Nghiên cứu sản xuất protein có hoạt tính sinh học dùng trong nông nghiệp bằng kỹ thuật di truyền trên tế bào cây thông (larich desidue) và bèo tấm (lema sp-wolffia sp)

Trong các loài thực vật được nghiên cứu để sử dụng làm hệ thống sản xuất vaccine, các loài họ bèo tấm Lemnaceae đang được đặc biệt chú ý bởi các đặc tính sau: có tốc độ nhân vô tính rất

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN

VIỆN DI TRUYỀN NÔNG NGHIỆP

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHỊ ĐỊNH THƯ

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT PROTEIN CÓ HOẠT TÍNH

SINH HỌC DÙNG TRONG NÔNG NGHIỆP

BẰNG KỸ THUẬT DI TRUYỀN TRÊN TẾ BÀO CÂY THÔNG (Larich desidue) VÀ BÈO TẤM (Lemna

MỤC LỤC

DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI THAM GIA ĐỀ TÀI 1

BÀI TÓM TẮT 2

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT 4

LỜI MỞ ĐẦU 5

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 7

1.1 Tổng quan về bèo tấm 7

1.1.1 Cây phân loại bèo tấm 7

1.1.2 Phân bố của bèo tấm 7

1.1.3 Thành phần dinh dưỡng của cây bèo tấm 8

1.1.4 Đặc điểm sinh học 8

1.2 Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh ở bèo tấm 12

1.3 Nghiên cứu chuyển gen vào bèo tấm Woffia sp, Lemna sp 13

1.3.1 Thiết kế vector biểu hiện ở thực vật 13

1.3.2 Các phương pháp chuyển gen ở thực vật 15

1.3.3 Chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens 19

1.3.4 Hệ thống chuyển gen ở bèo tấm 23

1.4 Chuyển gen vỏ virus gumboro vào Wolffia / Lemna 25

1.4.1 Bệnh Gumboro ở gia cầm 25

1.4.2 Chiến lược nghiên cứu và thử nghiệm ứng dụng vaccine thế hệ mới 26

1.4.3 Gen kháng nguyên VP2 trong chiến lược phát triển vaccine thế hệ mới 27

1.5 Nghiên cứu sản xuất vaccin qua đường miệng 29

1.6 Tình hình nghiên cứu trong nước 30

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32

2.1 Mục tiêu của đề tài 32

2.2 Nội dung nghiên cứu cần thực hiện 32

2.3 Vật liệu 33

2.3.1 Vật liệu thực vật 33

2.3.2 Vật liệu vi khuẩn 33

2.3.3 Hoá chất 35

2 4 Phương pháp 35

2.4.1 Phương pháp thiết kế vector biểu hiện ở thực vật 35

2.4.2 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào 44

2.4.3 Phương pháp biến nạp gen 45

2.4.4 Phương pháp đánh giá cây chuyển gen 49

2.4.5 Thử nghiệm khả năng gây đáp ứng miễn dịch trên gà 57

CHƯƠNG3:NHỮNG NỘI DUNG VÀ KẾT QUẢ ĐÃ THỰC HIỆN 58

1 THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN Ở THỰC VẬT 58

1.1 Kết quả khuyếch đại gen mã hoá protein của virus VP2 bằng phương pháp PCR 58

1.2 Kết quả tạo dòng gen mã hoá protein VP2 của virus Gumboro 58

1.2.1 Phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vectơ pCR đ 2.1 58

1.2.2 Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào khả biến E coli chủng InVαF ’ 59

1.2.3 Kết quả tách chiết ADN plasmid 60

1.2.4 Kiểm tra vectơ tái tổ hợp bằng cách cắt với enzyme giới hạn EcoRI 60

1.3 Kết quả giải trình tự gen mã hoá protein VP2 của virus Gumboro 61

1.4 Thiết kế vectơ biểu hiện VP2 63

2 XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH VÀ NHÂN SINH KHỐI Ở 66

BÈO TẤM WOLFFIA, LEMMA 66

2.1 Xây dựng hệ thống tái sinh và nhân sinh khối ở bèo tấm Wolffia australiana 66

2.1.1 Nghiên cứu khả năng sinh trưởng và phát triển của W australiana trong các điều kiện nuôi khác nhau 67

2.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của W australiana 68

2.1.3 Tạo nguồn vật liệu khởi đầu trong ống nghiệm W australiana trong điều kiện nuôi

tủ ổn nhiệt 69

2.2 Xây dựng hệ thống tái sinh ở bèo tấm Lemna 70

2.2.1 Tạo vật liệu vô trùng 70

2.2.2 Nghiên cứu xác định môi trường nhân cây bèo phù hợp 70

2.2.3 Tạo và nhân callus 75

2.2.4 Nhân sinh khối callus dạng I 81

2.2.5 Tái sinh cây từ callus 82

3 XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUYỂN GEN ĐẠT HIỆU QUẢ CAO VÀO BÈO TẤM WOFFIA SP, LEMMA SP .86

3.1 Xây dựng quy trình chuyển gen đạt hiệu quả cao vào bèo tấm Woffia sp 86

3.1.1 Xác định chủng vi khuẩn thích hợp cho chuyển gen vào W australiana 86

3.1.2 Kết quả thí nghiệm khảo sát thời gian ly tâm hút chân không 87

3.1.3 Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn và thời gian đồng nuôi cấy 88

3.1.4 Ảnh hưởng của môi trường đồng nuôi cấy 89

3.1.5 Đánh giá mức độ ảnh hưởng của kháng sinh Geneticin và Paromycine đến khả năng gây chết bèo tấm Woffia australiana 90

3.2 Xây dựng qui trình chuyển gen đạt hiệu quả cao vào bèo tấm Lemna 92

3.2.1 Xây dựng quy trình chuyển gen nguyên cây và callus sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens 92

3.2.2 Xây dựng quy trình chuyển gen nguyên cây và callus sử dụng súng bắn gen 99

4 CHUYỂN GEN VỎ VIRUS GUMBORO VÀO WOLFFIA/LEMNA 104

4.1 Chuyển gen vỏ virus Gumboro vào Wolffia australiana 104

4.2 Chuyển gen vỏ virus Gumboro vào Lemna 106

4.2.1 Chuyển gen nguyên cây bèo LA 106

4.2.2 Tạo callus và vật liệu chuyển gen 107

4.2.3 Chuyển gen VP2 vào callus dạng I và dạng II 108

5 PHÂN TÍCH ĐÁNH GIÁ CÂY CHUYỂN GEN 109

THỬ NGHIỆM SẢN PHẨM CHUYỂN GEN TRÊN GIA CẦM 109

5.1 Phân tích đánh giá cây chuyển gen 109

5.1.1 Đánh giá biểu hiện gen gus trong các dòng bèo tấm chuyển gen 110

5.1.2 Tách chiết và kiểm tra ADN tổng số của bèo tấm 111

5.1.3 Phân tích PCR các dòng bèo tấm chuyển gen VP2 111

5.1.4 Phân tích lai Southern 113

5.1.5 Xác định protein trong bèo tấm chuyển gen 113

5.2 Thử nghiệm sản phẩm chuyển gen trên gia cầm 116

5.2.1 Thu mẫu huyết thanh gà 116

5.2.2 Phát hiện kháng thể kháng protein VP2 bằng ELISA 117

CHƯƠNG 4: TỔNG QUÁT HÓA VÀ ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ THU ĐƯỢC 121

4.1 Dạng sản phẩm kết quả tạo ra 121

4.2 Kết quả về khoa học 121

4.3 Kết quả nổi bật và khả năng áp dụng 122

4.4 Trình độ công nghệ 122

4.5 Khả năng áp dụng 123

4.6 Nhu cầu kinh tế, xã hội và địa chỉ áp dụng 123

4.7 Đào tạo 123

4.8 Sản phẩm khoa học của đề tài 124

4.9 Hợp tác quốc tế 124

4.10 Tình hình sử dụng kinh phí 124

4.11 Danh sách các công trình công bố 125

4.12 Hạn chế của đề tài 125

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 126

5.1 Kết luận 126

5.2 Đề nghị 126

TÀI LIỆU THAM KHẢO 128

B¸o c¸o Tæng kÕt Khoa häc & Kü thuËt §Ò tµi

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.3 Bèo tấm W australiana nuôi trên đĩa thạch 12

Hình 1.6 Cơ chế lây nhiễm của A tumefaciens vào tế bào thực vật 21

Hình 1.7 Sơ đồ cấu trúc hệ vector nhị thể 22 Hình 1.8 Sơ đồ cấu trúc vector liên hợp 22

Hình 2.2 Bèo tấm Lemna aequinoctialis 33

Hình 3.8 Xác định sự có mặt của gen VP2 trong chủng Agrocaterium GV3101pMp90 65

Hình 3.14 Nhân callus dạng I trên môi trường có 2,0 mg/l 2,4D + 6,0 mg/l BAP 82

Hình 3.16 Bèo tái sinh từ callus dạng I trên môi trường không có chất ĐHST 83

Hình 3.19 Xác định thời gian ly tâm chân không thích hợp 87

Hình 3.20: Ảnh hưởng của mật độ VK và thời gian đồng nuôi cấy 88

Hình 3.22: Đánh giá ảnh hưởng của môi trường đồng nuôi cấy 90

Hình 3.24: Ảnh hưởng của Paramomycin đến khả năng sống của W australiana 92

Hình 3.25 Biểu hiện tạm tới của gen GUS trên bèo tấm với các chủng khác nhau 93

Hình 3.30: Cánh bèo trên môi trường diệt khuẩn 107

Hình 3.31: Kết quả chọn lọc nguyên cánh LA trên môi trường bổ sung hygromycin, geneticin 107

Hình 3.33: Mẫu callus dạng I LA trên môi trường diệt khuẩn 108

Hình 3.37: Biểu hiện gen gus ở cánh bèo tấm W australiana (1); W globosa (2) và bèo LA (3)

chuyển gen sau chọn lọc

110

Hình 3.39 Kết quả phân tích PCR các dòng Lemna aequinoctialis chuyển gen 112

Hình 3.43: Mô tả thí nghiệm thử khả năng gây đáp ứng miễn dịch của bèo tấm chuyển gen trên gà 120

B¸o c¸o Tæng kÕt Khoa häc & Kü thuËt §Ò tµi

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 3.1: Ảnh hưởng của hàm lượng khoáng khác nhau đến khả năng sinh trưởng của W australiana 66

Bảng 3.2: Nghiên cứu khả năng sinh trưởng và phát triển của W australiana trong các điều kiện nuôi

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của hàm lượng khoáng Hutner tới số cánh bèo nhân sau mỗi ngày nuôi cấy 71

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi tới số cánh bèo nhân sau mỗi ngày nuôi cấy 72

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của sucrose tới số cánh bèo nhân sau mỗi ngày nuôi cấy 73

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của các nền khoáng và chất điều hoà sinh trưởng khác nhau đến sự tạo callus 75

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của hàm lượng khoáng trong môi trường N6 đến hiệu quả tạo callus 76

Bảng 3.16 Ảnh hưởng của các chất điều hoà sinh trưởng đến chất lượng callus 81

Bảng 3.21: Kết quả khảo sát chủng vi khuẩn thích hợp cho chuyển gen vào W australiana 86

Bảng 3.22: Kết quả thí nghiệm khảo sát thời gian ly tâm hút chân không 87

Bảng 3.23 Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn và thời gian đồng nuôi cấy 88

Bảng 3.24 Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn và thời gian đồng nuôi cấy 89

Bảng 3.25 Ảnh hưởng của môi trường đồng nuôi cấy 89

Bảng 3.28 Biểu hiện tạm thời của gen GUS trên mẫu bèo với các chủng vi khuẩn khác nhau 93

Bảng 3.29 Tỷ lệ biểu hiện tạm thời của các biện pháp tăng cường tiếp xúc (%) 94

Bảng 3.30 Ảnh hưởng của thời gian hút chân không tới biểu hiện tạm thời 94

Bảng 3.31 Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn tới biểu hiện tạm thời 95 Bảng 3.32 Ảnh hưởng của AS tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen GUS trên mẫu bèo 96

Bảng 3.36 Ảnh hưởng của tuổi mẫu đến biểu hiện tạm thời của gen gus ở bèo nguyên cây 100

Bảng 3.37 Ảnh hưởng của tuổi mẫu đến biểu hiện tạm thời của gen gus ở callus bèo tấm 100

Bảng 3.38 Ảnh hưởng của khoảng cách bắn và áp lực khí đến biểu hiện gen tạm thời của gen gus ở

bèo nguyên cây

101 Bảng 3.39 Ảnh hưởng của khoảng cách bắn và áp lực khí đến biểu hiện gen tạm thời của gen gus ở

Bảng 3.40 Ảnh hưởng của xử lý áp suất thẩm thấu đến biểu hiện gen gus tạm thời ở bèo nguyên cây 102

Bảng 3.41 Ảnh hưởng của xử lý áp suất thẩm thấu đến biểu hiện gen gus tạm thời ở callus 102

Bảng 3.42 Ảnh hưởng hàm lượng hạt vàng đến biểu hiện tạm thời của gen gus ở bèo nguyên cây 103

Bảng 3.43 Ảnh hưởng hàm lượng hạt vàng đến biểu hiện tạm thời của gen gus ở callus 103

Bảng 3.44 Tổng hợp các thí nghiệm chuyển gen VP2 vào bèo tấm Wolffia australiana 105

Bảng 3.45 Tổng hợp các thí nghiệm chuyển gen VP2 vào bèo tấm L.aequinoctialis 106

Bảng 3.46: Tổng hợp các thí nghiệm chuyển gen chỉ thị vào bèo tấm LA và W australiana 110

Bảng 3.49 Danh sách các mẫu huyết thanh gà thu được 116 Bảng 3.50: Kết quả xét nghiệm ELISA trên các mẫu huyết thanh gà đã được gây đáp ứng miễn dịch 117

Bảng 3.51: Kết quả xét nghiệm ELISA dương tính của các mẫu huyết thanh gà đã được gây đáp ứng

miễn dịch

118 Bảng 3.52: Đánh giá mức độ tạo kháng thể kháng protein VP2 trong các mẫu huyết thanh của gà ăn bèo

tấm chuyển gen

119

DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI THAM GIA ĐỀ TÀI

A Chủ nhiệm đề tài

PGS.TS Lê Huy Hàm

Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ

tế bào thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp

B Cán bộ tham gia nghiên cứu

1 ThS Trần Duy Dương

Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ

tế bào thực vật, Viện Di truyền nông nghiệp

5 PGS TS Lê Thanh Hoà Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa

học và Công nghệ Việt Nam

6 PGS TS Đinh Duy Kháng Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa

học và Công nghệ Việt Nam

7 PGS TS Đỗ Năng Vịnh

Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ

tế bào thực vật, Viện Di truyền nông nghiệp

8 CN Trịnh Thị Minh Thuỳ

Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ

tế bào thực vật, Viện Di truyền nông nghiệp

hạ là một trong những tìm kiếm sôi động trên thế giới những năm gần đây

Các nghiên cứu trong thập niên vừa qua đã cho thấy tiềm năng ứng dụng của vaccine uống sản xuất thông qua hệ thống thực vật chuyển gen là rất lớn, không những góp phần giảm giá thành vaccine mà còn mở ra những triển vọng mới của việc ứng dụng CNSH thực vật trong nông nghiệp và y học Trong các loài thực vật được nghiên

cứu để sử dụng làm hệ thống sản xuất vaccine, các loài họ bèo tấm (Lemnaceae) đang

được đặc biệt chú ý bởi các đặc tính sau: có tốc độ nhân vô tính rất nhanh, có hàm lượng các chất dinh dưỡng cao, rất dễ nuôi trồng, không cần các điều kiện đặc biệt như: bảo quản lạnh, chế độ vô trùng Do các đặc điểm trên, việc nghiên cứu sản xuất vaccine bằng các đối tượng này là hết sức hấp dẫn và hứa hẹn nhiều triển vọng

Đề tài: “Nghiên cứu sản xuất protein có hoạt tính sinh học dùng trong nông nghiệp

bằng kỹ thuật di truyền trên tế bào cây thông (Larich desidue) và bèo tấm (Lemna sp/ Wolffia sp.)“, được thực hiện trên cơ sở hợp tác khoa học với Viện Sinh lý phân tử và

Công nghệ sinh học, ĐHTH Bonn (CHLB Đức) là một trong những cố gắng góp phần giải quyết các vấn đề trên để tiến tới ứng dụng thành công kỹ thuật di truyền vào việc sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học phục vụ chăn nuôi thú y và bảo vệ sức khoẻ con người

Mục tiêu của đề tài phía Việt Nam tập trung vào giải quyết các vấn đề sau: i) Chuyển thành công gen mã hoá virus gumboro VP2 vào bèo tấm; ii) Đánh giá được khả năng tạo miễn dịch khi cho gia cầm ăn bèo tấm có protein trên

Đề tài đã thực hiện đầy đủ các nội dung nghiên cứu và thu được những kết quả chính như sau:

• Thiết kế vector mang gen vỏ protein virus gumboro biểu hiện ở thực vật

Thu thập đánh giá các nguồn gen protein vỏ virus gumboro ở Việt Nam Thiết kế vector pPAM-VP2 mang gen VP2 biểu hiện ở thực vật

• Xây dựng hệ thống tái sinh và nhân sinh khối ở bèo tấm (Lemna sp.; Wolffia sp.)

Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào đã được áp dụng để xây dựng và hoàn thiện phương

pháp tạo callus và tái sinh cây ở các loài bèo tấm Wolffia sp và Lemna sp Một số

đặc điểm sinh học cũng như các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng, tạo callus và tái sinh cây đã được tối ưu

• Xây dựng quy trình chuyển gen đạt hiệu quả cao vào bèo tấm (Lemna/Wolffia) Quy trình chuyển gen vào callus và nguyên cây Lemna sp và Wolfia sp bằng súng bắn gen và thông qua Agrobacterium đã được xây dựng và cải thiện trên cơ sở tối

ưu hoá các yếu tố chính ảnh hưởng đến quá trình biến nạp: chủng vi khuẩn, nồng độ

AS, thời gian đồng nuôi cấy

• Chuyển gen vỏ virus gumboro vào Wolffia/ Lemna

Các thí nghiệm chuyển gen VP2 đã được thực hiện trên loài bèo tấm Wolffia

australina và Lemna aequinoctialis Các dòng bèo tấm chuyển gen đã được duy trì

và nhân sinh khối trên môi trường có bổ sung tác nhân chọn lọc

• Phân tích cây chuyển gen Thử nghiệm sản phẩm chuyển gen trên gia cầm

Sự có mặt của gen chuyển trong các dòng bèo tấm chuyển gen đã được phân tích bằng các phương pháp sinh học phân tử (PCR, Southern) Đã nhận được 06 dòng

bèo tấm Wolffia australiana chuyển gen VP2 Protein VP2 đã được tách chiết từ

các dòng bèo tấm chuyển gen Thử nghiệm bước đầu cho thấy 01 dòng bèo tấm chuyển gen có khả năng gây đáp ứng miễn dịch trên gà

Phía đối tác (CHLB Đức) Viện Sinh lý phân tử và công nghệ sinh học thực vật (Đại

học tổng hợp Bonn) đã thực hiện các nghiên cứu trên đối tượng cây thông (Larich

desidue) và đã thu được kết quả sau: i) Đã nghiên cứu tạo huyền phù, xác định các điều

kiện tạo huyền phù và nhân nhanh tế bào thông; ii) Tối ưu hoá quy trình chuyển gen

vào Larich desidue thông qua Agrobacterium; iii) Chuyển gen kháng virus Gumboro

VP2 vào mô sẹo và đánh giá giá biểu hiện của protein VP2 ở các dòng thông chuyển gen

Nói tóm lại, đề tài đã thực hiện tốt các nội dung nghiên cứu đặt ra và thu được những kết quả rất khả quan Các kết quả nghiên cứu đạt được mang tính khoa học và thực tiễn cao Thành công của đề tài là tiền đề cho việc nghiên cứu tạo vaccine kháng Gumboro giá rẻ dùng trong chăn nuôi gia cầm và xa hơn là sản xuất các hoạt chất sinh học khác cho nông nghiệp và y học bằng kỹ thuật di truyền thực vật

CTAB: Cetyltrimeethylammonium bromide

DNA: Deoxy ribo-Nucleic Acid

ĐC: Đối chứng

EC: Embryogenic Callus: mô sẹo phôi hoá

EDTA: Ethylene Diamine Tetraacetace Acid

Et-Br: Ethidium Bromide

GMC: Cây trồng chuyển gen

GMO: Sinh vật chuyển gen

gus: β- glucuronidase gene = gen mã hoá β-glucuronidase

IAA: Indol-3-Acetic Acid

IBA: Indol -3-Butyric Acid

Kbp: Kilobase

Km: Kanamycine

KTST: Kích thích sinh trưởng

LA: Lemna aequinoctialis

LB: Luria and Bertani

MCS: Multi-Cloning Site

MS: Môi trường nuôi cấy theo Murashige & Skoog (1962)

NAA: ỏ-Naphthalenacetic Acid

NOS: Nopaline Synthetase

NOS-P: Nopaline Synthetase Promotor

nptII: Neomycin phosphotransferase gene = gen mã hoá neomyciphosphotransferase

OD 600 : Mật độ vi khuẩn đo ở bước sóng 600nm bằng quang phổ kế DUR800 Spectrophotometer của hãng Beckman Coulter

PCR: Polymerase Chain Reaction

T-DNA: transferred-DNA = DNA chuyển

TDZ: Thidiazuron

Ti- Plasmid: Tumor inducing plasmid= plasmid gây khối u thực vật

X-Gluc: 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucuronic acid

LỜI MỞ ĐẦU

Thập niên cuối thế kỷ 20 đầu thế kỷ 21 chứng kiến những thành tựu vượt bậc trong lĩnh vực công nghệ sinh học thực vật Một trong những thành tựu đó là tạo ra các giống cây trồng chuyển gen có các đặc tính hoàn toàn khác biệt như chống chịu sâu, bệnh, kháng thuốc diệt cỏ Đến cuối năm 2008 diện tích cây chuyển gen toàn cầu đã đạt 125 triệu ha Một loạt các giống cây trồng với các đặc tính hoàn toàn mới như: chịu hạn, mặn, tăng cường khả năng hấp thụ nitơ, chịu úng, tăng cường sinh trưởng, hoặc tăng cường chất lượng dinh dưỡng, chất lượng chế biến, tăng cường hoạt chất sinh học đã được nghiên cứu và đang chuẩn bị đưa vào ứng dụng trong sản xuất (Jame, 2008)

Sự phát triển hứa hẹn sáng sủa nhất của công nghệ sinh học thực vật là sử dụng cây chuyển gen để sản xuất các chất có hoạt tính sinh học như: vitamin, các hợp chất chữa bệnh, các hoá chất sử dụng trong công nghiệp, trong y tế như: kháng nguyên, kháng thể, interferon, vaccine (Mason et al, 1998)

Có nhiều hệ thống sản xuất protein tái tổ hợp cần thiết cho các mục đích khác nhau của con người Đó là hệ thống sử dụng tế bào động vật bậc cao, vi khuẩn, nấm men Gần đây tế bào côn trùng, thực vật biến đổi gen được sử dụng để khắc phục các nhược điểm của hệ thống sản xuất protein sử dụng tế bào động vật bậc cao, vi khuẩn và nấm men Do đó nhiệm vụ to lớn đặt ra cho các nhà khoa học là tìm kiếm hệ thống sản xuất protein tái tổ hợp khác, rẻ tiền, dễ sử dụng và không mang nguy cơ lây nhiễm các bệnh

có nguồn gốc virus Hệ thống đó là thực vật So với các hệ thống truyền thống, thực vật

có nhiều lợi thế trong việc sản xuất protein tái tổ hợp Vaccine do thực vật sản xuất ra thông qua kỹ thuật di truyền được gọi là "Vaccine sản xuất bằng thực vật" (Rowlandson & Tackaberry, 2003) Vaccine này có thể được sử dụng ở dạng tinh khiết hay dưới dạng dịch chiết thực vật hoặc nguyên liệu thực vật Vaccine tái tổ hợp có thể được đưa vào những thực vật ăn được đối với người và động vật, tạo khả năng đưa vaccine vào qua đường miệng, gây miễn dịch cho hệ thống màng nhầy và miễn dịch toàn cơ thể (Hansson et al, 2000; Fishcher et al, 2003) Ý tưởng sử dụng thực vật làm

hệ thống sản xuất vaccine uống (edible vaccine) đã lôi cuốn các nhà khoa học của nhiều nước tham gia vào nghiên cứu trong thập niên vừa qua và đã thu được nhiều kết quả khả quan (Rowlandson & Tackaberry, 2003)

Bệnh Gumboro là bệnh viêm túi bạch huyết nhiễm trùng (Infectiuous Bursal Disease -IBD) cấp tính do virus gây ra ở gà, chủ yếu là ở gà 2-6 tuần tuổi, với tỷ lệ chết

và khả năng lây lan cao ở gà con Tỷ lệ chết cao còn là hậu quả của suy giảm miễn dịch

do virus gây ra và sự liên - tạp nhiễm các bệnh khác Cũng do bị suy giảm miễn dịch, mọi chương trình vaccine phòng chống một số bệnh nguy hiểm khác ở gia cầm cũng bị

và 34% Trong khi VP1 và VP4 chỉ là protein phụ VP1 chỉ chiếm 3% còn VP4 chỉ chiếm 6% VP2 là protein vỏ của virus IBD, được mã hoá bởi đoạn gen có độ dài khoảng 1.300 nucleotide VP2 có độ bảo tồn cao về thành phần nucleotide ở hai đầu 5’

và 3’ và thành phần amino acid, nhưng lại có một vùng khoảng gần 500 nucleotide ở

chính giữa của gen rất thay đổi trong các chủng khác nhau, nên được gọi là vùng “siêu

biến đổi” Vùng này quyết định tính độc lực và tính kháng nguyên của virus, do vậy,

được chọn để so sánh, chẩn đoán, giám định và lập phả hệ các chủng virus cường độc Gumboro (Yamaguchi và cs, 1996; Scherbacova và cs, 1998; Jackwood và cs, 2008)

Xuất phát từ những cơ sở khoa học và đòi hỏi của thực tế trên, Viện Di truyền

Nông nghiệp đã được Bộ Khoa học Công nghệ cho phép thực hiện đề tài “Nghiên cứu

sản xuất protein có hoạt tính sinh học dùng trong nông nghiệp bằng kỹ thuật di truyền trên tế bào cây thông (Larich desidue) và bèo tấm (Lemna sp/ Wolffia sp.)” Đây là một

trong những đề tài thuộc chương trình hợp tác khoa học công nghệ giữa Việt Nam và CHLB Đức, đề tài vừa có định hướng ứng dụng lại vừa có ý nghĩa tiếp thu công nghệ, xây dựng tiềm lực tiến tới làm chủ lĩnh vực công nghệ ADN tái tổ hợp

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 1.1 Tổng quan về bèo tấm

1.1.1 Cây phân loại bèo tấm

Theo Landolt (1986), bèo tấm thuộc giới thực vật, ngành Magnoliophyta, lớp

Liliopsida, bộ Arales, họ Lemnaceae, chi Lemna, Spirodela, Wolffia, Wolffiella với

trên 40 loài khác nhau

Les và cộng sự, 2002 đã dựa trên đặc điểm về hình thái, nhiễm sắc thể và vi phân tử (DNA của nhân và lục lạp) đề ra giả thiết về cây phân loại của bèo tấm gồm có

5 chi tức là thêm một chi mới là Landoltia (Les và cs, 2002)

Một số nghiên cứu gần đây của Rothwell và cộng sự, 2004 dựa trên sự so sánh trình tự đoạn intron nằm giữa locus trnL và trnF của bộ gen lục lạp đã xác định rằng họ

Lemnaceae và Pistia cùng thuộc họ ráy Araceae (Rothwell và cs, 2004)

1.1.2 Phân bố của bèo tấm

Bèo tấm phân bố khắp thế giới trừ vùng cực bắc và cực nam quanh năm giá lạnh Vùng sa mạc và vùng đất rất ẩm ướt thì khá hiếm Trong 4 chi bèo tấm thì 3 chi

(Spirodela, Lemna, Wolffia) được phân bố khắp thế giới, Wolffiella ít có ở châu Mĩ và châu Phi Spirodela có tâm phân bố ở Nam Mỹ Chi Lemna có tính đa dạng cao nhất ở Bắc Mĩ và Đông Nam Á Wolffiella phân bố chủ yếu ở vùng ven nhiệt đới của châu Mĩ

và châu Phi Wolffia tồn tại chủ yếu ở châu Mĩ, Đông Nam Á và châu Úc

L aequinoctialis được phân bố rộng rãi ở các vùng ấm áp trên thế giới Cùng

với nghề trồng lúa nước, chúng có mặt rộng rãi ở nhiều vùng khác nhau như Nam Âu, vùng trung tâm Bắc Mĩ, Bắc Trung Quốc, Bắc Nhật Bản…(Landolt, 1986)

1.1.3 Thành phần dinh dưỡng của cây bèo tấm

Hàm lượng các chất dinh dưỡng của bèo tấm rất cao Bèo tấm có chứa các vitamin A, B1, B2 và các axit amin không thay thế, trừ methionin Bèo tấm nuôi ở điều kiện tối ưu là một trong số các loài thực vật có hàm lượng protein tổng số đạt cao nhất Hầu hết các loài bèo có hàm lượng protein đạt từ 6,8-45% phụ thuộc chủ yếu vào điều kiện nuôi cấy (Landolt và Kandeler, 1987)

Các yếu tố ảnh hưởng tới hàm lượng protein trong cánh bèo gồm có: ánh sáng, nhiệt độ, thành phần và hàm lượng khoáng chất trong môi trường nuôi (đặc biệt là nitơ) Hàm lượng protein và các thành phần hữu cơ khác có trong cánh bèo được liệt kê

ở bảng 2.5 (Landolt và Kandeler, 1987)

Bảng 1.1.Thành phần và hàm lượng các hợp chất hữu cơ có trong cánh bèo

Thành phần Hàm lượng (% trọng lượng khô)

Bèo sinh trưởng trong điều kiện tối ưu về dinh dưỡng và các điều kiện nuôi cấy

thì hàm lượng protein có thể đạt tới 45% trọng lượng chất khô (Leng và cs, 1994) Hàm lượng protein này rất cao so với các loài thực vật khác và tương đương với hàm lượng protein có trong đậu tương

1.1.4 Đặc điểm sinh học

1.1.4.1 Khái niệm cơ bản về cánh bèo

Dạng thân giống lá của các loài Lemnaceae được gọi là “frond” (cánh bèo), là

một tập hợp của các mô có sự biệt hoá hạn chế Mức độ tổ chức của mô cánh bèo trong

họ Lemnaceae giảm từ Spirodela tới Lemna, Wolffiella và Wolffia (Landolt, 1986)

1.1.4.2 Hình dạng và kích thước cánh bèo

Đa số bèo tấm có cánh mỏng giống lá Một số loài có cánh không dẹt do có

xoang khí lớn Cánh bèo có hình ovan (hay tròn) dài tới 1,5 cm và rộng tới 1 cm (S

polyrrhiza, L trisulca) Loài nhỏ nhất có cánh đạt kích thước 3 mm ở điều kiện tối ưu

Ở điều kiện thường có thể nhỏ hơn 1 mm

Kích thước và hình dạng của cánh bèo phụ thuộc nhiều vào các điều kiện bên ngoài và kiểu gen của chúng Các yếu tố ngoại cảnh này bao gồm: ánh sáng, hàm lượng đường, hàm lượng nitơ, phospho, kali, canxi và magie, nhiệt độ (Landolt, 1986)

1.1.4.3.Hình thức sinh sản của bèo tấm

Bèo tấm có hai hình thức sinh sản chính: sinh sản vô tính và sinh sản hữu tính Sinh sản vô tính chiếm ưu thế so với sinh sản hữu tính Hình thức sinh sản hữu tính của bèo tấm chỉ xảy ra khi chúng gặp điều kiện bất thuận để bảo tồn nòi giống (Landolt, 1986; Landolt và Kandeler, 1987)

*Sinh sản vô tính

Hình 1.1 Vòng sinh sản vô tính của L aequinoctialis (Landolt, 1986)

F1 cánh con thế hệ thứ nhất b cánh con thứ hai

F2 cánh con thế hệ thứ 2 + cạnh dương của

cánh

F 2+a (1-a) cánh con đầu tiên của cạnh dương của thế hệ thứ hai

phát sinh từ cánh đầu tiên ở cạnh âm của thế hệ đầu tiên

- cạnh âm của cánh

Các loài bèo sinh trưởng bằng phương thức nảy chồi từ vùng đỉnh phân sinh nằm trong xoang ở vùng gốc cánh Ở điều kiện tối ưu tốc độ sinh sản vô tính của bèo tấm gần đạt mức tăng theo hàm số mũ Lượng cánh có thể tăng lên gấp đôi chỉ sau 24

giờ nuôi cấy ở các loài sinh trưởng nhanh như L aequinoctialis, W microscopica (xem

hình 1.1)

+ Vòng đời của cánh bèo

Với hình thức sinh sản vô tính, thời gian một vòng đời của cánh bèo chỉ vài tuần Theo nhiều tác giả cho biết vòng đời của một cánh bèo phụ thuộc vào nhiệt độ nuôi, ở 30oC, vòng đời giảm còn một nửa so với ở 20oC Trong giai đoạn ngủ nghỉ và ở nhiệt độ thấp, cánh bèo có thể tồn tại trong vài tháng Điều kiện dinh dưỡng cũng có thể ảnh hưởng tới vòng đời Lượng dinh dưỡng không đủ có thể làm cánh bèo già hoá nhanh và chết chỉ sau 1 đến 2 tuần Nói chung, vòng đời của một cánh bèo sẽ dài hơn nếu tốc độ nhân cánh thấp hơn Khi nồng độ dinh dưỡng giảm dưới ngưỡng tối thiểu thì cánh bèo bị tổn thương và chết nhanh hơn bình thường (Landolt, 1986)

*Sinh sản hữu tính

+Ra hoa

+ Quả và hạt

Khoảng 2 - 5 tuần sau khi thụ tinh thì quả chín Mỗi quả có lá bao khô và

thường có 1 hạt Ở hầu hết các loài quả gần như đối xứng ngoại trừ L valdiviana và L

perpusilla Quả dài từ 0,35 mm – 2,75 mm Hạt bèo tấm có dạng hình trứng với 1 vảy

đen ở đỉnh Khi quả có nhiều hơn 1 hạt thì quả có dạng hình trứng hoặc tam giác Kích thước hạt biến đổi trong cùng 1 loài và giữa các loài từ 0,3 - 2 mm về chiều dài và 0,2 - 0,8 mm về đường kính Hạt có vỏ hạt ngoài và vỏ trong, nội nhũ và phôi Vỏ ngoài gồm 2 - 11 lớp tế bào của biểu bì ngoài, ở đỉnh có nhiều lớp tế bào hơn ở giữa và cuối hạt (Landolt, 1986)

1.1.4.4 Đặc điểm sinh học của Wolffia australiana

W australiana là loài thực vật hạt kín có hoa nhỏ bé nhất Chúng không có rễ,

cây dạng hình trứng hoặc hình elip, có chiều dài từ 0,4 mm đến 0,9 mm Chúng sống

trôi nổi trên mặt nước, rất khó để quan sát được hoa của chúng Hoa của W australiana

được bao bọc trong một cái bao, phát triển bên trên thân của cây chứa một nhị hoa và một nhụy đơn không có đài hoa và những cánh hoa Hạt phấn có gai, những phần nhô lên mặt nước được bao trùm lại Ở giữa những tế bào được bao bọc bởi một lớp lục lạp, nhờ đó chúng nổi lên mặt nước

Ưu điểm của W australiana so với các loài thực vật khác

- W australiana có thể sản xuất từ 6,8% đến 45% protein tính trên trọng lượng

khô Protein của bèo tấm có hầu hết các amino acid không thay thế Ngoài ra W

australiana có các loại vitamine: A, B1, B2, B6, E

- Thời gian nhân đôi 24-48h tuỳ theo điều kiện nuôi trồng Có thể sản xuất sinh khối lớn trong thời gian rất ngắn

- Dễ nuôi trồng, chỉ cần nước, ánh sáng, CO và muối khoáng

- Cây tự thụ, không tạo phấn đảm bảo tốt các điều kiện về an toàn sinh học cho

Các cơ quan ra hoa ở bèo tấm LA gồm các

thành phần: 1 lá bắc, 2 nhị, 1 nhuỵ, hiếm khi có 3

nhị (hình 1.2) Ở Spirodela và Lemna, các cơ quan

của hoa phát sinh trong xoang phát sinh cánh con Ở

Wolffiella và Wolffia, hoa phát sinh trong 1 xoang ở

bề mặt trên của cánh và không ở cùng xoang phát

sinh cánh con Hoa của Wolffia nằm dọc theo đường

trung tâm cánh Hoa của Wolffia nằm ở cạnh đường

trung tâm của cánh (Landolt, 1986) Hình 1.2 Hoa của L.A

St: nhị; Pi: Nhuỵ; Pe: lá bắc

(Landolt, 1986)

cây biến đổi gen

- Cải tạo môi trường nước, đặc biệt nó còn làm giảm sự phát triển của muỗi Anopheles

- W australiana là hệ thống mới cho sản xuất các loại vacxin và những kháng

thể đơn

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng phát triển W australiana

Cũng giống như các loài cây khác,nhiệt độ, môi trường, ánh sáng, chất dinh

dưỡng, độ pH là các yếu tố tác động lên sinh trưởng và phát triển của W australiana

W australiana có thể sinh trưởng trong các ao hồ, các môi trường nước nhân

tạo, các bình nuôi Việc thay nước thường xuyên là rất quan trọng, tránh được sự mất

nước do bay hơi W australiana cần được nuôi trong môi trường sạch Khi lấy bèo từ

các ao hồ sẽ bị lẫn nhiều các sinh vật khác: vi khuẩn, nấm, tảo, vi sinh vật, thậm chí các

tế bào động vật rất nhỏ, những ấu trùng Do đó phải làm sạch bèo trước khi nuôi bằng cách chuyển các cá thể riêng lẻ vào môi trường nước sạch, việc này được làm hết sức cẩn thận bởi các tế bào bèo rất dễ bị tổn thương

Môi trường nuôi

Cây sinh trưởng và phát triển tốt hay không phụ thuộc rất nhiều vào môi trường nuôi Nhu cầu dinh dưỡng tối ưu cho các loài cây là không giống nhau, tuỳ thuộc vào loài, giống, thậm chí các mô được lấy từ các cơ quan khác nhau trên cùng một cơ thể sinh vật

Cho đến nay người ta đã tìm ra nhiều loại môi trường dinh dưỡng cơ bản như: môi trường MS, môi trường Knop, môi trường B5 Trong đó, môi trường MS được sử dụng cho nhiều loại cây trồng Môi trường MS rất giàu thành phần khoáng đa lượng, đặc biệt là nitrat và amonium Tuy nhiên đối với một số loài thì hàm lượng khoáng MS

tỏ ra quá cao và có trường hợp gây độc cho mô nuôi cấy

Vì thế, với mỗi đối tượng, ta cần tìm ra môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng

và phát triển của chúng Riêng đối với W australiana môi trường nuôi nhân tạo thường

dùng là H (Hutner)

Nguồn cacbon

Trong quá trình nuôi cấy cây chủ yếu hút chất dinh dưỡng từ môi trường Nguồn cacbon được sử dụng chủ yếu trong nuôi cấy thực vật là sucrose với nồng độ 1-8%, glucose và fructose thường được sử dụng thay cho sucrose, còn các loại đường khác như mantose, manose, lactose ít được dùng Đối với W globosa đường tốt nhất để dùng cho nuôi cấy là sucrose với nồng độ 1%

Các muối khoáng

W australiana sinh trưởng tốt ở những nơi mà trong nước giàu chất khoáng, đặc

biệt là photpho và nitơ Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, nitơ được sử dụng dưới dạng muối: CaNO3; KNO3; NaNO3; NH4NO3 Photpho thường được dùng dưới dạng Kaliphotphat (KH2PO4)

Nhiệt độ

Nhiệt độ tối ưu cho bèo sinh trưởng khoảng từ 200 - 300C, ở nhiệt độ 35-400C ảnh hưởng nghiêm trọng đến sinh trưởng của bèo Dưới nhiệt độ lạnh bèo hình thành các chồi ngủ, vì thế bèo có thể sống qua mùa đông ở ao hồ dưới dạng những chồi ngủ

Ánh sáng

Ánh sáng trực tiếp là điều kiện tự nhiên cho bèo, tuy nhiên, ánh sáng trự tiếp có thể là một vấn đề nếu ta nuôi bèo trong một vật đựng nhỏ, ánh sáng sẽ làm nước tăng nhiệt độ và bốc hơi làm cho cây chết Chính vì vậy thay nước thường xuyên và tránh mất nước là điều rất quan trọng

Ánh sáng đèn huỳnh quang là loại ánh sáng dùng phổ biến nhất vì nó phát ra tia hồng ngoại cung cấp đầy đủ ánh sáng cho quang hợp và cây sẽ không bị nóng lên

Độ pH

Độ pH ảnh hưởng đến quá trình hút chất dinh dưỡng trong cây tương đối phức tạp, ở các nồng độ pH khác nhau thì quá trình hút chất dinh dưỡng cũng khác nhau W globosa có thể sinh trưởng trong một phạm vi pH rộng, nhưng sống tốt trong khoảng pH=4,5 đến pH=7,5

Hình 1.3 Bèo tấm W australiana nuôi trên đĩa thạch 1.2 Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh ở bèo tấm

Có rất ít các nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh trên bèo tấm được công bố từ trước tới nay Theo các tài liệu mà chúng tôi có được từ năm 1978 Chang và Hsing đã

tạo được callus thành công trên L aequinoctialis khi nuôi cấy các cánh trưởng thành của L aequinoctialis trong môi trường lỏng có chứa 10 mg/l 2,4 D Callus được tạo ra

từ vùng mô phân sinh xung quanh điểm node phát sinh cánh sau 13 tuần nuôi cấy Trong thời gian nuôi cấy tiếp theo, hai ông chỉ tạo được dạng cấu trúc giống cánh có màu xanh mà không có tiến triển nào tốt hơn sau đó hai tháng (Chang và Hsing, 1978)

Trước đó, vào những năm 1976-1978 Chang và Chiu đã tạo thành công callus và tái

sinh cánh ở dòng bèo L.gibba G3 (Chang và Chiu, 1978) Mãi cho đến những năm

1997, 1998, một số nhà nghiên cứu thuộc đại học phía Bắc Bang Carolina phát triển

một hệ thống tái sinh thông qua callus ở L gibba G3 Tuy nhiên kết quả cuối cùng mới

chỉ là dạng cấu trúc giống cánh màu xanh hoặc là dạng nốt sần màu xanh (Moon và Stomp, 1997)

Một quy trình tái sinh được xây dựng trên L.minor L đã được công bố năm 2002, trong đó callus được tạo ra với tỷ lệ 89.11% khi cấy từ mẫu cánh bèo L minor (4 loại

mẫu: toàn cánh trưởng thành; cánh bị tổn thương do cắt; nửa cánh; mẫu rễ xấp xỉ 1cm) trên môi trường có bổ sung 45 mM 2,4 D Cánh tái sinh từ callus thu được trên môi trường tái sinh có 22mM IAA và 4,0 mM Kinetin Tỷ lệ tái sinh đạt 100%, cánh tái sinh thu được khi chuyển lên môi trường nhân cánh đã nhanh chóng tạo ra cánh bình thường (Stefaniak và cs, 2002)

Li và cộng sự, 2004 đã xây dựng hệ thống tái sinh hoàn chỉnh và chi tiết trên các

loài bèo Spirodela oligorrhiza, Spirodela punctata, Lemna gibba var Hurfeish Báo cáo

này đã phân tích ảnh hưởng của các loại đường và các chất KTST tới giai đoạn tạo callus (Li và cs, 2004) Các auxin sử dụng gồm có dicamba, PCA, NAA, 2,4 D Các cytokinin gồm có TDZ, BA, 2iP, zeatin Các loại đường gồm có galactose, sorbitol, maltose, sucrose, mannitol Các chất KTST, đường và hàm lượng của chúng được sử dụng khác nhau ở các giai đoạn khác nhau trong hệ thống tái sinh và ở mỗi loài bèo (Li

và cs, 2004)

1.3 Nghiên cứu chuyển gen vào bèo tấm Woffia sp, Lemna sp

1.3.1 Thiết kế vector biểu hiện ở thực vật

1.3.1.1 Vectơ tách dòng

Để tách dòng một đoạn ADN, đoạn đó cần phải được đính vào vectơ tách dòng

Có nhiều loại vectơ: plasmid, phage, cosmid, YAC… Người ta chọn sử dụng vectơ dựa vào kích thước của đoạn ADN cần tạo dòng và mục đích tạo dòng Một vectơ được sử dụng cho mục đích tách dòng cần có những đặc điểm sau đây:

• Vectơ phải có khả năng sao chép tích cực trong tế bào chủ, không phụ thuộc vào

sự sao chép hệ gen tế bào chủ

• Vectơ phải có kích thước càng nhỏ càng tốt để có thể thu nhận một lượng ADN tối đa Hơn nữa, kích thước vectơ càng nhỏ thì càng dễ dàng xâm nhập vào tế bào vi khuẩn và càng được sao chép nhanh và đạt hiệu quả

• Vectơ phải có các đặc tính cho phép phát hiện dễ dàng tế bào vi khuẩn có chứa vectơ, các đặc tính này được mã hoá bởi các gen chọn lọc Thông thường đó là

các đặc tính kháng kháng sinh giúp vi khuẩn có mang vectơ sống được trên môi trường có chất kháng sinh chọn lọc, hoặc có khả năng sản sinh một enzyme chuyển hoá một cơ chất tạo mầu, dễ dàng phát hiện trên môi trường thạch

• Vectơ phải tồn tại được trong vi khuẩn qua nhiều thế hệ và phải gây ít xáo trộn nhất cho tế bào chủ

• Vectơ phải mang những vị trí nhận biết duy nhất của một số lượng tối đa enzyme giới hạn Điều này mở rộng khả năng xây dựng các vectơ tái tổ hợp Hơn nữa các vị trí nhận biết này thường đặt vào giữa các gen chọn lọc Nhờ vậy

mà khi trình tự ADN gắn xen vào một vị trí cũng sẽ gắn xen vào chính giữa gen

và làm bất hoạt gen đấy Cho đến nay đã có nhiều thế hệ plasmid khác nhau ra đời, thế hệ sau là cải tiến của thế hệ trước và ngày càng mang nhiều đặc tính quý báu cho việc tạo dòng

Trong số các loại vectơ hiện nay thì plasmid được sử dụng rộng rãi nhất Về chức năng, người ta chia vectơ thành hai loại lớn là vectơ nhân dòng (cloning vector) và vectơ biểu hiện (expression vector)

Trong đề tài nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng vectơ pCRđ 2.1 để tách dòng và vectơ pPAMksGFP để biểu hiện đoạn gen VP2 của virus gumboro

Vectơ pCR đ 2.1

Để tách dòng và xác định trình tự gen mã hoá protein VP2 của virus Gumboro chúng tôi sử dụng vectơ pCRđ 2.1 của hãng Introgen làm vectơ tách dòng Đây là một trong các vectơ có hiệu quả rất cao và đang được sử dụng phổ biến, có ưu điểm nổi bật

là có thể gắn trực tiếp sản phẩm PCR vào vectơ đã được cắt mở vòng do có sẵn hai đầu dính, mỗi đầu có một base Thymine Vectơ pCRđ 2.1 có kích thước 3,9 kb, được thiết

kế có gắn một operon chuyển hoá đường lactose là operon-lac Tại vùng ranh giới giữa promoter của operon này là gen cấu trúc mã hoá cho β- galactosidase có vùng cắt đa vị

(multiple cloning site (MCS) – vùng nhân dòng đa điểm cắt) với 17 vị trí cắt cho các

enzyme giới hạn: EcoR I, Hind III, Nsi I, Kpn I, Sac I, BamH I, Spe I, BstX I, EcoR V,

Not I, Ava I, PaeR7 I, Xho I, Xba I, Apa I Trong đó EcoR I, BstX I có hai vị trí cắt, các

enzyme còn lại chỉ có một vị trí cắt Với vị trí của vùng MCS như vậy, sản phẩm β galactosidase có thể được tạo ra (nếu vectơ không được đính đoạn ngoại lai) hoặc

-không được tạo ra (nếu vectơ được đính đoạn ngoại lai) Dựa vào dấu chuẩn đó, người

ta có thể lựa chọn được những tế bào mang vectơ tái tổ hợp với tần suất cao Ngoài ra, vectơ pCRđ 2.1 có chứa gen kháng kháng sinh là Ampicillin và Kanamycin, nhờ đó có

thể sinh trưởng bình thường trên môi trường có chứa Ampicillin và Kanamycin với

nồng độ ức chế tối thiểu Phần trình tự trên biểu thị vectơ pCRđ 2.1 được đính kèm sản phẩm PCR bởi liên kết TA

1.1.3.2 Vectơ biểu hiện

Để có thể thu nhận protein tái tổ hợp thì gen mã hoá cho protein phải được gắn vào vectơ biểu hiện Có rất nhiều vectơ biểu hiện tương ứng với nhiều loại tế bào biểu hiện khác nhau Ở đây để biểu hiện gen VP2 mã hoá một phần kháng nguyên vỏ của virus gumboro, chúng tôi chọn vectơ pPAMksGFP (6496 bp) để thiết kế pPAM-VP2 Các vectơ này được điều khiển bởi promotor 35S promoter và gen chỉ thị nptII kháng với geneticin (Hình 1.4) Vùng nhận biết gắn gen kháng kháng sinh giúp cho việc chọn lọc chính xác dòng plasmid tái tổ hợp Những plasmid này được TS J.Schillberg (Fraunhofer, Viện sinh học phân tử và kinh tế ứng dụng, Aachen, CHLB Đức cung cấp)

Hình 1.4 Cấu trúc pPAMksGFP

1.3.2 Các phương pháp chuyển gen ở thực vật

Hiện nay có nhiều phương pháp chuyển gen vào thực vật, chúng được chia thành 2 loại chính: gián tiếp và trực tiếp Phương pháp chuyển gen gián tiếp là phương pháp dựa trên việc đưa 1 cấu trúc gen mang bởi 1 plasmid vào tế bào đích bằng các vi

khuẩn Agrobacterium tumefaciens hay Agrobacterium rhizogenes Phương pháp trực

tiếp là phương pháp không sử dụng tế bào vi khuẩn làm đối tượng trung gian (Trojanowska, 2002)

1.3.2.1 Chuyển gen gián tiếp thông qua Agrobacterium tumefaciens

Số lượng các loài cây trồng được chuyển gen thông qua A tumefaciens tăng mạnh

trong vài năm gần đây Nhiều loài cây trồng khác nhau đã được chuyển gen bằng việc

áp dụng hai hệ thống chuyển gen:

a) Hệ thống chuyển gen in vitro (sử dụng hệ thống tế bào nuôi cấy in vitro)

b) Hệ thống chuyển gen in vivo (không sử dụng hệ thống tế bào nuôi cấy in vitro)

(Sharma và cs, 2005)

Hệ thống chuyển gen thông qua Agrobacterium in vitro

Khó khăn chính trong việc xây dựng hệ thống chuyển gen in vitro là phải có

được sự kết hợp giữa sự xâm nhiễm của Agrobacterium và khả năng tái sinh của các tế

bào sau khi lây nhiễm với Agrobacterium (Birch, 1997)

Một số kỹ thuật hỗ trợ trong quá trình biến nạp đã cải thiện hiệu quả của hệ thống

chuyển gen thông qua Agrobacterium bao gồm:

vân sam trắng, lúa mỳ và ngô sau khi biến nạp với Agrobacterium theo phương pháp

SAAT (Trick và Finer, 1997)

* Ly tâm tế bào

Phương pháp chuyển gen thông qua Agrobacterium kết hợp với ly tâm đã được

áp dụng thành công khi biến nạp vào huyền phù tế bào phôi hoá nhận được từ hoa

chuối đực nuôi cấy in vitro của hai giống chuối thương mại Cavendish và Lady Finger

Tần số chuyển gen đã được cải thiện đáng kể bằng cách áp dụng chế độ ly tâm tế bào thực vật trong quá trình nuôi cấy cộng sinh với vi khuẩn (Khanna và cs, 2004)

Hệ thống chuyển gen thông qua Agrobacterium in vivo

Phương pháp này dựa trên cơ sở của việc chuyển gen vào nguyên cây (in planta)

và rất phổ biến đối với loài A thaliana, một trong những loài cây mô hình đối với các

nghiên cứu về hệ gen học Phương pháp chuyển gen này tốn ít thời gian, bỏ qua công đoạn nuôi cấy mô và tái sinh sau biến nạp, vì thế loại bỏ được các biến dị soma và số lượng cây chuyển gen thu được lớn hơn Kỹ thuật này đã được mô tả ở các cây trồng

khác nhau như: đậu tương, Arabidopsis, hoa hướng dương, hoa rum và cây lạc (Rohini

và Rao, 2000)

* Phương pháp chuyển gen vào hạt

Hạt Arabidopsis được lây nhiễm với Agrobacterium sau đó đem trồng và thu được cây trưởng thành với tần số biến nạp 1% Hạt Arabidopsis chuyển gen đã được tạo thành từ các cụm hoa mới xuất hiện sau khi lây nhiễm Agrobacterium tại những

vùng bị tổn thương khi cắt bỏ cụm hoa (Katavic và cs, 1994)

* Phương pháp ngâm cụm hoa

Một số nghiên cứu chuyển gen đã được tiến hành ở cây Arabidopsis bằng cách ngâm các thể giao tử cái của hoa non, cụm hoa trong dịch vi khuẩn Agrobacterium

(Desfeux và cs, 2000) Phương pháp này cũng được áp dụng với các cây 1 lá mầm

* Phương pháp thấm lọc chân không

Phương pháp chuyển gen thấm lọc chân không cũng tương tự như phương pháp ngâm cụm hoa Phương pháp này đã được áp dụng ở một số cây trồng, đặc biệt là cây

một lá mầm Trong môi trường chân không, tế bào thực vật tiếp xúc với Agrobacterium tốt hơn Người ta đã nhận được các cây Medicago truncatula (cây mô hình thuộc họ

đậu) chuyển gen bền vững bằng phương pháp chuyển gen này (Trieu và cs, 2000)

1.3.2.2 Các phương pháp chuyển gen trực tiếp

Chuyển gen bằng súng bắn gen

Bắn gen là một kĩ thuật sử dụng các mảnh kim loại kích thước ỡm được bọc các DNA và được tăng tốc bắn vào các tế bào đích ở tốc độ đủ để xuyên qua thành tế bào

mà không gây tổn hại nghiêm trọng tới tế bào (Taylor và Fauquet, 2002) Theo cách

đó, gen quan tâm được chuyển vào bên trong của tế bào nơi nó được tách khỏi vỏ hạt vi đạn và được tổ hợp vào nhân hay bộ gen Phương pháp bắn gen được phát triển vào

những năm 1980 nhằm cạnh tranh với phương pháp chuyển gen bằng Agrobacterium

Phương pháp được áp dụng cho hầu hết các loài cây không thuộc họ cà, cây ngũ cốc, cây họ đậu

Chuyển gen nhờ Silicon Carbide

Nguyên lý: Các sợi Silicon Carbide được đưa vào huyền phù chứa mô thực vật (màng tế bào, phôi non, callus) và DNA plasmid Tất cả được trộn bằng máy votex, máy lắc hoặc máy đảo Sợi Silicon Carbide bọc DNA sẽ xuyên qua thành tế bào do có các lỗ nhỏ tạo ra trên thành tế bào khi sợi Silicon Carbide va đập với tế bào Sợi Silicon Carbide hay được sử dụng là các tinh thể đơn lẻ của các khoáng chất hữu cơ như thạch anh (silica) Silicon Carbide có hình dạng ống dài từ 10 - 80 mm, đường kính 0,6 mm

và ít bị co giãn

Ưu điểm chính của phương pháp này là giá rẻ và có thể sử dụng cho các loại vật liệu thực vật khác nhau Nhược điểm chính là tỉ lệ chuyển gen không cao, gây tổn thương tế bào dẫn đến khả năng tái sinh kém và cần phải tuân thủ qui trình cảnh báo nghiêm ngặt khi làm trong phòng thí nghiệm, nếu hít phải sợi Silicon Carbide, đặc biệt

là sợi amiăng có thể bị bệnh nghiêm trọng

Có một số kết quả đã đạt được của phương pháp này như thu được dạng chuyển gen-dòng tế bào hay cây ở ngô, lúa mì, thuốc lá…

Chuyển gen bằng xung điện

và 54,6% với callus ( D’Halluin và cs, 1992) Các tác giả tính toán rằng cứ 10000 tế bào thì có 1 nhận được gen chuyển Ở lúa mì, tỉ lệ thu được cây chuyển gen chỉ đạt 0,28% Mặc dù phương pháp này rất đơn giản và hiệu quả trên một số loài, nó vẫn ít được sử dụng để chuyển gen thực vật

Kỹ thuật vi tiêm

Biến nạp thông qua vi tiêm dựa trên việc chuyển DNA vào nhân hoặc bào tương bằng các dụng cụ của một pipet có đầu vi mao dẫn thuỷ tinh (Morikawa và Yamada, 1985) Các bước vi tiêm cần được thực hiện trên một thiết bị vi thao tác Trong quá trình đưa DNA vào nhân, tế bào được cố định với một pipet giữ và hút cẩn thận Cả hai pipet đều chứa dầu khoáng hoạt động giống như xilanh Vi tiêm chủ yếu được sử dụng cho chuyển gen vào các tế bào động vật lớn

Phương pháp này không được phát triển do qui trình thực hiện mất nhiều thời gian và thiết bị vi thao tác rất đắt Tuy nhiên phương pháp này có ưu điểm là nó cho phép chuyển không chỉ DNA plasmid mà còn toàn bộ gen vào tế bào thực vật (Griesbach, 1987) Cây chuyển gen chỉ được tạo ra trong vài nghiên cứu bao gồm các loài như: thuốc lá petunia, cải dầu và lúa mạch và thường ở tỉ lệ rất thấp (Trojanowska, 2002)

Phương pháp chuyển gen qua ống phấn

Nguyên lý: DNA ngoại lai được đưa vào vòi nhuỵ bị cắt một thời gian ngắn sau khi thụ phấn DNA ngoại lai chuyển tới tế bào trứng bằng cách chảy xuống theo ống phấn Quy trình được áp dụng lần đầu tiên cho chuyển gen vào lúa gạo Sau đó nó được

sử dụng cho các loài khác như lúa mì, đậu tương, Pentunia hybrida và dưa hấu

(Trojanowska, 2002) Vi khuẩn hay DNA plasmid có thể được tiêm vào cụm hoa với các tế bào mẹ hạt phấn ở giai đoạn tiền giảm phân mà không cần loại bỏ nhị Trong trường hợp đó người ta hy vọng DNA ngoại lai sẽ hợp với bộ gen thể giao tử

Phương pháp chuyển gen bằng Liposome

Ý tưởng về một phương pháp chuyển gen trực tiếp hình thành vào giữa những năm 80 nhằm để chuyển DNA vào tế bào bằng công cụ của liposone Liposome là các túi vi thể hình cầu được tạo ra khi các phospho lipid bị hydrat hoá Chúng có thể được

mang cùng với rất nhiều loại phân tử, gồm có DNA Đối với tế bào trần, quá trình chuyển gen diễn ra sự dung hợp thành tế bào và nội thực bào Chuyển gen thông qua liposome ít được sử dụng dù nó rẻ và không yêu cầu thiết bị Nguyên nhân chính là do thực hiện nó quá tốn nhân công và hiệu quả thu được lại thấp Chỉ có vài báo cáo về chuyển gen bằng liposome vào bộ gen cây chủ và tạo được cây tái sinh ở thuốc lá và lúa mì (Zhu và cs, 1993; Trojanowska, 2002)

1.3.3 Chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens

Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid

Ti-plasmid được tìm thấy ở tất cả các chủng A tumefaciens gây bệnh và tồn tại

bền vững ở nhiệt độ dưới 30oC Đây là một phân tử DNA mạch vòng, sợi kép, có trọng lượng phân tử bằng 3 - 5% so với trọng lượng phân tử của nhiễm sắc thể vi khuẩn Với kích thước khoảng 200 kb, trong tế bào chúng tồn tại như một đơn vị sao chép độc lập

Có 2 dạng Ti-plasmid phổ biến Octopine Ti là plasmid mang các gen cần để tạo

ra các khối u sần sùi sản sinh ra octopine trong khi nopaline Ti- plasmid mang các gen gây khối u nhẵn sản sinh ra nopaline (Hooykaas và cs, 1979) Octopine Ti plasmid và

Nopaline Ti plasmid có các vùng cơ bản như sau: (i) Vùng T-DNA, (ii) vùng vir-là

vùng điều khiển hoạt động cắt và chuyển T-DNA vào tế bào sinh vật chủ, (iii) vùng

rep-vùng cần thiết cho sự tái bản Ti-plasmid, (iv) các operon tra và trb-đóng vai trò

điều khiển sự chuyển liên hợp của Ti-plasmid và (v) các gen điều khiển sự hấp thu và

sử dụng các opine (hình 1.5) (Zhu và cs, 2000)

Hình 1.5 Cấu trúc Ti plasmid dạng octopine

Cấu trúc và chức năng của đoạn T-DNA

Kết quả phân tích trình tự gen trên T-DNA ở các Ti-plasmid khác nhau cho thấy, T-DNA được giới hạn bởi hai đoạn trình tự lặp lại ở hai biên có kích thước 25bp (Negrotto và cs, 2000; Lê Thị Thu Hiền, 2003)

Ở Ti-plasmid dạng nopaline, T-DNA xâm nhập vào genom thực vật là một đoạn liên tục dài 22 kb Trong khi ở Ti-plasmid dạng octopin, T-DNA là một đoạn gen liên tục dài 13 kb T-DNA mang rất nhiều gen như: (l) Các gen mã hoá những enzym cần

thiết cho quá trình sinh tổng hợp opin; (2) Các gen gây khối u như tms1, tms2, tmr mã

hoá cho các enzym liên quan đến quá trình sinh tổng hợp auxin và cytokinin (Hooykaas

và Schilperoort, 1992)

Cơ chế phân tử của quá trình chuyển gen thông qua A tumefaciens

Các tế bào cây bị tổn thương sẽ tiết ra các hợp chất phenol và đường có tác dụng

dẫn dụ A tumefaciens đến bám vào thành tế bào cây chủ Các hợp chất này đồng thời cũng làm cảm ứng hoạt động của các gen vùng vir Trước tiên protein virA nằm trên

thành tế bào vi khuẩn nhận biết sự có mặt và tương tác với các hợp chất phenol thực vật Nhờ đó protein virA được phosphoryl hoá, tiếp đó nó chuyển tiếp phosphoryl hoá phân tử protein virG tạo ra dạng protein virG hoạt hoá Protein virG đã hoạt hoá kết

hợp với vùng điều khiển của vir-box giúp kích hoạt và tăng cường mức độ phiên mã các gen gây độc khác như virB, virC, virD và virE (Mclean và cs, 1994; Gelvin, 2003)

Sợi dưới của T-DNA bị cắt ở vị trí cách 4 nucleotid từ đầu bờ phải bởi hoạt động của protein virD2 Protein này liên kết đồng hoá trị với đầu 5’ của mỗi đoạn bị cắt Đồng thời với quá trình cắt là quá trình tổng hợp mới sợi thay thế cho sợi bị cắt Đoạn bị cắt ra là sợi đơn đại diện cho vùng T-DNA và được gọi là sợi T (Wie và cs, 2000; Valentine, 2003)

Trong quá trình di chuyển, protein virE2 gắn với sợi T tạo thành phức hợp T dạng ống sợi nucleo-protein (T-complex) nhằm bảo vệ chúng trước các tác động của các enzym thuỷ phân và các enzym endonuclease có trong dịch bào của tế bào cây chủ Protein virB tạo ra cầu nối giữa tế bào vi khẩn và tế bào cây chủ giúp cho sợi T có thể được vận chuyển sang tế bào cây chủ (Citovsky và cs, 1989; Durenberger và cs, 1989; Zupan và cs, 2000) Protein virD2 gắn ở đầu 5’ của sợi T đóng vai trò là tín hiệu nhận biết trong hệ thống vận chuyển (Hooykaas và Schilperoot, 1992) Quá trình chuyển T-DNA này gần giống với quá trình tiếp hợp ở vi khuẩn, trong đó protein virB tương đương với yếu tố F

Ở bên trong nhân, T-complex chuyển tới điểm tổ hợp và các protein bảo vệ sợi

T được tách ra trước khi T-DNA được tổ hợp vào những vị trí ngẫu nhiên trên bộ gen cây chủ Quá trình tổ hợp T-DNA vào bộ gen cây chủ là quá trình phụ thuộc nhiều nhất vào cây tế bào chủ (hình 1.6) (Bako và cs, 2003)

Sau khi kết hợp vào bộ gen cây chủ, các gen trên T-DNA, nhờ sự điều khiển của gen thực vật, bắt đầu hoạt động và sản sinh ra auxin, cytokinin và opin gây nên sự phát triển thái quá của hàng loạt tế bào lân cận dẫn đến sự hình thành khối u (Wie và cs, 2000; Lê Thị Thu Hiền, 2003)

Hình 1.6 Cơ chế lây nhiễm của A tumefaciens vào tế bào thực vật

(Nguồn: Zhu và cs, 2000)

Hệ thống vectơ chuyển nạp

Kích thước lớn của Ti-plasmid gây không ít khó khăn trong việc sao chép ở mức

phân tử cũng như không đơn giản để chuyển nạp gen thông qua Agrobacterium Mặt

khác, chúng lại chứa các gen tổng hợp hormon sinh trưởng thực vật gây khối u cho cây

bị xâm nhiễm nên không được dùng trực tiếp làm vectơ Các enzym giới hạn có thể cắt DNA của Ti-plasmid ở nhiều chỗ khác nhau, trong khi đó công nghệ gen lại cần có những vị trí cắt duy nhất cho hoạt động của một số enzym giới hạn Ngoài ra, các gen

onc được dùng làm chỉ thị chọn lọc có tính trội, nhưng chúng lại cản trở quá trình tái

sinh bình thường ở thực vật (Lê Trần Bình và cs, 1997, 2003; Lê Thị Thu Hiền, 2003)

Với những lý do này, Ti-plasmid đã được cắt bỏ các gen không quan trọng, lắp thêm các gen cần thiết vào vùng tạo dòng đa năng (MCS), tạo hai hệ thống vectơ

chuyển gen hiệu quả: vectơ nhị thể (binary vector) và vectơ liên hợp (co-integrate vector) Nhờ vậy, cây trồng được biến nạp Ti-plasmid cải biến vừa mang gen quan tâm,

vừa có khả năng tái sinh và phát triển bình thường (Hajdukiewicz và cs, 1994)

Hệ vector nhị thể

Trên cơ sở phát hiện vùng vir không cần nằm trên cùng một plasmid với vùng

T-DNA mà vẫn điều khiển được sự chuyển và xâm nhập của T-DNA vào genom thực vật, người ta đã nghiên cứu và hoàn chỉnh hệ thống vectơ nhị thể trong đó vùng T-

DNA và vùng vir nằm trên hai plasmid khác nhau nhưng trong cùng một chủng A

tumefaciens (hình 1.7)

Có hai loại vectơ được sử dụng trong hệ thống vectơ nhị thể:

(1) Vectơ chuyển gen: Là Ti-plasmid nhỏ có khả năng tự sao chép và có phổ vật chủ rộng với đoạn T-DNA được cắt bỏ hết các gen không cần thiết ở giữa hai trình tự

vị sao chép để DNA plasmid có thể vừa tự nhân trong cả E coli và Agrobacterium; ii)

các gen chọn lọc, gen đánh dấu và iii) vùng có chứa nhiều điểm cắt của các enzym giới hạn (vùng tạo dòng đa năng) nằm ở giữa hai trình tự biên trái và biên phải để chèn gen mong muốn

Hình 1.7 Sơ đồ cấu trúc hệ vector nhị thể

(2) Vector bổ trợ: nằm trong A tumefaciens, với toàn bộ vùng vir được giữ lại

nhưng loại bỏ hoàn toàn vùng T-DNA và RB, LB Plasmid này được cải tiến loại bỏ gen kích thích tế bào thực vật phát triển thành khối u, nhưng vẫn duy trì khả năng thâm nhập vào tế bào thực vật

Hai loại vector này cùng được đưa vào Agrobacterium, khi các gen trên vector bổ trợ

hoạt động thì các sản phẩm của nó sẽ tác động tới đoạn T-DNA trên vector chuyển gen dẫn đến sự chuyển đoạn T-DNA sang tế bào thực vật

Hệ vectơ liên hợp

Vectơ liên hợp được xây dựng trên cơ sở sự tái tổ hợp giữa vùng tương đồng

nằm trên plasmid vi khuẩn (như vectơ của E coli) với vùng T-DNA trên Ti-plasmid của A tumefaciens Trong đó, người ta giữ lại vùng vir, loại bỏ vùng mã hoá chức năng

gây khối u và thay thế bằng những đoạn DNA mới trong Ti-plasmid (hình 1.8)

Hình 1.8 Sơ đồ cấu trúc vector liên hợp

Có 3 loại vectơ tham gia vào hệ thống vectơ liên hợp:

(i) Ti-plasmid: các gen gây khối u đã bị vô hiệu hoá bằng cách thay vào đó gen kháng kanamycin của vi khuẩn;

(ii) Vectơ trung gian: có nguồn gốc từ pBR322 với kích thước nhỏ và được sử dụng để bổ trợ chức năng không ưu việt của Ti-plasmid (kích thước lớn và thiếu vùng

MCS) Chúng được nhân lên trong E coli và chuyển sang A tumefaciens nhờ quá trình tiếp hợp Do không thể sao chép trong A tumefaciens nên chúng mang những đoạn

tương đồng với T-DNA

(iii) Vectơ trợ giúp: tồn tại trong E coli, có kích thước nhỏ, chứa các gen di động (mob) và gen chuyển (tra) giúp cho quá trình tiếp hợp và chuyển vào A tumefaciens

(Walkerpeach và Velten, 1994)

1.3.4 Hệ thống chuyển gen ở bèo tấm

Trong các loài thực vật được nghiên cứu để sử dụng làm hệ thống sản xuất vaccine, các loài họ bèo tấm (Lemnaceae) đang được đặc biệt chú ý bởi các đặc tính sau: Họ bèo tấm (Lemnaceae) gồm có 5 chi và gần 40 loài Đó là loài thực vật sống dưới nước, có thể sinh trưởng tốt ở hầu như mọi nơi, chỉ cần có nước và ánh sáng Bèo tấm có tốc độ sinh sản rất nhanh, nhân đôi trọng lượng trong vòng 24 - 72 giờ Một số giống bèo tấm có tốc độ tăng sinh khối cao hơn hẳn so với các loài thực vật khác Ví dụ: ngô là cây sinh truởng rất nhanh, nhưng từ 1g chất khô ban đầu, sau một tuần không thể tạo ra lượng chất khô lớn hơn 2,3g Nhưng một số loại bèo tấm có thể tạo ra 64g chất khô từ 1g chất khô ban đầu sau một tuần (Edelman, 1999; Landolt, 1987)

Mặt khác, hàm lượng các chất dinh dưỡng của bèo tấm rất cao Bèo tấm có chứa các vitamin A, B1, B2 và các axit amin không thay thế, trừ methionin Riêng protein của bèo tấm có thể đạt từ 15-45% trọng lượng khô tuỳ theo loài (Landolt E., 1986 ), tức

là tương đương với đậu tương Theo tính toán, chỉ cần 1-3% trong số protein nói trên

có hoạt tính sinh học quan tâm là đã làm cho sản xuất protein bằng bèo tấm có hiệu quả cao Vì thế trên thế giới, trong những năm gần đây đã có nhiều nghiên cứu chuyển gen

để sản xuất hoạt chất bằng bèo tấm Các nhà khoa học Mỹ, Israel, Pháp đã sử dụng các loài Lemna để chuyển các gen có giá trị kinh tế, nhằm sản xuất các hoạt chất khác nhau, trong đó có vaccine Tháng 10 năm 2004, chính phủ Pháp đã tài trợ để thành lập công ty Lemnagene nhằm mục đích ứng dụng công nghệ sinh học (www lemnagene com)

Quy trình biến nạp vào bèo tấm cũng tương tự như quy trình biến nạp ở các loài thực vật khác, tức là phải tạo vật liệu vô trùng trong ống nghiệm, tạo callus rồi sau đó tái sinh callus đã chuyển gen thành cây hoàn chỉnh Ngoài ra các loài bèo tấm còn có thể chuyển gen sử dụng nguyên cây, không cần nuôi cấy mô và vật liệu vô trùng (Edelman M., 1999) Các loài chi Wolffia có kích thước cực nhỏ, chỉ từ 0,1 - 0,6 mm,

chỉ nhìn rõ dưới kính lúp Toàn cơ thể thực vật đã bị thuyên giảm một cách triệt để chỉ còn lại một cấu trúc hình thoi có kích thước 0,1 - 0,6 mm, có thể sinh sản vô tính bằng cách tạo chồi ở một đầu Bản thân cơ thể các loài này đã là một cấu trúc tương tự như dạng callus phôi hoá có thể tiếp nhận gen lạ Vì thế, một số phòng thí nghiệm trên thế giới đã bắt đầu nghiên cứu chuyển gen thẳng vào các loài của chi Wolffia song song với việc chuyển gen qua callus và tái sinh cây qua cấy mô (Shnable et al, 2001)

Một khi gen tổng hợp vaccine đã được biến nạp vào các loài thực vật này, vaccine có thể được sản xuất để cung cấp cho chăn nuôi (và trong tương lai cho con người) một cách tức thì, vì các loài thực vật này có tốc độ sinh sản rất nhanh (nhân đôi sau 1 - 4 ngày), rất dễ nuôi trồng, không cần các điều kiện đặc biệt như: bảo quản lạnh, chế độ vô trùng Do các đặc điểm trên, việc nghiên cứu sản xuất vaccine bằng các đối tượng này là hết sức hấp dẫn và hứa hẹn nhiều triển vọng Thành công trong lĩnh vực sản xuất vaccine dùng qua đường miệng bằng kỹ thuật di truyền thực vật sẽ làm cho việc sử dụng vaccine trở lên thông dụng và tiện lợi cho các nước kém phát triển, vùng sâu, vùng xa, nơi mà chưa có điều kiện để bảo quản lạnh, hay điều kiện vô trùng với đội ngũ cán bộ y tế có trình độ cần thiết Một số nhà khoa học đã dự báo rằng sản xuất vaccine và các chất có hoạt tính sinh học bằng kỹ thuật di truyền thực vật sẽ là một tương lai hứa hẹn nhất của công nghệ sinh học thực vật (RowlandSon & Tackaberry,

2003)

Năm 2001, các nhà nghiên cứu thuộc đại học phía Bắc Bang Carolina đã áp

dụng thành công phương pháp chuyển gen vào bèo tấm thông qua Agrobacterium

tumefaciens ở giai đoạn nốt sần trước khi tái sinh cánh L.gibba G3 và L.minor 8744

(Yamamoto và cs, 2001) Họ đã sử dụng qui trình tái sinh của Moon và Stomp (1997) Trong bài báo này, Yamamoto và cộng sự đã xây dựng 1 qui trình chuyển gen hiệu quả

ở hai loài bèo tấm L.gibba (G3) và L.minor (8627 và 8744) Yamamoto và cộng sự đã tạo ra 1 dòng bèo chuyển gen từ loài L.gibba G3, 2 dòng chuyển gen từ L.minor 8627

và 1 dòng chuyển gen từ L.minor 8744 Gen được chuyển là gen chỉ thị (GUS) được

điều khiển bởi promotor CaMV35 S (Yamamoto và cs, 2001)

Các loài bèo tấm đã được sử dụng làm hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp với nhiều thuận lợi so với các hệ thống biểu hiện gen và nuôi cấy tế bào hiện tại Có tới 12 loại protein đã được biểu hiện thành công trên hệ thống Lemna SystemTM, gồm các đoạn peptid nhỏ, mảnh Fab (Fabs), các kháng thể đơn dòng (mAbs) và các enzyme đa tiểu phần lớn… Lemna SystemTM là hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp dựa trên nền

tảng là các loài bèo tấm thuộc chi Lemna được hãng Biolex phát triển và đăng kí độc

quyền tại nhiều nước trên thế giới (Gasdaska và cs, 2003)

Quy trình biến nạp vào bèo tấm cũng tương tự như quy trình biến nạp ở các loài thực vật khác, tức là phải tạo vật liệu vô trùng trong ống nghiệm, tạo callus rồi sau đó tái sinh callus đã chuyển gen thành cây hoàn chỉnh Bên cạnh đó, phương pháp chuyển gen nguyên cây ("in planta") cũng được một số tác giả áp dụng trên bèo tấm đã cho thấy khả năng thu cây chuyển gen bền vững từ phương pháp này (Eldeman và cs,

1999 ; Stomp và cs, 2000)

1.4 Chuyển gen vỏ virus gumboro vào Wolffia / Lemna

1.4.1 Bệnh Gumboro ở gia cầm

Bệnh Gumboro là bệnh viêm túi bạch huyết hay còn gọi là viêm túi bạch huyết

nhiễm trùng (Infectiuous Bursal Disease -IBD), là một bệnh cấp tính, có khả năng lây lan cao ở gà con Gumboro (lấy tên từ địa danh ở Mỹ, nơi phát hiện bệnh đầu tiên vào năm 1962) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính do virus gây ra ở gà, chủ yếu là ở gà 2-6 tuần tuổi, với tỷ lệ chết cao Tỷ lệ chết cao cũng là hậu quả của suy giảm miễn dịch do virus gây ra và sự liên - tạp nhiễm các bệnh khác Cũng do bị suy giảm miễn dịch, mọi chương trình vaccine phũng chống một số bệnh nguy hiểm khác ở gia cầm cũng bị ảnh hưởng, gây thiệt hại kinh tế lớn, đối với gà nuôi công nghiệp (Lê Thanh Hoà, 1992; Nguyễn Tiến Dũng, 1996; Lê Thanh Hoà, 2003)

Virus gây bệnh thuộc loại Birnavirrus thuộc họ Birnaviridae (Dobos, 1979) Tổ chức lympho, đặc biệt là túi fabricius - cơ quan có thẩm quyền miễn dịch ở gia cầm là mục tiêu tấn công của virus cường độc Gumboro Sự tấn công của virus gây huỷ hoại tế bào lympho B và đại thực bào, làm suy giảm miễn dịch ở gia cầm Thiệt hại do bệnh gây nên được thể hiện ở hai khía cạnh: Bệnh Gumboro gây tỷ lệ chết 10 - 20% ở gà từ

3 - 6 tuần tuổi Quan trọng hơn, bệnh làm suy giảm miễn dịch ở đàn gà, ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển làm cho đàn gà dễ nhiễm các loại bệnh khác ở lứa tuổi sớm Sự suy giảm miễn dịch của đàn gà cũng làm giảm khả năng tạo miễn dịch của gà khi được tiêm phòng các loại vaccin phòng các loại bệnh nguy hiểm, như bệnh Newcastle, Mycoplasmosis…

Cấu trúc kháng nguyên của virus Gumboro

Phần lõi của virus Gumboro chứa ARN được xếp cuộn tròn và phân làm hai đoạn riêng biệt Hai phân đoạn ARN của virus Gumboro đều mang thông tin di truyền

và có nhiệm vụ sinh tổng hợp 4 loại protein cấu trúc và một số enzym thích hợp trong quá trình sao chép của virus bằng cơ chế bổ sung để tổng hợp ARN mới (Mulller at al., 1979; Becht et al 1988)

Proein virus chiếm 90% trọng lượng, bao quanh nhân để tạo thành lớp vỏ protein (capsit) Vỏ này được hình thành bởi 32 đơn vị cấu trúc được gọi là capsomer

(Hirai et al, 1979) Chúng liên kết với nhau bằng các cấu trúc bậc 4 Một cặp capsomer được tạo thành bởi 4 loại protein cấu trúc là VP1, VP2, VP3 và VP4, với trọng lượng phân tử là 90 kDa, 43 kDa, 32 kDa và 28 kDa Người ta cũng quan sát thấy những protein khác như VPX (Dobos, 1979) Toàn bộ hạt virus Gumboro có phân tử lượng 2,2 -2,5 x 106 dalton, có hằng số lắng là 14S và phân vùng trong clorua xezi ở nồng độ 1,32 g/m Các thông số này hoàn toàn giống nhau đối với IBDV thuộc các typ 1,2 cũng như đối với virus nhược độc và cường độc (Jackwood D.J at al 1983)

Cấu trúc kháng nguyên của IBDV tập trung ở phần vỏ capsit Chúng có cấu trúc protein là VP1, VP2, VP3 và VP4 Sự khác nhau về tính kháng nguyên của các typ virus là do cấu trúc protein của vỏ capsit quyết định Kibenge F.S và cộng sự (1988) đã thông báo rằng VP2 và VP3 là hai thành phần chủ yếu của virus Gumboro, chiếm 57%

và 34% Trong khi VP1 và VP4 chỉ là protein phụ VP1 chỉ chiếm 3% còn VP4 chỉ chiếm 6%

Hệ gen của IBDV chứa acid ribonucleic (RNA) gồm 2 phân đoạn A và B lồng vào nhau (Boot và cs, 2000) Phân đoạn A bao gồm các gen tổng hợp các loại protein VP2, VP3, VP4 và VP5; phân đoạn B tổng hợp protein VP1 (Skinner và cs, 1996) VP2 là protein vỏ, được mã hoá bởi đoạn gen có độ dài khoảng 1.300 nucleotide VP2

có độ bảo tồn cao về thành phần nucleotide ở hai đầu 5’ và 3’ và thành phần amino acid, nhưng lại có một vùng khoảng gần 500 nucleotide ở chính giữa của gen rất thay

đổi trong các chủng khác nhau, nên được gọi là vùng “siêu biến đổi” Vùng này quyết

định tính độc lực và tính kháng nguyên của virus, do vậy, được chọn để so sánh, chẩn đoán, giám định và lập phả hệ các chủng virus cường độc Gumboro (Yamaguchi và cs, 1996; Scherbacova và cs, 1998; Jackwood và cs, 2008)

Bệnh Gumboro xảy ra mọi nơi trên thế giới và trên toàn bộ nước Việt Nam (Lê Thanh Hoà, 2003) Tuy có rất nhiều loại vaccine được sử dụng, nhưng do tính phức tạp

về kháng nguyên của virus cường độc và chưa rừ ràng trong sự phân biệt độc lực của nhiều chủng virus Gumboro phân lập ở Việt Nam, nên việc can thiệp phòng chống bệnh Gumboro ở nước ta cũng chưa thật sự đạt hiệu quả

1.4.2 Chiến lược nghiên cứu và thử nghiệm ứng dụng vaccine thế hệ mới

Cho đến nay, trên thế giới và trong nước có nhiều loại vaccine phũng bệnh Gumboro bao gồm vaccine nhược độc cũng như vô hoạt, dùng cho gà các lứa tuổi khác nhau, nhiều vùng có tính chất dịch tễ khác nhau, và gà nuôi với mục đích khác nhau Vấn đề là ở chỗ nên chọn loại vaccine nào, sử dụng ở thời điểm nào, sao cho hệ miễn dịch của gia cầm được bảo vệ không bị virus cường độc tấn công, và nếu có bị xâm nhập, thì virus không gây bệnh được (Juneja và cs, 2008)

Cho dù chương trình phòng chống bệnh Gumboro được thực hiện một cách nghiêm ngặt, bao gồm chương trình vaccine chủ động và thụ động sử dụng vaccine

nhược độc sống, vaccine phân tử và vaccine vô hoạt; cũng như sử dụng kháng huyết

thanh, bệnh Gumboro vẫn hoành hành nghiêm trọng ở nhiều nước trên thế giới, kể cả

Mỹ Phòng chống bệnh chưa đạt hiệu quả cao do sử dụng không hoặc chưa đúng loại vaccine (do Gumboro có nhiều biến chủng và kháng nguyên thay đổi), do vaccine kém chất lượng do bảo quản và phương thức sử dụng chưa đúng Một số vaccine Gumboro tuy có bảo vệ miễn dịch, nhưng có tác dụng phụ gây suy giảm miễn dịch làm ảnh hưởng đến hiệu quả các chương trình vaccine phòng chống các bệnh khác như Newcastle, Marek, cúm gia cầm là những bệnh nguy hiểm ở gia cầm Mặt khác, trong quá trình sản xuất và sử dụng virus nhược độc Gumboro làm vaccine có khả năng tăng cường độc lực và trở nên gây bệnh (Jackwood và cs, 2008)

Một số loại hình vaccine thế hệ mới bao gồm vaccine trên nền vector (đậu gà, adenovirus, herpesvirus ), vaccine DNA, vaccine vector đơn và đa gen, đang được ứng dụng rộng rãi đối với nhiều bệnh vật nuôi, trong đó có bệnh Gumboro trong vòng 5-7 năm gần đây (Shams, 2005; Meeusen và cs, 2007) Thực chất vaccine thế hệ mới là

tạo nên các plasmid tái tổ hợp có chứa gen kháng nguyên của vi sinh vật gây bệnh

(phân lập bằng kỹ thuật PCR; cDNA ), rồi từ đó được ghép vào vector dẫn truyền và biểu hiện gen (là các loại plasmid) đó được thiết kế phù hợp, để sản xuất kháng nguyên hoặc làm vector vaccine (Roh và cs, 2006; Wang và cs, 2007b)

Như đã giới thiệu, hệ gen của virus Gumboro gồm phân đoạn A (~3.200 nucleotide) và phân đoạn B (~2.900 nucleotide) móc vào nhau, và có mức độ biến đổi thành phần khá cao, đặc trưng là mỗi một chủng phân lập ở mỗi một vùng địa lý đều có sai khác di truyền nhất định với nhau (Boot và cs, 2000; Jackwood và Sommer-Wagner, 2007) Một số hướng chiến lược khác trong nghiên cứu sản xuất vaccine phũng bệnh Gumboro là áp dụng công nghệ gen tạo nên các loại vector tái tổ hợp chứa gen kháng nguyên VP2 hoặc toàn bộ phân đoạn A để làm vaccine (Rong và cs, 2007) Hướng vaccine chỉ chứa gen kháng nguyên sử dụng các vector đang được chú ý, do loại hình vaccine này an toàn, khụng tồn tại toàn bộ virus, dễ sản xuất và bảo quản, dễ

sử dụng đặc biệt bằng đường uống và hít thở, nên sử dụng đại trà, diện rộng, giá thành

rẻ và có hiệu lược bảo hộ tốt (Shams và cs, 2005)

1.4.3 Gen kháng nguyên VP2 trong chiến lược phát triển vaccine thế hệ mới

VP2 là đoạn RNA đầu tiên trong chuỗi gen hợp nhất VP2-4-3 mã hoá cho protein chung (polyprotein) của phân đoạn A (segment A) Toàn bộ chuỗi polynucleotide mó hoá cho protein chung VP2-4-3 của phân đoạn A có độ dài 3039 bp, bao gồm cả bộ mã khởi đầu ATG (của VP2) và bộ mã kết thúc TGA (của VP3), sắp

xếp polypeptide theo trật tự: NH2-pVP2-VP4-VP3-COOH (Ye và cs, 2007), từ đó, nhờ hoạt động của chính VP4 là enzym protease, tự phân cắt thành VP2 nguyên thuỷ (pVP2, cũn gọi là VPX) có trọng lượng phân tử là 48 kDa, VP3 (28 kDa) và VP4 (32 kDa) (Lejal và cs, 2000) Cuối cùng, polypeptide VP2 được tóm gọn lại tại đầu C (carboxyl, -COOH), để tạo nên VP2 trưởng thành có trọng lượng 37 kDa (Da Costa và

cs, 2002) Protein VP2 và VP3 là protein cấu trúc, sau khi được phân cắt thành sản phẩm độc lập, các protein này được lắp ghép lên bề mặt virion tạo nên hai lớp ngoài và trong của cấu trúc capsid của virus VP2 có độ dài khoảng 1353-1356 bp, có mộ mã khởi đầu ATG nhưng không có bộ mã kết thúc (Jackwood và cs, 2007) Do vậy, trong công nghệ vector tái tổ hợp sử dụng gen kháng nguyên VP2, người ta cần thiết kế thêm một hoặc hai bộ mã kết thúc tại đầu 3’ của gen, thông thường là một (hai) trong số bộ

mã TAA, TGA, hoặc TAG (Yu và cs, 2000)

Đối với bệnh Gumboro, từ những năm 1990, nhiều tác giả đó tiến hành nghiên cứu tái tổ hợp đơn gen kháng nguyên VP2 hoặc toàn bộ phân đoạn A chứa VP2-VP4-VP3 làm nguồn gen kháng nguyên cơ sở cho thiết kế vaccine tái tổ hợp thế hệ mới Tuy toàn bộ VP2-4-3 có thể tạo nên polypeptide giống vỏ bọc virus Gumboro, nhưng

do đặc tính protease của VP4 can thiệp nhiều vào sự biểu hiện kháng nguyên, và bản thân gen VP2 cho sự biểu hiện hoàn chỉnh protein vai trò kháng nguyên, nên xu hướng chỉ sử dụng đoạn gen VP2 ngày càng nhiều và có lợi thế khi thiết kế (Mundt và Vakharia, 1996; Fodor và cs, 1999; Rong và cs, 2005) Nguyên tắc chung thiết kế plasmid tái tổ hợp là cần gài một promotor thích ứng với động vật máu nóng, thông thường được sử dụng nhiều nhất là CMV promotor (có nguồn gốc từ virus cytomegalovirus), vào đằng trước chuỗi gen kháng nguyên VP2 hoặc toàn bộ phân đoạn A cần biểu hiện (Chang và cs, 2002)

Như vậy, VP2 là một gen kháng nguyên với khả năng ứng dụng của chúng rất rộng làm vaccine thế hệ mới và khả năng linh hoạt thiết kế trong chiến lược vaccine phòng chống bệnh Gumboro (Pitcovski và cs, 2003; Rong và cs, 2005) Một loạt các nghiên cứu ứng dụng protein tái tổ hợp kháng nguyên VP2 như là một vaccine dưới nhóm cũng như VP2 gài vào các hệ thống vector mang bao gồm plasmid, virus, vi khuẩn

và thực vật Có thể kể đến một số ứng dụng VP2 làm vaccine như sau:

VP2 hoặc toàn bộ VP2-4-3 được cài vào plasmid biểu hiện và sử dụng DNA của plasmid tái tổ hợp làm vaccine DNA (Fodor và cs, 1999; Chang và cs, 2002; Lê Thanh Hoà, 2006) hoặc cùng với gen cytokine như IL-2 để kích ứng miễn dịch (Hulse và cs, 2002)

VP2 được đưa vào hệ thống biểu hiện baculovirus và biểu hiện polypeptide VP2 làm vaccine dưới nhóm (Liu và cs, 2005) hoặc toàn bộ VP2-4-3 tạo nên vaccine

virus(VLP, virus like particle), hoặc tách chiết làm nguồn protein kháng nguyên (Pitcovski và cs, 1996)

VP2 được bắn vào nhiễm sắc thể của hệ gen thực vật, tạo nên nguồn gen VP2 lâu dài trong thực vật để có nguồn kháng nguyên cố định làm vaccine, trong đó đó thành công với

cây lúa (Wu và cs, 2007), hoặc Arabidopsis thaliana (Wu và cs, 2004)

VP2 cũng là nguồn gen kháng nguyên dễ dàng chuyển nạp vào vi khuẩn như E

coli và sử dụng làm vaccine vector vi khuẩn gây miễn dịch chống bệnh Gumboro

(Mahmood và cs, 2007) hoặc tách chiết polypeptide VP2 làm vaccine (Omar và cs, 2006)

VP2 cũng được sử dụng để cài vào hệ gen của các hệ thống vector virus, ví dụ virus thuộc nhóm Herpes như virus gây bệnh Marek (Tsukamoto và cs, 1999; 2002); virus đậu gà (Butter và cs, 2003)

VP2 được sử dụng như là một đơn nguyên cung cấp gen để nạp vào virus Newcastle làm vaccine tái tổ hợp vector virus song giá, cùng lúc gây miễn dịch đối với Newcastle và Gumboro (Huang và cs, 2004)

VP2 cũng có lợi thế để thiết kế thực khuẩn thể tái tổ hợp làm vaccine, ví dụ đối với thực khuẩn thể T4 mang gen VP2 giới thiệu kháng nguyên lên bề mặt (Cao và cs, 2005)

1.5 Nghiên cứu sản xuất vaccin qua đường miệng

Có thể nói, tình hình nghiên cứu sản xuất protein tái tổ hợp và vaccine dùng qua đường miệng bằng kỹ thuật di truyền thực vật, đặc biệt là vaccine dùng qua đường miệng trong thập niên vừa qua diễn ra sôi động trên thế giới và đã gặt hái được những thành tựu đáng kể Những ứng dụng đầu tiên về vaccine dùng qua đường miệng sản xuất bằng công nghệ di truyền thực vật sẽ bắt đầu vào năm 2006 Trong một thời gian tới, thế giới sẽ chứng kiến sự thay đổi lớn trong lĩnh vực phòng bệnh cho người và gia súc nhờ có việc đưa những thành tựu mới này vào cuộc sống

Người ta đã tạo ra giống "lúa vàng" để sử dụng như nguồn bổ sung vitamin A cho cơ thể Một loạt các protein gây miễn dịch của virus, vi khuẩn và một loạt các loài thực vật đã được nghiên cứu Kết quả thử nghiệm đã chứng minh vaccine tái tổ hợp chống viêm gan B sản xuất bằng thực vật đã gây miễn dịch hệ thống màng nhầy trên động vật (Mason et al, 1992), gây miễn dịch ở người tình nguyện (Tacket et al, 1998)

Nhiều loại vaccine thú y cũng được quan tâm nghiên cứu Ví dụ: Gen VP2 tổng hợp protein vỏ của virus Gumboro đã được chuyển vào Arabidopsis thailiana Dịch chiết của thực vật được tách và sử dụng để gây miễn dịch cho gà qua đường miệng Kết quả cho thấy vaccine thương mại gây miễn dịch cho 78%, trong khi đó dịch chiết

gây miễn dịch cho 80% số gà được uống dịch chiết Kết hợp hai loại vaccine này, cho

gà uống vaccine thương mại ở 1 tuần tuổi và vaccine tách từ thực vật ở tuần thứ 4 cho

tỷ lệ miễn dịch 90% (Wu H et al, 2004) Cỏ Linh lăng chuyển gen tổng hợp polyprotein P1 và protease 3C của virus gây bệnh lở mồm long móng đã gây miễn dịch cho chuột (Maria J.Dus Santos et al, 2005) Ngay cả động vật không xương sống như tôm (Penaeus monodon) được nuôi bằng vi khuẩn bất hoạt chuyển gen tổng hợp protein vỏ virus gây bệnh đầu trắng cũng có tỷ lệ sống cao hơn hẳn so với đối chứng (Witteveldt J, 2004)

Hiện nay người ta đã thành công trong việc trong việc chuyển gen tổng hợp các vaccine ở các thực vật sau: Glycoprotein B (cytomegalovirus người) ở lúa, thuốc lá (Tackabery et al, 1999; Sardana et al, 2003); NVCP (virus Norwalk) ở khoai tây (Marson et al, 1996); Hemagglutinin (virus sởi) ở cà rốt (Bouche et al, 2003); HbsAg (viêm gan B) ở khoai tây, rau diếp, chuối (Kapusta et al, 1999; Kong et al, 2001); độc

tố gây bệnh tả B (bệnh tả) ở cà chua (Jani et al, 2002); Protein F (virus hợp bào hô hấp)

ở cà chua (Sandhu et al, 2000); LT-B (E coli) ở khoai tây, ngô (Haq et al, 1995; Chikwamba et al, 2002); Protein S (virus đường ruột) ở thuốc lá (Tuboly et al, 2000); Protein L1 (papilloma virus người) ở khoai tây (Warzecha et al, 2003); kháng nguyên chống bệnh than ở thuốc lá (Aziz et al, 2002); Protein vỏ hantavirus ở khoai tây (Kehm

et al, 2001) và Epitope VP1 (bệnh lở mồm long móng) ở khoai tây (Carrillo et al, 2001)

1.6 Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam chưa có các nghiên cứu tiến hành về vaccine dùng qua đường miệng sản xuất bằng thực vật chuyển gen Các nghiên cứu về chuyển gen vào thực vật

để tạo giống cây chuyển gen mới chỉ thực sự bắt đầu từ những năm 2001 - 2002, khi chương trình công nghệ sinh học của Nhà nước chính thức phê duyệt một số đề tài chuyển gen vào một số cây nông nghiệp Các nghiên cứu này đang trong giai đoạn phát triển, chưa có kết quả ứng dụng

Đối với bèo tấm, các nghiên cứu nói chung, kể cả các nghiên cứu sơ đẳng nhất

về phân loại đặc điểm sinh hoá, sinh lý hoàn toàn chưa được tiến hành Trong khi đó

ở nước ta bèo tấm tồn tại phổ biến ở hầu hết mọi nơi Tuy chưa có một nghiên cứu nào

về phân loại học thực vật các loài bèo tấm ở Việt Nam, qua quan sát sơ bộ chúng tôi

thấy rằng, ở Việt Nam có mặt rất nhiều loài của cả 5 chi thuộc họ Lemnaceae Nhiều

loài được sử dụng rộng rãi trong chăn nuôi Một số loài trước kia được sử dụng làm

thức ăn cho người ở một số vùng nông thôn như các loài chi Wolffia

Các nghiên cứu liên quan đến bèo tấm ở Việt Nam chỉ hạn chế ở việc sử dụng

làm thức ăn bổ sung cho gia súc, gia cầm Bèo tấm - (chi Lemna và chi Spirodela) sinh

trưởng một cách tự nhiên vào mùa hè, sống trôi nổi trên mặt nước ao hay ruộng Đây là các loài có kích thước lớn nhất được sử dụng chủ yếu làm thức ăn chăn nuôi Chúng

có hàm lượng protein khá cao, (180-190g/kg chất khô), chiếm 40% trọng lượng khô (đậu nành 41%, lạc 23,6%), ít chất xơ (5%), năng lượng trao đổi 2900 Kcal/ kg, có tiền sinh tố A, B, bởi vậy thường được tận dụng để chăn nuôi lợn, vịt, ngỗng

Các loài họ bèo tấm ở Việt Nam đã được chúng tôi thu thập về để nghiên cứu tại Viện Di truyền Nông nghiệp Chúng có hình dạng và kích thước rất đa dạng, từ 0,1 mm đến 9 mm, từ hình tròn không có rễ đến hình dáng điển hình của bèo Các nghiên cứu

về nuôi cấy mô, xây dựng hệ thống tái sinh đã được tiến hành với các loài: Lemna

aquinoctiallis, Lemna gibba, Lemna minor, Spirodela polyhrriza, Wolffia globosa, Wolffia australiana Kết quả bước đầu cho thấy, đối với chúng hoàn toàn có thể áp

dụng quy trình nuôi cấy mô bình thường Mặt khác, các thí nghiệm chuyển gen thăm

dò của chúng tôi tiến hành trên loài này đã cho thấy rằng chúng hoàn toàn có khả năng tiếp nhận gen ở ngay trong điều kiện bình thường ở trạng thái nguyên cây, vừa thu về không cần qua xử lý vô trùng hay thông qua tạo callus bằng cấy mô Trong trạng thái này biểu hiện của GUS và GFP được thể hiện rất rõ ràng Như vậy có thể dự đoán rằng đây là hệ thống sản xuất các chất có hoạt tính sinh học lý tưởng có nhiều tiềm năng ứng dụng trong tương lai

* Nghiên cứu tạo vaccin kháng virus Gumboro ở Việt Nam

Ở Việt Nam, bệnh Gumboro được phát hiện và báo cáo tại miền Trung và miền Bắc từ

1978 Từ năm 1981 đến nay bệnh xảy ra ngày càng tăng và làm thiệt hại nặng nề đến sản xuất Từ 1987, kỹ thuật chẩn đoán khuyếch tán trên thạch đã được tiến hành để phát hiện bệnh Gumboro ở nhiều trại gà (Lê Thanh Hoà, 1992) Đến năm 1990, Viện Công nghệ sinh học và Trung tâm chẩn đoán thú y quốc gia đã nghiên cứu sản xuất vaccine Gumboro nhược độc bằng công nghệ tế bào và đưa ra ứng dụng ở Việt Nam (Đái Duy Ban và cộng sự, 1990) Công nghệ này đã được công ty thuốc thú y Trung ương II tiếp nhận và đưa vào sản xuất đại trà dưới dạng đông khô Hiện nay loại vaccine này đang là phương tiện hữu hiệu phòng chống bệnh Gumboro trên toàn quốc Gần đây, Trường Đại học Nông nghiệp I Hà Nội cũng đã ứng dụng công nghệ sinh học

để sản xuất kháng thể phòng chống bệnh Gumboro (Vũ Đạt, 1999)

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Mục tiêu của đề tài

Đề tài tập trung giải quyết các mục tiêu và nội dung nghiên cứu sau đây:

- Chuyển thành công gen mã hoá virus gumboro VP2 vào bèo tấm (tại Việt Nam), tế bào cây thông (tại CHLB Đức) và tạo được protein

- Đánh giá được khả năng tạo miễn dịch khi cho gia cầm ăn bèo tấm có protein trên

2.2 Nội dung nghiên cứu cần thực hiện

1 Thiết kế vector mang gen vỏ protein virus gumboro với các promotor thích hợp cho biểu hiện ở thực vật

+ Thu thập đánh giá các nguồn gen protein vỏ virus gumboro ở Việt Nam

+ Thiết kế vector mang gen virus gumboro biểu hiện ở thực vật

2 Xây dựng hệ thống tái sinh và nhân sinh khối ở bèo tấm (Lemna sp.; Wolffia sp.)

+ Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của Wolffia sp./ Lemna sp

+ Nghiên cứu tối ưu hoá các điều kiện tạo callus và tái sinh cây Wolffia sp và Lemna

sp thông qua tối ưu các yếu tố như: thành phần môi trường, các chất điều hoà sinh

trưởng, các chất bổ sung vào môi trường, điều kiện nuôi cấy như: pH, chu kỳ quang

3 Xây dựng quy trình chuyển gen đạt hiệu quả cao bèo tấm (Lemna/Wolffia) trên cơ

sở so sánh và tối ưu hoá hai phương pháp chuyển gen bằng súng bắn gen và chuyển

gen thông qua Agrobacterium tumefacience

+ Thử nghiệm các chủng Agrobacterium để xác định được chủng thích hợp cho chuyển gen vào callus và nguyên cây Lemna sp và Wolfia sp

+ Nghiên cứu tối ưu hoá quy trình chuyển gen vào callus và Lemna nguyên cây bằng

súng bắn gen

+ Nghiên cứu tối ưu hoá quy trình chuyển gen vào callus và Wolffia/Lemna nguyên cây thông qua Agrobacterium tumefacience

4 Chuyển gen vỏ virus gumboro vào Wolffia/ Lemna

Chuyển gen VP2 vào Wolffia/ Lemna thông qua A tumefacience

5 Phân tích đánh giá cây chuyển gen Thử nghiệm sản phẩm chuyển gen trên gia cầm

- Phân tích sự có mặt của gen chuyển trong các dòng bèo tấm chuyển gen bằng các

phương pháp sinh học phân tử (PCR, Southern)

- Tách chiết protein từ các dòng bèo tấm chuyển gen

- Cho gà ăn bèo tấm chuyển gen, đánh giá khả năng gây đáp ứng miễn dịch trên gà

2.3.Vật liệu

2.3.1 Vật liệu thực vật

• Bèo tấm Wolffia australiana No 7540 có nguồn gốc từ New Zealand do GS

Landolt E (Viện Địa Thực vật học, Học viện Liên bang Thuỵ Sĩ) cung cấp

• Bèo tấm Lemna aequinoctialis được thu thập tại một số ao hồ ngoại thành Hà

Nội Mẫu được gửi tới các nhà khoa học tại Viện Địa Thực vật, Học Viện Liên bang

Thuỵ Sỹ và được xác định là loài Lemna aequinoctialis (viết tắt là LA) Đây là một

trong những loài phổ biến nhất ở Việt Nam và nhiều nước Đông Nam Châu á

Hình 2.2 Bèo tấm Lemna aequinoctialis

A Nhân mẫu bèo trong vại B Hình thái của bèo Lemna aequinoctialis

2.3.2 Vật liệu vi khuẩn

Các chủng vi khuẩn E coli, Agrobacterium, plasmid DNA sử dụng trong các thí

nghiệm biến nạp gen vào cây bèo tấm được cung cấp thông qua thoả thuận chuyển giao nguyên vật liệu (MTA) giữa Viện Di truyền nông nghiệp và các đối tác nước ngoài gồm:

Hình 2.1 Bèo tấm W australiana No 7540

Hình 2.5: Cấu trúc Vector pPAM-VP2

- Các chủng vi khuẩn Agrobacterium AGL-1; GV3101; EHA105; C58;

LBA4404 Các chủng này đều mang vector nhị phân pBINGUS-INT mang CaMV35S

Promoter; gen chỉ thị gus-int và gen chọn lọc nptII

Hình 2.3: Cấu trúc của vector nhị phân pBIN GUS-int

- Các chủng Agrobacterium GV3101, AGL-1, C58, LBA4404 mang vector nhị

phân pCAMBIA1301 cũng được sử dụng trong các nghiên cứu của đề tài

Hình 2.4: Vector nhị phân pCAMBIA1301

(Nguồn:www.cambia.org/daisy/cambia/585.html ) Trong vùng T-DNA có gen chỉ thị sàng lọc là gen GUS, gen này được chia thành 2 exon là GUS first exon và gusA second exon phân cách nhau bởi đoạn intron Catalase Promoter của gen GUS là CaMV35S, đoạn kết thúc là chuỗi NOS polyA Chỉ thị chọn lọc thực vật là gen hptII (gen kháng hygromycine) được điều khiển bởi CaMV35S, kết thúc bởi chuỗi polyadenine Ngoài ra, trên vector còn có gen chỉ thị chọn lọc vi khuẩn kanamycine(r), đoạn khởi đầu phiên mã vector pBR322 ori

- Chủng vi khuẩn GV3101 mang vector nhị phân pPAM-VP2 chứa cấu trúc gen VP2

2.3.3 Hoá chất

Ethidium bromide, tryptone, agar, IPTG, X-gal, Kanamycin, cao nấm men (yeast extract), DEPC, SDS, chloroform, agarose, TAE, isoamylalcohol, EDTA,

ethanol, các enzym giới hạn (EcoRI, BamHI, XhoI), enzym ligaza, và các hoá chất

khác Các hoá chất này hầu hết do hãng In vitrogen, Fermentas, Applies Biosystem cung cấp Kit tách dòng - TA cloning của hãng Invitrogen, Kit xác định trình tự - BigDye Terminator v3.1 của hãng Applied Biosystems, Vectơ biểu hiện pPAMksGFP

do hãng Novagen cung cấp, Kit tinh sạch plasmid - S.N.A.P.TM của hãng Invitrogen

2 4 Phương pháp

2.4.1 Phương pháp thiết kế vector biểu hiện ở thực vật

Tách ADN tổng số từ máu gà

Trình tự tiến hành như sau:

• Cho 1ml máu vào ống Ependoff 1,5ml và bổ sung 0,8 ml SSC 1X

• Ly tâm 12000 vòng/1 phút

• Hút bỏ 1ml dịch ly tâm, thêm 1ml SSC 1ml

• Ly tâm 12000 vòng/1 phút

• Loại dịch ly tâm, thu cặn

• Thêm 375µl NaOAC 0,2M, vortex

• Thêm 25 µl SDS 10% + 5 µl proteinaseK (20mg/ml)

• Vortex nhẹ, ủ 550C/1h (thường xuyên lắc nhẹ trong khi ủ)

• Thêm 120 µl phenol/chloroform/isoamyl alcohol

• Làm khô, thêm 180 µl TE, vortex, ủ 550C/10 phút

• Thêm 20 µl NaOAC 2M, trộn đều

• Thêm 500 µl cồn lạnh 100%

• Ly tâm 12000 vòng/phút trong 3 phút

• Rửa bằng 1ml cồn 80%

• Ly tâm, làm khô trong box

• Hoà tan tủa bằng 200 µl TE

• Ủ 550C qua đêm