Khảo sát tác dụng giảm đau, hạ sốt, kháng viêm của các cao chiết từ lá sa sâm nam ( launaea sarmentosa ( willd ) sch bip ex kuntze )

OVLT Organum vasculosum laminaeterminalis Cơ quan chứa đựng mạch máucủa phiến tận cùng PAF Platelet-activating factor Yếu tố hoạt hóa tiểu cầu PAMP Pathogen-associated molecular PMN P

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS TS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG

LỜI CAM ĐOAN

Tôi tên là Đào Trần Mộng, học viên khóa 2019 – 2021 Trường Đại học Ydược Thành phố Hồ Chí Minh, chuyên ngành Dược lý và Dược lâm sàng, xin camđoan:

1 Đây là luận văn do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫncủa PGS TS Nguyễn Thị Thu Hương

2 Công trình này không trùng lắp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đãcông bố tại Việt Nam

3 Các số liệu trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung thực vàkhách quan, đã được xác nhận và chấp thuận của cơ sở nghiên cứu.Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về những cam kết này

Tp Hồ Chí Minh, ngày 15 tháng 10 năm 2021

Người viết cam đoan

(Ký và ghi rõ họ tên)

Đào Trần Mộng

Luận văn thạc sĩ dược học – Khóa: 2019 – 2021 Ngành Dược lý và Dược lâm sàng – Mã số 87202075 KHẢO SÁT TÁC DỤNG GIẢM ĐAU, HẠ SỐT, KHÁNG VIÊM CỦA

CÁC CAO CHIẾT TỪ LÁ SA SÂM NAM Học viên: Đào Trần Mộng

Người hướng dẫn: PGS TS Nguyễn Thị Thu Hương

Sa sâm nam đã được sử dụng theo truyền thống như là một thuốc thảo dượccho nhiều bệnh như vàng da, lợi tiểu, lọc máu và có hoạt tính bảo vệ gan Nghiêncứu đã khảo sát sự hiện diện và xác định hàm lượng polyphenol trong lá và caochiết nước (ALS), cao chiết ethanol 45% (ELS) sa sâm nam Thêm vào đó, nghiêncứu cũng khảo sát tác dụng của ALS và ELS trong thực nghiệm xoắn bụng do acidacetic, thực nghiệm gây sốt bởi nấm men và thực nghiệm viêm cấp gây bởicarrageenan Kết quả sắc ký lớp mỏng và định lương cho thấy trong lá, ALS, ELS

có chứa polyphenol (Rf 0,36 và 0,14) và hàm lượng polyphenol lần lượt là 14,6,47,88, 64,20 mg GAEs/g mẫu Liều an toàn của các cao chiết từ lá sa sâm nam đượcchọn tương đương 1,25 g và 2,5 g dược liệu/kg thể trọng chuột Kết quả cho thấyALS và ELS ở các liều tương ứng 0,6 g/kg, 1,2 g/kg và 0,54 g/kg, 1,08 g/kg có tácdụng giảm đau bằng cách làm giảm trung bình số lần xoắn bụng ở chuột Ngoài ra,

ALS và ELS ở các liều tương ứng 0,6 g/kg, 1,2 g/kg và 0,54 g/kg, 1,08 g/kg cũng

thể hiện tác dụng hạ sốt thông qua giảm nhiệt độ trực tràng chuột và tác dụng khángviêm thông qua giảm thể tích chân chuột Nghiên cứu đã chứng minh tác dụng giảmđau, hạ sốt, kháng viêm của các cao chiết từ lá sa sâm nam trên các mô hình chuột

bị đau, sốt, viêm

Từ khóa: lá sa sâm nam, tác dụng giảm đau, tác dụng hạ sốt, tác dụng khángviêm

Final assay for the Master of Pharmacology – Course: 2019 – 2021 Specialization: Pharmacology and Clinical Pharmacy – Code: 8720205 ANALGESIC, ANTI-PYRETIC AND ANTI-INFLAMMATORY

EFFECTS OF THE EXTRACTS FROM LAUNAEA SARMENTOSA LEAVES

Student: Dao Tran Mong

Supervisor: Assoc Prof PhD Nguyen Thi Thu Huong

Launaea sarmentosa (Willd.) Sch - Bip Ex Kuntze has been traditionallyused as a folk herbal remedy for many diseases such as jaundice, diuretic, bloodpurifier, and hepatoprotective action The study investigated the presence anddetermined the content of polyphenol of the material and the aqueous and 45 %ethanol extract from L sarmentosa leaves In addition, the study also investigatedthe effects of the aqueous and 45 % ethanol extract from L sarmentosa leaves (ALSand ELS) in acetic acid-induced writhing test, Brewer’s yeast-induced pyrexia test,and carrageenan-induced hind paw edema test The result of thin-layerchromatography and quantitative determination showed that the leaves of L sarmentosa, ALS, and ELS contained polyphenol (Rf 0.36 and 0.14) and amount ofpolyphenol compounds 14.6, 47.88, 64.20 mg GAEs/g extract respectively The oraldoses of L sarmentosa leaf extracts were chosen in equivalent to 1.25 g and 2.5 g ofraw materials/kg mouse body weight The results showed that ALS and ELS atrespective doses of 0.6 g/kg, 1.2 g/kg, and 0.54 g/kg, 1.08 g/kg had an analgesiceffect by reducing the number of writhing In addition, ALS and ELS at respectivedoses of 0.6 g/kg, 1.2 g/kg, and 0.54 g/kg, 1.08 g/kg also expressed antipyreticeffect by reducing the rectal temperature and anti-inflammatory effect by reducingthe inflamed hind paw volume The study demonstrated the analgesic, antipyreticand anti-inflammatory effects of aqueous and ethanol extracts from L sarmentosa leaves on mouse models of pain, fever, and inflammation

Keywords: Launaea sarmentosa Leaves, Analgesic effect, Antipyretic effect,

Anti-inflammatory effect

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

MỤC LỤC iv

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH MỤC CÁC BẢNG ix

DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ xi

MỞ ĐẦU 1

Mục tiêu nghiên cứu 2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về sa sâm nam 3

1.1.1 Phân loại thực vật 3

1.1.2 Đặc điểm hình thái, công dụng 4

1.1.3 Thành phần hóa học 4

1.1.4 Tình hình nghiên cứu 5

1.1.5 Một số sản phẩm trên thị trường 6

1.2 Đau, sốt, viêm và một số mô hình thực nghiệm 7

1.2.1 Đau 7

1.2.2 Sốt 12

1.2.3 Viêm 17

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.1 Nguyên liệu 27

2.2 Động vật thử nghiệm 27

2.3 Thiết bị, dụng cụ - hóa chất 27

2.3.1 Thiết bị, dụng cụ 27

2.3.2 Hóa chất 28

2.4 Phương pháp nghiên cứu 29

2.4.1 Chiết xuất dược liệu 29

2.4.2 Thử tinh khiết 30

2.4.3 Định tính hợp chất polyphenol 31

2.4.4 Định lượng polyphenol tổng bằng phương pháp UV-Vis 31

2.4.5 Xác định liều an toàn cho các thử nghiệm 32

2.4.6 Khảo sát tác dụng giảm đau trên thực nghiệm gây xoắn bụng bởi acid acetic (Acetic acid-induced writhing test) 33

2.4.7 Khảo sát tác dụng hạ sốt trên thực nghiệm gây sốt bởi nấm men (Brewer’s Yeast) 34 2.4.8 Khảo sát tác dụng kháng viêm 34

2.4.9 Khảo sát tác động ức chế myeloperoxidase trên cao chiết tiềm năng 36

2.4.10.Phương pháp đánh giá kết quả 36

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 37

3.1 Chiết xuất cao 37

3.2 Thử tinh khiết 37

3.2.1 Mất khối lượng do làm khô 37

3.2.2 Độ tro 37

3.3 Định tính hợp chất polyphenol 38

3.3.1 Định tính bằng phản ứng màu 38

3.3.2 Định tính bằng sắc ký lớp mỏng 39

3.4 Định lượng polyphenol tổng bằng phương pháp UV – Vis 40

3.4.1 Kết quả xây dựng đường chuẩn 40

3.4.2 Kết quả định lượng polyphenol tổng trên bột dược liệu và cao chiết sa sâm nam 41 3.5 Liều an toàn cho các thử nghiệm 42

3.6 Tác dụng giảm đau trên thực nghiệm xoắn bụng gây bởi acid acetic 43

3.6.1 Liều duy nhất 43

3.6.2 Liều lặp lại trong 7 ngày 45

3.6.3 So sánh tác dụng giảm đau trên thực nghiệm xoắn bụng gây bởi acid acetic liều duy nhất và lặp lại 7 ngày uống cao chiết sa sâm nam 47

3.7 Tác dụng hạ sốt trên thực nghiệm gây sốt bởi nấm men 47

3.8 Tác dụng kháng viêm 49

3.8.1 Tác dụng kháng viêm in vitro bằng phương pháp ổn định màng tế bào 49

3.8.2 Tác dụng kháng viêm cấp trên thực nghiệm carrageenan 51

3.9 Chọn cao chiết tiềm năng 53

3.10 Tác động ức chế myeloperoxidase của cao chiết tiềm năng 54

3.10.1.Khảo sát tác động ức chế myeloperoxidase tại các thời điểm 54

3.10.2.Tác động của cao chiết nước sa sâm nam trên hoạt tính myeloperoxidase 54

Chương 4 BÀN LUẬN 56

4.1 Thử tinh khiết, định tính, định lượng hợp chất polyphenol 56

4.2 Tác dụng giảm đau 58

4.3 Tác dụng hạ sốt 61

4.4 Tác dụng kháng viêm 62

4.5 Tác dụng ức chế hoạt tính myeloperoxidase 66

4.6 Bàn luận chung 66

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 68

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ 69

TÀI LIỆU THAM KHẢO 70

PHỤ LỤC i

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

CAM Cellular adhesion molecule Phân tử kết dính tế bào

CD31 Cluster of differentiation-31 Cụm biệt hóa 31

ED50 Effective Dose 50 Liều hữu hiệu trung bình

GOT Glutamic-oxaloacetic

GPT Glutamic-pyruvic Transaminase Enzym GPT

HTAB Hexadecyltrimethylammonium

bromide

Hexadecyltrimethylammoniumbromid

IASP The International Association for

the Study of Pain

Hiệp hội nghiên cứu đau Quốctế

ICAM-1 Intercellular adhesion molecule-1 Phân tử kết dính liên bào -1

IL-6R Membrane-bound receptor Thụ thể gắn với màng

iNOS Inducible nitric oxide synthase Enzym NO cảm ứng

NSAIDs Non-steroidal anti-inflammatory

drug

Thuốc chống viêm khôngsteroid

OVLT Organum vasculosum laminae

terminalis

Cơ quan chứa đựng mạch máucủa phiến tận cùng

PAF Platelet-activating factor Yếu tố hoạt hóa tiểu cầu

PAMP Pathogen-associated molecular

PMN Polymorphonuclear neutrophils Bạch cầu đa nhân trung tính

sIL-6R Soluble isoforms of the interleukin

6 receptor

Các isoform tan của thụ thểinterleukin 6

SOCS Suppressor of cytokine signaling Chất ức chế tín hiệu cytokin

STAT Signal transducer and activator of

transcription

Chất chuyển tín hiệu và kíchhoạt phiên mã

TLR-4 Toll-like receptor Thụ thể Toll-like

TMB 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidinTNF-α Tumor necrosis factor α Yếu tố hoại tử khối u α

VCAM-1 Vascular cell adhesion molecule-1 Phân tử kết dính tế bào mạch -1WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Danh sách thiết bị, dụng cụ sử dụng trong thực nghiệm 27

Bảng 2.2 Danh sách hóa chất, thuốc thử sử dụng trong nghiên cứu 28

Bảng 2.3 Bố trí thí nghiệm 33

Bảng 2.4 Bố trí thí nghiệm 34

Bảng 3.1 Hiệu suất chiết cao 37

Bảng 3.2 Mất khối lượng do làm khô của dược liệu và cao chiết sa sâm nam 37

Bảng 3.3 Độ tro dược liệu sa sâm nam 37

Bảng 3.4 Độ tro toàn phần cao chiết nước và cao chiết ethanol 45% sa sâm nam 38

Bảng 3.5 Độ hấp thu của chất chuẩn acid gallic ở các nồng độ khác nhau 40

Bảng 3.6 Độ hấp thu tại bước sóng 760 nm và hàm lượng polyphenol tổng được

biểu diễn theo mg đương lượng acid gallic trong 1 g mẫu 41

Bảng 3.7 Kết quả độc tính cấp đường uống cao chiết ethanol 45% sa sâm nam 42

Bảng 3.8 Tác dụng giảm đau của các cao chiết sa sâm nam trên thực nghiệm xoắn bụng gây bởi acid acetic liều duy nhất 43

Bảng 3.9 Tác dụng giảm đau của các cao chiết sa sâm nam trên thực nghiệm xoắn bụng gây bởi acid acetic liều duy nhất theo các thời điểm 44

Bảng 3.10 Tác dụng giảm đau của các cao chiết sa sâm nam trên thực nghiệm xoắn bụng gây bởi acid acetic sau 7 ngày uống 45

Bảng 3.11 Tác dụng giảm đau của các cao chiết sa sâm nam trên thực nghiệm xoắn bụng gây bởi acid acetic sau 7 ngày uống tại các thời điểm 46

Bảng 3.12 Tác dụng hạ sốt các cao chiết sa sâm nam trên thực nghiệm gây sốt bởi nấm men 47

Bảng 3.13 Phần trăm ức chế cơn sốt của các cao chiết sa sâm nam trên thực nghiệm gây sốt bởi nấm men 49

Bảng 3.14 Hoạt tính ổn định màng tế bào của các cao chiết sa sâm nam 50

Bảng 3.15 Mức độ phù chân chuột trong thử nghiệm tác dụng kháng viêm cấp của các cao chiết sa sâm nam 52

Bảng 3.16 Phần trăm ức chế phù chân chuột so với lô chứng trong thử nghiệm tácdụng kháng viêm của các cao chiết sa sâm nam 53Bảng 3.17 Tổng hợp kết quả thực nghiệm và lựa chọn cao chiết tiềm năng 53Bảng 3.18 Khảo sát hoạt tính MPO tại các thời điểm 6 giờ và 24 giờ sau tiêmcarrageenan 54Bảng 3.19 Tác động của cao chiết nước sa sâm nam trên hoạt tính MPO 55

DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ

Hình 1.1 Mẫu tươi và bột lá khô sa sâm nam 4

Hình 1.2 Một số sản phẩm từ sa sâm nam 7

Hình 1.3 Sinh bệnh học của đau 10

Hình 1.4 Sinh bệnh học của sốt 12

Hình 1.5 Con đường gây sốt bởi chất gây sốt 16

Hình 1.6 Nguyên nhân gây viêm 17

Hình 1.8 Các loại viêm 18

Hình 1.9 Các ảnh hưởng của viêm trên hệ thống cơ thể 19

Hình 1.10 Các thành phần quá trình gây viêm 21

Hình 1.11 Sinh học bạch cầu trong đáp ứng với tổn thương và viêm 25

Hình 3.1 Phản ứng màu đặc trưng của polyphenol mẫu dược liệu và các cao chiết sa sâm nam 39

Hình 3.2 Bản sắc ký lớp mỏng của bột dược liệu, cao chiết nước, cao chiết ethanol 45 % sa sâm nam và chấm trùng 40

Hình 3.3 Đường hồi quy biểu diễn mối liên hệ giữa OD và nồng độ acid gallic 41

Hình 3.4 Biểu đồ cột thể hiện tác dụng giảm đau trên thực nghiệm gây đau bởi acid acetic liều duy nhất và sau 7 ngày uống cao chiết sa sâm nam 47

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 29

MỞ ĐẦU

Năm 2015, Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ khuyến cáo việclạm dụng các thuốc giảm đau mạnh đã trở nên phổ biến, nhưng lại kèm theo nhiềutác dụng phụ nguy hiểm, như nguy cơ bệnh tim và đột quỵ Thuốc giảm đau, hạ sốt,kháng viêm được sử dụng nhiều trên đối tượng người cao tuổi trong điều trị cácbệnh cơ xương khớp Trước đây, thoái hóa khớp thường gặp ở những người từ 50tuổi trở lên do quá trình lão hóa tự nhiên, nhưng hiện nay, thống kê cho thấy, tìnhtrạng thoái hóa khớp ngày càng trở nên phổ biến ở người mới 35 tuổi, thậm chí trẻ

hơn Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization - WHO) coi thập niên

2011-2020 là “Thập niên của bệnh lý xương và khớp” Theo đó, WHO cũng xếpViệt Nam vào nhóm các nước có tỷ lệ dân số mắc bệnh xương khớp cao nhất thếgiới Trước thực trạng đó, việc tìm ra phương pháp hoặc thuốc điều trị mới theohướng đảm bảo hiệu quả điều trị lâu dài, có tính an toàn và hạn chế tối thiểu tácdụng phụ là vô cùng cần thiết

Sa sâm nam, có tên khoa học là Launaea sarmentosa (Willd.) Sch - Bip ex Kuntze hay Launaea pinnatifida Cass., thuộc họ Asteraceae. Nhiều cây trong họnày đã được dùng trong y học dân tộc với các tác dụng như giảm đau dạ dày, điềutrị tiêu chảy, các bệnh đường tiêu hóa, kháng viêm, điều trị các bệnh ngoài da, vếtthương nhiễm trùng, các tổn thương gan, sốt ở trẻ em, có tác dụng gây ngủ và lợi

tiểu Sa sâm nam là một trong mười cây của chi Launaea Cass đã được nghiên cứu

về thành phần hóa học, cụ thể là các hợp chất thứ cấp bao gồm terpenoid, steroid,triterpenoid, sesquiterpen lacton, coumarin, flavonoid, flavon glycosid và các hợpchất phenol [8]

Hiện nay thế giới vẫn chưa có nhiều nghiên cứu về sa sâm nam Riêng tạiViệt Nam, nghiên cứu của Le Thi Them và cộng sự đã xác định được sự hiện diệncủa các hợp chất flavonoid, saponin, alkaloid, tannin và steroid, tiềm năng khángoxy hóa (IC50 24,15 µg/ml trong thực nghiệm DPPH) và hoạt tính ức chế α –glucosidase (IC50 67,09 µg/ml) [41] Cho đến nay, tại nước ta vẫn chưa có nhiều đềtài nghiên cứu về các tính năng dược lý của loài cây này Do đó, đề tài “Khảo sát tác

dụng giảm đau, hạ sốt, kháng viêm của các cao chiết từ lá sa sâm nam (Launaea

sarmentosa (Willd.) Sch - Bip ex Kuntze)” được thực hiện nhằm chứng minh giá

trị của cây thuốc và tạo cơ sở cho việc phát triển sản phẩm từ sa sâm nam trồng tạiViệt Nam

Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu tổng quát

Xác định cao chiết tiềm năng từ lá sa sâm nam (Launaea sarmentosa

(Willd.) Sch - Bip ex Kuntze) có tác dụng giảm đau, hạ sốt, kháng viêm

 Khảo sát tác dụng của các cao chiết trên thực nghiệm gây sốt bởi nấm men

 Khảo sát tác dụng kháng viêm in vitro (thực nghiệm ổn định màng tế bào hồng cầu) và in vivo (thực nghiệm carrageenan) của các cao chiết.

3 Khảo sát tác dụng của cao chiết tiềm năng trên hoạt tính myeloperoxidase

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về sa sâm nam

1.1.1 Phân loại thực vật

Sa sâm nam, còn được gọi là sa sâm nam hay Sâm trường sa, có tên

khoa học là Launaea sarmentosa (Willd.) Sch - Bip ex Kuntze hay Launaea

pinnatifida Cass., thuộc họ Asteraceae, thường tìm thấy dọc bờ biển Ấn Độ.

Phần lá và rễ sa sâm nam đã được sử dụng như một phương thuốc dân giantrong điều trị bệnh vàng da, thanh lọc máu huyết và lợi sữa ở Maharastra, Ấn

Độ, đặc biệt là các bộ tộc ở phương Tây [25]

Phân loại

Giới: Thực vậtGiới phụ: Thực vật có hoaNgành: Thực vật hạt kínLớp: Hai lá mầm

Phân lớp: Cúc (Asterids)Bộ: Cúc (Asterales)Họ: Cúc (Asteraceae)Phân họ: Cichorioideae

Chi: Launaea Loài: Launaea pinnatifida Cass [43]

Hình 1.1 Mẫu tươi (A) và bột lá khô (B) sa sâm nam

1.1.2 Đặc điểm hình thái, công dụng

Sa sâm nam có lá nhám và dày, lá tươi có màu xanh, hình dạng răng cưa(tooth shape) dài 10 – 15 cm, vị đắng với mùi đặc trưng, được sử dụng trong điều trị

ho, cảm lạnh, bệnh tim cấp (fever heart) và các vấn đề liên quan đến máu Nước sắccủa cây rất hữu ít trong rối loạn não và có tác dụng tăng cường trí nhớ Rễ tươi tiếtnhựa mủ dính màu trắng đến nâu sữa, ngọt và có mùi thơm, có chiều dài từ 10 cmđến 1 m và đường kính 0,5 - 2 cm Rễ khô có màu nâu nhạt, thô và có vị ngọt Quansát dưới kính hiển vi rễ sa sâm nam cho thấy sự hiện diện của các tế bào tiết, cáctannin, mạch gỗ, tinh thể calci oxalat, các sợi đơn và không có vùng tủy Dịch chiếtmethanol sa sâm nam là một nguồn thuốc hiệu quả trong hạ sốt, kháng viêm, giảmđau và bảo vệ gan Nước sắc sa sâm nam được sử dụng trong các rối loạn não và tácđộng như chất tăng cường trí nhớ [8], [16], [43]

1.1.3 Thành phần hóa học

Sa sâm nam là một trong mười loài thuộc chi Launaea Cass đã được nghiên

cứu về thành phần hóa học, cụ thể là các hợp chất thứ cấp bao gồm terpenoid,steroid, triterpenoid, sesquiterpen lacton, coumarin, flavonoid, flavon glycosid vàcác hợp chất phenol Nghiên cứu sơ bộ thành phần hóa thực vật cho thấy trong rễ sasâm nam có sự hiện diện các hợp chất alkaloid, carbohydrat, các steroid, acid amin

và tannin, trong khi đó lá bao gồm các hợp chất steroid, alkaloid, terpenoid,glycosid, flavonoid và tannin Theo các tài liệu tổng quan cho thấy loại cây này

không được nghiên cứu nhiều về các thành phần hóa lý cũng như phân lập các hoạtchất có hoạt tính sinh học của các dịch chiết phân đoạn lá và rễ Các thông tin sẵn

có chủ yếu liên quan đến cách sử dụng theo truyền thống [8], [16], [43]

Md và cộng sự đã thực hiện nghiên cứu sàng lọc hoạt tính ổn định màng hồng cầu

và tan huyết khối in vitro của dịch chiết methanol sa sâm nam Kết quả nghiên cứu cho thấy, tác dụng làm tan huyết khối in vitro của sa sâm nam phụ thuộc vào nồng

độ sử dụng, trong đó tại nồng độ 10 mg/ml có thể ly giải 22,57% cục máu đông (p <

0,001) Dịch chiết thô methanol sa sâm nam có hoạt tính phụ thuộc nồng độ trong

thử nghiệm ổn định màng, trong đó nồng độ 10 mg/ml cho thấy khả năng ức chế sựtiêu huyết đáng kể nhất và đạt 12,11%, 20,23% trong thử nghiệm tiêu huyết donhiệt và do dung dịch nhược trương Streptokinase và acid acetyl salicylic được sửdụng làm chất đối chiếu trong các thực nghiệm này [62] Năm 2017, nghiên cứu củanhóm Shalahuddin Millat Md và cộng sự cho thấy dịch chiết methanol từ sa sâmnam có hoạt tính kháng vi khuẩn gram âm ở mức trung bình và đề kháng với vikhuẩn gram dương [63]

1.1.4.2 Trong nước

Tại Việt Nam, nhiệm vụ nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ cấptỉnh Bến Tre năm 2019 “Nghiên cứu đánh giá thành phần hóa học và hoạt tính sinhhọc, định hướng sản xuất thực phẩm chức năng từ cây sa sâm nam tại tỉnh Bến Tre”

đã khảo sát quy trình chiết xuất, thành phần hóa học và khảo sát tác dụng sinh họccủa chế phẩm viên nang từ cây sa sâm nam trên hai hoạt tính tăng cường sinh lực vàtăng cường miễn dịch Nghiên cứu của Le Thi Them và cộng sự đã xác định được

sự hiện diện của các hợp chất flavonoid, saponin, alkaloid, tannin và steroid Kếtquả định lượng cho thấy trong lá có chứa hàm lượng cao các hợp chất polyphenol(290,90 mg GAEs/g dịch chiết), hàm lượng thấp hơn là các hợp chất flavonoid(85,47 mg QEs/g dịch chiết) và saponin được tìm thấy chiếm 10,8% (trên trọnglượng khô) Dịch chiết ethanol có tiềm năng kháng oxy hóa với giá trị IC50 24,15µg/ml trong thực nghiệm DPPH, so với vitamin C Thử nghiệm ức chế α –glucosidase thể hiện hoạt tính ức chế enzym với giá trị IC50 67,09 µg/ml [41]

1.1.5 Một số sản phẩm trên thị trường

Một số sản phẩm được sản xuất từ sa sâm nam đang có trên thị trường ViệtNam hiện nay (Sâm xương khớp, sâm giải độc gan, sâm đẹp da, sâm sinh lựcMen, ) được trình bày như hình 1.2

Hình 1.2 Một số sản phẩm từ sa sâm nam [70]

1.2 Đau, sốt, viêm và một số mô hình thực nghiệm

Viêm, đau và sốt có lợi cho hệ thống miễn dịch Tuy nhiên, đây cũng lànguyên nhân gây nhiều đau đớn và khó chịu cho bệnh nhân, làm giảm chất lượngcuộc sống và vì vậy cần được kiểm soát Thuốc chống viêm không steroid (Non-steroidal anti-inflammatory drug – NSAIDs) thường được sử dụng trong điều trịviêm, sốt và đau Cơ chế tác động của thuốc là ức chế cyclooxygenase (COX), dẫnđến ngăn quá trình tổng hợp các prostaglandin Tuy nhiên, các thuốc NSAIDsthường được sử dụng trong điều trị viêm, sốt và đau thường có nhiều tác dụng phụsau thời gian dài sử dụng như kích ứng dạ dày, gây loét, xuất huyết kéo dài, suythận Các dược liệu được biết có đặc tính giảm đau, hạ sốt và kháng viêm đã được

sử dụng nhưng chỉ với tỷ lệ nhỏ, đã được tính đến trong các hệ thống chăm sóc sứckhỏe sau khi nghiên cứu lâm sàng có khả năng điều trị đau, sốt và viêm [18]

1.2.1 Đau

1.2.1.1 Khái niệm

Đau là một quá trình phức tạp liên quan đến sự tương tác giữa các con đườngcủa hệ thần kinh ngoại biên và trung ương với các cơ chế sinh học thần kinh đa

dạng Mặc dù sự hiểu biết về đau không ngừng tăng lên, vẫn còn nhiều đặc điểmchưa được khám phá Có một sự tương tác phức tạp giữa sinh lý, tâm lý, các yếu tốcảm xúc và xã hội, cảm nhận đau Theo Hiệp hội nghiên cứu đau quốc tế (theInternational Association for the Study of Pain-IASP) đau là một cảm giác khó chịu

và trải nghiệm cảm xúc, xuất hiện cùng lúc với sự tổn thương thực sự hay tiềm tàngcủa các mô hoặc được mô tả dưới dạng tổn thương Đau luôn mang tính chủ quan[23]

1.2.1.2 Phân loại

Có nhiều cách để phân loại đau, tất cả đều có những khả năng ứng dụng vàhạn chế nhất định Theo thời gian xảy ra, cơn đau có thể phân thành đau cấp tính vàđau mạn tính Đau cấp tính được xem là sự thích nghi, có chức năng cảnh báo, xảy

ra trong thời gian ngắn (thường lên đến vài tuần) và giảm dần khi bệnh hoặc vếtthương được chữa khỏi (ví dụ như đau sau phẫu thuật) Tuy nhiên, cơn đau có thểkéo dài hơn thời gian chữa trị dự kiến và cơ chế phức tạp hơn ví dụ như đau daidẳng, sự nhạy cảm ở trung ương và ngoại biên (peripheral or central sensitization),các vấn đề thần kinh, hành vi né tránh dẫn đến chuyển thành đau mạn tính Ngoàicác yếu tố thể chất và tinh thần, di truyền, môi trường, các nhân tố kinh tế xã hộicũng góp phần làm cho cơn đau mạn tính phát triển Dựa trên các đặc tính lâm sàng

và các cơ chế cơ bản giả định, có thể chia thành đau do tác nhân kích thích và đau

do rối loạn thần kinh [23]

Theo cơ chế của đau và cách làm giảm đau chu phẫu (perioperative pain –bao gồm đau trong tất cả các giai đoạn trước, trong và sau phẫu thuật), đau có thểphân thành 4 loại như sau:

- Đau cảm thụ (Nociceptive pain) là cơn đau sinh lý được tạo ra do cáckích thích độc hại kích hoạt các thụ thể đau ngoại biên còn gọi lànociceptor thần kinh ở ngưỡng cao, chỉ thoáng qua, không có sự quá mẫncảm của hệ thống đau, không có tổn thương hoặc rối loạn chức năng của

hệ thần kinh trung ương và đau đảm nhận chức năng thích nghi (bảo vệ

cơ thể khỏi kích thích độc hại) [53]

- Đau do viêm (Inflammatory pain) là sự nhạy cảm với đau do viêm môngoại vi liên quan đến sự phát hiện viêm hoạt động bởi các nociceptor vàmột sự nhạy cảm của hệ thống cảm thụ Mục đích là để chữa lành mô đãtổn thương Như trong đau cảm thụ, đau do viêm không có rối loạn chứcnăng của hệ thần kinh trung ương và đau đảm nhận chức năng thích nghi(thúc đẩy việc chữa lành) Tuy nhiên, có sự khác biệt là đau do viêm có

sự quá mẫn cảm của hệ thống đau do tăng kích thích của các tiểu thể tậndây thần kinh ngoại vi (peripheral nerve terminals) thông thường khônggây độc (tức là nhạy cảm ngoại vi) [53]

- Đau thần kinh (Neuropathic pain), theo đinh nghĩa của IASP, là “cơn đaukhởi phát hoặc gây ra bởi một tổn thương bệnh lý hoặc rối loạn chứcnăng” ở các dây thần kinh ngoại biên và thần kinh trung ương Các ví dụphổ biến là đau dây thần kinh do bệnh đái tháo đường, đau sau phẫuthuật, đau dây thần kinh số V, đau liên quan đến đột quỵ, đa xơ hoặc chấnthương tủy sống Đau thần kinh không đảm nhận chức năng bảo vệ khỏicác kích thích độc hại hoặc thúc đẩy việc chữa lành [53]

- Đau chức năng (Functional pain or dysfunctional pain) là đau bệnh lý,được định nghĩa là “sự khuếch đại tín hiệu cảm thụ đau khi không cóhoặc viêm hoặc tổn thương thần kinh” Không giống đau thần kinh, ở đâychưa có tổn thương hoặc gây hại cho thần kinh trung ương hoặc ngoại vi

Ví dụ như rối loạn gây đau ở cơ và xương, hội chứng ruột kích thích vàhội chứng đau bàng quang [53]

1.2.1.3 Con đường đau

Con đường đau có 2 phần, phần ngoại biên liên quan đến các nociceptor vàcác dây thân kinh ngoại biên, phần trung tâm liên quan đến các trung tâm vỏ não(hình 1.3) [33] Sự tổn thương do kích thích điện, kích thích cơ học, kích thíchnhiệt, kích thích hóa học khởi phát cảm giác đau đến cơ quan cảm nhận kích thíchđau thông qua các nociceptor Các tín hiệu được truyền qua hạch rễ lưng (dorsalroot ganglion) đến sừng tủy sống (dorsal horn) Từ sừng tủy sống, các tín hiệu được

truyền theo con đường đau hướng lên (the ascending pain pathway) hoặc theo bógai đồi thị đến vùng dưới đồi và não Đau có thể được kiểm soát bởi tế bào thầnkinh ức chế đau và hỗ trợ đau (pain-inhibiting and pain-facilitating neurons) Khởiđầu các tín hiệu truyền xuống (descending signals) trong các trung tâm kiểm soáttủy có thể điều chỉnh hoạt động sừng tủy bằng cách kiểm soát sự truyền cảm giácđau tại tủy sống [16] Các dây thần kinh ngoại biên truyền các kích thích đau đếntủy sống, sau đó truyền đến não Tại não, kích thích đau được xử lý và tạo ra dẫntruyền đến tủy sống theo các dây thần kinh thích hợp và giúp cơ thể tạo ra đáp ứng,

ví dụ rút tay khỏi lửa

Hình 1.3 Sinh bệnh học của đau [33]

BK, bradykinin; H, hydrogen; 5HT, 5-hydroxytryptamin (serotonin);

P, phosphat

Có hai loại sợi thần kinh tham gia vào quá trình này, sợi đau chậm (slow painfibers) và sợi đau nhanh (fast pain fibers) Đau cấp tính được truyền theo các sợi Aδđến tủy sống Hoạt động của sợi đau nhanh được kết thúc tại khoang trong tủy sống(luminal in the spinal cord) Một neuron thần kinh thứ hai được kích thích theo conđường bó gai đồi thị mới và kết thúc sự truyền tín hiệu trong cuống não (brainstem).Tận cùng thần kinh đau cấp tính tiết ra một chất dẫn truyền thần kinh là glutamat,chất dẫn truyền đau cấp tính đến vùng võ não Các chất trung gian chính của đaubao gồm bradykinin, histamin, serotonin và các prostaglandin, cung cấp tín hiệucảnh báo đến hệ thống thần kinh Cảm giác đau là tín hiệu cho sự sai sót trong cơthể Đau đóng vai trò quan trọng cảnh báo sự tổn thương mô từ kích thích có hại và

sự phản xạ được tạo ra để bảo vệ bộ phận bị tổn thương của cơ thể Đau là một đápứng sinh lý bình thường qua trung gian hệ thần kinh và được sử dụng trong chẩnđoán các bệnh khác nhau liên quan đến đau mạn tính như đái tháo đường, viêmkhớp và ung thư [18], [21]

1.2.1.4 Thực nghiệm đau

Thuốc giảm đau là thuốc hay nhân tố làm giảm hoặc ngăn chặn cảm giác đaumột cách tạm thời Hiệu quả và tiềm năng của một số thuốc giảm đau có nguồn gốctổng hợp hoặc thực vật được thử nghiệm trên các mô hình động vật khác nhau baogồm đau do nhiệt nóng (hot-plate), thử nghiệm ngâm đuôi (tail immersion test), kẹpđuôi (tail pinch test), đau do lạnh, thử nghiệm xoắn bụng gây bởi acid acetic, thửnghiệm gây đau bởi formalin [51]

Các mô hình đau được phân theo tác nhân kích thích được sử dụng: kíchthích nhiệt, điện, cơ học và hóa học Cơ chế thần kinh của các mô hình chưa đượchiểu rõ, nhưng chúng đã được sử dụng để tiên đoán hoạt tính giảm đau của các hợpchất mới Các mô hình gây đau bởi acid acetic (acetic acid - induced pain test),phenylquinon, bradykinin trên chuột nhắt/chuột cống (i.p) thường được sử dụng.Khi các chất hóa học được tiêm vào, động vật thử nghiệm có các đặc điểm như duỗichân sau, xoay người, cơ bụng co thắt và dạ dày chạm sàn Những triệu chứng nàyđược sử dụng như là tín hiệu của cơn đau [18], [51]

độ cao không kèm theo các triệu chứng này có thể là dấu hiệu của chứng bệnhnghiêm trọng Trong tình trạng sức khỏe bình thường, khoảng nhiệt độ tại miệng là33,2 – 38,2oC, tại nách 35,5 – 37,0oC, tại trực tràng 34,4 – 37,8oC, màng tai 35,4 –37,8oC Sốt liên quan đến các tình trạng bệnh như trầm cảm, biếng ăn, mất ngủ, hôn

mê, mất tập trung và đau quá mức [18]

Sốt là một cơ chế chiến đấu hoặc bảo vệ của hệ miễn dịch khỏi sự tấn côngcủa các tác nhân xâm nhiễm Điều hòa nhiệt được thực hiện trong vùng dưới đồi.Sốt được kích hoạt bởi chất gây sốt (pyrogen) và các chất gây sốt này là nguyênnhân làm phóng thích prostaglandin E2 (PGE2) PGE2 tác động lên vùng dưới đồi

và tạo ra đáp ứng toàn thân, gây nên đáp ứng tạo nhiệt để phù hợp với nhiệt độ mới

Trong nhiều hoàn cảnh, vùng dưới đồi làm việc như một bộ điều nhiệt (hình 1.4)[14].

1.2.2.2 Vật liệu cơ bản của sốt

Các cytokin gây sốt (pyrogenic cytokines)

Các cytokin gây sốt là một phần của hệ miễn dịch tự nhiên Các chất gây sốtngoại sinh xâm nhập vào vật chủ tạo ra một chuỗi các đáp ứng miễn dịch thông quacác kiểu phân tử liên quan đến tác nhân gây bệnh (pathogen-associated molecularpatterns – PAMPs), bao gồm lipopolysaccharid (LPS), các lipoarabinomannan, acidlipoteichoic và RNA virus PAMPs hoạt động thông qua các thụ thể nhận dạng kiểuphân tử, chẳng hạn các thụ thể Toll – like (Toll-like receptors – TLRs), trên các tếbào miễn dịch để cảm ứng sự giải phóng các cytokin gây sốt Các cytokin gây sốtchính được công nhận hiện nay là IL-1, IL-6, TNF-α Tiêm LPS toàn thân trong các

mô hình động vật có thể làm tăng giải phóng các cytokin này vào tuần hoàn chung.LPS kích thích TLRs, đặc biệt là TLR4, gây ra sự giải phóng cytokin gây sốt và gâysốt [40]

IL-1

IL-1 đại diện cho hai dạng phân tử khác nhau (IL-1α và IL-1β) và một chấtđối kháng thụ thể IL-1 nội sinh (IL-1 receptor antagonist – IL-1RA) IL-1 thì cầnthiết trong cảm ứng sốt IL -1 cảm ứng các chất trung gian, PGE2 và COX-2, là chấtcần thiết cho các biến cố xuôi dòng (downstream events) làm trung gian cho sốt gâybởi IL-1 ngoại vi IL-1 cảm ứng COX-2 và PGE2 tùy thuộc vào sự biểu hiện củaprotein hoạt hóa mitogen kinase 7 (mitogen-activated protein kinase 7 – MAPK7,còn được biết là TAK1) và con đường hoạt hóa NF-κB [40]

IL-6

IL-6 được tạo ra do các kích thích khác nhau bao gồm sự tổn thương mô,virus hoặc các cytokin tiền viêm khác IL-6 trong quá trình viêm và nhiễm tạo ra sựkích thích các tế bào bởi IL-1 hoặc TNF-α hoặc thông qua sự kích thích của TLRssau khi gắn với PAMPs Các thụ thể IL-6 tồn tại dưới 2 dạng: Các isoform tan củathụ thể interleukin 6 (soluble receptor - sIL-6R) và thụ thể gắn với màng

(membrane-bound receptor – IL-6R) IL-6 sinh ra do các tế bào không tạo máu(non-hematopoietic) là thành phần thiết yếu của sốt gây bởi LPS, IL-6 sinh ra docác tế bào tạo máu đóng vai trò thứ yếu trong sản sinh IL-6 toàn thân Các nghiêncứu gần đây cho thấy IL-6 gắn với các thụ thể của nó trên các tế bào màng trongnão và gắn vào cơ chất cảm ứng sự biểu hiện của prostaglandin synthase COX-2thông qua con đường truyền tín hiệu và kích hoạt phiên mã 3 (Signal transducerand activator of transcription - STAT3) [40].

Yếu tố hoại tử khối u α (tumor necrosis factor α - TNF-α)

TNF là một cytokin được sản xuất tự nhiên bởi các đại thực bào trong đápứng với sự xâm nhiễm của vi khuẩn hoặc các nguồn miễn dịch khác Dựa vàonguồn gốc và cấu trúc, TNF có thể chia thành 2 loại: TNF-α và TNF-β, được sảnxuất chủ yếu bởi đại thực bào, tế bào T và các tế bào giết chết tự nhiên TNF-α làcytokin đầu tiên được tạo ra khi tiêm LPS Tiêm màng bụng TNF-α ở người vàđộng vật thí nghiệm có thể gây sốt một cách nhanh chóng Một số nhà nghiên cứu

đã lý giải rằng TNF-α tạo ra IL-1 in vivo, vì vậy, TNF-α và IL-1 đóng vai trò hiệp

đồng trong tạo sốt, tuy nhiên chưa có cơ chế cụ thể nào được báo cáo [40]

Chất trung gian gây sốt

vực vùng dưới đồi có thể là những vị trí mà PGE2 hoạt động trên các thụ thể EP3 đểtạo ra cơn sốt Tóm lại, giai đoạn đầu của sốt có thể qua trung gian bởi PEG2 ngoạibiên và tốc độ truyền tín hiệu sốt có thể phụ thuộc vào các con đường thần kinh.

PGE2 còn được sản xuất bởi các tế bào nội mô trong não và phóng thích từcon đường acid arachidonic Con đường này qua trung gian bởi các enzymphospholipase A2, COX-2 và mPGGES-1 COX-2 và mPGES-1 là các gen mục tiêucủa NF-κB và STAT3 và sự hoạt hóa NF-κB hoặc STAT3 trong các tế bào nội mônão thì liên quan đến COX-2 và mPGGES-1 Các nghiên cứu trước đây đã tuyên bốrằng các cytokin gây sốt có thể cảm ứng sản xuất COX-2 và mPGES-1 thông quacác con đường tín hiệu khác nhau, vì vậy PGE2 được tạo bởi các tế bào nội mô nãochủ yếu qua trung gian bởi tác động của các cytokin gây sốt này Do đó, PGE2 tổnghợp ngoại biên có thể khởi đầu cơn sốt, PGE2 tổng hợp ở trung tâm có thể tham giavào duy trì sốt [40]

Ngoài PGE2, các chất trung gian khác cũng gây ra sốt Gốc tự do, glutamat

và các rối loạn con đường chuyển hóa cũng đóng một vai trò trong sốt [40]

1.2.2.3 Chất gây sốt và con đường sốt do chất gây sốt gây ra

Chất gây sốt được phân thành chất gây sốt nội sinh và ngoại sinh Chất gâysốt ngoại sinh là những chất bên ngoài cơ thể như độc tố vi khuẩn Màng tế bào vikhuẩn phóng thích các sản phẩm như lipopolysaccharid, các độc tố và sự phá vỡ cácprotein trong cơ thể sinh vật có thể là nguyên nhân làm tăng điểm điều nhiệt tạitrung tâm điều nhiệt vùng dưới đồi Chất gây sốt nội sinh là các cytokin liên quan

hệ miễn dịch tự nhiên, được bắt nguồn từ các tế bào miễn dịch trong cơ thể nhằmđáp ứng với các kích thích từ môi trường bên ngoài Các cytokin do đại thực bàosản xuất bao gồm IL-1α và IL-1β là nguyên nhân làm tăng điểm điều nhiệt Khiđiểm điều nhiệt tăng, cơ thể phát triển cơ chế sinh nhiệt và giữ nhiệt Sự co mạchlàm giảm sự mất nhiệt qua da và làm cho cá thể cảm thấy lạnh [14] Phản ứng sốtliên quan đến hoạt động của hệ miễn dịch tự nhiên với thụ thể TLR-4 dẫn đến sảnxuất các cytokin gây sốt như IL-1β, IL-6 và TNF-α hoạt động trên OVLT Chất gâysốt nội sinh không hoạt động trực tiếp trên trung tâm điều nhiệt Thay vào đó, hoạt

động trên các tế bào nội mô của OVLT Dưới tác động của các chất gây sốt, các tếbào nội mô của OVLT sản xuất prostaglandin PGE2 thông qua hoạt hóa enzymCOX-2, PGE2 được tạo ra khuếch tán đến vùng dưới đồi kề bên Trong vùng dướiđồi, PGE2 gắn kết với các thụ thể dẫn đến làm tăng cơ chế sinh nhiệt và làm giảm

sự mất nhiệt cho đến khi điểm điều nhiệt mới được tạo ra [33], [48]

Hình 1.5 Con đường gây sốt bởi chất gây sốt [50]

IL-1, interleukin-1; PGE, prostaglandin; TNF, tumor necrosis factor; INF, interferon; OVLT, Organum vasculosum laminae terminalis; COX2, cyclooxygenase 2;

1.2.2.4 Thực nghiệm gây sốt bởi nấm men

Trong thực nghiệm sốt gây bởi nấm men (Brewer’s yest - induced test), saukhi được tiêm dưới da động vật thử nghiệm, nấm men gắn kết với một protein miễndịch gọi là protein gắn kết - lipopolysaccharid (lipopolysaccharide-binding protein),kết quả làm giải phóng các yếu tố cytokin nội sinh khác nhau như đại thực bào vàIL-1 Interleukin sẽ hoạt hóa các tế bào lympho T và sản xuất các prostaglandin tạivùng dưới đồi Nấm men còn cảm ứng TNF-α và các prostaglandin Một số thựcnghiệm gây sốt khác được sử dụng như thực nghiệm gây sốt bởi turpentin, thựcnghiệm gây sốt bởi 2,4-dinitrophenol [18]

1.2.3 Viêm

1.2.3.1 Khái niệm

Viêm “inflammation” có nguồn gốc từ tiếng Latin, trong đó từ “inflamao” cónghĩa là “Ignite (khơi mào), set alight (tránh các tổn thất)” [24] Đây là quá trìnhloại bỏ các kích thích có hại như chất kích thích, các tế bào hư hỏng, sự xâm nhiễm

và các kích thích khác, để bắt đầu quá trình chữa lành vết thương [54] Viêm có thểxảy ra do một số nguyên nhân như bỏng, nhiễm trùng, các kích thích hóa học,chứng tổn thương do lạnh, quá mẫn cảm, các độc tố, tổn thương thể chất, bức xạion, stress, chấn thương và rượu [54] Nhiều tác giả định nghĩa viêm theo cách củariêng họ nhưng cơ bản viêm là sự bảo vệ cơ thể chống lại các tổn thương Các tácgiả nêu một cách sơ lược về viêm như sau “Viêm là một quá trình phức tạp xảy ratrong các mô mạch máu nhằm đáp ứng lại các kích thích gây tổn thương như cácmầm bệnh, các tế bào bị tổn thương hoặc các tác nhân kích thích” Hoặc “Viêm làmột phản ứng sinh học giúp lấp đầy một khu vực bằng máu nhằm loại bỏ các mô bịtổn thương” Hoặc “Viêm là đáp ứng đầu tiên của việc bảo vệ và chữa lành trướckhi hệ miễn dịch hoạt động” Hoặc “Đáp ứng viêm là một loạt các sự kiện hoặc cácgiai đoạn, mà cơ thể thực hiện để đạt được cân bằng nội mô” Hoặc “Viêm là phảnứng sinh lý của cơ thể hoặc là một cơ chế bảo vệ không đặc hiệu đối với vết cắt, vếtbỏng hoặc nhiễm khuẩn” [46]

Hình 1.6 Nguyên nhân gây viêm [46]

1.2.3.2 Cơ chế

Khi một mô bị tổn thương bởi bất kì tác nhân vật lý hay hóa học nào, quátrình viêm khởi đầu một cách tự động Viêm được gây ra bởi sự phóng thích cácchất hóa học, quan trọng nhất là các prostaglandin (PGs), các leukotrien (LTs),histamin, bradykinin, yếu tố hoạt hóa tiểu cầu (platelet-activating factor – PAF) vàinterleukin-1 Tất cả các nguồn kháng viêm có được tác dụng là do ngăn cản sự tổnghợp các prostaglandin, ức chế cạnh tranh các thụ thể histamin Thuốc kháng viêmtương tự aspirin ức chế cyclooxgenase (COX) và giảm tổng hợp các prostanoid.Tuy nhiên, các corticosteroid ngăn cản sự hình thành cả PGs và LTs nhờ vào sự giảiphóng lipocortin (có tác dụng ức chế phospholipase A2 từ đó làm giảm sự phóngthích acid arachidonic) [46]

1.2.3.3 Phân loại viêm

Viêm có 2 loại, cấp tính và mạn tính Viêm cấp tính tồn tại trong thời gianngắn từ vài giờ đến vài ngày, quá trình này được khởi đầu bởi các tế bào như đạithực bào, tế bào tua, các mô bào (histiocyte), các tế bào Kupffer và dưỡng bào.Viêm cấp tính bao gồm hai biến cố đó là biến cố tế bào và mạch máu Trong viêmmạn tính, quá trình viêm tồn tại trong thời kì dài hơn và thường kèm theo bởi môhạt và chứng xơ hóa [46]

Hình 1.7 Các loại viêm [46]

Tiến trình viêm

Viêm cấp tính

Viêm cấp tính là đáp ứng khởi đầu của hệ miễn dịch nhằm chống lại các tácnhân gây bệnh và mô tổn thương được đặc trưng bởi thiếu máu cục bộ, rối loạnchuyển hóa và tổn thương màng tế bào Đây là một quá trình tự giới hạn nhanhchóng, qua trung gian các eicosanoid và các amin kích hoạt mạch (vasoactiveamines) theo sau là các biến cố mạch máu và tế bào, từ đó làm tăng sự di chuyểncủa huyết tương và các bạch cầu vào vị trí nhiễm Giai đoạn tăng sinh của quá trìnhviêm dẫn đến hình thành mô hạt kéo dài 6-8 tuần Giai đoạn cuối của viêm cấp tínhliên quan đến sự hình thành sẹo và chữa lành Trong suốt giai đoạn này, hoạt động

tế bào giảm và sự tạo thành chất nền ngoại bào tăng Một số tình trạng viêm là kếtquả của viêm cấp tính, như hội chứng suy hô hấp cấp tính, thải loại mảnh ghép cấptính, hen suyễn, viêm cầu thận, tổn thương do tái tưới máu, sốc nhiễm trùng vàviêm mạch Phản ứng viêm bao gồm giãn mạch, tăng tính thấm thành mạch, sự xâmnhập tế bào và hoạt hóa tế bào của hệ miễn dịch cũng như các hệ thống enzym phứctạp của huyết tương [46]

Hình 1.8 Các ảnh hưởng của viêm trên hệ thống cơ thể [46]

Đáp ứng xảy ra trong vài giây của sự tổn thương mô và kéo dài trong vàiphút là đáp ứng mạch cấp tính Các biến cố mạch máu bao gồm giãn mạch và tăngtính thấm của mạch, dẫn đến tăng lưu lượng máu và sự xâm nhập của chất lỏng vào

Đáp ứng tế bào cấp tính diễn ra trong vài giờ tới khi tổn thương mô đã xảy ra

đủ Các bạch cầu trung tính xuất hiện trong các mô trong suốt giai đoạn này, hồngcầu cũng xâm nhập vào vào các mô và xảy ra xuất huyết Các tiểu cầu tập hợp tại vịtrí hồng cầu xếp chồng lên nhau nhằm giúp cầm máu và hình thành cục máu đông.Các tế bào đã chết và sắp chết góp phần hình thành mủ, tiếp sau đó là đáp ứng tếbào mạn tính được đặc trưng bởi xâm nhiễm tế bào đơn nhân bao gồm các đại thựcbào và các tế bào lympho Các đại thực bào tham gia vào việc tiêu diệt vi sinh vật,dọn dẹp tế bào và mảnh vụn của mô Các biến cố tế bào bắt đầu do sự di chuyển củacác leukocyt trong dòng máu và bám vào nội mô bởi quá trình gọi là sự bám vào rìa(margination) Tất cả quá trình này thường xảy ra tại vị trí mạch nhỏ sau mao mạch(postcapillary venules) và diễn ra do sự tương tác của các phân tử kết dính khácnhau như các selectin, các integrin, phân tử kết dính liên bào -1 (intercellularadhesion molecule-1 – ICAM-1), phân tử kết dính tế bào mạch -1 (vascular celladhesion molecule-1 – VCAM-1), cụm biệt hóa 31 (cluster of differentiation-31 –CD31) và các protein biến đổi Sialyl-Lewis X Sự biểu hiện của các phân tử kếtdính này được kiểm soát bởi các cytokin khác nhau [42] Sau khi thoát khỏi hệ tuầnhoàn, các leukocyt di chuyển về phía bị thương bởi quá trình hóa hướng động Cácchất hóa hướng động có thể là sản phẩm vi khuẩn, các peptid, các lipid, cácleukotrien và các cytokin Qua vài tuần tiếp theo, cấu trúc mô bình thường đượcphục hồi Các cục máu đông được loại bỏ bằng cách ly giải fibrin để đưa mô trở lạinhư ban đầu Tuy nhiên, nếu không thể loại bỏ hoàn toàn các tác nhân gây nhiễm đãtích tụ tại vị trí nhiễm thì các tác nhân này sẽ được bao bọc bởi các mô xung quanhtrong mô hạt U hạt được hình thành khi đại thực bào và các tế bào lympho tích tụxung quanh vật liệu chưa được loại bỏ, cùng với các tế bào biểu mô và các tế bàokhổng lồ xuất hiện sau đó, để tạo thành một quả cầu tế bào (a ball of cell) [46]

Viêm mạn tính

Viêm mạn tính là tình trạng viêm kéo dài trong khoảng thời gian vài thángđến hàng năm trong đó viêm liên tục, sự tổn thương mô và chữa lành, thường bằngcách xơ hóa, diễn ra đồng thời Viêm mạn tính có thể xảy ra do sự nhiễm khuẩn dai

dẳng như Mycobacterium tuberculosis, Treponema pallidum và một số loại virus và

nấm Những vi sinh vật này khơi gợi đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bàolympho T được gọi là quá mẫn muộn (delayed-type hypersensitivity) Miễn dịch tựnhiên cũng đóng vai trò quan trọng trong một vài bệnh viêm mạn tính thông thường

và các bệnh viêm suy nhược mạn tính như viêm khớp dạng thấp, bệnh viêm ruột vàbệnh vảy nến [26] Viêm mạn tính cũng liên quan đến một số bệnh như Alzheimer,

xơ vữa động mạch, hội chứng chuyển hóa, đái tháo đường týp 2 và một số dạng ungthư Phơi nhiễm kéo dài với silica dẫn đến bệnh bụi phổi, một tình trạng viêm mạntính [46]

1.2.3.4 Các tế bào viêm

Các tế bào viêm (phản ứng với những chất lạ) tham gia vào viêm cấp tính vàmạn tính là các bạch cầu đa nhân trung tính (polymorphonuclear neutrophils -PMN), bạch cầu ái kiềm, bạch cầu ái toan, các tế bào lympho, tương bào và cácbạch cầu đơn nhân [46]

Hình 1.9 Các thành phần quá trình gây viêm [31]

TNF, Tumor necrosis factor; IL-6, interleukin-6; CCL2, chemokin C-C

Ligand 2; CXCL8, chemokine C-X-C chemokine 8

- Dưỡng bào: là nguồn gốc quan trọng của các cytokin và các chất trunggian tiền viêm Các chất chính phóng thích từ dưỡng bào là histamin,heparin, các leukotrien, nhân tố hoạt hóa tiểu cầu (PAF), các nhân tố tăngtrưởng thần kinh và một số interleukin Vì vậy, dưỡng bào được coi là cóliên quan đến sửa chữa mô [52, 55]

- Các bạch cầu hạt: PMN là đơn vị đầu tiên của các bạch cầu máu đi vàonơi bị viêm Các bạch cầu đa nhân trung tính chứa nhiều chất trong cáchạt như protease, myeloperoxidase, lysozyme và alkalin phosphatase.PMN được xem là hàng rào bảo vệ đầu tiên chống lại vi khuẩn Các bạchcầu trung tính bị thu hút bởi các chất hóa hướng động được tiết ra bởi visinh vật hoặc các tế bào tại chỗ như đại thực bào (ví dụ chemokin) Cácbạch cầu trung tính có thể bao lấy, giết chết và tiêu hóa vi sinh vật bằngcách tạo ra các gốc tự do oxy và các enzym tiêu hóa Các bạch cầu trungtính sống sót, chết dần và tạo thành mủ Khi các bạch cầu trung tính tiết

ra các hóa chất độc hại, chúng sẽ trải qua apoptosis và phải được đào thải

ra ngoài bởi các đại thực bào [55] Các bạch cầu ái toan tiêu diệt ký sinhtrùng đa bào như giun sán Bạch cầu ái kiềm được tìm thấy trong một sốtrường hợp nhiễm ký sinh trùng và phản ứng quá mẫn [46]

- Bạch cầu đơn nhân/Đại thực bào: các bạch cầu đơn nhân đến nơi viêmsau bạch cầu hạt vài giờ Các chất kết dính của tế bào này tương tự cácbạch cầu trung tính, chất hóa hướng động sử dụng các chemokin bổ sung,chẳng hạn như protein hóa ứng động bạch cầu đơn nhân (monocytechemoattractant protein-1 – MCP-1) Các đại thực bào được hoạt hóa giảiphóng nhiều chất tác động lên các tế bào nội mô mạch máu nhưcollagenase, elastase, yếu tố hoạt hóa plasminogen, các sản phẩm của bổthể, yếu tố đông máu, IL-1, yếu tố hoại tử khối u và các gốc tự do oxy,thu hút các bạch cầu khác đến và làm tăng các biểu hiện toàn thân củaviêm như sốt Các đại thực bào bao lấy các mảnh vụn của mô và các tếbào chết, giết chết hầu hết các vi sinh vật [52]

- Các tế bào nội mô mạch máu: đóng vai trò tích cực trong quá trình viêm,tiết ra oxid nitric, gây giãn cơ trơn bên dưới, giãn mạch và tăng phân phốicác tế bào máu và tương bào đến vị trí viêm Các tế bào nội mô điềuchỉnh sự bài tiết và phân phối các chất trung gian có nguồn gốc từ huyết

tương và biểu hiện nhiều loại thụ thể bao gồm các thụ thể gắn vớihistamin, acetylcholin và IL-1 [52].

- Tiểu cầu: chủ yếu tham gia vào quá trình đông máu và tạo huyết khốinhưng cũng đóng một phần vai trò trong viêm Các tiểu cầu có thể tạo racác gốc tự do và các protein cation tiền viêm ngoài thromboxan A2 vàPAF [46]

ly giải hemoglobin trên hồng cầu người, chuột cống hoặc chuột nhắt gây bởi nhiệt

độ và dung dịch nhược trương Sự ly giải màng các tế bào máu với hiện tượng tiêuhuyết và oxy hóa hemoglobin có thể xảy ra khi các tế bào máu tiếp xúc với nhữngtác nhân gây hại (môi trường nhược trương, nhiệt độ, methyl salycilat và phenylhydrazin) Vì màng tế bào máu người tương tự màng lysosom, ức chế sự ly giảimàng tế bào máu bởi môi trường nhược trương và nhiệt độ được xem như là mộtthước đo cho hoạt tính chống viêm, tác động của dịch chiết lên sự ổn định mànghồng cầu cho phép đánh giá sự ổn định của màng lysosom Trong dung dịch nhượctrương, các tế bào máu tích trữ nước quá mức dẫn đến phá vỡ màng, cuối cùng là sự

ly giải hemoglobin Các tế bào máu bị tổn thương làm cho tế bào dễ bị ảnh hưởngbởi tổn thương thứ cấp thông qua quá trình peroxy hóa lipid gây bởi các gốc tự do[61]

Myeloperoxidase (MPO) thuộc họ peroxidase có chứa nhân heme, có nhiềutrong các tế bào miễn dịch như các tế bào bạch cầu trung tính, bạch cầu đơn nhân,đại thực bào và còn được sản sinh trong các tế bào khác của cơ thể Khi có kíchthích (tổn thương hay sự xâm nhiễm), các bạch cầu, các đại thực bào và các tế bàotua đáp ứng sự tổn thương cấp ngay lập tức bằng cách làm tăng tính thấm thànhmạch thông qua phóng thích histamin và kích thích tạo các chemokin và sự chênhlệch nồng độ chemokin để bắt giữ các bạch cầu tuần hoàn MPO được phóng thíchvào dịch ngoại bào sau các phản ứng viêm và sau quá trình stress oxy hóa Kiểmsoát sự giải phóng MPO tại vị trí viêm là một vấn đề quan trọng Sự phóng thíchkhông kiểm soát sẽ làm tăng quá trình viêm và có thể gây tổn thương mô Một sốtổn thương mô và cơ chế bệnh sinh của một số bệnh mạn tính như viêm khớp dạngthấp, bệnh tim mạch, bệnh gan, bệnh đái tháo đường và ung thư đã được báo cáo cóliên quan đến các chất oxy hóa có nguồn gốc từ MPO (MPO-derived oxidant) Vìvậy mức độ tăng cường hoạt động MPO là một trong những dấu ấn sinh học giúpchẩn đoán viêm và stress oxy hóa tốt nhất Hoạt tính MPO tỉ lệ với quá trình viêm,mẫu thử thể hiện tác dụng ngăn chặn quá trình viêm khi làm giảm hoạt tính MPO.Trên chuột 8 tuần tuổi, hàm lượng MPO tăng đáng kể trong pha sớm tại thời điểm 6giờ, đạt tối đa sau 24 giờ và trở về giá trị nền sau 48 giờ [19], [32], [34].

Hình 1.10 Sinh học bạch cầu trong đáp ứng với tổn thương và viêm [34]

MPO, myeloperoxidase; PMN, polymorphonuclear;

ER, endoplasmic reticulum

Thực nghiệm kháng viêm cấp gây bởi carrageenan

Viêm cấp tính là một quá trình liên quan đến sự sản sinh quá mức các gốc tự

do, sự hoạt hóa các phức hợp enzym và sự giải phóng các chất trung gian tiền viêm,các chất gây viêm Gây phù chân bởi carrageenan được biết như một mô hình gâyviêm cấp tính được sử dụng rộng rãi trong sàng lọc các hợp chất chống viêm.Carrageenan là một ester sulfat của polygalactan, khối lượng trung bình trên 100kDa Được tạo thành từ D-galactose và 3,6-anhydrogalactose bởi liên kết α-1,3 vàβ-1,4-glycosid Sự phù do tiêm γ-carrageenan vào gan bàn chân chuột được thể hiệnqua 2 pha Pha sớm kéo dài đến 6 giờ, liên quan đến sự giải phóng histamin,

serotonin, bradykinin và một lượng ít các prostaglandin, không bị ức chế bởiNSAIDs Pha muộn đạt đỉnh sau 72 giờ và giảm dần sau 96 giờ, chủ yếu là sự thâmnhập của bạch cầu trung tính và sự sản sinh prostaglandin, giải phóng các gốc tự do

có nguồn gốc từ bạch cầu, oxid nitric và các cytokin tiền viêm như TNF-α, IL-1β,pha này bị ức chế bởi NSAIDs Dung dịch carrageenan 1-3 % trong nước muối sinh

lý, với thể tích 50-150 µl được sử dụng phổ biến trong tiêm gan bàn chân, chỉ chuột

7 hoặc 8 tuần tuổi, có trọng lượng 32 – 34 g thể hiện được đáp ứng trong cả 2 pha.Các nồng độ cao hơn được sử dụng trong tạo các mô hình bệnh lý chuyên biệt [32],[35], [44]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu

Lá sa sâm nam được thu vào tháng 1 – 2 tại tỉnh Bến Tre Lá sa sâm nam sauthu hái được rửa sạch, phơi khô và xay nhỏ thành bột qua rây 200 μm Mẫu lá tươiđược định danh và lưu mẫu tại Trung tâm Sâm và Dược liệu TP HCM Mất khốilượng do làm khô đạt yêu cầu theo tiêu chuẩn DĐVN V

2.2 Động vật thử nghiệm

Chuột nhắt trắng đực, chủng Swiss albino (Mus musculus var albino), 5 – 6

tuần tuổi, trọng lượng từ 22-27 g, được cung cấp bởi Viện Vắc xin và Sinh phẩm y

tế Nha Trang Chuột được nuôi bằng thực phẩm dạng viên (Viện Vắc xin và Sinhphẩm y tế Nha Trang), nước uống đầy đủ và được để ổn định ít nhất một tuần trướckhi thử nghiệm Thể tích cho uống hoặc tiêm phúc mạc, tiêm dưới da là 10 ml/kgthể trọng chuột

2.3 Thiết bị, dụng cụ - hóa chất

2.3.1 Thiết bị, dụng cụ

Bảng 2.1 Danh sách thiết bị, dụng cụ sử dụng trong thực nghiệm

Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm

 Đầu kim cho uống

 Máy ly tâm thường

 Máy ly tâm lạnh

 Ống nghiệm nhựa có chứa giọt

EDTA chống đông máu

 Nhiệt kế điện tử

 Cân phân tích Ohaus PA214 (Mỹ)

 Tủ sấy SANYO MOV – 112

 Các dụng cụ thông thường trongphòng thí nghiệm Hóa Phân tích

 Hộp nhựa nuôi chuột và chai nước cóđầu uống

 Cối và chày

 Đồng hồ bấm giờ

 Micropipet