Khảo sát tác động điều hòa miễn dịch in vitro của cây sậy phragmites australis (cav ), poaceae trên tế bào đơn nhân máu ngoại vi người

Do đó đề tài được tiến hành nhằm khảo sát tác độngcủa cao chiết toàn phần và các cao phân đoạn cây Sậy trên tế bào đơn nhân đượcchiết từ máu ngoại vi người PBMCs.. Phương pháp nghiên cứu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ) BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRẦN QUỐC VIỆT

KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG ĐIỀU HÒA

MIỄN DỊCH IN VITRO CỦA CÂY SẬY PHRAGMITES AUSTRALIS (CAV.), POACEAE

TRÊN TẾ BÀO ĐƠN NHÂN MÁU NGOẠI VI NGƯỜI

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ) BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRẦN QUỐC VIỆT

KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG ĐIỀU HÒA

MIỄN DỊCH IN VITRO CỦA CÂY SẬY PHRAGMITES AUSTRALIS (CAV.), POACEAE

TRÊN TẾ BÀO ĐƠN NHÂN MÁU NGOẠI VI NGƯỜI

NGÀNH: DƯỢC LÝ VÀ DƯỢC LÂM SÀNG

MÃ SỐ: 8720205

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN THỊ MINH THUẬN

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học do tôi thực hiện dưới sựhướng dẫn của TS Nguyễn Thị Minh Thuận Số liệu trong đề tài này được thu thập

và sử dụng một cách trung thực Kết quả và nội dung trình bày trong luận văn nàykhông sao chép của bất kỳ luận văn nào và chưa được trình bày hay công bố ở bất

cứ công trình nghiên cứu nào trước đó

Trần Quốc Việt

KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG ĐIỀU HÒA MIỄN DỊCH IN VITRO CỦA CÂY SẬY

PHRAGMITES AUSTRALIS (CAV.), POACEAE TRÊN TẾ BÀO ĐƠN NHÂN

MÁU NGOẠI VI NGƯỜI Trần Quốc Việt Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thị Minh Thuận

Tổng quan: Ở Việt Nam, cây Sậy Phragmites australis (Cav.) được sử dụng theo

kinh nghiệm dân gian để chữa bệnh viêm dạ dày, viêm phế quản mạn tính, viêmthận cấp, phát ban Tuy nhiên, các nghiên cứu về tác dụng dược lý trên trên hệ miễndịch của cây Sậy còn hạn chế Do đó đề tài được tiến hành nhằm khảo sát tác độngcủa cao chiết toàn phần và các cao phân đoạn cây Sậy trên tế bào đơn nhân đượcchiết từ máu ngoại vi người (PBMCs)

Phương pháp nghiên cứu: Đánh giá tác động của cao chiết toàn phần ethanol 96%

cây Sậy và các cao phân đoạn (n-hexan, chloroform, ethyl acetat, nước) trên tỉ lệsống PBMCs sau 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ với thuốc thử MTT Khảo sát tác động củacác cao chiết lên khả năng sản xuất IL-1β và IL-2 của tế bào PBMCs sau 48 giờnuôi cấy bằng phương pháp ELISA Khảo sát sự thay đổi tỉ lệ tế bào T CD4+ và TCD8+ dưới tác động của phân đoạn chloroform và n-hexan cây Sậy trong 48 giờbằng phương pháp đo dòng chảy tế bào

Kết quả: Sau 24 giờ nuôi cấy, cao toàn phần ức chế sự tăng sinh của PBMCs với

IC50 là 21,39 ppm Phân đoạn n-hexan và chloroform ức chế sự tăng sinh củaPBMCs sau 48 giờ với IC50 > 200 ppm Sự sản xuất IL-1β của PBMCs bị ức chếdưới tác động của cao chiết Sậy Cao toàn phần, phân đoạn n-hexan và chloroform

ức chế PBMCs tiết IL-2 với giá trị IC50 lần lượt là 102,2 ppm ; 0,9 ppm ; 36,14ppm Tỉ lệ tế bào T CD4+ và CD8+ bị thay đổi dưới tác động của phân đoạnchloroform và n-hexan sau 48 giờ nuôi cấy

Kết luận: Các cao chiết cây Sậy ức chế sự tăng sinh và chức năng của PBMCs in

vitro.

Từ khóa: Cây Sậy, PBMCs, IL-1β, IL-2 , điều hòa miễn dịch

IN VITRO IMMUNOMODULATATORY ACTIVITY OF PHRAGMITES AUSTRALIS (CAV.), POACEAE ON

HUMAN PERIPHERAL BLOOD MONONUCLEAR CELLS

Tran Quoc Viet Supervisor: PhD Nguyen Thi Minh Thuan

Background: In Viet Nam, Phragmites australis (Cav.) is used empirically to treat

gastritis, chronic bronchitis, acute nephritis and rash However, studies on the

pharmacological effects on the immunomodulatory effects of Phragmites australis are limited The objective of this study was to investigate the in vitro immunomodulatory activity of Phragmites australis extracts on cell proliferation,

cytokine production (IL-1β, IL-2) of human peripheral blood mononuclear cells(PBMCs) and the change in CD4+/CD8+ ratio of T cell

Materials and methods: The effects on PBMCs proliferation of 96% ethanol crude

extract and its fractions (n-hexan, chloroform, ethyl acetat) after 24, 48, 72 hourswere evaluated using MTT reagent IL-1β and IL-2 concentrations secreted by

PBMCs under effects of Phragmites australis extracts for 48 hours were quantified

by ELISA method Percentage of human CD4+ and CD8+ T cell after 48 hours

exposure to chloroform and n–hexan fractions of Phragmites australis was analysed

by flow cytometry

Results: After 24 hours, crude extract inhibited PBMCs proliferation with IC50 at21,39 ppm N–hexan and chloroform fractions inhibited PBMCs proliferation after

48 hours with IC50 > 200 ppm Phragmites australis extracts inhibited IL-1β

production after 48 hours Crude extract, n–hexan and chloroform fractionsinhibited IL-2 production secreted by PBMCs after 48 hours of incubation Theratio of CD4+/CD8+ T-cells was changed after 48 hours exposure to chloroformand n–hexan fractions

Conclusion: Phragmites australis extracts have effects on the proliferation and

function of PBMCs

Keywords: Phragmites australis, PBMCs, IL-1β, IL-2 , immunomodulatory.

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH vi

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vii

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về cây Sậy 3

1.1.1 Vị trí phân loại thực vật 3

1.1.2 Đặc điểm thực vật 3

1.1.3 Thành phần hóa học 4

1.1.4 Bộ phận thường dùng 4

1.1.5 Tính vị, tác dụng 4

1.1.6 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam và trên thế giới 5

1.2 Tế bào đơn nhân trong máu ngoại vi (PBMCs) 6

1.2.1 Thành phần 6

1.2.2 Vai trò của tế bào PBMCs đối với hệ miễn dịch lympho T 6

1.2.3 Cytokin 9

1.2.4 Ứng dụng của dòng tế bào PBMCs trong các nghiên cứu in vitro 12

1.3 Các phương pháp đánh giá độ sống tế trên bào 14

1.3.1 Đánh giá độ sống tế bào bằng phương pháp nhuộm màu 14

1.3.2 Đánh giá độ sống tế bào bằng các phương pháp đo màu 15

1.3.3 Đánh giá độ sống tế bào bằng phương pháp đo huỳnh quang 17

1.3.4 Đánh giá độ sống tế bào bằng phương pháp phát quang 18

1.4 Kỹ thuật định lượng interleukin 19

1.4.1 Phương pháp miễn dịch hấp phụ gắn men (ELISA) 19

1.4.2 Phương pháp miễn dịch phóng xạ (Radio Immuno Assay – RIA) 19

1.4.3 Phương pháp miễn dịch điện hóa phát quang (Electrochemiluminescence immunoassay – ECLIA) 19

1.5 Kỹ thuật định lượng CD4, CD8 20

1.5.1 Phương pháp miễn dịch huỳnh quang 20

1.5.2 Phương pháp đếm tế bào dòng chảy 20

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Đối tượng nghiên cứu 21

2.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, thuốc thử 21

2.2.1 Thiết bị 21

2.2.2 Dụng cụ 22

2.2.3 Hóa chất 22

2.3 Dược liệu 23

2.3.1 Xác định độ ẩm, độ tro toàn phần của dược liệu 23

2.3.2 Điều chế cao chiết toàn phần cây Sậy 24

2.3.3 Điều chế các cao phân đoạn 25

2.3.4 Sơ bộ định tính các thành phần hóa học trong cao chiết dược liệu 26

2.3.5 Chuẩn bị các mẫu cao chiết theo thang nồng độ 26

2.4 Chiết PBMCs từ máu ngoại vi người 26

2.4.1 Nguyên tắc 26

2.4.2 Cách tiến hành 27

2.5 Khảo sát độ sống tế bào PBMCs dưới tác động in vitro của các cao chiết cây Sậy bằng phương pháp MTT 28

2.5.1 Nguyên tắc 28

2.5.2 Cách tiến hành 28

2.6 Đánh giá tác động của cao chiết toàn phần và cao phân đoạn lên sự sản xuất IL-1β in vitro của PBMCs 29

2.6.1 Nguyên tắc 29

2.6.2 Tiến hành 29

2.7 Đánh giá tác động của cao chiết toàn phần và cao phân đoạn lên sự sản xuất IL-2 in vitro của PBMCs 30

2.7.1 Nguyên tắc 30

2.7.2 Tiến hành 30

2.8 Khảo sát tác động của cao chiết cây Sậy trên tế bào lympho T 31

2.8.1 Nguyên tắc 31

2.8.2 Tiến hành 31

2.9 Xử lý thống kê 32

2.10 Đạo đức trong nghiên cứu 32

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ 33

3.1 Dược liệu 33

3.1.1 Thử độ tinh khiết dược liệu 33

3.2 Khảo sát độ sống tế bào PBMCs dưới tác động in vitro của các cao chiết cây Sậy bằng phương pháp MTT 37

3.2.1 Kết quả sau 24 giờ nuôi cấy 37

3.2.2 Kết quả sau 48 giờ nuôi cấy 40

3.2.3 Kết quả sau 72 giờ nuôi cấy 43

3.3 Khảo sát tác động của cao toàn phần và cao phân đoạn trên sự sản xuất IL -1β của tế bào PBMCs 45

3.3.1 Xây dựng đường tuyến tính nồng độ IL-1β 45

3.3.2 Kết quả tác động của các cao toàn phần và cao phân đoạn trên sự sản xuất IL-1β 46

3.4 Khảo sát tác động của cao toàn phần và cao phân đoạn trên sự sản xuất IL-2 của tế bào PBMCs 48

3.4.1 Xây dựng đường tuyến tính nồng độ IL-2 48

3.4.2 Kết quả tác động của các cao toàn phần và cao phân đoạn trên sự sản xuất IL-2 của tế bào PBMCs 48

3.5 Khảo sát tác động của cao toàn phần và cao phân đoạn cây Sậy lên tế bào lympho T CD4+ và CD8+ 50

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 52

4.1 Chuẩn bị cao chiết cây Sậy cho thử nghiệm 52

4.2 Khảo sát độ sống tế bào PBMCs dưới tác động in vitro của các cao chiết cây Sậy bằng phương pháp MTT 53

4.3 Tác động của các cao chiết cây Sậy lên sự sản xuất IL-1β của PBMCs 55

4.4 Tác động của các cao chiết cây Sậy lên sự sản xuất IL-2 của PBMCs 56

4.5 Đánh giá sự thay đổi tỉ lệ CD4+ và CD8+ trong quần thể lympho T dưới tác động của cao chiết cây Sậy 57

4.6 Hạn chế đề tài 57

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58

5.1 Kết luận 58

5.2 Kiến nghị 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Vai trò của một số cytokin trong quá trình miễn dịch 11

Bảng 2.2 Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 22

Bảng 2.3 Hóa chất, thuốc thử sử dụng trong nghiên cứu 23

Bảng 3.4 Độ ẩm dược liệu 33

Bảng 3.5 Độ tro dược liệu 33

Bảng 3.6 Độ ẩm và độ tro toàn phần của cao toàn phần 34

Bảng 3.7 Hiệu suất chiết cao toàn phần 34

Bảng 3.8 Hiệu suất chiết cao phân đoạn 35

Bảng 3.9 Kết quả sơ bộ định tính hóa thực vật của cao toàn phần và cao phân đoạn của dược liệu Sậy 36

Bảng 3.10 Tóm tắt kết quả tác động của các cao chiết Sậy lên tỉ lệ sống của PBMCs sau 24 giờ 37

Bảng 3.11 Tóm tắt kết quả tác động của các cao chiết Sậy lên tỉ lệ sống của PBMCs sau 48 giờ 40

Bảng 3.12 Tóm tắt kết quả tác động của các cao chiết Sậy lên tỉ lệ sống của PBMCs sau 72 giờ 43

Bảng 3.13 Kết quả định lượng IL-1β của các mẫu tế bào nuôi cấy sau 48 giờ 46

Bảng 3.14 Kết quả định lượng IL-2 của các mẫu tế bào nuôi cấy sau 48 giờ 49

Bảng 3.15 Sự thay đổi tỉ lệ tế bào lympho T CD4+ và CD8+ sau 48 giờ 51

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cây Sậy (Phragmites australis (Cav.), Poaceae) 4

Hình 2.2 Sơ đồ chiết xuất cao toàn phần 24

Hình 2.3 Sơ đồ chiết cao phân đoạn 25

Hình 2.4 Máu ngoại vi sau khi chiết bằng dung dịch ficoll 27

Hình 3.5 Tác động của các cao chiết lên tỉ lệ sống của PBMCs sau 24 giờ 38

Hình 3.6 Tác động của các cao chiết lên tỉ lệ sống của PBMCs sau 48 giờ 41

Hình 3.7 Tác động của các cao chiết lên tỉ lệ sống của PBMCs sau 72 giờ 44

Hình 3.8 Đường tuyến tính của IL-1β chuẩn 46

Hình 3.9 Đường tuyến tính của IL-2 chuẩn 48

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

Từ viết

tắt Tên đầy đủ Ý nghĩa tiếng Việt

ADN Acid deoxyribonucleic

ALT Alanine aminotransferase

AST Aspartate aminotransferase

BSA Bovine serum albumin Albumin huyết thanh bò

CD Cluster of differentiation Cụm biệt hóa

DMSO Dimethyl sulfoxid

DTH Delayed-type hypersensitivity Quá mẫn muộn

ELISA Enzyme linked immunosorbent assay Thử nghiệm miễn dịch

gắn menFBS Fetal bovine serum Huyết thanh thai bòHDL High-density lipoprotein Lipoprotein tỉ trọng caoHPLC High-performance liquid

chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năngcao

IC50 Inhibition concentration of 50% Nồng độ ức chế 50%

IL Interleukin

INF-γ Interferon gamma

LDH Lactic acid dehydrogenase

LDL Low-density lipoprotein Lipoprotein tỉ trọng

thấpLPS Lipopolysaccharides

MHC Major histocompatibility complex Phức hợp tương thích

mô chínhMIF Macrophage migration inhibitory factor Yếu tố ức chế di chuyển

đại thực bàoMTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-

diphenyl tetrazolium bromid

NK Natural killer Tế bào diệt tự nhiên

NO Nitric oxid

OD Optical density Mật độ quang

PBMCs Peripheral blood mononuclear cell Tế bào đơn nhân máu

ngoại vi

PBS Phosphat-buffer saline Đệm muối phosphatPHA Phytohaemagglutinin

ROS Reactive oxygen species

RPMI Roswell Park Memorial Institute

SD Standard deviation Độ lệch chuẩn

TNF-β Tumor necrosis factor beta Yếu tố hoại tử khối u

betaVLDL Very low-density lipoprotein Lipoprotein tỉ trọng rất

thấp

ĐẶT VẤN ĐỀ

Theo báo cáo của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), việc sử dụng các bài thuốc truyềnthống hoặc có nguồn gốc dược liệu đang gia tăng ở các nước [57] Tại Việt Nam,các thuốc có nguồn gốc tự nhiên được nghiên cứu ngày càng phát triển để phục vụcông tác điều trị dự phòng và điều trị nhiều bệnh lý, kể cả bệnh ung thư [11] Tuynhiên vẫn còn nhiều dược liệu được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian nhưngchưa được nghiên cứu rõ tác dụng, độc tính để phát triển thành nguyên liệu làm

thuốc Cây Sậy (Phragmites australis (Cav.)) được nghiên cứu trên thế giới chủ

yếu về khả năng bảo vệ môi trường [31] Ở Việt Nam, cây Sậy được sử dụng theokinh nghiệm dân gian để chữa viêm dạ dày, viêm phế quản mạn tính, trị cảm nóng,phát ban, viêm thận cấp, thanh nhiệt giải độc, Một số bộ phận dùng của cây Sậy

đã được phát triển thành thuốc, ví dụ Lô căn là thành phần của rễ cây Sậy, đượcbào chế để làm thuốc chữa bệnh với công dụng thanh nhiệt, lợi thủy, sinh tân vàmột số bệnh lý khác Gần đây, một nghiên cứu đã khảo sát độc tính cấp và khảnăng chống oxy hoá của cây Sậy [7], nhưng vẫn chưa có nghiên cứu về tác dụngđiều hòa miễn dịch của cây Sậy

Có rất nhiều mô hình để nghiên cứu đánh giá độc tính và hiệu quả của dược liệutrong điều trị các bệnh liên quan đến hệ miễn dịch Các nghiên cứu có thể sử dụng

mô hình in vitro hoặc in vivo Các mô hình được thực hiện nhằm đánh giá hiệu quả

của các dược liệu có nguồn gốc tự nhiên trong sự tăng sinh, hoạt hóa các tế bàomiễn dịch cho đến ức chế, giảm hoạt tính của chúng [11], [48] Một trong những mô

hình được sử dụng rộng rãi là mô hình in vitro nuôi cấy tế bào miễn dịch đơn nhân

phân lập từ máu ngoại vi người để thử hoạt tính làm tăng sinh hoặc ức chế miễndịch của dược liệu Để hiểu rõ hơn về độc tính và tác dụng điều hòa miễn dịch của

cây Sậy, chúng tôi thực hiện đề tài “Khảo sát tác động điều hòa miễn dịch in vitro của cây Sậy Phragmites australis (Cav.), Poaceae trên tế bào đơn nhân máu ngoại

vi người”, với các mục tiêu:

1 Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học trong cao chiết toàn phần và cao phân đoạncủa cây Sậy

2 Khảo sát tác động của các cao chiết toàn phần và cao phân đoạn của cây Sậy lên

độ sống của tế bào đơn nhân trong máu ngoại vi (PBMCs) trên mô hình in vitro

bằng phương pháp MTT

3 Khảo sát tác động của các cao chiết cây Sậy lên sự thay đổi thành phần CD4+,CD8+ của tế bào lympho T và sản xuất interleukin-1β và interleukin-2 từ tế bàoPBMCs

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về cây Sậy

Cây Sậy thường (Phragmites australis) là loài cây mọc hoang ở bờ nước, đầm lầy

nơi ẩm phân bố nhiều ở các tỉnh thành phía Nam nước ta Ngoài ra còn có cây Sậy

núi (Arundo donax) mọc trên cạn, phân bố nhiều ở các tỉnh phía Bắc Cây Sậy thuộc

họ Lúa (Poaceae) Cây Sậy được sử dụng cho nhiều mục đích, đặc biệt làm thànhphần của các bài thuốc dân gian [2], [3]

rủ cong, dài 15 – 45 cm, cuống chung thường có thân mềm dày đặc ở gốc, nhánh rấtmảnh, nhẵn, lá hơi ráp, mọc gần vòng Bông chét mang 3 – 6 hoa, mày xòe ra khichín, rất nhọn thường xuyên ở đỉnh Mày hoa hình trái xoan, xẻ đôi ở đỉnh [2], [39].Đặc điểm sinh thái: cây Sậy mọc hoang trên đất ẩm dọc các bờ sông suối và đầmlầy Ra hoa từ tháng 11 đến tháng 1 năm sau

Hình 1.1 Cây Sậy (Phragmites australis (Cav.), Poaceae)

1.1.3 Thành phần hóa học

Theo Duke, mỗi 100 g sậy chứa: 415 calo, 10,6 g protein, 2,1 g chất béo, 72,7 gcarbohydrat, 31,9 g chất xơ, 14,6 g tro, 480 mg canxi, 60 mg phospho và 130 mgmagie Lá có chứa 17,1 g protein, 3,5 g chất béo, 63,7 g tổng carbohydrat, 27,4 g chất

xơ, và 15,7 g tro Thân cây có chứa 4,8 g protein, 0,8 g chất béo, 90,0g carbohydrat,41,2 g chất xơ và 4,4 g tro [19] Theo Cẩm nang Hager (List và Horhammer 1969-1979), 100 g thảo mộc tươi chứa 5,15 g Vitamin A và 91,1 mg Vitamin C, Vitamin B1

và B2, β-amyrin, taraxerol và taraxeron (C30H48O) Thân rễ chứa 5,3% độ ẩm; 5,2%chất nitơ; 0,9% chất béo; 5,2% sucrose; 5,8% tro (giàu silica) Phân tích cây non đã chothấy có 11,4% protein; 43,1% carbohydrat; 10,8% chất khoáng (có hàm lượng silicacao); canxi 0,94% (CaO); và 0,39% phospho (P2O5) Cây Sậy có chứa sáp và saponin

Lá có hàm lượng cao acid ascorbic (200 mg/100 g lá) [47]

buốt, viêm bàng quang, đau dạ dày nôn mửa, phổi nóng ho khan, phổi có mủ, hokhạc ra máu mủ, miệng khô khát, tiểu gắt, tiểu ra máu, thống phong Ngoài ra, rễcủa cây Sậy là một bài thuốc trong Đông y có thể trị một số bệnh trong đó có đáitháo đường, giảm acid uric [2].

1.1.6 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam và trên thế giới

Trong y học cổ truyền Trung Quốc, thân rễ cây Sậy (Phragmites australis) từ lâu đã

được sử dụng để điều trị bệnh viêm gan Chen và cộng sự đã tiến hành đánh giáhoạt tính bảo vệ gan và chống oxy hóa của cao khô thân rễ Sậy sau khi chiết vớinước Kết quả thử nghiệm độc tính cấp tính cấp trên chuột cho thấy cao khô Sậykhông gây độc vì liều 2000 mg/kg cân nặng không gây ra các triệu chứng nhiễmđộc hoặc tử vong Cao chiết nước từ thân rễ Sậy liều 500 mg/kg có tác động bảo vệenzym chuyển hóa thuốc trong ti thể gan thể hiện qua việc làm giảm gia tăng liềugây ngủ trên chuột bị tổn thương gan gây ra bởi carbon tetrachlorid (CCl4) Chuộtđược cho uống cao khô Sậy 5 ngày trước khi dùng CCl4 làm giảm đáng kể sự tăngenzym gan trong huyết thanh như AST, ALT, LDH Thông qua việc đánh giá hoạttính bắt gốc hydroxyl và gốc anion superoxide, tác giả đã chỉ ra rằng hoạt tínhchống oxy hóa phụ thuộc vào liều (tỉ lệ 62% với nồng độ cao 50 mg/mL) cho thấykhả năng bảo vệ gan [14]

Một nghiên cứu khác chỉ ra rằng lá cây Sậy có tác dụng kháng viêm và kháng virus.Với thử nghiệm gia tăng chất trung gian hóa học NO, ROS khi sử dụng LPS để kíchthích trên tế bào RAW264.7, kết quả có sự giảm đáng kể mức NO tạo thành vớimẫu tế bào có cao nồng độ 100 µg/mL so với mẫu tế bào chỉ có LPS, cao chiết thô

ở tất cả nồng độ (1, 10, 50, 100 µg/mL) làm giảm hoàn toàn sinh ra ROS Cytokintiền viêm TNF- bị ức chế bởi nồng độ cao trên 100 µg/mL, đối với IL-1β là 10 và

100 µg/mL Tín hiệu ngoại bào Erk1/2, P38MAPK, C-Jun và kappaB được hoạt hóabởi LPS có thể bị ức chế bởi cao chiết Cao chiết lá Sậy còn ức chế đáng kể sự saochép virus herpes 1 ở bò trên tế bào MDBK [58]

Một nghiên cứu khác cho thấy dịch chiết nước thân rễ Sậy Phragmites australis có

khả năng kiểm soát lượng đường huyết trong bệnh đái tháo đường, bảo vệ tế bào β

tuyến tụy, cải thiện quá trình chuyển hóa glucose và biến chứng tim mạch do đáitháo đường Nghiên cứu sử dụng mô hình gây bệnh đái tháo đường trên chuột bằngalloxan, chuột mang bệnh đái tháo đường sau 21 ngày cho sử dụng cao chiết thân rễSậy liều lượng 200 mg/kg cân nặng giảm đáng kể nồng độ glucose huyết (6,38 ±0,11 mmol/L) so với nhóm chuột bị đái tháo đường không được cho dùng cao chiết

rễ Sậy (10,2 ± 0,41 mmol/L) Nhóm chuột đái tháo đường được cho dùng cao chiếtSậy giảm mức cholesterol toàn phần, triglycerid, LDL, VLDL và tăng HDL so vớinhóm không sử dụng Chỉ số AST, ALT, amylase, được cải thiện ở nhóm thử.Hình ảnh mô học của tuyến tụy cho thấy khu vực tập trung của hoại tử và thâmnhiễm mỡ ở nhóm chuột đái tháo đường không được điều trị, nhưng những tổnthương này không có ở tuyến tụy của nhóm chuột được điều trị bằng chiết xuất từ

thân rễ Sậy Phragmites australis [21].

Có rất nhiều nghiên cứu về cây Sậy trong bảo vệ môi trường sinh thái vì cây Sậy cókhả năng tạo phức chelat với một số kim loại như sắt, đồng, kẽm [45]

1.2 Tế bào đơn nhân trong máu ngoại vi (PBMCs)

1.2.1 Thành phần

Tế bào máu đơn nhân ngoại vi người (human peripheral blood mononuclear cells PBMCs) là một hỗn hợp các tế bào máu có một nhân tròn, bao gồm tế bào lympho(lympho T, lympho B và tế bào giết tự nhiên (natural killer cells - NK cells), tế bàomono, tế bào tua (dendritic cells) Tần suất các tế bào này biến động giữa cá nhânnhưng thông thường tế bào lympho sẽ trong khoảng 70 – 90%, monocyte từ 10 –20%, tế bào dendritic khá hiếm chiếm khoảng 1 – 2% [38], [53]

-1.2.2 Vai trò của tế bào PBMCs đối với hệ miễn dịch lympho T

Các tế bào PBMCs có vai trò quan trọng trong miễn dịch dịch thể và miễn dịch tếbào [1]

1.2.2.1 Tế bào lympho T

Lympho T là tế bào phụ trách đáp ứng miễn dịch tế bào với nhiều phân nhóm gồm:

T giúp đỡ (T helper – Th) và T gây quá mẫn chậm (T delayed type hypersensitivity– TDTH) có protein màng CD4+, T độc (T cytotoxic – Tc) và T ức chế (T suppressor

– Ts) có protein màng CD8+ Tế bào Th kích thích sự tăng trưởng và biệt hóa củalympho B bằng cách sản xuất các cytokin (IL-4, IL-6), trong khi tế bào Tc có vai trògây độc và loại trừ các tế bào nhiễm virus, các tế bào u Ngoài ra, các tế bào Ts cóchức năng điều hòa, kiểm soát quá trình miễn dịch của cơ thể và tế bào TDTH cóchức năng loại trừ kháng nguyên [1], [6].

a Chức năng điều hòa, kiểm soát và nhận biết kháng nguyên của tế bào Th

Th chi phối toàn bộ các hoạt động hiệu ứng, tức là hoạt động của các tế bào miễndịch, bao gồm sự sản xuất kháng thể của tế bào lympho B và vai trò gây độc của tếbào Tc Th có thể tiết ra các cytokin giúp cho sự sinh sản đủ mức của các tế bào hiệuứng, giúp chúng hoạt hóa đủ mức để loại trừ kháng nguyên [1], [6]

Th có khả năng nhận biết kháng nguyên ngoại lai do phân tử MHC lớp II trình ra.Phân tử CD4 có thể gắn kết đặc hiệu với phân tử MHC (II) do vậy Th có điều kiệntiếp cận với (mảnh) kháng nguyên do MHC (II) trình ra bề mặt đại thực bào Việctrực tiếp nhận biết kháng nguyên do thụ thể của tế bào T (T cell receptor – TCR) Th

chi phối toàn bộ các hoạt động hiệu ứng, tức là tức là hoạt động của các tế bào miễndịch, bao gồm sự sản xuất kháng thể của tế bào lympho B và vai trò gây độc của tếbào Tc và vai trò gây viêm của TDTH Th có thể tiết ra các cytokin giúp cho sự sinhsản đủ mức của các tế bào hiệu ứng, giúp chúng hoạt hóa đủ mức để loại trừ khángnguyên Sự hoạt hóa của Th sẽ được kiểm soát nhờ chính sản phẩm và hiệu quả của

tế bào hiệu ứng [1], [6]

Khi được hoạt hóa, Th sẽ trở thành tế bào hành sự (effector cells), chúng được chiathành 2 phân nhóm khác nhau về cytokin chúng sản xuất ra: Th1 sản xuất chủ yếu làTNF-β, INF-γ, IL-2 đóng vai trò quan trọng trong đáp ứng miễn dịch tế bào Th2 sảnxuất IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13 đóng vai trò giúp đỡ hoạt hóa lympho B tức làgiúp cho đáp ứng miễn dịch đặc hiệu [1], [6]

b Chức năng kiểm soát của Ts

Ts là phân nhóm của lympho T, có CD8+ trong đa số trường hợp, là phân nhóm cóchức năng ức chế quá trình miễn dịch Ts ức chế các phản ứng loại trừ khángnguyên do tế bào Th phát động nếu phản ứng này diễn ra quá mức Ngoài ra, Ts còn

có chức năng kìm hãm suốt đời các tế bào Th “tự phản ứng”, tức là những tế bào Th

có tiềm năng chống lại những kháng nguyên của chính cơ thể Nhờ cơ chế điều hòanày mà cơ thể không mắc các bệnh tự miễn [1]

c Chức năng nhận biết và loại trừ kháng nguyên của Tc

Phân tử MHC (I) đưa kháng nguyên nội sinh ra bề mặt tế bào, và liên kết đặc hiệuvới Tc mang protein bề mặt CD8+, việc trực tiếp nhận biết do TCR của Tc Tế bào

Tc chống lại những tế bào mang kháng nguyên nội sinh, tức là kháng nguyên đượchình thành từ trong nội bào, như tế bào nhiễm virus, tế bào ung thư, tế bào ghép dịgen Sự hoạt hóa tế bào Tc dẫn đến sự tiết ra các độc tố, gây hủy hoại các tế bàoxung quanh Tc có khả năng tạo ra tế bào trí nhớ nên nhiều bệnh được miễn dịchsuốt đời như đậu mùa, sởi, thủy đậu,…[1]

d Chức năng loại trừ kháng nguyên của TTDH

Các tế bào TDTH mang dấu ấn CD4+ trên bề mặt tế bào, có vai trò trong việc tạo ramột ổ viêm nhằm khu trú kháng nguyên lại và loại trừ kháng nguyên tại chỗ TDTH

được hoạt hóa bởi IL-2 do tế bào Th và đại thực bào tiết ra Sau khi được hoạt hóa,các tế bào TDTH tập trung vào nơi có kháng nguyên, sinh sản để đạt nồng cộ cao tạikhu vực mà kháng nguyên khu trú Các tế bào TDTH tiết ra các cytokin tác động lênquá trình miễn dịch, bao gồm yếu tố hoạt hóa đại thực bào (MAF), có tác dụng kíchthích đại thực bào tiết ra các cytokin gây viêm (IL-6, TNF), và yếu tố ức chế đạithực bào (MIF), có tác dụng ức chế đại thực bào di chuyển ra khỏi ổ viêm Ổ viêm

do các tế bào TDTH do vậy xảy ra chậm (hình thành sau 48 – 72 giờ) và tập trungdày đặc các tế bào lympho và đại thực bào Đây là cách rất hiệu quả để cơ thể loạitrừ các kháng nguyên vi khuẩn (lao, phong, nấm,…) và nhiều kháng nguyên hóachất, thuốc Khi đáp ứng miễn dịch tạo ra bởi các tế bào TDTH quá mức cần thiết sẽgây ra phản ứng quá mẫn typ IV (quá mẫn chậm) [1]

1.2.2.2 Vai trò của tế bào lympho B

Tế bào lympho B có vai trò sản xuất kháng thể và chịu sự chi phối chặt chẽ của tếbào Th Tế bào Th tự hoạt hóa bởi chính IL-2 do nó tiết ra, sau đó tiết ra IL-4 giúp

kích thích tế bào lympho B phát triển và IL-6 giúp biệt hóa tế bào lympho B thành

tế bào trí nhớ [1], [6]

1.2.2.3 Vai trò của tế bào NK

Tế bào NK là những tế bào lớn, có hạt, trên bề mặt tế bào mang dấu ấn của tế bàolympho chưa trưởng thành (CD38+) nhưng không biệt hóa thành tế bào lympho Thay B Chất gây hoạt hóa tế bào NK là IL-2 (sản xuất từ lympho T và đại thực bào).Vai trò chủ yếu của tế bào NK là diệt “tự nhiên” các tế bào ung thư xuất hiện trong cơthể, kiểm soát sự miễn dịch, bảo vệ cơ thể chống lại sự nhiễm virut Các tế bào NK cóthể nhận diện các tế bào “bệnh” mà không cần thông qua tín hiệu của lớp phù hợp

mô, tức là không cần thông qua trình diện kháng nguyên – kháng thể, và không cầnphải hoạt hóa để trở thành dạng hoạt động Do đó các tế bào NK tạo đáp ứng miễndịch nhanh, đóng vai trò quan trọng trong miễn dịch tự nhiên của cơ thể [1] [49]

1.2.2.4 Vai trò của tế bào tua

Tế bào tua đóng vai trò quan trọng trong miễn dịch tự nhiên của cơ thể để chống lại

sự nhiễm khuẩn Ngoài ra, chúng còn có vai trò liên kết giữa miễn dịch tự nhiên vàmiễn dịch thu nhận của cơ thể Các tế bào tua nhận biết kháng nguyên, và biểu lộcác phân tử kháng nguyên cho tế bào lympho nhận diện Tế bào tua hoạt hóa tiết racác cytokin như IL-4, IL-12, TNF-α và INF-γ, qua đó kích thích đáp ứng miễn dịch

tự nhiên, cũng như đáp ứng miễn dịch dịch thể của cơ thể Tế bào tua còn có vai tròtrong sự hoạt hóa tế bào T non, tế bào B non, tế bào B trí nhớ [1], [25]

số cytokin có tác động hiệp đồng với nhau, như IL-4 và IL-5 hiệp đồng hoạt hóa tếbào B tiết kháng thể IgE Ngược lại, một số cytokin lại có tác động đối khángnhau, như INF-γ ức chế IL-4 trong hoạt động tiết kháng thể IgE của tế của tế bàolympho B [1].

Các cytokin tồn tại trong máu trong một thời gian ngắn và ở một nồng độ rất thấp.Tuy nhiên, ở nồng độ 10 - 15 M các cytokin đã có tác dụng sinh học: tác động trêncác tế bào, điều hòa thụ thể cytokin, kích thích tế bào tiết cytokin khác,…Cáccytokin đóng vai trò quan trọng trong quá trình đáp ứng miễn dịch của cơ thể, biểuhiện qua số lượng và chức năng của các cytokin tham gia điều hòa quá trình miễndịch và điều hòa sự tương tác giữa các tế bào miễn dịch [1] Một số cytokin và vaitrò của chúng trong quá trình miễn dịch đã được xác định trong bảng 1.1 [1], [6]

Bảng 1.1 Vai trò của một số cytokin trong quá trình miễn dịch

Cytokin Nguồn gốc Tế bào đích Tác động

IL-1 Đơn nhân thực

bào

Tế bào Th Kích thích tế bào Th tiết IL-2

Tế bào lympho B Kích thích tế bào lympho B

tăng sinh, hoạt hóa, biệt hóa,sản xuất kháng thể

Tế bào NK Hoạt hóa tế bào NKBạch cầu trung

tính

Hoạt hóa và hóa hướng động

tế bào bạch cầu trung tínhIL-2 Tế bào Th1 đã

được hoạt hóa

Hầu hết các tế bàomiễn dịch

Kích thích hầu hết các tế bàomiễn dịch tăng sinh và pháttriển, bao gồm tế bàolympho T, tế bào lympho B,đại thực bào, tế bào NK,…

Tế bào Tc

Tế bào NK

IL-3 Tế bào lympho T Kích thích phát triển tế bào

máu đa năng

Tế bào mast Kích thích phát triển tế bào

mastIL-4 Tế bào Th2 Tế bào lympho T Kích thích tế bào lympho T

tăng trưởng

Tế bào mast Tế bào lympho B Kích thích, hoạt hóa và tăng

biểu lộ phân tử phù hợp môlớp II của tế bào lympho BĐại thực bào Tăng biểu lộ phân tử phù

hợp mô lớp I và II của đạithực bào

IL-6 Tế bào Th2 Tế bào lympho B Tăng sinh, biệt hóa tế bào

lympho B sản xuất kháng thể

Cytokin Nguồn gốc Tế bào đích Tác động

IL-10 Tế bào Th2 Tế bào Th1 Ức chế tế bào Th1, tế bào

NK, đơn nhân thực bào tiếtcytokin

Tế bào TCD8 Tế bào NK

Tế bào lympho B Đơn nhân thực bào

Tế bào lympho B Kích thích tế bào lympho B

tăng sinh và sản xuất khángthể

Tế bào mast Tăng trưởng tế bào mastIL-12 Tế bào lympho B Tế bào Tc, Th1, Th2 Cảm ứng tế bào Th1 và ức

chế tế bào Th2

Đơn nhân thựcbào

Tế bào NK Tăng sinh và tăng hoạt hóa

tế bào NK đã hoạt tácINF Đại thực bào Đại thực bào Ngăn không cho virus xâm

TNF Đại thực bào Tương tự IL-1 Tương tự IL-1

Tế bào Th1 Gây độc và hoại tử tế bào u

1.2.4 Ứng dụng của dòng tế bào PBMCs trong các nghiên cứu in vitro

1.2.4.1 Sàng lọc thuốc mới tác động lên hệ miễn dịch

PBMCs được dùng để sàng lọc, nghiên cứu các thuốc, hợp chất tiềm năng vớikhả năng điều hòa miễn dịch có ứng dụng trong điều trị các bệnh lý miễn dịchtheo hướng là ức chế miễn dịch, kích thích miễn dịch hoặc kháng viêm Các

hướng nghiên cứu này thường đo lường sự thay đổi về mức độ tăng sinh in vitro

của tế bào PBMCs, sự thay đổi trong sản xuất các cytokin, thay đổi trong biểuhiện gen, thay đổi hình thái học tế bào, các dấu ấn bề mặt, các tế bào nhóm dướitrong quần thể PBMCs [38]

Tình trạng viêm có liên quan trực tiếp đến một số bệnh như ung thư, tim mạch,thoái hóa thần kinh PBMCs có thể được sử dụng trong các thử nghiệm sàng lọcthuốc để đo hoạt tính gây viêm của các phân tử nhỏ Sự phân hủy neopterin vàtryptophan, các dấu hiệu hoạt hóa hệ thống miễn dịch và phản ứng viêm, có thểđược xác định bằng mô hình PBMCs với phương pháp ELISA và HPLC [29].

1.2.4.2 Đánh giá độc tính của thuốc mới

Đây có thể coi là ứng dụng quan trọng nhất của PBMCs trong nghiên cứu, giúpđánh giá độc tính của các hợp chất thuốc mới tiềm năng trên hệ miễn dịch Độc tínhcủa thuốc trên PBMCs có thể gây ra nhiều tác dụng phụ nghiêm trọng, thậm chí đedọa tính mạng của bệnh nhân, bao gồm ức chế và độc trên hệ miễn dịch PBMCs làcông cụ quan trọng trong các nghiên cứu tiền lâm sàng giúp xác định giới hạn liềucủa các thuốc mới [38]

Nhiều nghiên cứu trên các thuốc hoặc chất điều trị ung thư thường sử dụng PBMCsnhư tế bào thường để đánh giá độc tính chọn lọc của thuốc hoặc hợp chất trên tế bàoung thư và ít hoặc không gây độc tính trên tế bào thường Thông số để đánh giá làchỉ số chọn lọc (Selectivity Index – SI) được biểu diễn bằng tỷ số của IC50 của tếbào thường và IC50 của tế bào ung thư Chỉ số SI càng lớn, chất hoặc thuốc càngchọn lọc trên tế bào ung thư [33]

1.2.4.3 Nghiên cứu so sánh song song

Các nhà nghiên cứu cần tế bào PBMCs bình thường và tế bào PBMCs có bệnh lý để

so sánh trong nghiên cứu song song nhằm tìm hiểu cơ chế ở mức độ phân tử củamột đáp ứng có hại cụ thể Hiểu rõ quá trình hay phân tử nào đã tác động giúp quátrình nghiên cứu thuốc mới tiến triển nhanh hơn, hiệu quả cao hơn và giảm thiểuđộc tính trên hệ miễn dịch [38]

1.2.4.4 Liệu pháp miễn dịch ung thư

Một liệu pháp mới điều trị ung thư dựa trên PBMCs là liệu pháp CAR T-cell(Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-Cell), tế bào T được phân lập từ bệnh nhân

ung thư và được biến đổi di truyền ex vivo sau đó truyền lại vào bệnh nhân Các

biến đổi này giúp tế bào T nhắm vào tế bào ung thư và tiêu diệt Liệu pháp CAR

T-cell có tính cách mạng vì nó kích thích và làm mạnh hệ miễn dịch của bệnh nhân đểchống lại tế bào ung thư một cách đặc hiệu Ngược lại, nhiều trị liệu trong ung thưbao gồm ly giải cả tế bào ung thư và tế bào khỏe mạnh và không sinh ra đáp ứngmiễn dịch có lợi [35].

1.2.4.5 Liệu pháp tái sinh

Tế bào đơn nhân máu ngoại vi đã được báo cáo là chứa vô số các quần thể tế bàotiền thân đa năng khác biệt và có tiềm năng biệt hóa thành các tế bào máu, tế bàonội mô, tế bào gan, tế bào cơ tim, tế bào cơ trơn, nguyên bào xương, tế bào hủyxương, biểu mô tế bào, tế bào thần kinh, hoặc nguyên bào sợi myofi trong điều kiệnthích hợp Hơn nữa, việc cấy ghép những tế bào có nguồn gốc từ PBMCs có thể táitạo các mô và phục hồi chức năng sau chấn thương [56]

1.3 Các phương pháp đánh giá độ sống tế trên bào

Thử nghiệm in vitro đánh giá sự tăng trưởng tế bào nuôi cấy thường được sử dụng

để đánh giá độc tính hóa chất và sàng lọc thuốc Ứng dụng của phương pháp này tạo

sự chú ý trong những năm gần đây Hiện nay các phương pháp này được sử dụngnhằm nghiên cứu về ung thư để đánh giá độc tính của thuốc và ức chế tăng trưởng

tế bào ung thư trong phát triển thuốc mới Các phương pháp đánh giá độc tính tếbào dựa trên việc đánh giá các chức năng tế bào, bao gồm: tính nguyên vẹn củamàng tế bào, tính thấm của màng tế bào, hoạt động của các enzym, sự sản xuấtATP, sự sản xuất các co-enzym và hoạt động thu hồi các nucleotid [13]

Thử nghiệm tăng trưởng và độc tính tế bào có một vài ưu điểm như tốc độ thực hiệnnhanh, giảm chi phí, có khả năng tự động hóa, sử dụng tế bào từ người, không cần

sử dụng đến động vật Tuy nhiên phương pháp này vẫn chưa thể thay thế các thửnghiệm trên động vật [17]

1.3.1 Đánh giá độ sống tế bào bằng phương pháp nhuộm màu

Xác định tỷ lệ tế bào sống/chết thông qua đánh giá tính toàn vẹn của màng tế bào:những tế bào sống (màng tế bào nguyên vẹn) không bắt màu thuốc nhuộm, do đókhông màu, trong khi những tế bào chết (màng tế bào mất tính thấm chọn lọc hoặc

không còn nguyên vẹn) bắt màu thuốc nhuộm và có màu Một số thuốc nhuộmthường dùng như trypan blue, eosin, đỏ Congo, erythrosin B,… [13], [52].

Phương pháp nhuộm màu có ưu điểm là thực hiện nhanh, thao tác đơn giản, sốlượng tế bào dùng trong thử nghiệm nhỏ, tiết kiệm chi phí nhưng không phân biệtđược tế bào sống và tế bào bị mất chức năng, thao tác đếm bằng buồng đếm dễ gâysai số và khó khăn khi thực hiện với số lượng mẫu lớn [13]

1.3.1.1 Nhuộm trypan blue

Phương pháp nhuộm này được sử dụng để xác định số lượng tế bào còn sống và/hoặc tế bào chết trong huyền phù Trypan blue là một phân tử tích điện âm lớn Thửnghiệm nhuộm trypan blue dựa trên nguyên tắc rằng các tế bào sống có màng tế bàonguyên vẹn sẽ không bắt màu thuốc nhuộm, trong khi tế bào chết sẽ bắt màu Sốlượng tế bào sống và/hoặc chết trên mỗi đơn vị thể tích được xác định bằng kínhhiển vi [13]

- Ưu điểm: phương pháp này đơn giản, rẻ tiền và là một chỉ dấu tốt về tính toàn vẹncủa màng tế bào Tế bào chết bị nhuộm màu xanh trong vài giây khi tiếp xúc vớihóa chất nhuộm [13]

- Nhược điểm: thường sử dụng buồng đếm hemocymeter để đếm tế bào nên có thểxảy ra sai số khoảng 10% Sai số trong việc đếm tế bào dẫn đến pha loãng tế bàokhông được chính xác [13]

1.3.1.2 Nhuộm erythrosine B

Erythrosine B là thuốc nhuộm để đếm tế bào Nguyên tắc của nhuộm erythrosine Btương tự như nhuộm trypan blue Mặc dù erythrosine B là sự lựa chọn thay thế antoàn hơn nhưng lại không được sử dụng rộng rãi để đếm tế bào [13] [30]

- Ưu điểm: chi phí thấp, linh hoạt và an toàn [13], [30]

- Nhược điểm: tốn nhiều thời gian và công sức [13], [30]

1.3.2 Đánh giá độ sống tế bào bằng các phương pháp đo màu

Nguyên tắc của phương pháp đo màu là đo lường chỉ dấu sinh hóa để đánh giáhoạt động chuyển hóa của tế bào Thuốc thử được sử dụng trong phương pháp đomàu sẽ tạo màu đáp ứng với tế bào sống từ đó cho phép định lượng tế bào sống

bằng máy quang phổ Phương pháp đo màu áp dụng được cho dòng tế bào huyềnphù và tế bào bám dính, dễ dàng thực hiện và tương đối kinh tế [13] Một số thửnghiệm đo màu:

1.3.2.1 Thử nghiệm MTT

MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2–5-diphenyltetrazolium bromide) là thửnghiệm đo màu thường được sử dụng để đánh giá độ sống và độc tính tế bào Thửnghiệm này xác định khả năng sống của tế bào chủ yếu thông qua xác định chứcnăng ty thể của tế bào bằng cách đo hoạt động của các enzym ty thể như succinatedehydrogenase MTT màu vàng bị khử thành màu tím formazan bởi NADH, sảnphẩm tạo thành có thể được định lượng bởi độ hấp thụ ánh sáng tại bước sóngthích hợp [13], [24], [36]

- Ưu điểm: tốt hơn phương pháp nhuộm vì dễ sử dụng, an toàn, độ lặp lại cao, vừa

để đo lường tương đối tốc độ tăng sinh tế bào trong nuôi cấy Nguyên tắc của xétnghiệm này dựa trên sự chuyển đổi muối tetrazolium WST-1 thành formazan hòatan tốt trong nước bởi enzym dehydrogenase ty thể với sự hiện diện của chất nhậnđiện tử trung gian, chẳng hạn như mPMS (1-methoxy-5-methyl-phenaziniummethyl sulfate) Muối tan trong nước được giải phóng vào môi trường nuôi cấy tếbào Trong thời gian ủ, phản ứng tạo ra sự thay đổi màu sắc tỷ lệ thuận với số lượngenzym dehydrogenase của ty thể trong môi trường nuôi cấy và do đó thử nghiệm đolường hoạt động trao đổi chất của tế bào [13]

- Ưu điểm: dễ sử dụng, an toàn, độ lặp lại cao, đánh giá được độ sống và độc tính

tế bào Chỉ thị đỏ phenol trong môi trường nuôi cấy không ảnh hưởng đến phản

ứng nhuộm màu Sản phẩm tạo màu tại điểm cuối tan trong nước nên không cầnhòa tan và ủ [13].

- Nhược điểm: thời gian ủ tiêu chuẩn WST-1 là 2 giờ Việc bổ sung một lần WST-1

có thể phản ánh tác động của các tác nhân thử nghiệm tại các thời điểm khác nhautuy nhiên xu hướng đối với độ sống tế bào vẫn chưa rõ ràng [13]

1.3.3 Đánh giá độ sống tế bào bằng phương pháp đo huỳnh quang

Thử nghiệm đo huỳnh quang đánh giá độ sống và độc tế bào sử dụng kính hiển vihuỳnh quang, máy đo huỳnh quang, máy đọc đĩa huỳnh quang hoặc máy đếm tế bàodòng chảy Phương pháp đo huỳnh quang có rất nhiều ưu điểm so với phương phápnhuộm truyền thống hoặc đo màu đặc biệt về độ nhạy nhưng kết quả đo có thể bịảnh hưởng bởi các hóa chất, thuốc thử dùng trong thử nghiệm [13]

Các thuốc thử (alamarBlue, 5-carboxyfluorescein diacetate) là những chất có thểthấm qua màng tế bào và không phát huỳnh quang Những tế bào sống có khả năngchuyển hóa những thuốc thử này thành những sản phẩm có huỳnh quang Cường độphát huỳnh quang tỷ lệ thuận với tỷ lệ tế bào sống [13]

1.3.3.1 AlamarBlue (AB)

Thử nghiệm AlamarBlue còn được biết đến là thử nghiệm giáng hóa resazurin Thửnghiệm resazurin dựa trên sự giáng hóa nội bào của resazurin thành resorufin bởicác tế bào sống, tế bào có hoạt động trao đổi chất Khi resazurin khuếch tán quamàng tế bào nó bị chuyển hóa bởi các tế bào sống thành huỳnh quang, sản phẩmmàu hồng [13], [24]

- Ưu điểm: resazurin có độ nhạy cao và đáng tin cậy hơn các muối tetrazolium [13]

- Nhược điểm: các hợp chất thử nghiệm có thể gây nhiễu huỳnh quang [13]

1.3.3.2 Thử nghiệm CFDA-AM

CFDA-AM (5-carboxyfluorescein diacetate, acetoxymethyl ester) là một chấtnhuộm huỳnh quang được sử dụng để đánh giá độc tính tế bào vì đóng vai trò chấtchỉ thị cho sự toàn vẹn màng tế bào Thuốc nhuộm CFDA-AM là chất nền enzymesterase không độc có thể được chuyển đổi bởi các enzym esterase không đặc hiệucủa tế bào sống từ chất có thể thấm qua màng, không phân cực, không huỳnh

quang thành chất nhuộm phân cực, huỳnh quang, carboxyfluorescein (CF) Sựchuyển đổi từ CFDA-AM thành CF bởi tế bào chỉ ra tính toàn vẹn màng tế bào vìchỉ khi màng tế bào nguyên vẹn mới có thể duy trì môi trường tế bào chất cần chohoạt động enzym esterase [13].

- Ưu điểm: không độc tế bào, có thể phát hiện tại nhiều bước sóng mà không bịnhiễu [13]

- Nhược điểm: các hợp chất thử nghiệm có thể gây nhiễu huỳnh quang [13]

1.3.4 Đánh giá độ sống tế bào bằng phương pháp phát quang

Thử nghiệm phát quang giúp phát hiện nhanh và đơn giản sự tăng sinh và độc tính

tế bào động vật có vú Thử nghiệm được thực hiện trên đĩa 96 giếng hoặc 384 giếng

sử dụng máy đọc đĩa phát quang Tính năng nổi bật của phương pháp phát quang làsau khi cho thuốc thử sẽ cho tín hiệu dạng phát sáng ổn định và bền [12], [13], [37]

- Ưu điểm: thử nghiệm ATP là thử nghiệm đánh giá độ sống tế bào nhanh vànhạy nhất Tín hiệu phát quang đạt trạng thái ổn định chỉ trong vòng 10 phút saukhi cho thuốc thử Thử nghiệm không có bước ủ tạo màu cơ chất và không cầnnhiều thao tác [40]

- Nhược điểm: độ nhạy của thử nghiệm bị ảnh hưởng bởi độ lặp lại khi hút mẫu [40]

1.3.4.2 Thử nghiệm đánh giá độ sống Real-time

Trong thử nghiệm này, một enzym luciferase được thiết kế có nguồn gốc từ tômbiển và một tiền chất nền phân tử nhỏ được sử dụng Tiền chất nền và luciferase

được thêm trực tiếp vào môi trường nuôi cấy tế bào làm thuốc thử Các tế bào sốngtrong quá trình trao đổi chất tích cực sẽ giáng hóa tiền chất nền thành chất nền từ đó

bị oxy hóa bởi luciferase, để tạo ra tín hiệu phát quang [40]

- Ưu điểm: phương pháp duy nhất cho phép đánh giá độ sống/độc tính tế bào tạithời gian thực Sự sụt giảm nhanh chóng tín hiệu phát quang do tế bào chết chophép thử nghiệm ghép kênh với các thử nghiệm phát quang khác có bước ly giảilàm chết tế bào [40]

- Nhược điểm: giới hạn của thử nghiệm là lượng tiền chất nền bị chuyển hóa bởi tếbào sống [40]

1.4 Kỹ thuật định lượng interleukin

1.4.1 Phương pháp miễn dịch hấp phụ gắn men (ELISA)

Phương pháp sử dụng kháng thể kháng cytokin (kháng thể bắt) được cố định trênđĩa Kháng thể được cố định đóng vai trò bắt giữ các cytokin trong mẫu thử đượcthêm vào, cytokin được phát hiện bằng kháng thể kháng cytokin liên kết biotin(kháng thể phát hiện) và enzym avidin hoặc streptavidin Sau khi thêm cơ chất tạomàu, mức độ tạo màu của thuốc thử được đo bằng máy đọc ELISA tại bước sóngthích hợp [42]

1.4.2 Phương pháp miễn dịch phóng xạ (Radio Immuno Assay – RIA)

Phương pháp miễn dịch phóng xạ có độ nhạy cao và chính xác trong định lượngcytokin Thử nghiệm cần có kháng thể cytokin đặc hiệu đánh dấu và cytokin đánhdấu hoặc hoặc thụ thể với đồng vị phóng xạ để phát hiện (125I) Các đĩa được đếmnhanh chóng và dễ dàng bằng bộ đếm nhấp nháy bức xạ beta hoặc thử nghiệm thựchiện trong ống thì được đếm bằng bộ đếm bức xạ gamma [42]

1.4.3 Phương pháp miễn dịch điện hóa phát quang (Electrochemiluminescence immunoassay – ECLIA)

Phương pháp này dựa trên quá trình chuyển dịch điện tử trong đó phân tửtripropylamine (TPA) và phức hợp ruthenium tris-bipiridine được hoạt hóa mất mộtelectron trên bề mặt điện cực Các kháng thể (hoặc kháng nguyên) gắn biotin vàchất đánh dấu ruthenium cùng vi hạt phủ streptavidin được ủ trong hỗn hợp phản

ứng Dưới tác dụng của dòng điện, phức hợp ruthenium phản ứng với TPA và phátquang ở bước sóng 620 nm, cường độ ánh sáng tỉ lệ với chất cần phân tích [46].

1.5 Kỹ thuật định lượng CD4, CD8

1.5.1 Phương pháp miễn dịch huỳnh quang

Thử nghiệm miễn dịch huỳnh quang sử dụng hỗn hợp các hạt từ tính và phát quang,mỗi loại tác động trên cùng kháng nguyên Các hạt từ tính tạo thành hệ thống phântách còn hạt phát huỳnh quang tạo thành hệ thống phát hiện Trong thời gian ủ, hạt

từ tính và hạt phát huỳnh quang gắn và tạo thành cụm với tế bào đích (CD4 hayCD8) Các tế bào được đánh dấu (cụm tế bào) được giữ lại ở đáy các giếng trongđĩa bằng nam châm, các tế bào không được đánh dấu và hạt phát huỳnh quang đượcloại bỏ Mẫu sau đó được đọc kết quả bằng máy đọc huỳnh quang [20]

1.5.2 Phương pháp đếm tế bào dòng chảy

Kỹ thuật phân tích tế bào dòng chảy (flow cytometry) sử dụng các kháng thể đơndòng kháng CD3, CD4, CD8 có gắn các chất huỳnh quang khác nhau (FITC, PE,RD-1) để phát hiện và xác định chính xác các dấu ấn bề mặt tế bào lympho T đồngthời có thể đếm được số lượng tuyệt đối và tỷ lệ phần trăm các tế bào lympho Ttrong mẫu thông qua máy đếm tế bào dòng chảy [20]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Dược liệu

Mẫu dược liệu nghiên cứu là toàn bộ phần trên mặt đất của cây Sậy có chiều caokhoảng 50 – 80 cm Dược liệu được thu hái vào tháng 9 năm 2020 tại xã Đông Hòa,huyện Châu Thành, tỉnh Tiền Giang Dược liệu được rửa sạch, để ráo, sấy khô ở50°C Mẫu dược liệu đã được định danh theo nghiên cứu của tác giả Nguyễn CẩmHoàng và cộng sự [4]

2.1.2 Đối tượng thử nghiệm

Đề tài đánh giá tác động điều hòa ức chế in vitro tế bào PBMCs được phân lập từ

máu ngoại vi người, là phân đoạn giàu tế bào lympho

Mẫu máu toàn phần chống đông bằng heparin được thu thập từ 10 tình nguyện viênkhỏe mạnh Các tế bào PBMCs được phân lập từ máu toàn phần trong vòng 4 giờ,tại nhiệt độ phòng kể từ lúc lấy mẫu Tiêu chuẩn chọn đối tượng lấy máu:

- Độ tuổi: trên 18 tuổi

- Khỏe mạnh, không đang mắc các bệnh nhiễm trùng

- Âm tính với các bệnh viêm gan B, viêm gan C, HIV

- Không đang dùng thuốc kháng viêm hoặc ức chế miễn dịch

- Không sử dụng kháng sinh trong 3 tháng trước ngày lấy máu

- Đã ký tên vào bản đồng thuận

2.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, thuốc thử

2.2.1 Thiết bị

Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu được trình bày trong Bảng 2.2

Bảng 2.2 Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

STT Tên thiết bị Hãng sản xuất

1 Cân phân tích Satorius (Đức)

3 Kính hiển vi quang học Olympus

5 Nồi hấp tiệt trùng Sturdy (Đài Loan)

8 Tủ an toàn sinh học Esco (Indonesia)

9 Máy đo quang ELISA BioRad (Mỹ)

10 Tủ lạnh 4 – 8°C Sanyo (Nhật)

12 Máy cô quay áp suất giảm Stuart (Anh)

14 Máy flow cytometry BD FacsCanto III

Bảng 2.3 Hóa chất, thuốc thử sử dụng trong nghiên cứu

STT Hóa chất, thuốc thử Hãng sản xuất

1 Môi trường RPMI – 1640 Gibco (Mỹ)

2 Fetal bovine serum (FBS) Gibco (Mỹ)

3 Penicillin – Streptomycin Gibco (Mỹ)

4 Phytohaemagglutinin – M (PHA) Gibco (Mỹ)

5 Đệm phosphat (Phosphate Buffer

Saline – PBS) 1X Cytiva HyClone (Mỹ)

6

3 – (4,5 – dimethylthiazol – 2 – yl) –2,5 – diphenyl tetrazolium bromid)(MTT)

Trung Quốc

9 Kit định lượng IL-1β (số lô:

252136-001, hạn dùng: 30/03/2022) Invitrogen (Mỹ)

10 Kit định lượng IL-2 (số lô:

223758-004, hạn dùng: 30/06/2022) Invitrogen (Mỹ)

11 Dimethylsulfoxid (DMSO) Trung Quốc

12 Cồn tuyệt đối Việt Nam

15 Ethyl acetat Trung Quốc

16 Nước cất, nước khử khoáng

17 Acid sulfuric đậm đặc Trung Quốc

2.3 Dược liệu

2.3.1 Xác định độ ẩm, độ tro toàn phần của dược liệu

Tiến hành xác định độ ẩm, độ tro toàn phần của dược liệu được theo hướng dẫn củaDược điển Việt Nam (DĐVN) V

- Xác định độ ẩm: phụ lục 9.6 DĐVN V (trang phụ lục – 203)

- Xác định độ tro toàn phần: phụ lục 9.8 DĐVN V (trang phụ lục – 204)

- Xác định độ tro không tan trong HCl: phụ lục 9.7 DĐVN V (trang phụ lục – 203)

- Xác định độ tro sulfat: phụ lục 9.9 DĐVN V (trang phụ lục – 204)

Các chỉ tiêu độ ẩm và độ tro toàn phần được tiến hành thử nghiệm 3 lần độc lập vàlấy kết quả trung bình

2.3.2 Điều chế cao chiết toàn phần cây Sậy

Dựa trên kết quả nghiên cứu trước đó về tác dụng kháng viêm cấp trên chuột củacác cao chiết toàn phần cây Sậy, cao toàn phần ethanol 96% có tác động khángviêm mạnh nhất [4] Vì vậy, trong nghiên cứu này chúng tôi chọn dung môi chiếtcao toàn phần là ethanol 96% cho các mô hình nghiên cứu trên tế bào PBMCs.Đầu tiên làm ẩm 2000 gam dược liệu khô đã được xay mịn và sàng qua rây 2 mmvới dung môi ethanol 96% trong 72 giờ, sau đó chiết ngấm kiệt dược liệu theo tỉ lệ(1:10; kg/L) với tốc độ 3 ml/phút Dịch chiết thu được được lọc qua giấy lọc, rồiloại dung môi bằng cô quay áp suất giảm ở nhiệt độ 50°C Phần dung môi còn lạiđược loại bỏ bằng cách cho bay hơi trên bếp cách thủy ở nhiệt độ 60°C đến khi thuđược cao đặc Cao toàn phần được bảo quản lạnh ở 4 – 8°C, tránh ánh sáng, dùng đểđiều chế các cao phân đoạn và cho các thử nghiệm tiếp theo Tính độ ẩm của cao đểsuy ra hiệu suất chiết cao

Hình 2.2 Sơ đồ chiết xuất cao toàn phần

2.3.3 Điều chế các cao phân đoạn

Phân tán cao toàn phần với lượng nước tối thiểu để được cao lỏng, sau đó thực hiệnchiết lỏng – lỏng cao toàn phần với 3 hệ dung môi có độ phân cực tăng dần lần lượt

là n-hexan, chloroform, ethyl acetat với tỉ lệ nước : dung môi là 1:1 (v/v) Với mỗiphân đoạn dịch chiết thu được, cô quay giảm áp thu cao phân đoạn đặc Phân đoạnnước cuối cùng được loại nước bằng cách bay hơi trên bếp cách thủy ở 60°C trong 3ngày Kiểm tra màu của mỗi phân đoạn sau mỗi lần lắc bằng cách cho bốc hơi 10giọt dịch chiết trên mặt kính đồng hồ và quan sát, đến khi không còn vết hoặc vếtrất mờ thì ngưng Bảo quản cao phân đoạn lạnh 4-8°C, tránh ánh sáng để dùng chocác thử nghiệm tiếp theo Tính hiệu suất chiết và độ ẩm cao phân đoạn

Hình 2.3 Sơ đồ chiết cao phân đoạn

Cao nước

Bay hơi ở 60oCCao ethyl acetat

Cô áp suất giảm

Cao chloroform

Cô áp suất giảm

2.3.4 Sơ bộ định tính các thành phần hóa học trong cao chiết dược liệu

Phân tích sơ bộ thành phần hóa học của các cao chiết theo quy trình mô tả tronggiáo trình “Phương pháp nghiên cứu Dược liệu” của bộ môn Dược liệu, khoa Dược,Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh, năm 2020

2.3.5 Chuẩn bị các mẫu cao chiết theo thang nồng độ

Pha dung dịch cao gốc có nồng độ 40 mg/mltrong DMSO (100% DMSO) Lọc tiệtkhuẩn qua màng lọc 0,22 µm Bảo quản cao gốc 40 mg/ml tránh ánh sáng ở -20oCtới khi sử dụng

Pha các nồng độ cao thử nghiệm: từ cao gốc 40 mg/ml, pha loãng thành dãy cácnồng độ gấp đôi nồng độ thử nghiệm (0,2; 2; 20; 100; 200; 400 ppm) bằng môitrường nuôi cấy hoàn chỉnh (MTNCHC) cho các thử nghiệm sinh học Chỉ pha ngaytrước khi sử dụng

2.4 Chiết PBMCs từ máu ngoại vi người

Các tế bào PBMCs được phân lập trong vòng 4 giờ ở nhiệt độ phòng từ máu toànphần của những người tình nguyện khỏe mạnh, đã được chống đông bằng heparinbằng phương pháp ly tâm tỷ trọng

Toàn bộ dụng cụ trong quá trình nghiên cứu được đảm bảo vô trùng bằng cách hấptiệt trùng hoặc sử dụng dụng cụ vô trùng có sẵn Quy trình thu thập mẫu máu, phânlập PBMCs từ mẫu máu toàn phần và các thử nghiệm trên tế bào được tiến hànhtrong điều kiện vô trùng tại Bộ môn Sinh hóa và Vi sinh – Khoa Dược, Đại học YDược TP.Hồ Chí Minh

2.4.1 Nguyên tắc

Tế bào PBMCs được chiết từ máu ngoại vi người bằng phương pháp ly tâm gradient

tỷ trọng với dung dịch tỷ trọng 1,077 g/ml (thường là dung dịch ficoll hay dung dịchlymphoprep) Các tế bào PBMCs và tiểu cầu có tỷ trọng < 1,077 g/ml sẽ nổi lênphía trên môi trường tách gradient Các tế bào hồng cầu và bạch cầu đa nhân có tỷtrọng > 1,077 g/ml sẽ lắng xuống dưới đáy ống ly tâm Do đó, sau khi ly tâm vớidung dịch gradient tỷ trọng, máu toàn phần được tách thành 4 lớp:

- Lớp dưới cùng: hồng cầu, bạch cầu đa nhân

- Dung dịch tách gradient tỷ trọng

- Lớp tế bào PBMCs và tiểu cầu

- Lớp trên cùng: huyết tương [5]

Hình 2.4 Máu ngoại vi sau khi chiết bằng dung dịch ficoll

2.4.2 Cách tiến hành

2.4.2.1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh (MTNCHC) bao gồm môi trường RPMI-1640+10% FBS + 1% kháng sinh Penicillin-Streptomycin

- Cách pha 10 ml MTNCHC: hút 8,9 ml môi trường RPMI-1640 cho vào ống falcon 15

ml Thêm 1 ml FBS và 100 μl dung dịch kháng sinh Penicillin-Streptomycin, lắc đều

- Cách pha 10 ml MTNCHC có bổ sung PHA 3%: hút 9,7 ml MTNCHC + 300 μlPHA cho vào ống falcon 15 ml, lắc đều

2.4.2.2 Phân lập PBMCs

Các tế bào PBMCs được phân lập trong vòng 4 giờ ở nhiệt độ phòng từ máu toànphần của những người tình nguyện khỏe mạnh, đã được chống đông bằng heparin.Quy trình phân lập PBMCs được tóm tắt như sau: Máu toàn phần được pha loãng vớidung dịch đệm PBS 1X theo tỉ lệ 1:2 Thêm dung dịch ficoll vào máu pha loãng theo

tỉ lệ 1,5:2 Ly tâm với tốc độ 400 x g trong 30 phút ở nhiệt độ 18-20°C Dùng pipet

tiệt khuẩn hút lớp tế bào PBMCs nằm dưới lớp huyết tương và cho vào falcon 15 mltiệt khuẩn Rửa PBMCs 2 lần với 6 ml đệm PBS để loại bỏ tiểu cầu, ly tâm ở 200 x gtrong 10 phút ở 20°C Cắn PBMCs được phân tán vào MTNCHC có PHA 3%