Hoạt tính xâm nhiễm và đặc điểm bộ gene của thực khuẩn thể nhằm kiểm soát vi khuẩn xanthomonas oryzae pv oryzae gây bệnh cháy bìa lá lúa

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng sử dụng phage là phương pháp hữu ích để kiểm soát vi khuẩn gây bệnh trên thực vật, giảm thiểu việc sự dụng thuốc trừ sâu và hóa chất, hiệu quả ổn định lâu

PHAN ĐÌNH HẢI

HOẠT TÍNH XÂM NHIỄM VÀ ĐẶC ĐIỂM

BỘ GENE CỦA THỰC KHUẨN THỂ NHẰM

KIỂM SOÁT VI KHUẨN XANTHOMONAS ORYZAE

PV ORYZAE GÂY BỆNH CHÁY BÌA LÁ LÚA

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 8420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 01 năm 2023

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS Hoàng Anh Hoàng

2 TS Phan Thị Huyền – Thư ký

3 TS Nguyễn Thị Lệ Thuỷ – Phản biện 1

4 TS Nguyễn Tiến Dũng – Phản biện 2

5 PGS.TS Hoàng Anh Hoàng – Uỷ viên

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng PGS.TS Nguyễn Quang Long

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Phan Đình Hải MSHV: 2070075

Ngày, tháng, năm sinh: 27/04/1994 Nơi sinh: Đồng Nai

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 8420201

I TÊN ĐỀ TÀI:

Hoạt tính xâm nhiễm và đặc điểm bộ gene của thực khuẩn thể nhằm kiểm soát vi

khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae gây bệnh cháy bìa lá lúa

NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

1 Khảo sát đặc tính của thực khuẩn thể xâm nhiễm vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv

oryzae gây bệnh cháy bìa lá lúa

 Xác định hoạt tính xâm nhiễm của thực khuẩn thể

 Khảo sát khả năng kiểm soát vi khuẩn của thực khuẩn thể trong điều kiện in vitro

2 Phân tích đặc điểm genome của thực khuẩn thể

 Phân tích genome và đánh giá tính an toàn của thực khuẩn thể kháng Xanthomonas

oryzae pv oryzae

II NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 14/02/2022

III NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 05/12/2022

IV.CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS.TS Hoàng Anh Hoàng

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình tìm hiểu học hỏi để hoàn thành luận văn được giao Tôi cũng đã gặp rất nhiều vướng mắc, nhưng được sự giúp đỡ tận tình của giáo viên hướng dẫn, các thầy cô quản lý phòng thí nghiệm, các anh chị và các bạn trong lab đã tạo điều kiện tốt nhất, giúp tôi có thể thực hiện tốt luận văn, cũng nhử giải đáp những vướng mắc trong quá trình nghiên cứu để hoàn thành luận văn này Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô

và các anh chị đã giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này.

đó M625 có hệ số nhân tốt nhất là 28 ± 5, chu kỳ xâm nhiễm 100 phút Khả năng kiểm

soát vi khuẩn Xanthomonas oryzae pathovar oryzae trong môi trường in vitro của 3 thực

khuẩn thể M223, M624, M625 đều kiểm soát tốt, môi trường trở nên trong suốt sau 3 –

4 giờ, vi khuẩn không huyền phù trở lại trong suốt thời gian thí nghiệm

Kích thước bộ gen của ba thực khuẩn thể M223, M624, M625 đều là 46.226bp Số

khung đọc mở (orf) của các thực khuẩn thể M223, M624, M625 lần lượt là 74 (orf), 76 (orf), 75 (orf) Tất cả đều không phát hiện có chứa gen kháng thuốc kháng sinh, yếu tố

độc lực, gen độc tố và gen tích hợp trong bộ gen của ba thực khuẩn thể Kết quả cho thấy

cả ba thực khuẩn thể đều có tiềm năng ứng dụng kiểm soát vi khuẩn Xanthomonas oryzae pathovar oryzae

ABSTRACT

Bacterial blight of rice caused by bacteria Xanthomonas oryzae pathovar oryzae is

one of the most devastating diseases to rice, especially in the Mekong Delta - Vietnam With practical use it is possible to control bacterial leaf blight disease on rice plants I performed a survey to evaluate the infective activity and genome analysis of three bacteriophages M223, M624, M625 All three bacteriophages have a latent periods of about 25-35 minutes, including M625 has the best multiplier of 28 ± 5, infectivity cycle

of 100 minutes The ability to control Xanthomonas oryzae pathovar oryzae in the in

vitro medium of three bacteriophages M223, M624, M625 were well controlled, the medium became transparent after 3 - 4 hours, maintain bacterial population at a relatively low level

The genome sizes of the three bacteriophages M223, M624, and M625 are all

46,226bp The number of open read frames (orf) of bacteriophages M223, M624, M625

is 74 (orf), 76 (orf), 75 (orf), respectively All were not found to contain antibiotic

resistance genes, virulence factors, toxins genes and integrated genes in the genomes of the three genome phage This results introduced that all three phages as a potential

biological agent in the control of Xanthomonas oryzae pathovar oryzae

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận văn “Hoạt tính xâm nhiễm và đặc điểm bộ gene của thực

khuẩn thể nhằm kiểm soát vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae gây bệnh cháy

bìa lá lúa” là công trình nghiên cứu của tôi với sự hướng dẫn của PGS TS Hoàng Anh

Hoàng Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn này là trung thực và chưa từng được người khác công bố trong bất kỳ công trình nào khác

TÁC GIẢ LUẬN VĂN

PHAN ĐÌNH HẢI

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii

LỜI CAM ĐOAN iv

MỤC LỤC v

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH MỤC HÌNH ẢNH viii

DANH MỤC BẢNG x

MỞ ĐẦU……….1

Chương 1: TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2

1.1 Bệnh cháy bìa lá lúa 2

1.2 Vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae 4

1.3 Nghiên cứu thực khuẩn thể lây nhiễm trên Xanthomonas oryzae pv oryzae 5 1.4 Các phương pháp giải trình tự gene thế hệ mới 9

1.5 Công nghệ giải trình tự gene thế hệ mới của Illumina 10

1.6 Mục tiêu nghiên cứu 12

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 14

2.1 VẬT LIỆU 14

2.2 PHƯƠNG PHÁP 14

2.2.1 Xác định hoạt tính xâm nhiễm 14

2.2.2 Phương pháp xác định chu kỳ lây nghiễm 14

2.2.3 Khảo sát khả năng kiểm soát vi khuẩn trong in vitro 15

2.2.4 Xác định đặc điểm bộ gene 16

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

3.1 Hình thái của thực khuẩn thể 23

3.2 Hoạt tính xâm nhiễm 24

3.3 Khả năng kiểm soát vi khuẩn trong in vitro 26

3.4 Đặc điểm genome của thực khuẩn thể: 27

3.4.1 Kiểm tra và xử lý dữ liệu thô 27

3.4.2 Lắp ráp hệ gen 32

3.4.3 Chú giải cấu trúc 36

3.4.4 Chú giải chức năng 36

3.4.5 Phân tích cây phát sinh loài 39

3.4.6 Tính an toàn của thực khuẩn thể 40

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42

4.1 Kết luận 42

4.2 Kiến nghị 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO 43

PHỤ LỤC 1 46

PHỤ LỤC 2 57

PHỤ LỤC 3 65

PHỤ LỤC 4 74

LÝ LỊCH TRÍCH NGANG 76

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Xoo: Xanthomonas oryzae pv oryzae

PFU: Plaque Forming Units

CFU: Colony Forming Unit

EBI: European Bioinformatics Institute

ENA: European Nucleotide Archive

MCP: Major Capsid Protein

MSA: Multiple sequence alignment

NCBI: National Center for Biotechnology Information

NCBI CDD: NCBI Conserved Domains Database (CDD)

NGS: Next Generation Sequencing

ORF: Open Reading Frame

sRNA: Soluble Ribonucleic Acid

TerL: Terminase Large Subunit

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Các triệu chứng của bệnh cháy bìa lá lúa do vi khuẩn Xoo trên (a) ở cây lúa trưởng thành; (b) ở trên luống ươm lúa; (c) ở cây lúa non (EPPO (European and Mediterranean Plant Protection Organization), 2007) 3 Hình.1.2 A: Khuẩn lạc của Xoo trên môi trường GF; B: khuẩn lạc của Xoo trên môi trường thạch mXOS (EPPO (European and Mediterranean Plant Protection Organization), 2007) 5 Hình 3.1 Vòng sinh tan của ba chủng thực khuẩn thể: A M223; B M624; C M625 23 Hình 3.2 Hình thái của các chủng thực khuẩn thể được quan sát qua hình chụp TEM A M223; B M624; C M625 23 Hình 3.3 Sự thay đổi số lượng thực khuẩn thể M223 xâm nhiễm vi khuẩn Xoo LA1+ theo thời gian Kích thước ly giải của phage M223 là khoảng 13 ± 2 thực khuẩn thể trên mỗi tế bào bị xâm nhiễm, thời gian tiềm ẩn khoảng 25 - 30 phút Các thanh Error bars biểu thị khoảng tin cậy 95% cho các giá trị trung bình (n = 3) 24 Hình 3.4 Sự thay đổi số lượng thực khuẩn thể M624 xâm nhiễm vi khuẩn Xoo LA1+ theo thời gian Kích thước ly giải của phage M624 là khoảng 16 ± 3 thực khuẩn thể trên mỗi tế bào bị xâm nhiễm, thời gian tiềm ẩn khoảng 30 – 35 phút Các thanh Error bars biểu thị khoảng tin cậy 95% cho các giá trị trung bình (n = 3) 25 Hình 3.5 Sự thay đổi số lượng thực khuẩn thể M625 xâm nhiễm vi khuẩn Xoo LA1+ theo thời gian Kích thước ly giải của phage M625 là khoảng 28 ± 5 thực khuẩn thể trên mỗi tế bào bị xâm nhiễm, thời gian tiềm ẩn khoảng 30 – 35 phút Các thanh Error bars biểu thị khoảng tin cậy 95% cho các giá trị trung bình (n = 3) 25 Hình 3.6 Ảnh hưởng của ba thể thực khuẩn thể M223, M624, M625 đến sự phát triển của Xoo LA1+ trong môi trường TSB lỏng Mật độ tế bào của môi trường nuôi cấy được theo dõi bằng cách đo OD600 Các thanh Error bars biểu thị khoảng tin cậy 95% cho các giá trị trung bình (n = 3) 27

Hình 3.7 Kết quả kiểm tra chất lượng dữ liệu thô phage M223 với phần mềm FastQC

29

Hình 3.8 Kết quả kiểm tra chất lượng dữ liệu thô phage M624 với phần mềm FastQC 30

Hình 3.9 Kết quả kiểm tra chất lượng dữ liệu thô phage M625 với phần mềm FastQC 31

Hình 3.10 Kết quả đánh giá các thông số genome M223 đã lắp ráp bằng qualimap_v2.2.1 33

Hình 3.11 Kết quả đánh giá các thông số genome M624 đã lắp ráp bằng qualimap_v2.2.1 33

Hình 3.12 Kết quả đánh giá các thông số genome M625 đã lắp ráp bằng qualimap_v2.2.1 34

Hình 3.13 Kết quả BLASTN của genome thực khuẩn thể M223 35

Hình 3.14 Kết quả BLASTN của genome thực khuẩn thể M624 35

Hình 3.15 Kết quả BLASTN của genome thực khuẩn thể M625 36

Hình 3.16 Minh họa bộ gen của thể thực khuẩn và gen tương ứng được mã hóa (A) M223, (B) M624, (C) M625 39

Hình 3.17 Phân tích cây phát sinh loài của thực khuẩn thể và các thực khuẩn thể tương đồng dựa trên trình tự amino acid của Terminase large subunit (A) và Major capsid protein (B) Các trình tự được sắp gióng dùng phần mềm MAFFT và cây phát sinh loài được xây dựng dung phần mềm IQ-TREE sử dụng phương pháp Maximum Likelihood với giá trị bootstrap là 1000 40

Hình 3.18 Kết quả so sánh các trình tự genome của thực khuẩn thể với cơ sở dữ liệu của CARD 40

Hình 3.19 Kết quả tìm kiếm trên cơ sở dữ liệu của RAST 41

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các quốc gia có nghiên cứu phân lập các thể thực khuẩn xâm nhiễm Xoo 6 Bảng 2.2 Mối quan hệ giữa điểm chất lượng Q và xác suất lỗi 16

MỞ ĐẦU

Lúa gạo (Oryza sativa L.) là một trong những cây lương thực chính được tiêu thụ

bởi gần một nửa dân số thế giới, đóng một vai trò quan trọng trong sản xuất lương thực thế giới, đặc biệt là ở các nước châu Á [1] Do sự gia tăng dân số thế giới nên nhu cầu

về lúa gạo cũng tăng lên hàng năm Cây lúa lại dễ bị nhiễm một số bệnh làm giảm năng

suất nghiêm trọng Bệnh cháy bìa lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae là

một trong những bệnh gây thiệt hại lớn về năng suất lúa trên toàn thế giới và đe dọa đến

an ninh lương thực toàn cầu [2] Để chống lại bệnh nhiều biện pháp khác nhau đã được

sử dụng như sử dụng hóa chất - thuốc trừ sâu, chất kháng sinh và kiểm soát bằng tác nhân sinh học

Việc ứng dụng thực khuẩn thể (phage) như một phương pháp kiểm soát sinh học

có rất nhiều tiềm năng Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng sử dụng phage là phương pháp hữu ích để kiểm soát vi khuẩn gây bệnh trên thực vật, giảm thiểu việc sự dụng thuốc trừ sâu và hóa chất, hiệu quả ổn định lâu dài vì phage tồn tại lâu dài trong môi trường song song với mầm bệnh cần được kiểm soát Sự thành công của phương pháp sử dụng phage phụ thuộc lớn vào việc lựa chọn phage thích hợp với hoạt tính xâm nhiễm lên vật chủ mạnh; tính đặc hiệu trên vật chủ của một phage và các phage khác nhau cùng trên một loài vi khuẩn [3] Vì những lý do đó nên cần phải nghiên cứu để xác định thêm các mầm

bệnh vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae trên các quốc gia khác nhau và phân lập

các chủng thực khuẩn thể ở các môi trường đó, từ đó chọn lọc, thu được các phage thích hợp có hoạt tính xâm nhiễm mạnh, cho phép ứng dụng rộng rãi hơn Đã có các nghiên

cứu trên thế giới báo cáo về việc sử dụng thực khuẩn thể để kiểm soát vi khuẩn Xoo gây

bệnh cháy bìa lá lúa và thu kết quả khả thi [4] Tuy nhiên các báo cáo về genome phage

thực khuẩn thể xâm nhiễm Xanthomonas oryzae pv oryzae ở Việt Nam còn rất hạn chế

Do đó, tôi thực hiện nghiên cứu đánh giá “Hoạt tính xâm nhiễm và đặc điểm bộ

gene của thực khuẩn thể nhằm kiểm soát vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv Oryzae

gây bệnh cháy bìa lá lúa” để đánh giá hoạt tính xâm nhiễm và tính an toàn của của các

thực khuẩn thể, định hướng kiểm soát bệnh cháy bìa lá lúa do vi khuẩn trên cây lúa

Chương 1: TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Bệnh cháy bìa lá lúa

Bệnh cháy bìa lá lúa (bacterial blight of rice) hay còn gọi là bệnh bạc lá do vi khuẩn gây hại trên cây lúa, là một trong những loại bệnh gây hại thiệt hại nặng nề nhất đối với cây lúa Trong những đợt dịch bệnh nghiêm trọng nhất có thể giảm năng suất vụ mùa lên tới 75%, hàng năm có hàng triệu ha lúa bị nhiễm bệnh [5] Nguyên nhân gây bệnh được

mô tả lần đầu từ năm 1884 – 1885 ở Kyushu, Nhật Bản Tác nhân gây bệnh được xác

định là do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pathovar oryzae (gọi là Xoo), được định danh lần đầu tiên vào năm 1911 và đặt tên là Bacillus oryzae [6, 7] Mầm bệnh phát triển mạnh

trong môi trường ấm, ẩm ướt, bệnh cháy bìa lá lúa thường xuất hiện ở các vùng trồng lúa của châu Á , bờ biển tây Phi, Australia, Mỹ Latinh và vùng Caribe [8] Dấu hiệu của bệnh xuất hiện rõ ràng là những vệt giống như thấm nước lan rộng từ ngọn và mép lá, vết bệnh lớn dần và cuối cùng có màu trắng đục, khô lại thành màu vàng (Hình 1.1) Vào giai đoạn cuối của bệnh, các vết bệnh màu trắng xám đặc trưng xuất hiện trên lá, lá bị khô và dẫn đến chết cây Cây lúa non nhiễm bệnh lá sẽ khô và héo, hội chứng bệnh được gọi là kresek Cây non bị nhiễm bệnh thường chết trong vòng hai đến ba tuần sau khi bị nhiễm bệnh; cây trưởng thành vẫn có thể sống sót nhưng năng suất và chất lượng lúa sẽ

bị giảm mạnh

Riêng tại Việt Nam, bệnh xuất hiện và gây hại trên ruộng lúa trải dài từ miền Bắc tới miền Nam, nhất là các vùng trồng lúa quan trọng ở đồng bằng sông Cửu Long, do việc thâm canh từ lâu cùng với canh tác các giống cao sản và tác động của các yếu tố gây stress làm tăng tỷ lệ nhiễm bệnh Theo số liệu năm 2013, diện tích lúa bị nhiễm bệnh trên cả nước khoảng 135,4 nghìn ha Đến năm 2019, chỉ riêng diện tích lúa bị nhiễm bệnh của đồng bằng sông Cửu Long tới 50 – 60 nghìn ha gây thiệt hại nghiêm trọng cho người nông dân [9]

Hình 1.1. Các triệu chứng của bệnh cháy bìa lá lúa do vi khuẩn Xoo trên (a) ở cây lúa

trưởng thành; (b) ở trên luống ươm lúa; (c) ở cây lúa non [10]

Trong thời kỳ sinh trưởng, ruộng lúa luôn ngập nước, vi khuẩn Xoo có thể dễ dàng

lây nhiễm, vi khuẩn di chuyển trong môi trường nước từ cây bị nhiễm bệnh sang rễ và

lá của những cây lúa khỏe mạnh ở lân cận Yếu tố gió có thể giúp việc lây lan nhanh

chóng vi khuẩn Xoo sang các cánh đồng lúa khác Ngoài cây lúa, Xoo còn có thể lây nhiễm sang các cây khác như cỏ cắt lúa Leersia oryzoides, cỏ Leptochloa chinensis và nhiều loại cỏ dại thông thường khác Sau vụ mùa thu hoạch, Xoo vẫn có thể tồn tại trong

hạt lúa, rơm rạ, các thực vật khác, trong nước hoặc trong đất một thời gian ngắn Vi khuẩn có thể xuất hiện ở khắp nơi trong môi trường trồng lúa tự nhiên Vì thế, nhiều phương pháp khác nhau đã được phát triển để kiểm soát mầm bệnh từ trên đồng ruộng

nhưng các phương pháp phòng trừ bệnh vẫn còn có nhiều hạn chế Sử dụng hóa chất để kiểm soát không mang lại hiệu quả cao trong việc giảm thiểu bệnh cháy bìa lá lúa, mà còn mang lại các mối lo ngại về tính an toàn, có khả năng gây ô nhiễm môi trường, hiệu quả thực tiễn không cao và làm tăng khả năng kháng thuốc của vi khuẩn Phương pháp phổ biến nhất để chống lại bệnh này là lai tạo ra các giống lúa có chứa gen kháng nhiễm

Xoo Trên 30 gen kháng đã được tìm thấy trong cây lúa, chẳng hạn như gene Xa21 đã

được tích hợp vào bộ gen của nhiều dòng lúa thương phẩm Những giống lúa kháng bệnh này phần lớn đã thành công, giúp giảm đáng kể thiệt hại ở nhiều nước sản xuất lúa gạo Ngoài ra, những năm gần đây các phương pháp kiểm soát sinh học như ứng dụng thực khuẩn thể để bảo vệ, chống lại vi khuẩn gây bệnh cho cây lúa có thể làm giảm bệnh cháy bìa lá lúa, và được đánh giá là một phương pháp an toàn, có khả năng ứng kiểm soát rộng rãi [11]

1.2 Vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae

Vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae thuộc chi Xanthomonas là các vi khuẩn

hình que với hai đầu tròn với chiều dài từ 0,8 – 1 µm và chiều rộng từ 0,4 – 0,7 µm, có một tiên mao ở một đầu và có màng nhầy bao bọc Khuẩn lạc trên môi trường Growth Factor agar (GF) tròn, nhỏ, màu vàng và sáng bóng và trên mXOS các khuẩn lạc có màu

hồng hồng đặc trưng, sáng và nhầy (Hình 1.2) [10] Nhiệt độ phát triển tối ưu của Xoo

là từ 25 – 30oC và giới hạn nhiệt độ là từ 5 – 40oC [4, 12] Con đường xâm nhiễm chủ

yếu của Xoo vào trong cây lúa là thông qua các thủy khổng ở mép lá, các vết thương, khí

khổng hoặc từ hạt giống chứa mầm bệnh và nhân lên ở biểu mô trước khi tăng sinh mạnh trong mạch xylem và lan truyền khắp nơi trong cây và gây ra hiện tượng cháy lá [13]

Năng suất cây lúa nhiễm bệnh cháy bìa lá do Xoo giảm mạnh do hai nguyên nhân sau:

lá bị khô héo làm giảm diện tích lá xanh, giảm sự khả năng thu nhận ánh sáng; gây khô tắc mạch xylem làm giảm sự vận chuyển nước nên khả năng quang hợp của cây giảm

mạnh [14] Xoo có thể tồn tại trong đất khoảng hai tháng, trong nước khoảng 15 ngày hoặc

trên hạt giống hoặc rơm rạ Do đó, đây có thể là các nguồn lưu trữ và lan truyền mầm bệnh

từ vụ này qua vụ khác [14, 4] Vi khuẩn Xoo xâm nhiễm và gây bệnh cho tất cả các giai

đoạn sinh trưởng và phát triển của cây lúa từ giai đoạn cây non cho đến giai đoạn lúa chín, tuy nhiên bệnh đạt đỉnh và gây hại nặng nhất trong giai đoạn trổ bông Khi vi khuẩn xâm nhiễm và gây bệnh trong giai đoạn đẻ nhánh và giai đoạn ra hoa sẽ gây giảm mạnh năng suất [14, 12]

Hình.1.2 A: Khuẩn lạc của Xoo trên môi trường GF; B: khuẩn lạc của Xoo trên môi

trường thạch mXOS [10]

1.3 Nghiên cứu thực khuẩn thể lây nhiễm trên Xanthomonas oryzae pv oryzae

Một số thực khuẩn thể (phage) lây nhiễm Xoo đã được mô tả từ lâu, trước đây Wakimoto (1960) đã phân loại phage lây nhiễm Xoo thành hai loại OP1 và OP2, dựa

trên các đặc điểm về hình thái học Những năm gần đây các loại phage Xoo khác biệt về

mặt hình thái như: Xp10, Xp20 và Xp12 được phân lập ở Đài Loan, đã được giải trình

tự và phân tích sâu hơn [11] Các phage chỉ có thể lây nhiễm cho một loài vi khuẩn và không thể lây nhiễm các loài vi khuẩn khác, do có sự khác biệt trong các thụ thể bề mặt của

tế bào vi khuẩn Điều này là một lợi thế cho việc sử dụng phage như một phương pháp kiểm soát sinh học vi khuẩn gây bệnh mà không ảnh hướng đến các vi khuẩn có lợi khác Tuy nhiên việc sử dụng phage còn một số lo ngại về khả năng chuyển gen của phage, cho nên việc phân tích genome của phage để đảm bảo tính an toàn trước khi ứng dụng là rất cần thiết Thực khuẩn thể xuất hiện đa dạng trong nhiều môi trường khác nhau và một số loài

có khả năng kiểm soát các bệnh do vi khuẩn gây ra [15] Những năm gần đây, nhiều phương pháp khác nhau đã được nghiên cứu và phát triển để kiểm soát mầm bệnh bằng cách sử dụng một thực khuẩn thể đơn lẻ hoặc nhiều thực khuẩn thể [16] Hiện tại đang

có nhiều nghiên cứu trên thế giới để phân lập một phage mới trên Xoo (bảng 1.1) [17] Sử

đụng thực khuẩn thể có nhiều lợi thế để kiểm soát các bệnh do vi khuẩn cũng như ứng dụng vào các kỹ thuật công nghệ sinh học khác

Bảng 1.1 Các quốc gia có nghiên cứu phân lập các thể thực khuẩn xâm nhiễm Xoo

Trung Quốc Xoo-sp1,Xoo-sp2, Xoo-sp3,

Xoo-sp4

Siphoviridae

Trung Quốc X1, X2, X3, X4, X5 Myoviridae

Trung Quốc Xoo-sp14, Xoo-sp13 Myoviridae

Hàn Quốc P8L, P27L, P30L, P59L, P73L Siphoviridae

Phá hủy cấu trúc màng sinh học rất quan trọng trong kiểm soát khả năng gây bệnh của vi khuẩn Thực khuẩn thể X3 làm giảm 53% quá trình tổng hợp sản xuất

exopolysaccharide và giảm 43% sự tổng hợp màng sinh học ở vi khuẩn Xoo Phun phage

X3 lên lá và hạt lúa trước khi mầm bệnh xâm nhập làm tăng khả năng không bị bệnh lên

83,1% và 95,4% Phage X3 có phổ ký chủ rộng ( 22 trong số 23 chủng Xoo được thử

nghiệm) và thời gian tiềm tan dài 40 phút với hệ số nhân là 50 pfu/tế bào [18]

Nghiên cứu về phage lysin như một biện pháp kiểm soát sinh học cho các mầm

bệnh gây ra bởi Xanthomonas còn ít được nghiên cứu Một nghiên cứu đã chỉ ra rằng

phage lysozyme, Lys411, được mã hóa bởi bộ gen thực khuẩn thể ϕXo411 để kiểm

soát Xoo, có thể ly giải các chủng Xanthomonas , làm cho protein trở thành ứng cử viên

có tiềm năng kiểm soát các bệnh thực vật do Xanthomonas gây ra [19]

Sự lây nhiễm giữa phage - vi khuẩn gây ra những thay đổi phân tử trong đó có sự methyl hóa DNA, sự phosphoryl hóa quá trình phiên mã Khi xâm nhiễm vào vi khuẩn

Xoo, thực khuẩn thể Xp12 gây ra quá trình sinh tổng hợp bất thường ở base

5-methylcytosine, thay thế tất cả các gốc cytosine trong DNA của Xp12 Các base còn lại: adenine, thymine và guanine không thay đổi [20] Quá trình methyl hóa DNA tạo ra các đặc tính vật lý và hóa học độc đáo cho DNA của Xp12, làm giảm tỷ trọng, tăng nhiệt

độ nóng chảy của DNA Các tế bào vi khuẩn bị nhiễm phage Xp12 tạo ra một enzyme deoxycytidylate methyltransferase, xúc tác sự methyl hóa trực tiếp deoxycytidine monophosphate (dCMP) thành 5-methylcytosine, với sự hiện diện của axit tetrahydrofolic [21] Sự biến đổi phân tử này giống như cơ chế điều hòa đặc hiệu của phage trong quá trình xâm nhiễm

Phage Xp10 lây nhiễm lên Xoo đã gây nên sự bất hoạt hoàn toàn của RNA

polymerase vật chủ do sự phân ly của tiểu đơn vị δ khỏi lõi RNA polymerase của vật chủ Các nghiên cứu tiếp theo chỉ ra Xp10 hoàn nguyên quá trình phiên mã bằng cách

mã hóa yếu tố chống kết thúc p7, cho phép hình thành các bản sao RNA từ RNA polymerase của vật chủ [22]

Hầu hết các loại cây lương thực đều được nhân giống bằng hạt cho nên mầm bệnh trên hạt trước khi gieo trồng có ảnh hưởng rất lớn sức khỏe cây trồng Hạt giống được

xử lý sạch mầm bệnh làm giảm nguy cơ giảm năng suất do dịch bệnh do vi khuẩn gây

ra Trong thí nghiệm xác định khả năng của phage φXOF4 để để xử lý Xoo trên hạt lúa,

phage được thêm vào, thể thực khuẩn ngăn chặn sự phát triển của mầm bệnh, ly giải tế bào vi khuẩn trong vòng một giờ [3]

Phage φXOF4 ức chế sự phát triển của Xoo gây bệnh cháy bìa lá lúa [3] Tất cả cây

con được xử lý bằng φXOF4 ở nồng độ 1×10 8 pfu/ml không có biểu hiện bệnh, so với 73% bị nhiễm bệnh của nhóm không được xử lý Thực khuẩn thể φXOF4, lây nhiễm lên

6 chủng Xoo có thời gian tiềm ẩn ngắn từ 20 đến 30 phút, mật độ xử lý hiệu quả ở 1,8×10

7 pfu/ml Việc sử dụng phage được ưa chuộng vì khả năng kiểm soát hiệu quả lên các chủng gây bệnh và trì hoãn sự xuất hiện của các chủng kháng thuốc Các nghiên cứu ủng

hộ việc sử dụng phương pháp điều trị bằng “monophage” có thể có hiệu quả trong việc giảm hoặc loại bỏ bệnh [3]

Ứng dụng của thực khuẩn thể trong trong việc kiểm soát vi khuẩn Xoo đã được

quan sát bởi Zhaoxia Dong và cộng sự [23] Kết quả cho thấy hiệu quả kiểm soát tốt, ở

cây lúa được xử lý bằng phage Xoo-sp2 có chiều dài vết bệnh trung bình ở cây được xử

lý là 13,31 ± 1,69 cm nhỏ hơn rất nhiều so với nhóm đối chứng không được xử lý phage

là 20,83 ± 2,43 cm Phage Xoo-sp2 có phạm vi ký chủ rộng, 9/10 chủng Xanthomonas

oryzae pv oryzae, thời gian tiềm ẩn là 180 phút và hệ số nhân là 350 pfu/tế bào bị xâm

nhiễm Kết quả phân tích genome cho thấy vật chất di truyền của Xoo-sp2 là sợi đôi DNA với chiều dài 60 370 bp, trong đó có 79 orf (Open Reading Frame)

Khả năng bảo vệ chống lại bệnh ở thực vật của các phage đột biến không khác mấy

so với các phage hoang dã [21] Hỗn hợp phage đột biến (PMh; P4L, P43M, P23M1)

làm giảm bệnh cháy bìa lá lúa do vi khuẩn Xoo đến 18,1%, và hỗn hợp phage hoang dã

(PM; P4L, P43M và P23M1) làm giảm bệnh xuống 19,2%, so với 39,1% của nhóm không được xử lý phage Hóa chất nông nghiệp lại tỏ ra kém hiệu quả hơn thực khuẩn thể trong việc kiểm soát bệnh hại cây trồng, trong một thí nghiệm nghiên cứu trong nhà

kính kéo dài hai năm, phage DB1 đã chứng minh khả năng kiểm soát bệnh được cải thiện tới 71,1% trong khi thuốc trừ sâu gốc đồng là 59,1% [21]

1.4 Các phương pháp giải trình tự gene thế hệ mới

Những báo cáo đầu tiên về kỹ thuật giải trình tự gene thế hệ mới hay còn được gọi là giải trình tự gene thế hệ thứ hai (Next generation sequencing – NGS) đã bắt đầu

từ năm 2005 [24] Công nghệ giải trình tự gene thế hệ sử dụng khuếch đại song song và thời gian đọc giải trình tự ngắn hơn, cho tỷ lệ lỗi thô trung bình là 1% –1,5%, có ưu thế vượt trội về chi phí và thời gian so với phương pháp trước đây Hiện nay đang có 5 nền tảng công nghệ chính trên thị trường thế giới trong việc giải trình tự thế hệ mới, đã được phát triển đến từ các thương hiệu: Illumina, Roche 454, Solid, BGI và IonTorrent

Nền tảng 454 do Life Sciences phát triển, là công nghệ giải trình tự gene thế hệ mới đầu tiên được thương mại vào năm 2005, sử dụng kỹ giải trình tự pyrosequencing kết hợp với PCR nhũ tương Nền tảng này được ROCHE mua lại và đã ngưng phát triển vào năm 2014 do không thể cạnh tranh về dung lượng giải và giá thành với nền tảng của Illumina

Thứ hai là nền tảng do Solexa phát triển năm 2006 và được Illumina mua lại năm

2007, các hệ thống trên nền tảng của Illumina sử dụng phương pháp tổng hợp mạch kết hợp với reversible terminators để giải trình tự Đây là nền tảng giải trình tự thế hệ mới dẫn đầu hiện nay, sau nhiều cải tiến và phát triển hiện đang là công nghệ phổ biến nhất, chiếm đến 70% dữ liệu giải trình tự gene thế hệ mới

Nền tảng thứ 3 là Sequencing by Oligo Ligation Detection (SOLiD) do Applied Biosystems phát triển vào năm 2007 Nền tảng này giải trình tự bằng phản ứng gắn sử dụng enzyme ADN ligase để xác định trình tự đích Do giới hạn về kích thước chỉ có thể giải tối đa 75 bp và thời gian chạy từ 7 đến 14 ngày nên nền tảng này hiện không còn được ứng dụng rộng rãi

Nền tảng thứ 4 là DNA nanoball sequencing do Complete Genomics phát triển vào năm 2010 và được Beijing Genomics Institute (BGI) mua lại vào năm 2013 Nền

tảng này sử dụng các DNA nanoballs kết hợp với phản ứng Rolling circle replication để giải trình tự DNA

Và cuối cùng là nền tảng Ion Torrent do Life Sciences phát triển năm 2011 Nền tảng này sử dụng chip bán dẫn để đo giá trị protons giải phóng ra trong quá trình base mới được gắn vào khi tổng hợp mạch mới Mặc dù kích thước đoạn giải có thể lên đến

400 bp nhưng hệ thống này dễ sai sót khi giải những homopolymer

1.5 Công nghệ giải trình tự gene thế hệ mới của Illumina

Đề tài luận văn lựa chọn sử dụng nền tảng của Illumina để giải trình tự thực khuẩn thể Nguyên lý của hệ thống Illumina là sử dụng phương pháp tổng hợp mạch dùng các deoxynucloside triphosphate đánh dấu huỳnh quang (dNTP) Trong mỗi chu kỳ tổng hợp mạch, khi các deoxynucloside triphosphate đính kèm phân tử huỳnh quang gắn vào mạch mới sẽ phát ra tín hiệu quang và tạm dừng quá trình tổng hợp mạch Trong mỗi chu trình giải trình tự, một deoxynucloside triphosphate đánh dấu huỳnh quang (dNTP) được thêm vào phản ứng tổng hợp chuỗi acid nucleic Phân tử huỳnh quang của nucleotide đóng vai trò như một khóa dừng phản ứng polymer hóa, do đó, sau khi mỗi dNTP được tích hợp, màu huỳnh quang được ghi lại để xác định nucleotide và sau đó bị cắt bỏ để tổng hợp nucleotide tiếp theo Vì cả 4 loại dNTP gắn khóa dừng tổng hợp thuận nghịch có mặt đồng thời dưới dạng đơn phân tử, sự cạnh tranh ngẫu nhiên giúp giảm thiểu việc tổng hợp mất cân đối Việc xác định các base dựa vào cường độ tín hiệu đo được trong mỗi chu trình, giúp giảm thiểu các sai số thô so với công nghệ khác Kết quả cuối cùng là trình tự được đọc từng base một với độ chính xác cao, loại bỏ được các lỗi do đặc thù trình tự, cho phép quá trình giải trình tự mạnh mẽ trên toàn bộ genome, bao gồm các trình tự lặp lại Ở chu kỳ tiếp theo, enzyme sẽ phân cắt các phân tử huỳnh quang cho phép các nucleotide tiếp theo được gắn vào, các deoxynucloside triphosphate gắn huỳnh quang này được gọi là các reversible terminator

Khác biệt lớn nhất với kỹ thuật giải trình tự Sanger là thay vì giải trình tự một đoạn đơn lẻ, kỹ thuật này cho phép giải trình tự với một lượng lớn các đoạn DNA khác nhau song song tại cùng một thời điểm do đó tạo ra một lượng lớn thông tin dữ liệu Đặc

biệt, các hệ thống giải trình tự của Illumina sử dụng các deoxynucleotide triphosphate gắn huỳnh quang có khả năng thuận nghịch, từ đó tiết kiệm thời gian và cho lượng dữ liệu đầu ra vô cùng lớn so với phương pháp Sanger

Nguyên lý kỹ thuật giải trình tự theo phương pháp tổng hợp của Illumina gồm 4 bước chính sau:

 Chuẩn bị thư viện

 Nhân bản Cluster

 Giải trình tự

 Phân tích dữ liệu

Chuẩn bị thư viện: gDNA mẫu sẽ được phân cách thành các đoạn DNA mạch đơn,

sau đó chọn lọc các đoạn có kích thước phù hợp, xử lý gắn với các adapter đặc biệt ở cả hai đầu và có thể nhân bản hoặc không nhân bản tùy theo phương pháp tạo thư viện sử dụng để tạo thành thư viện cho việc giải trình tự

Adapter là các phân tử oligonucleotide ngắn được tổng hợp nhân tạo với trình tự xác định gồm các thành phần:

 Trình tự gắn: là các đoạn trình tự xác định có chức năng giúp các đoạn DNA mạch đơn gắn được vào bề mặt của flowcell (tấm kính được phân chia thành các rãnh (lane), trên bề mặt được cố định sẵn hai loại oligonucleotide bắt cặp với trình tự adapter)

Có hai loại trình tự gắn ký hiệu là P5 và P7 dùng gắn tương ứng với hai chiều của đoạn DNA mạch đơn

 Trình tự primer nhân bản: trình tự giúp cho enzyme DNA polymerase bám vào nhân bản tròn quá trình tạo thư viện

 Trình tự phân biệt (indexs): giúp giải trình tự đồng thời nhiều mẫu trong cùng lần giải, phân biệt giữa các mẫu khác nhau Có nhiều kiểu trình tự phân biệt khác nhau tùy theo kit giải trình tự sử dụng như chỉ sử dụng 1 trình tự phân biệt (i7) hoặc hai trình

tự phân biệt (i5 và i7) hoặc sử dụng kết hợp 3 trình tự phân biệt

Nhân bản Cluster: Thư viện sẽ được nạp vào flowcell, các đoạn DNA mạch đơn

sẽ lai với bề mặt của flowcell nhờ vào trình tự bổ sung của adapter với các

oligonucleotide đã gắn trên flowcell Mỗi đoạn DNA mạch đơn đã gắn trên flowcell sẽ được nhân bản tạo thành các cluster nhờ vào quá trình nhân bản bắc cầu

Quá trình nhân bản thường được thực hiện khoảng 35 chu kỳ tùy theo kit sử dụng để tạo thư viện Kết quả của quá trình nhân bản bắc cầu sẽ tạo thành các cụm trình tự (cluster) Các cụm trình tự các đọan DNA mạch đơn khác nhau của gDNA ban đầu được gọi là thư viện cho phản ứng giải trình tự

Mặc dù quá trình nhân bản bắc cầu tạo thành đoạn trình tự theo cả hai hướng 3’ và 3’-5’) nhưng quá trình giải trình tự chỉ có thể thực hiện theo một chiều tại một thời điểm Do đó, một mạch sẽ được loại bỏ (mạch chứa P7) để tạo thành cụm trình tự chỉ theo môt chiều, các vị trí còn lại trên flowcell sẽ được khóa lại sử dụng Terminal transferase [15]

(5’-Giải trình tự: Hoá chất giải trình tự bao gồm các deoxynucloside triphosphate đánh

dấu huỳnh quang (dNTP) và các hóa chất cần thiết khác được nạp vào flow cell Khi bắt đầu phản ứng tổng hợp giải trình tự, 4 loại deoxynucloside triphosphate đánh dấu huỳnh quang (dNTP) được đưa vào cùng lúc, khi sự bắt cặp của 1 trong 4 loại nucleotide xảy

ra, quá trình kéo dài sẽ tạm thời ngừng lại và tín hiệu quang tương ứng với từng loại nucleotide sẽ phát ra và được chụp lại bằng hệ thống camera độ phân giải cao, cuối chu

kỳ tổng hợp phân tử huỳnh quang sẽ được loại bỏ sẵn sàng cho chu kỳ tổng hợp tiếp theo Qua mỗi chu kỳ, hệ thống sẽ thu nhận chuỗi hình ảnh theo từng vị trí và chuyển đổi thành trình tự nucleotide tương ứng Chiều dài đoạn trình tự giải được cũng là số chu

kỳ tổng hợp máy có thể thực hiện, với các hệ thống của Illumina chiều dài sẽ dao động

từ 75 bp đến 300 bq tùy theo thư viện sử dụng

Phân tích dữ liệu: dữ liệu thô tạo ra từ máy sẽ được kiểm tra, xử lý, sắp gióng, lắp

ráp để tạo thành dữ liệu cuối cùng phục vụ cho các mục đích phân tích khác nhau

1.6 Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu chính của nghiên cứu là bổ sung dữ liệu quan trọng về đặc tính sinh học của thực khuẩn thể trong bộ sưu tập thuộc nhóm nghiên cứu Bộ môn Công nghệ sinh học, Trường Đại học Bách Khoa – Đại học Quốc Gia TPHCM và đánh giá tính an toàn

dựa trên phân tích genome, làm cơ sở cho việc tuyển chọn các dòng thực khuẩn thể trong ứng dụng kiểm soát bệnh cháy bìa lá lúa

Với mục tiêu trên, đề tài thực hiện các nội dung sau:

 Xác định hoạt tính xâm nhiễm của thực khuẩn thể

 Khảo sát khả năng kiểm soát vi khuẩn của thực khuẩn thể in vitro

 Xác định đặc điểm bộ gene thực khuẩn thể

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 VẬT LIỆU

Chủng vi khuẩn Xoo LA1+ được cung cấp bởi Khoa Nông nghiệp, Trường Đại học

Cần Thơ

Thực khuẩn thể được sử dụng trong nghiên cứu là M223, M624, M625 do nhóm nghiên cứu Bộ môn Công nghệ sinh học, Trường Đại học Bách Khoa – Đại học Quốc Gia TPHCM phân lập từ các mẫu lá lúa bệnh thu tại Đồng bằng Sông Cửu Long

Cơ sở dữ liệu thô của thực khuẩn thể M223, M624, M625 do nhóm nghiên cứu gửi

mẫu phân tích tại công ty KTEST (Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam)

Hóa chất, môi trường, thiết bị và dụng cụ: được trình bày tại phụ lục của luận văn

2.2 PHƯƠNG PHÁP

2.2.1 Xác định hoạt tính xâm nhiễm

Hoạt tính xâm nhiễm của phage được đánh giá qua các tiêu chí sau:

‐ Chu kì xâm nhiễm của phage: là khoảng thời gian tính từ khi một hạt phage bắt đầu xâm nhiễm tế bào vi khuẩn cho đến khi tế bào bị ly giải và các hạt phage mới được giải phóng

‐ Hệ số nhân: Số lượng hạt phage được giải phóng từ một tế bào bị xâm nhiễm Hệ số nhân được xác định tại thời điểm có sự gia tăng đột biến phage trong thời gian ngắn Phage được xem là có hoạt tính xâm nhiễm mạnh khi có thời gian một chu kì xâm nhiễm ngắn và số lượng phage giải phóng từ một tế bào bị xâm nhiễm lớn

2.2.2 Phương pháp xác định chu kỳ lây nghiễm

Bước 1: Chuẩn bị 10mL môi trường TSB để nuôi vi khuẩn, vi khuẩn được thêm

vào với nồng độ ban đầu là 5% v/v, lắc ổn nhiệt ở 30oC, 150 rpm tới khi đạt OD 600 = 0.1, với nồng độ vi khuẩn đã khảo sát trước là 2×107 CFU/mL ()

Bước 2: Khi mật độ vi khuẩn đạt yêu cầu, bổ sung Phage vào dịch nuôi cấy vi

khuẩn trên với hệ số MOI = 0.01 (Multiplicity of infection - Tỷ lệ giữa số lượng phage

và số lượng vi khuẩn) Lắc ổn nhiệt ở 30oC, 150 rpm trong 10 phút để phage xâm nhập vào vi khuẩn

Bước 3 Sau 10 phút tiến hành li tâm dịch nuôi cấy trên ở 12000 rpm trong 2 phút

Phần phage tự do chưa xâm nhiễm vi khuẩn nổi lên trên, vi khuẩn đã bị phage xâm nhiễm Phần dịch nổi được bảo quản ở 4oC, phần còn lại được hòa tan với môi trường và tiếp tục nuôi lắc ổn nhiệt ở 30oC, 150 rpm

Bước 4: Tại các mốc thời gian t ( phút ), với t = 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45,

50, 55, 60, 65… phút, hút 10 µL hỗn hợp đem pha loãng 100 lần với SM buffer lạnh Ly tâm dịch pha loãng trên ở 12000 rpm trong 2 phút rồi thu lấy 500 µL dịch nổi dùng để tiến hành phương pháp plaque assay để xác định mật độ thực khuẩn thể

Bước 5: Đếm số vòng sinh tan trên mỗi đĩa thạch Mỗi vòng sinh tan hình thành từ

một phage ban đầu ly giải một tế bào vi khuẩn, sau đó lan rộng khi phage nhân lên thông qua các tế bào lân cận Từ đó, xác định số lượng phage trong dịch nuôi cấy tại thời điểm

t

Bước 6: Sử dụng Microsoft Excel vẽ biểu đồ đường cong biến đổi số lượng phage/

số lượng tế bào vi khuẩn bị xâm nhiễm theo thời gian

Trong đó, tại MOI = 0.01 có thể xem một tế bào vi khuẩn bị xâm nhiễm bởi một hạt phage Do đó số lượng tế bào vi khuẩn bị xâm nhiễm tương đương với số lượng hạt phage xâm nhiễm tế bào, được tính bằng số lượng phage bổ sung ban đầu trừ cho số lượng phage có trong dịch nổi Hệ số nhân của phage (burst size, số phage được phóng thích ra từ một tế bào vi khuẩn nhiễm phage) được tính bằng số phage trung bình ở pha

ổn định trên đường cong sinh trưởng chia cho số lượng tế bào vi khuẩn bị xâm nhiễm Thời gian tiềm ẩn là điểm giao của đường thẳng số lượng phage thời điểm đầu với đường cong tăng bùng phát phage

2.2.3 Khảo sát khả năng kiểm soát vi khuẩn trong in vitro

Nguyên lý

Các tế bào vi khuẩn bị nhiễm và ly giải bởi phage Sau các khoảng thời gian ủ khác nhau, dung dịch chứa vi khuẩn được kiểm soát bởi phage trở nên trong suốt, ngược lại

vi khuẩn tăng sinh liên tục làm tăng độ đục Kết quả khảo sát sẽ chỉ ra khả năng phage

có hiệu quả trong việc kiểm soát vi khuẩn

Bố trí thí nghiệm

Bước 1: Chuẩn bị 4 bình môi trường TSB 50mL nuôi cấy vi khuẩn Xoo LA1+ ở

30°C với tốc độ 150 rpm cho đến khi OD600 là 0,1 (khoảng 2x107 CFU/ml)

Bước 2: Thêm từng loại phage vào bình nuôi vi khuẩn thỏa MOI là 2.0; một bình

dùng làm mẫu đối chứng không trộn với bất kỳ phage nào

Bước 3: Tiếp tục lắc 4 bình vi khuẩn đã thêm phage ở 30°C với tốc độ 150 rpm

Việc lấy mẫu được tiến hành mỗi giờ để đo OD600 Thí nghiệm được tiến hành lặp lại

Hệ thống Illumina sẽ cung cấp dữ liệu thô ở dạng file fastq với dữ liệu trình tự và điểm chất lượng trình tự (Q) cho từng vị trí nucleotide, thể hiện xác suất lỗi trong quá trình ấn định nucleotide Điểm chất lượng được tính toán sử dụng thuật toán tương tự như Pherd và được mã hóa bằng ký tự của bảng mã ASCII

Mối quan hệ giữa điểm chất lượng Q của hệ máy Illumina và xác suất lỗi trong quá trình ấn định nucleotide (bảng 2.1)

Bảng 2.2 Mối quan hệ giữa điểm chất lượng Q và xác suất lỗi

Điểm Q Xác suất lỗi trong quá

trình ấn định nucleotide

Độ chính xác tương ứng trong quá trình ấn định

nucleotide

kê cơ bản về dữ liệu

Sau đó dữ liệu thô sẽ được xử lý bằng phần mềm Trimmomatic v0.39 để loại bỏ các adapter, các trình tự có chất lượng <Q20 (nếu có)

Dữ liệu sau khi xử lý sẽ được đánh giá, kiểm tra lại chất lượng bằng phần mềm FastQC

Chỉ tiêu theo dõi

Các thông số thống kê cơ bản của dữ liệu như: số lượng trình tự (reads), số trình tự lỗi, khoảng kích thước của các trình tự và biểu đồ phân bố chất lượng trước và sau khi

Khi không có bất cứ dữ liệu trình tự tham chiếu trước cho việc lắp ráp cũng như nếu giải trình tự của loài sinh vật mới, ta sẽ phải dùng thuật toán máy tính để lắp ráp các

đoạn nhỏ tạo thành các contigs và scaffold gọi là lắp ráp de novo như trong trường hợp loài mới của thực khuẩn thể

Trong các thuật toán lắp ráp, phương pháp lắp rắp phổ biến hiện nay là lắp ráp dựa trên k-mer của trình tự dùng de Bruijn Graphs Phương pháp lắp ráp này cho hiệu quả lắp ráp cao, giảm sử dụng tài nguyên tính toán của hệ thống Phần mềm tiêu biểu sử dụng thuật toán trên cho các genome nhỏ của virus, vi khuẩn là phần mềm SPAdes do đại học

St Petersburg State University xây dựng

Bố trí thí nghiệm

Dữ liệu sau khi xử lý sẽ được lắp ráp, dùng phần mềm Unicycler 0.5.0 để thực hiện quá trình lắp ráp, bằng cách sử dụng tùy chọn “Chỉ lắp ráp Illumina” được xác định bởi Pilon, GenomicConsensus và FreeBayes, đồng thời đánh giá việc lắp ráp bằng ALE sử dụng các tham số mặc định

Unicycler hoạt động chủ yếu như một bộ tối ưu hóa SPAdes Nó cung cấp một số lợi ích so với việc chỉ sử dụng SPAdes

 Thử nhiều loại kích cỡ k-mer và tự động chọn loại phù hợp nhất

 Lọc ra các bộ phận có độ sâu thấp của cụm lắp ráp để loại bỏ tạp chất

 Áp dụng độ phân giải lặp lại SPAdes cho biểu đồ (trái ngược với các đường nét

bị ngắt kết nối trong tệp FASTA)

 Từ chối độ phân giải lặp lại có độ tin cậy thấp để giảm tỷ lệ lắp ráp sai

 Cắt bớt phần chồng chéo của đồ thị để các chuỗi không bị lặp lại khi các đường nối kết hợp với nhau

Chỉ tiêu theo dõi

Sau khi lắp ráp, tiến hành đánh giá các thông số genome đã lắp ráp bằng qualimap_v2.2.1, các thông số như:

 Chiều dài genome lắp ráp

 Tỉ lệ phần trăm trống (percent gaps) biểu diễn thông qua số nucleotide ‘N’: chỉ số này đánh giá độ hoàn thiện của genome

 Chỉ số N50: là giá trị mà tại đó có ít nhất một nửa số contig của hệ gen có chiều dài lớn hơn hoặc bằng giá trị đó Giá trị N50 dùng để đánh giá độ liên tục, toàn vẹn của các contig nhưng không đánh giá được độ chính xác của trình tự

 Độ bao phủ của genome: giá trị trung bình của số lần một vị trí nucleotide trong genome được giải trình tự Độ bao phủ giúp xác định các biến thể cũng như độ chính xác tại vị trí nucleotide

Chú giải cấu trúc

Nguyên lý và mục tiêu

Bước đầu tiên trong chú giải genome là xác định các thành phần cơ bản của genome và vị trí của chúng trong genome như: Coding sequence, các loại RNA (non-coding RNA, mRNA, rRNA, tRNA) … quá trình này được gọi là tiên đoán gene Có ba hướng tiếp cận hiện nay trong tiên đoán gene là ab initio, extrinsic và kết hợp Với hướng tiếp cận ab inito, những mô hình thống kê sẽ được xây dựng và tích hợp vào phần mềm,

sử dụng thuật toán để tiên đoán gene Với hướng tiếp cận extrinsic, phần mềm sẽ sử dụng thuật toán tìm kiếm sự tương đồng với các cơ sở dữ liệu đã có sẵn từ đó tiên đoán gene khi có sự tương đồng nhất định và cuối cùng là tích hợp cả hai hướng, phần mềm sẽ vừa

sử dụng cơ sở dữ liệu đã có để tìm kiếm sự tương đồng sau đó tiếp tục thực hiện tiên đoán gene ab inito

Hiện nay có nhiều phần mềm chú thích khác nhau, trong đó máy chủ RAST (Rapid Annotation using Subsystem Technology - Chú thích nhanh sử dụng công nghệ

hệ thống con) đã được phát triển để chú thích bộ gen của vi sinh vật từ năm 2008 RAST hoạt động bằng cách tìm kiếm so sánh các bộ gen được gửi đến máy chủ với các gen đã được chú giải và được quản lý từ cơ sở dữ liệu SEED Thuật toán của RAST có tính nhất quán và chính xác cao vì dữ liệu cấu trúc được chú thích cẩn thận trong SEED, được tổ chức thành các hệ thống con (tập hợp các trình tự có liên quan về mặt logic) [25] Đến nay hệ thống máy chủ của RAST vẫn luôn được cập nhật thêm dữ liệu và đã trở thành một trong những nguồn phổ biến nhất cho việc chú thích bộ gen của vi sinh vật

Bố trí thí nghiệm

Genome thực khuẩn thể sau khi lắp ráp được chú giải cấu trúc sử dụng Rast version 2.0 (https://rast.nmpdr.org/) với thông số mặc định

Chỉ tiêu theo dõi

Kết quả mong muốn là dữ liệu cấu trúc và vị trí các thành phần trong genome Ngoài ra là tập hợp các file:

• gff3: File dữ liệu về vị trí các CDS

• fna: File chứa dữ liệu các thành phần ở dạng trình tự nucleotide

• faa: File chứa dữ liệu các thành phần ở dạng trình tự protein

Do đó việc chú giải chức năng gồm 2 phần chính là sử dụng các công cụ tìm kiếm tương đồng để xác định sự tương đồng của các trình tự protein trong genome thực khuẩn thể với trình tự protein trên cơ sở dữ liệu hiện có như NCBI, UniProtKB và công cụ tìm kiếm các vùng vùng chức năng (motif), domain, family của protein như NCBI Conserved Domains Database

Bố trí thí nghiệm

Sử dụng công cụ BLASTP trên web server của NCBI với giá trị e-value cut off là 0.001 để tìm kiếm tương đồng với cơ sở dữ liệu NCBI non-redundant nucleotide database, công cụ phmmer trên web server của EBI-ENA với giá trị e-value cut off là 0.001 để tìm kiếm trên cơ sở dữ liệu UniProtKB, InterPro, Pfam và web server của NCBI để tìm kiếm các motif trên NCBI Conserved Domains Database

Chỉ tiêu theo dõi

Xác định các protein chức năng, protein cấu trúc, domain của hệ protein trong genome

Phân tích cây phát sinh loài

Nguyên lý và mục tiêu

Việc xây dựng cây phát sinh loài giúp cho thấy lịch sử tiến hóa cũng như mối quan

hệ họ hàng giữa các loài cùng nhóm, với sự đa đạng của thực khuẩn thể trong tự nhiên, việc xây dựng cây phát loài còn giúp xác định các loài thực khuẩn thể mới Để xây dựng cây phát loài người ta thường dựa vào trình tự của các vùng bảo tồn Với thực khuẩn thể, phổ biến là sử dụng trình tự amino acid của terminase large subunit (terL) và major capsid protein (MCP) để xây dựng cây phát loài do đây là vùng bảo tồn

Mặc dù vậy, hai vùng terL và MCP vẫn không có mặt ở tất cả loài thực khuẩn thể

và hiện nay cũng chưa tìm thấy vùng gene nào có mặt ở tất cả thực khuẩn thể Do đó cần

sử dụng thêm các phương pháp khác để hỗ trợ xây dựng phát sinh loài của thực khuẩn thể Bên cạnh đó nhờ vào sự phát triển mạnh mẽ của kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới, rất nhiều genome của thực khuẩn thể đã được giải hoàn chỉnh dẫn đến hướng tiếp cận mới trong việc phân loại là dựa trên hệ thống mạng lưới, cách phân loại này sử dụng toàn bộ

hệ protein và genome để đánh giá mối tương quan giữa các thực khuẩn thể

Bố trí thí nghiệm

Sử dụng hai protein bảo tồn trong genome thực khuẩn thể là terminase large subunit (terL) và major capsid protein (MCP) để xây dựng cây phát sinh loài với các loài thực khuẩn thể tương đồng nhất (sử dụng BLASTP để xác định các thực khuẩn thể tương đồng nhất) Các trình tự sẽ được sắp gióng dùng MAFTT và xây dựng cây phát sinh loài dùng phương pháp Maximum Likelihood với giá trị bootstrap là 1000 và được minh hoạt

sử dụng IQ-TREE

Chỉ tiêu theo dõi

Cây phát sinh trên hai protein terL và MCP của thực khuẩn thể và mối liên hệ trong mạng lưới các thực khuẩn thể hiện tại

Tính an toàn của thực khuẩn thể

• Gene giúp thực khuẩn thể tích hợp gene vào vi khuẩn

Chỉ tiêu theo dõi

Tính an toàn của thực khuẩn thể khi ứng dụng thực tế

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Hình thái của thực khuẩn thể

Vòng sinh tan cho thấy sự ly giải của thực khuẩn thể lên vi khuẩn Xoo ở trong

vòng sinh tan Cả ba thực khuẩn thể đều có kích thước vòng sinh tan 1 – 2 mm (hình 3.1)

Hình 3.1 Vòng sinh tan của ba chủng thực khuẩn thể: A M223; B M624; C M625

Từ các hình ảnh TEM thu được, cả ba thể thực khuẩn được xếp vào họ Siphoviridae

có đuôi dài và không co [26] (hình 3.2)

Hình 3.2 Hình thái của các chủng thực khuẩn thể được quan sát qua hình chụp TEM

A M223; B M624; C M625

3.2 Hoạt tính xâm nhiễm

Thực khuẩn thể được xem là có hoạt tính xâm nhiễm mạnh khi có thời gian một chu kỳ xâm nhiễm ngắn và số lượng thực khuẩn thể sinh ra từ một tế bào vi khuẩn lớn Đây được xem là một trong những tiêu chí để chọn lọc thực khuẩn thể thích hợp trong việc kiểm soát vi khuẩn gây bệnh Thực hiện khảo xát hoạt tính xâm nhiễm của thực khuẩn thể M223, M624, M625 để thấy được chu kỳ xâm nhiễm và hệ số nhân của các thực khuẩn thể

Cả 3 thực khuẩn thể M223, M624, M625 đều có thời gian tiềm ẩn tương đối ngắn

từ 25 đến 35 phút và hệ số nhân lần lượt là 13 ± 2, 16 ± 3, 28 ± 5 (hình 3.3; 3.4; 3.5)

Hình 3.3 Sự thay đổi số lượng thực khuẩn thể M223 xâm nhiễm vi khuẩn Xoo

LA1+ theo thời gian Kích thước ly giải của phage M223 là khoảng 13 ± 2 thực khuẩn thể trên mỗi tế bào bị xâm nhiễm, thời gian tiềm ẩn khoảng 25 - 30 phút Các thanh Error bars biểu thị khoảng tin cậy 95% cho các giá trị trung bình (n = 3)

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

Hình 3.4.Sự thay đổi số lượng thực khuẩn thể M624 xâm nhiễm vi khuẩn Xoo

LA1+ theo thời gian Kích thước ly giải của phage M624 là khoảng 16 ± 3 thực khuẩn thể trên mỗi tế bào bị xâm nhiễm, thời gian tiềm ẩn khoảng 30 – 35 phút Các thanh Error bars biểu thị khoảng tin cậy 95% cho các giá trị trung bình (n = 3)

Hình 3.5 Sự thay đổi số lượng thực khuẩn thể M625 xâm nhiễm vi khuẩn Xoo

LA1+ theo thời gian Kích thước ly giải của phage M625 là khoảng 28 ± 5 thực khuẩn thể trên mỗi tế bào bị xâm nhiễm, thời gian tiềm ẩn khoảng 30 – 35 phút Các thanh Error bars biểu thị khoảng tin cậy 95% cho các giá trị trung bình (n = 3)

0 5 10 15 20

3.3 Khả năng kiểm soát vi khuẩn trong in vitro

Để đánh giá khả năng kiểm soát vi khuẩn Xoo của thực khuẩn thể, chúng tôi đã thực hiện thử nghiệm ức chế sự phát triển của vật chủ Vi khuẩn Xoo LA1+ được nuôi

cấy trong môi trường dinh dưỡng lỏng TSB đến khi đạt mật độ 2.107CFU/ml(OD600 = 0.1) rồi được thêm vào thực khuẩn thể để đánh giá khả năng ức chế tăng trưởng của vi

khuẩn Sự tăng trưởng của vi khuẩn Xoo trong môi trường TSB lỏng bị ức rõ ràng khi

xử lý bằng ba chủng thể thực khuẩn thể (Hình 3.1.)

Sự phát triển của vi khuẩn bị ức chế sau 3 – 4 giờ từ khi thêm vào thực khuẩn thể

và môi trường nuôi cấy trở nên trong suốt sau 7 - 8 giờ Môi trường nuôi cấy duy trì trong suốt 48 giờ Ở giai đoạn 1 – 2 giờ đầu, số lượng thực khuẩn thể chưa đủ để lây nhiễm kiểm soát vi khuẩn, mật độ vi khuẩn trong khoản thời gian này vẫn tăng lên Sau

3 – 4 giờ lượng phage đủ lớn để lây nhiễm kiểm soát vi khuẩn, số lượng tế bào vi khuẩn

bị ly giải nhiều hơn tế bào mới sinh ra, mật độ vi khuẩn giảm, giá trị OD600 đo được giảm Kết quả đều cho thấy 3 thực khuẩn thể M223, M624, M625 đều có khả năng kiểm

soát vi khuẩn Xoo tốt trong môi trường in vitro, vi khuẩn không huyền phù trở lại trong

suốt thời gian thí nghiệm

Hình 3.6 Ảnh hưởng của ba thể thực khuẩn thể M223, M624, M625 đến sự phát triển của Xoo LA1+ trong môi trường TSB lỏng Mật độ tế bào của môi trường nuôi cấy

được theo dõi bằng cách đo OD600 Các thanh Error bars biểu thị khoảng tin cậy 95% cho các giá trị trung bình (n = 3)

3.4 Đặc điểm genome của thực khuẩn thể:

3.4.1 Kiểm tra và xử lý dữ liệu thô

Dữ liệu giải trình tự của của mỗi phage M223, M624, M625 gồm 2 file tương ứng với hai chiều đọc của quá trình giải trình tự Kết quả sau xử lý cho thấy M223, M624, M625 có cả hai chiều đều có tổng số trình tự lần lượt là 364436, 46240, 381527 trình tự, không có trình tự gắn cờ là chất lượng thấp, độ dài các trình tự dao động đều trong khoảng 35-151 bp với %GC trung bình là 60 hoặc 61