấu trúc tế bào thực vật, hòa tan các hợp chất tự nhiên Sau khi chiết xuất, dung dịch được lọc chân không, và bã được giữ lại để tiến hành chiết lần hai Dịch thu được từ hai lần chiết được cô quay ở nhiệt độ 45-60 °C với số vòng quay 110-140 rpm để thu hồi dung môi Cuối cùng, cao chiết được cân và đo độ ẩm để xác định khối lượng cao khô.
Phương pháp ngâm là một kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện và tiết kiệm chi phí, nhưng có nhược điểm là năng suất chiết xuất thấp Việc chiết xuất một lần không thể thu được toàn bộ hoạt chất từ dược liệu, trong khi chiết nhiều lần lại dẫn đến dịch chiết loãng, tốn dung môi và thời gian Đối với lá trà hoa vàng, chỉ cần ngâm trong 24 giờ với một lượng dung môi cố định để đạt mức bão hòa, không thể hòa tan thêm Cao chiết từ phương pháp này không chịu tác động nhiệt, cho phép so sánh với cao chiết Soxhlet để đánh giá độ bền nhiệt của các hợp chất tự nhiên trong cây.
Hình 2.4 Sơ đồ quy trình chiết Soxhlet thu cao tổng EtOH
EtOH - Chiết kiệt, thời gian khoảng 7h
Chiết Soxhlet Lọc Dịch chiết
Dựa trên hướng dẫn trong sách “Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ” của cô Nguyễn Kim Phi Phụng, quy trình chiết Soxhlet được xây dựng với một số điều chỉnh phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm và đặc điểm nguyên liệu Nguyên liệu được xay thành bột và cân 50g cho vào túi vải, sau đó đặt vào bình Soxhlet Dung môi được rót vào bình cầu theo tỉ lệ 1:5 (w:v), tương ứng với 250 ml, để thấm ướt bột cây trước khi chảy xuống bình cầu Nước được cho chảy trong ống sinh hàn, và bếp điện được mở để điều chỉnh nhiệt độ sao cho dung môi sôi nhẹ Kiểm tra sự chiết bằng cách lấy một giọt dung môi và thử trên mặt kính; nếu không còn vết gì, quá trình chiết đã hoàn tất Cuối cùng, dịch chiết được lấy ra, lọc chân không, và dung môi được cô quay ở nhiệt độ 45-60 °C với số vòng quay 110-140 rpm, sau đó cân và đo ẩm để quy ra khối lượng cao khô.
Phương pháp chiết Soxhlet cho phép chiết xuất hiệu quả từ mẫu cây với lượng dung môi nhỏ, tiết kiệm thời gian và công sức so với phương pháp ngâm dầm Tuy nhiên, kích thước máy Soxhlet hạn chế lượng bột cây có thể chiết, và các hợp chất có thể bị hư hại do nhiệt độ sôi của dung môi Phương pháp này giúp xác định độ bền của các thành phần trong lá trà hoa vàng, tạo cơ sở cho các ứng dụng trong tương lai.
Hiệu suất chiết cao tổng được tính theo công thức:
Trong đó: H: hiệu suất chiết (%) mk: khối lượng cao khô thu được sau quá trình chiết cao tổng (g) mnlk: khối lượng nguyên liệu khô đem chiết (g)
Thực hiện chiết phân đoạn theo phương pháp trong “Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ” [78], chuẩn bị cao tổng theo quy trình Mục 2.3.3 Phân tán cao tổng vào nước và tiến hành chiết lỏng - lỏng với các dung môi từ kém phân cực đến phân cực, thực hiện nhiều lần với mỗi dung môi cho đến khi không còn chất hòa tan Sau đó, chuyển sang dung môi có tính phân cực hơn và theo dõi bằng sắc ký bản mỏng Gộp dung dịch các lần chiết, cô quay ở 40-50 o C với tốc độ 110-140rpm để thu được các cao phân đoạn và dung môi thu hồi Sơ đồ chiết phân đoạn được thể hiện trong Hình 2.5.
Mỗi dung môi được sử dụng để chiết xuất theo từng lần, với một lượng nhỏ dung môi cho đến khi dịch chiết trở nên trong Sau đó, chuyển sang dung môi tiếp theo Đối với mỗi phân đoạn, gộp các dung dịch từ các lần chiết lại với nhau và tiến hành bay hơi dung môi bằng phương pháp cô quay Cuối cùng, cân cao phân đoạn và tính hiệu suất của nó theo công thức đã định.
Trong đó: H: hiệu suất chiết (%) mcpđ: khối lượng cao phân đoạn thu được (g) mct: khối lượng cao tổng đem chiết (g)
Hình 2.5 Sơ đồ chiết các cao phân đoạn khác nhau từ cao tổng Phương pháp định tính và định lượng Định tính
Hòa tan khoảng 0,05g cao chiết vào 15mL ethanol và sử dụng siêu âm trong 10 phút để đảm bảo cao hòa tan hoàn toàn Sau đó, tiến hành định tính các nhóm chất theo Bảng 2.2.
Cao tổng Phân tán Chiết
Dịch chiết còn lại Chiết
Ethyl acetate n-butanol bão hòa nước
Bảng 2.2 Phương pháp định tính các nhóm chất Định tính Phương pháp Hiện tượng
Phản ứng Cyanidin: 2mL dịch chiết
+ 1mL alcol isoamyl và 0,5mL HCl đậm đặc + 3-5 hạt magnesium kim loại Đun nhẹ vài phút, quan sát màu ở lớp alcol phía trên
- Dung dịch trong ống 2 sẽ có màu cam đỏ hoặc tím: có chứa flavon, flavonon, flavonol, flavononol, xanthan
- Có chứa isoflavon, flavanonol, auron dung dịch không đổi màu
Tác dụng của chì acetate kiềm:
Cho 1mL dịch chiết + 1mL dung dịch chì acetate 1%
- Tủa với hầu hết các flavononid phenol
Lấy 2mL dịch chiết + 2mL nước cất và vài giọt dung dịch FeCl3
- Phản ứng tạo phức màu lục, xanh hay nâu đỏ tùy vào số lượng và vị trí nhóm OH trong phân tử
Lấy 5mL dịch chiết đun cách thủy cho nóng + 1mL anhydride acetic +
- Steroid thì có màu lơ-xanh lá
- Dẫn xuất triterpenoid thì có màu hồng đến tía
Lấy 2mL dịch chiết+ vài giọt dung dịch gelatin 1% có chứa 10% NaCl
- Tạo tủa màu vàng nhạt, để lâu hóa màu nâu Định lượng a Định lượng polyphenol tổng
Phương pháp Folin – Ciocalteau là một kỹ thuật định lượng polyphenol toàn phần, dựa trên sự trao đổi điện tử trong môi trường kiềm Hợp chất phenolic sẽ bị oxi hóa bởi thuốc thử Folin-Ciocalteu, bao gồm hỗn hợp phosphotungstic acid (H3PW12O40) và phosphomolybdic acid (H3PMo12O40), tạo thành phức hợp có màu xanh.
Bằng cách đo độ hấp thu tại bước sóng 765 nm và sử dụng đường chuẩn acid galic, có thể xác định hàm lượng tổng hợp các hợp chất phenolic trong mẫu phân tích Tuy nhiên, thuốc thử Folin-Ciocalteau cũng phản ứng với một số chất khác như thiols, acid amin (tyrosine, tryptophan và cysteine), vitamin, nucleotide base (adenine, guanine) và các ion (Fe²⁺, Mn²⁺, I⁻), dẫn đến việc gây nhiễu kết quả.
Hình 2.6 Cơ chế phản ứng định lượng polyphenol Tiến hành:
Chuẩn bị các dung dịch sau:
- Dung dịch Na2CO3 7,5%: hòa tan 3,75g Na2CO3 bằng 46,25mL nước cất
- Dung dịch Folin 10% (v/v): lấy 10mL Folin đậm đặc định mức lên 100mL bằng bình định mức với dung môi là nước
- Dung dịch acid gallic: Pha các dung dịch acid galic có nồng độ theo dãy 0; 12,5; 25; 50; 100; 200ppm với dung môi là ethanol tuyệt đối
Để lập đường chuẩn, cho 2mL thuốc thử Folin–Ciocalteu vào 0,4mL dung dịch acid gallic với các nồng độ khác nhau, sau đó đồng nhất bằng bể lắc siêu âm trong 5 phút ở nhiệt độ phòng Tiếp theo, thêm 1,6mL dung dịch Na2CO3 7,5% vào dung dịch và tiếp tục đồng nhất bằng siêu âm trong 30 phút, rồi để yên ở nhiệt độ phòng trong 30 phút Mật độ quang được đo ở bước sóng λ = 765nm, lặp lại 3 lần cho mỗi nồng độ và lấy giá trị trung bình Đối với mẫu, hòa tan 10 mg cao chiết trong ethanol tuyệt đối, sau đó pha ra các nồng độ phù hợp để thu được độ hấp thu nằm trong khoảng tuyến tính của đường chuẩn acid gallic, và tiến hành đo mẫu tương tự như bước dựng đường chuẩn, lặp lại ba lần cho mỗi mẫu cao và lấy giá trị trung bình.
Hình 2.7 Quy trình định lượng hàm lượng polyphenol tổng
Dựa vào độ hấp thu của dung dịch acid galic ở các nồng độ khác nhau, chúng tôi đã xây dựng được đường chuẩn nồng độ - độ hấp thu với phương trình y = 0,0125x + 0,0251 và hệ số xác định r² = 0,9952 Các giá trị độ hấp thu của mẫu được ghi nhận và từ đó, hàm lượng polyphenol tổng trong mẫu được ước lượng theo công thức đã thiết lập.
𝑚 Trong đó: TPE (mg GAE/g cao): khối lượng polyphenol tổng tính trên 1g cao chiết