Bước đầu xác định hàm lượng daidzein geristrin và 17 acid amin trong đậu tương và sản phẩm chế biến

Mặc dù chưa có những khẳng định chắc chắn về tác dụng sinh học trong cơ thể người, nhưng nhiều nghiên cứu khoa học đã chứng tỏ các phytoestrogen có thể đóng vai trò bảo vệ một số bệnh mã

BỘ Y TẾ VIỆN DINH DƯỠNG

][\^

Báo cáo kết quả đề tài khoa học công nghệ

BƯỚC ĐẦU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG DAIDZEIN, GENISTEIN VÀ

17 ACID AMIN TRONG ĐẬU TƯƠNG VÀ SẢN PHẨM CHẾ BIẾN

Chủ nhiệm đề tài: ThS Lê Hồng Dũng

ThS Lê Thị Hồng Hảo

Nơi thực hiện: Khoa Thực phẩm - VSATTP

Cơ quan chủ quản: Viện Dinh dưỡng

6626

06/11/2007

HÀ NỘI - 2007

BỘ Y TẾ VIỆN DINH DƯỠNG

][\^

Báo cáo kết quả đề tài khoa học công nghệ

BƯỚC ĐẦU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG DAIDZEIN, GENISTEIN VÀ

17 ACID AMIN TRONG ĐẬU TƯƠNG VÀ SẢN PHẨM CHẾ BIẾN

Chủ nhiệm đề tài: ThS Lê Hồng Dũng

ThS Lê Thị Hồng Hảo Cán bộ phối hợp: PGS TS Hà Thị Anh Đào

1 Đặt vấn đề

Đậu, đỗ là nhóm thực phẩm quan trọng cung cấp một lượng đáng kể protein cho cơ thể Các loại đậu hạt thường chứa từ 20 đến 24% protein và 3 đến 5% chất xơ Hạt đậu đã già thậm chí còn chứa nhiều protein hơn (30–42%) [1] Ngoài việc cung cấp một nguồn protein quan trọng cho con người, một số loại đậu, đỗ chứa nhiều các acid amin rất quan trọng như lysin và tryptophan Acid amin là một thành phần quan trọng trong cấu tại nên protein, tham gia nhiều chức năng quan trọng như cấu tạo tế bào, phục hồi mô, cấu tạo nên các kháng thể chống lại vi khuẩn và virus, cấu tạo enzym và hệ thống hormon Acid amin tạo nên ARN (acid ribo nucleic), ADN (acid deoxy nucleic) vận chuyển oxy đi khắp cơ thể và tham gia vào hoạt động của các cơ Acid amin được cung cấp cho cơ thể từ thực phẩm giàu protein Có 22 acid amin quan trọng đối với cơ thể, trong đó có 9 acid amin thiết yếu, là các acid amin cơ thể không tự tổng hợp được gồm histidin, isoleucin, leucin, lysin, methionin, phenylalanin, threonin, tryptophan và valin Sự thiếu hụt acid amin dẫn đến cơ thể mệt mỏi, hạ đường huyết, dị ứng [30]

Giá trị của một loại thức ăn không những phụ thuộc vào số lượng chất đạm có trong thức ăn

ấy mà còn phụ thuộc vào số lượng và tỷ lệ cân đối các acid amin, nghĩa là chất lượng của protein thức ăn Ngoài ra đối với các nước đang phát triển, thức ăn động vật mà protein có chất lượng tốt còn chưa đủ, thì việc phân tích các acid amin cần thiết trong thức ăn thực vật lại càng cần thiết Nó giúp ta phương hướng phối hợp các thức ăn với nhau để nâng cao chất lượng của protein trong khẩu phần Vì vậy xác định hàm lượng các acid amin trong thực phẩm là rất cần thiết

Một nhóm các chất hóa thực vật trong các cây họ đậu được quan tâm nhiều nhất hiện nay là phytoestrogen Phytoestrogen có cấu trúc hóa học tương tự các hormon oestrogen, oestradiol ở

cơ thể động vật và cũng có hoạt tính của oestrogen Tuy nhiên hoạt tính này thấp hơn nhiều lần

so với oestrogen động vật (chỉ bằng khoảng 1/500 đến 1/1000 hoạt tính oestradiol) Vì vậy các phytoestrogen có thể có tác dụng kháng oestrogen bằng cơ chế cạnh tranh tại các receptor của oestrogen [2,3] Các nhóm phytoestrogen chính trong tự nhiên là isoflavon, coumestan và lignan, trong đó isoflavon là các hợp chất được quan tâm nhất Isoflavon có nhiều ở thực vật họ đậu,

nhất là đậu tương (Glycine max, G hispida, G soja) Hai hợp chất isoflavon quan trong nhất là

genistein và daidzein

Gần đây, nhiều nghiên cứu dịch tễ đã cho thấy chế độ ăn có nhiều isoflavon và các lignan có khả năng làm giảm nguy cơ mắc một số bệnh ung thư, tim mạch và các rối loạn ở phụ nữ sau thời kỳ mãn kinh [2,3,4] Mặc dù chưa có những khẳng định chắc chắn về tác dụng sinh học trong cơ thể người, nhưng nhiều nghiên cứu khoa học đã chứng tỏ các phytoestrogen có thể đóng vai trò bảo vệ một số bệnh mãn tính, đặc biệt là khả năng phòng và điều trị bệnh ung thư tuyến tiền liệt nhờ khả năng kháng androgen của các hợp chất nhóm này [5,6] Bên cạnh những tác dụng có lợi của phytoestrogen, tác dụng bất lợi trên cơ thể người cũng đang được nghiên cứu Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu trên động vật cho thấy chế độ ăn giàu phytoestrogen gây ra một số tác dụng phụ nhưng chưa có nhiều nghiên cứu cho thấy tác dụng bất lợi trên người Một

số nghiên cứu quan sát thấy nguy cơ tăng hội chứng bệnh tự miễn tuyến yên ở trẻ nhỏ khi dùng bột dinh dưỡng bổ sung đậu tương và có liên quan đến sự ức chế hệ thống men peroxidase tuyến yên do isoflavon [33, 34, 35] Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu kỹ lưỡng nào về tác dụng lâu dài của phytoestrogen kể cả tác dụng có lợi và tác dụng bất lợi Nghiên cứu năm 2001 của Julie và cộng sự [32] khi bổ sung 40mg/ngày trên nam giới tình nguyện khỏe mạnh (lượng isoflavon ăn vào tương đương như ở nhiều nước châu Á) cho thấy không có ảnh hưởng đối với hormon

gonadotrophin hoặc hormon sinh dục nam Nghiên cứu này cũng không loại trừ khả năng khi bổ sung phytoestrogen liều cao và trong thời gian dài có thể ảnh hưởng đến sức khỏe sinh sản ở nam giới

Thành phần và hàm lượng các isoflavon trong thực phẩm đã được nghiên cứu và công bố từ nhiều nghiên cứu khác nhau trên thế giới [7,8,9,10,11] Nhiều cơ sở dữ liệu về các isoflavon hiện nay đã được công bố [7,10] Để phân tích thành phần các phytoestrogen nói chung và các isoflavon nói riêng, nhiều phương pháp đã được phát triển và được chuẩn hóa tại các phòng thí nghiệm trên thế giới Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha ngược được ứng dụng rộng rãi nhất trong phân tích các isoflavon Cột sắc ký thường dùng nhất là cột C18 với pha động gồm acetonitril và acid acetic hoặc acid phosphoric Detector thường dùng trong phân tích các isoflavon là detector UV hoặc photodiode array (PDA) ở bước sóng 249nm và 260nm Ngoài ra detector điện hóa cũng được ứng dụng trong một số nghiên cứu cho thấy có độ nhạy và chọn lọc cao với các isoflavon Gần đây, phương pháp sắc ký lỏng khối phổ đã được sử dụng trong phân tích đồng thời các hợp chất daidzein và genistein trong thực phẩm cũng như các mẫu phẩm sinh hóa Phương pháp sắc ký khí khối phổ thường được áp dụng để xác định lượng vết các isoflavon với độ nhạy cao và rất đặc hiệu Các phương pháp phân tích isoflavon và phytoestrogen trong thực phẩm hiện vẫn tiếp tục được hoàn thiện nhằm cung cấp cơ sở dữ liệu phục vụ các nghiên cứu trong lĩnh vực khoa học thực phẩm và y học [12,13,14,15, 16, 17, 18, 19]

Phương pháp cổ điển để phân tích acid amin được phát triển bởi Moore và Stein [44] Các acid amin tự do được xác định bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion với dẫn xuất sau cột (ninhydrin hoặc o-phthalaldehyde) Cùng với kỹ thuật này, nhiều phương pháp mới đã được phát triển và ứng dụng để phân tích acid amin như sắc ký điện di mao quản (CE), sắc ký lỏng khối phổ (LC/MS), sắc ký khí (GC/FID), sắc ký khí khối phổ [36, 37, 39, 40, 41, 42, 46, 47] Mỗi phương pháp có ưu điểm và những hạn chế riêng Trong điều kiện phòng thí nghiệm của Viện Dinh dưỡng phương pháp dẫn xuất trước cột với 6-aminoquinolyl-N-hydroxysucinimidyl carbamate (AQC) cho phép xác định cả acid amin bậc 1 và bậc 2 với detector huỳnh quang (λEx=250 nm; λEm=395 nm) Phương pháp sử dụng AQC làm chất tạo dẫn xuất là đã được áp dụng phổ biến trên thế giới để xác định acid amin trong nhiều đối tượng thực phẩm, như phân tích acid amin trong thức ăn trẻ em [42]

Hiện nay, không chỉ riêng nước ta mà nhiều nước khác trên thể giới đang phải tiếp tục giải quyết tình trạng nghèo đói và suy dinh dưỡng Trong khi đó, thừa dinh dưỡng kèm theo các bệnh mẵn tính như tim mạch và tiểu đường đang trở nên một thách thức lớn trong giai đoạn chuyển tiếp hiện nay Vấn đề thừa cân và béo phì ở một bộ phận dân cư đô thị (trẻ em, học sinh, lứa tuổi trung niên) và một số bệnh mạn tính có liên quan đến dinh dưỡng như tăng huyết áp và đái tháo đường đang nổi lên có ý nghĩa sức khỏe cộng đồng [20] Để giải quyết vấn đề này cần thiết phải kết hợp nhiều giải pháp chiến lược, trong đó đảm bảo một chế độ ăn lành mạnh và phù hợp là một trong những giải pháp rất quan trọng Các nghiên cứu về vai trò các chất có hoạt tính sinh học trong chế độ ăn đối với các bệnh mãn tính như tim mạch, béo phì và tiểu đường là rất cần thiết trong giai đoạn hiện nay Để thực hiện những nghiên cứu này, cần thiết phải xây dựng các

cơ sở dữ liệu đối với các hoạt chất sinh học trong tự nhiên như các carotenoids, sterols, flavonoid, isoflavonoid

Trong chế độ ăn của người châu Á nói chung và Việt Nam nói riêng, các thực phẩm từ đậu tương chiếm một vị trí quan trọng Theo kết quả Tổng điều tra dinh dưỡng năm 2000 của Viện Dinh dưỡng, mức tiêu thụ thực phẩm nhóm đậu, đỗ đã tăng lên đáng kể trong năm 2000, với

khoảng 6 g/người/ ngày so với 2,8g/người/ngày trong năm 1990 Đậu phụ, loại thực phẩm giàu đạm thực vật thông dụng ở Việt Nam cũng có mức tiêu thụ tăng lên đến 13,4 g/người/ngày trong năm 2000 so với 6,8g/người/ngày trong năm 1990 [31]

Tuy nhiên, việc phân tích các thành phần có hoạt tính sinh học trong thực phẩm Việt Nam còn hạn chế, chủ yếu mới có số liệu của một số loại carotenoid trong rau, quả Số liệu phân tích các acid amin trong thực phẩm Việt Nam còn thiếu, đặc biệt đối với một số acid amin quan trọng như lysin Những nghiên cứu, phân tích về thành phần dinh dưỡng và đặc biệt các thành phần có hoạt tính sinh học trong thực phẩm nhóm đậu, đỗ và các sản phẩm chế biến ở nước ta còn chưa đầy đủ Nhằm bổ sung và hoàn thiện số liệu của Bảng thành phần thực phẩm Việt Nam và cung cấp số liệu cho các nghiên cứu dinh dưỡng, việc xác định thành phần một các acid amin quan trọng như lysin, methionin và số chất hóa thực vật như genistein và daidzein là rất cần thiết

Vì vậy, đề tài này được thực hiện nhằm bước đầu xác định hàm lượng một số isoflavon và acid amin trong thực phẩm nhóm đậu, đỗ và sản phẩm chế biến, phục vụ cho công tác nghiên cứu chế độ ăn trong phòng và điều trị bệnh

2 Mục tiêu của đề tài

Mục tiêu chung: Phân tích hàm lượng genistein, daidzein và 17 acid amin quan trọng trong đậu

tương và hai loại sản phẩm chế biến nhằm bước đầu cung cấp số liệu cho Bảng thành phần thực phẩm Việt Nam

Pha các dung dịch chuẩn:

Chất chuẩn gốc daidzein và genistein được pha trong methanol và có nồng độ tương ứng là 120 µg/ml và 80 µg/ml tương ứng Dung dịch chuẩn làm việc được pha loãng bằng methanol đến nồng độ 1,2 µg/ml và 0,8 µg/ml tương ứng Các dung dịch chuẩn được bảo quản ở 0oC

Chuẩn hỗn hợp (17 acid amin) được pha từ dung dịch có chứa 2,5 mmol/µl cho tất cả các acid

amin và 1,25 mmol/µl đối với cystin trong HCl 20 mmol để được dung dịch chuẩn làm việc có chứa 100 pmol/µl đối với 17 acid amin và 50 pmol/µl đối với cystein Dung dịch chuẩn làm việc được bảo quản trong lọ màu sẫm bảo quản bằng tủ lạnh âm sâu -200C dùng được trong vòng 1 tháng Các chuẩn đơn được hoà tan trong nước và bảo quản trong môi trường acid với các điều kiện tương tự như chuẩn hỗn hợp

3.1.2 Dụng cụ, thiết bị

Hệ thống sắc ký được sử dụng là của hãng Waters (Mỹ), gồm bơm dung môi 2690 có bộ phận bơm mẫu tự động, detector PDA 2996, detector huỳnh quang 2475, phần mềm Empower Cột sắc ký dùng cho phân tích acid amin là cột Amino acid AccQ-Tag (150mm x 4,6mm x 3,5µm) của hãng Waters (Mỹ) Đề tài sử dụng các dụng cụ thông thường phòng thí nghiệm gồm máy ly tâm, bể siêu âm, máy lắc ngang, máy lắc ống nghiệm, bếp cách thủy và các dụng cụ thủy tinh

3.2 Chuẩn hóa kỹ thuật phân tích

Đề tài triển khai áp dụng một số phương pháp đã công bố trên thế giới, khảo sát và chọn lựa các điều kiện phân tích phù hợp nhất với phòng thí nghiệm Phương pháp được lựa chọn sẽ được thẩm định và đưa ra quy trình phân tích trên mẫu thực

3.3 Phương pháp lấy mẫu phân tích

Nghiên cứu này sử dụng phương pháp lấy mẫu phân tầng [21] Đây là phương pháp phù hợp nhất trong việc phân tích và xây dựng cơ sở dữ liệu các thành phần thực phẩm Quần thể thực phẩm được phân tầng theo vùng địa lý, theo mùa, theo mức độ tiêu thụ, hoặc theo khu vực phân phối trên thị trường, các điểm bán lẻ Trong đề tài này, mẫu được lựa chọn ngẫu nhiên từ các chợ bán lẻ trên thị trường Hà Nội và số liệu thu được sẽ đại diện cho khu vực này

Đối tượng mẫu: gồm 3 loại thực phẩm

1 Đậu tương (đậu nành)

2 Các sản phẩm chế biến từ đậu tương: đậu phụ, sữa đậu nành

Cỡ mẫu

Cỡ mẫu được tính toán và ước lượng theo công thức sau [21]

N ≥ (tα n-1)2 SD2 / (A x µ)2

trong đó: N là cỡ mẫu

A là độ chính xác của kết quả phân tích (có giá trị 0,1 hoặc 0,05)

µ là giá trị trung bình (kết quả phân tích) của quần thể, thu được từ các nghiên

cứu trước đây

SD độ lệch chuẩn của giá trị trung bình

t là giá trị thu được từ bảng thống kê chuẩn (bảng Student), với α là giới hạn tin

cậy (95% hoặc 99%) Tính toán cỡ mẫu cụ thể dựa theo bảng sau (đối với đậu nành):

Thông số (đậu nành) Daidzein (mg/100g) Genistein (mg/100g)

Cỡ mẫu yêu cầu với độ chính xác 0,05 39 69

Như vậy, để có số liệu đảm bảo độ chính xác 0,1, cần lấy 10 mẫu phân tích daidzein và 17 mẫu phân tích genistein, tương tự để đảm bảo độ chính xác 0,05, cần lấy 39 mẫu phân tích daidzein

và 69 mẫu phân tích genistein Trong khuôn khổ của đề tài này chúng tôi chọn cỡ mẫu phân tích tối thiểu là n = 17, với độ chính xác là 0,1

Tổng số mẫu phân tích cho 3 loại thực phẩm là 17 x 3 = 51 mẫu

Các chỉ tiêu phân tích: 17 loại acid amin và hai loại isoflavon là daidzein và genistein

Thu thập mẫu

Mẫu được thu thập bằng cách bốc thăm ngẫu nhiên từ các chợ đại diện cho 9 quận nội thành Hà Nội, gồm Chợ Thái Hà, chợ Hôm, chợ Mơ, chợ Trương Định, chợ Hàng Da, chợ Ngã Tư Sở, chợ Thành Công, chợ Lê Quý Đôn và chợ Ngô Sĩ Liên

4 Kết quả và bàn luận

4.1 Chuẩn hóa kỹ thuật phân tích acid amin

4.1.1 Giai đoạn thuỷ phân mẫu

Theo một số tác giả [24, 25, 28] phương pháp chủ yếu dùng để thuỷ phân tách các acid min ra khỏi thực phẩm là thuỷ phân trong môi trường acid chlorhydric có nồng độ cao

Quy trình thuỷ phân và phân tích mẫu như sau:

Cân 0,5-1,0 g mẫu (hoặc 10 ml sữa) vào ống nghiệm thành dày

↓ Thêm 10ml HCl 15%

Loại không khí bằng nitơ, đậy kín

↓ Thủy phân ở 125oC trong 23 giờ

↓

Để nguội, đuổi hết HCl dư

↓ Định mức bằng HCl 20 mmol

↓ Tạo dẫn xuất

↓ Xác định trên HPLC bằng detector huỳnh quang

Tạo dẫn xuất

Hút 0,5 ml mẫu pha trong HCl 20mM vào lọ 1,5ml có nắp, thêm 70 µl borate để tạo môi trường dẫn xuất có pH = 8,2 - 9,7, lắc trên máy lắc ống nghiệm, thêm 20µl AQC (3mg/ml trong acetonitril), lắc đều bằng tay khoảng 1 phút Đậy kín, ủ ở 55oC trong 10 phút (mẫu sau dẫn xuất

ổn định ở nhiệt độ phòng trong khoảng 1 tuần)

4.1.2 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

- LOD được xác định bằng nồng độ tối thiểu của chất phân tích tại đó cho các pic có tín hiệu bằng 3 lần nhiễu đường nền (S/N =3) Để xác định giới hạn phát hiện, nạp chất chuẩn với nồng độ thấp nhất định nằm trong khoảng tuyến tính và tính theo công thức sau:

LOD = Cs*3hn/2hs

(hn: chiều cao nhiễu, dung dịch có nồng độ Cs cho chiều cao hs)

- LOQ: là nồng độ chất phân tích tại đó có tín hiệu 10 lần nhiễu đường nền (S/N = 10)

LOQ = LOD*3,3

Bảng 1: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp

4.1.4 Độ lặp lại của phương pháp

Để khảo sát độ lặp lại của phương pháp, chúng tôi tiến hành các thí nghiệm trên 3 loại mẫu Mỗi loại mẫu tiến hành phân tích trên 6 mẫu

Độ lệch chuẩn được tính theo công thức:

1

)(

1

2 2

n i

Độ lệch chuẩn tương đối được tính theo công thức: RSD = s*100/XTB

Bảng 2: Kết quả về độ lặp lại hàm lượng trong mẫu hạt đậu

Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 Lần 6 N xTB S RSD

Các acid amin

Acid aspartic 4,444 4,435 4,511 4,421 4,431 4,507 6 4,453 0,040 0,91 Serin 1,615 1,627 1,634 1,594 1,605 1,629 6 1,613 0,016 1,01 Acid glutamic 8,97 8,952 9,105 8,82 8,943 9,078 6 8,988 0,104 1,15 Glycin 2,406 2,431 2,442 2,382 2,399 2,435 6 2,411 0,024 1,01 Histidin 1,879 1,875 1,907 1,816 1,873 1,901 6 1,882 0,033 1,76 Arginin 4,01 4,051 4,073 3,969 3,997 4,058 6 4,018 0,042 1,03 Threonin 2,062 2,058 2,093 2,041 2,056 2,087 6 2,066 0,020 0,96 Alanin 2,564 2,559 2,603 2,539 2,557 2,595 6 2,569 0,024 0,95 Prolin 2,77 2,765 2,812 2,742 2,762 2,803 6 2,776 0,027 0,96 Cystein 0,172 0,171 0,174 0,173 0,169 0,174 6 0,172 0,002 1,13 Tyrosin 1,702 1,699 1,728 1,685 1,697 1,723 6 1,706 0,016 0,97 Valin 2,108 2,104 2,146 2,087 2,152 2,134 6 2,112 0,028 1,33 Methionin 0,902 0,9 0,915 0,893 0,899 0,913 6 0,904 0,009 0,95 Lysin 1,849 1,845 1,877 1,781 1,843 1,903 6 1,853 0,041 2,22 Isoleucin 2,002 1,998 2,032 1,982 1,996 2,026 6 2,006 0,019 0,95 Leucin 3,582 3,575 3,636 3,547 3,572 3,625 6 3,59 0,034 0,95 Phenylalanin 3,468 3,461 3,52 3,433 3,457 3,509 6 3,475 0,033 0,96

Hình 1: Sắc đồ các chuẩn 17 acid amin bằng dẫn xuất AQC Cột AccQ-Tag (150mm x 4,6mm x 3,9µm) Tốc độ dòng 1ml/phút, nhiệt độ cột 35oC, chương trình dung môi như mục 4.3.1 Detector huỳnh quang, λEx=250 nm; λEm=395 nm

Bảng 3: Kết quả độ lặp lại thời gian lưu trong mẫu hạt đậu

Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 Lần 6 N xTB S RSD

Các acid amin

Acid aspartic 14,12 14,16 14,24 14,29 14,13 14,23 6 14,20 0,07 0,48 Serin 15,64 15,69 15,77 15,82 15,59 15,66 6 15,69 0,09 0,55 Acid glutamic 16,46 16,52 16,60 16,66 16,53 16,54 6 16,55 0,07 0,42 Glycin 17,76 17,35 17,91 17,95 17,65 17,77 6 17,73 0,22 1,22 Histidin 18,41 18,49 18,58 18,64 18,59 18,58 6 18,55 0,08 0,45 Arginin 21,26 21,29 21,31 21,33 21,27 21,32 6 21,30 0,03 0,13 Threonin 21,42 21,50 21,48 21,53 21,53 21,47 6 21,49 0,04 0,19 Alanin 22,07 22,10 22,13 22,14 22,18 22,12 6 22,12 0,04 0,17 Prolin 23,37 23,40 23,42 23,42 23,39 23,41 6 23,40 0,02 0,08 Cystein 26,42 26,13 26,16 26,45 26,13 26,16 6 26,24 0,15 0,57 Tyrosin 26,76 26,80 26,82 26,80 26,75 26,78 6 26,79 0,03 0,10 Valin 27,90 27,93 27,96 27,95 27,94 27,95 6 27,94 0,02 0,08 Methionin 28,46 28,50 28,52 28,51 28,51 28,53 6 28,50 0,02 0,09 Lysin 31,12 31,15 31,17 31,16 31,14 31,16 6 31,15 0,02 0,06 Isoleucin 31,91 31,94 31,96 31,96 31,95 31,95 6 31,95 0,02 0,06 Leucin 32,51 32,55 32,57 32,56 32,56 32,56 6 32,55 0,02 0,07 Phenylalanin 33,99 34,04 34,06 34,05 34,05 34,06 6 34,04 0,03 0,08

Bảng 4: Kết quả về độ lặp lại hàm lượng trong mẫu đậu phụ

Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 Lần 6 N xTB S RSD

Các acid amin

Acid aspartic 0,303 0,312 0,307 0,290 0,302 0,306 6 0,303 0,008 2,51 Serin 0,371 0,370 0,367 0,367 0,369 0,375 6 0,370 0,003 0,80 Acid glutamic 1,071 1,069 1,087 1,102 1,068 1,084 6 1,080 0,014 1,25 Glycin 0,379 0,379 0,385 0,376 0,368 0,384 6 0,379 0,006 1,62 Histidin 0,435 0,434 0,454 0,431 0,434 0,440 6 0,438 0,008 1,93 Arginin 1,514 1,511 1,505 1,499 1,509 1,532 6 1,512 0,011 0,74 Threonin 0,612 0,611 0,621 0,606 0,610 0,619 6 0,613 0,006 0,95 Alanin 0,162 0,161 0,164 0,157 0,161 0,164 6 0,162 0,003 1,61 Prolin 0,235 0,234 0,238 0,221 0,234 0,237 6 0,233 0,006 2,71 Cystein 0,068 0,068 0,069 0,066 0,068 0,069 6 0,068 0,001 1,41 Tyrosin 0,601 0,600 0,610 0,589 0,599 0,608 6 0,601 0,008 1,25 Valin 0,204 0,204 0,207 0,212 0,204 0,207 6 0,206 0,003 1,58 Methionin 0,070 0,070 0,071 0,068 0,070 0,071 6 0,070 0,001 1,91 Lysin 0,413 0,412 0,419 0,409 0,412 0,418 6 0,414 0,004 0,95 Isoleucin 0,213 0,212 0,216 0,221 0,212 0,215 6 0,215 0,003 1,51 Leucin 0,349 0,348 0,354 0,356 0,348 0,353 6 0,351 0,003 0,95 Phenylalanin 0,752 0,751 0,763 0,756 0,750 0,761 6 0,755 0,006 0,75

Bảng 5: Kết quả độ lặp lại thời gian lưu trong mẫu đậu phụ

Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 Lần 6 N xTB S RSD

Cỏc acid amin

Acid aspartic 13,91 13,98 13,89 14,10 13,58 13,71 6 13,86 0,19 1,36 Serin 15,50 15,57 15,47 15,64 15,13 15,26 6 15,43 0,20 1,27 Acid glutamic 16,35 16,42 16,30 16,45 15,94 16,07 6 16,26 0,21 1,26 Glycin 17,22 17,30 17,17 17,32 16,80 16,94 6 17,13 0,21 1,21 Histidin 18,41 18,49 18,34 18,44 17,95 18,08 6 18,28 0,22 1,20 Arginin 21,30 21,31 21,28 21,30 21,15 21,18 6 21,25 0,07 0,32 Threonin 21,48 21,49 21,46 21,50 21,33 21,14 6 21,40 0,14 0,67 Alanin 22,13 22,13 22,10 22,13 21,98 22,02 6 22,08 0,07 0,31 Prolin 23,43 23,41 23,40 23,45 23,29 23,34 6 23,39 0,06 0,26 Cystein 26,14 26,10 26,11 26,16 25,99 26,04 6 26,09 0,06 0,24 Tyrosin 26,80 26,75 26,77 26,80 26,32 26,69 6 26,69 0,19 0,70 Valin 27,94 27,90 27,91 27,97 27,79 27,85 6 27,89 0,06 0,23 Methionin 28,51 28,47 28,47 28,52 28,36 28,40 6 28,45 0,06 0,22 Lysin 31,73 31,67 31,69 31,74 30,97 31,07 6 31,48 0,36 1,13 Isoleucin 31,96 31,88 31,91 31,97 31,77 31,85 6 31,89 0,07 0,23 Leucin 32,57 32,48 32,51 32,57 32,37 32,44 6 32,49 0,08 0,24 Phenylalanin 34,06 33,94 33,97 34,04 33,79 33,88 6 33,95 0,10 0,30

Bảng 6: Kết quả về độ lặp lại hàm lượng trong mẫu sữa đậu nành

Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 Lần 6 N xTB S RSD

Cỏc acid amin

Acid aspartic 0,433 0,432 0,430 0,429 0,432 0,438 6 0,432 0,003 0,78 Serin 0,508 0,507 0,515 0,522 0,506 0,514 6 0,512 0,006 1,20 Acid glutamic 1,228 1,226 1,247 1,226 1,225 1,243 6 1,232 0,010 0,79 Glycin 0,540 0,539 0,548 0,554 0,538 0,546 6 0,544 0,006 1,18 Histidin 0,528 0,527 0,535 0,532 0,526 0,534 6 0,530 0,004 0,77 Arginin 1,916 1,912 1,944 1,996 1,910 1,939 6 1,936 0,033 1,70 Threonin 0,701 0,699 0,711 0,679 0,699 0,709 6 0,700 0,011 1,61 Alanin 0,287 0,287 0,292 0,274 0,286 0,291 6 0,286 0,006 2,15 Prolin 0,409 0,408 0,415 0,405 0,417 0,414 6 0,411 0,005 1,19 Cystein 0,051 0,051 0,052 0,050 0,061 0,051 6 0,053 0,004 7,59 Tyrosin 1,032 1,030 1,048 1,022 1,129 1,044 6 1,051 0,039 3,76 Valin 0,329 0,328 0,334 0,326 0,338 0,333 6 0,331 0,004 1,35 Methionin 0,220 0,219 0,223 0,217 0,229 0,222 6 0,222 0,004 1,84 Lysin 0,678 0,677 0,688 0,671 0,686 0,686 6 0,681 0,007 0,99 Isoleucin 0,324 0,324 0,329 0,321 0,323 0,328 6 0,325 0,003 0,95 Leucin 0,567 0,566 0,576 0,561 0,545 0,574 6 0,565 0,011 1,93 Phenylalanin 1,168 1,166 1,185 1,156 1,064 1,182 6 1,154 0,045 3,90

Bảng 7: Kết quả độ lặp lại thời gian lưu trong mẫu sữa đậu nành

Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 Lần 6 N xTB S RSD

Cỏc acid amin

Acid aspartic 13,74 13,87 13,84 13,85 13,86 13,72 6 13,81 0,07 0,48 Serin 15,30 15,44 15,41 15,43 15,45 15,31 6 15,39 0,07 0,44 Acid glutamic 16,11 16,27 16,24 16,27 16,26 16,12 6 16,21 0,08 0,46 Glycin 16,99 17,12 17,10 17,14 17,12 17,09 6 17,09 0,05 0,31 Histidin 18,13 18,28 18,26 18,32 18,28 18,19 6 18,24 0,07 0,39 Arginin 21,20 21,24 21,25 21,26 21,23 21,18 6 21,23 0,03 0,15 Threonin 21,42 21,42 21,43 21,44 21,42 21,43 6 21,43 0,01 0,04 Alanin 22,03 22,06 22,07 22,09 22,06 22,12 6 22,07 0,03 0,14 Prolin 23,34 23,36 23,37 23,39 23,37 23,34 6 23,36 0,02 0,08 Cystein 26,06 26,07 26,08 26,10 26,07 26,04 6 26,07 0,02 0,07 Tyrosin 26,70 26,75 26,76 26,76 26,75 26,69 6 26,73 0,03 0,12 Valin 27,87 27,89 27,91 27,91 27,89 27,78 6 27,87 0,05 0,17 Methionin 28,44 28,47 28,49 28,48 28,45 28,42 6 28,46 0,03 0,09 Lysin 31,06 31,66 31,68 31,69 31,68 31,05 6 31,47 0,32 1,03 Isoleucin 31,86 31,89 31,91 31,91 31,79 31,84 6 31,87 0,05 0,15 Leucin 32,47 32,49 32,52 32,52 32,43 32,43 6 32,47 0,04 0,12 Phenylalanin 33,91 33,95 33,99 33,99 33,89 33,97 6 33,95 0,04 0,12

4.1.5 Xỏc định độ thu hồi của phương phỏp

Dựa vào việc thờm mẫu chuẩn vào mẫu thực, cựng với việc tiến hành làm mẫu thực khụng cú mẫu chuẩn song song chỳng tụi tiến hành tớnh độ thu hồi như sau

M2

Độ thu hồi = - x 100%

M1

M1: acid amin (àg) biết trước (thờm vào)

M2: acid amin (àg) xỏc định được

Dựa vào đường chuẩn làm song song với mẫu thực chỳng tụi thu được kết quả của mẫu thờm chuẩn và đem so với giỏ trị cho vào, mỗi nồng độ làm 3 mẫu và lấy kết quả trung bỡnh Ta

cú kết quả ở bảng 8,9,10 với cỏc nền mẫu là hạt đậu, đậu phụ, sữa đậu nành

Bảng 8: Kết quả độ thu hồi với nền mẫu hạt đậu

Các thông số Các acid amin Hàm lượng trong mẫu

(mg/100g) n = 3

Hàm lượng chuẩn thờm vào (mg/100g)

Hàm lượng tỡm thấy (mg/100g) n = 3

Độ thu hồi (%)

mãu (g/100g) n = 3

Hàm l−ợng chuẩn thêm vào (mg/100g)

Hàm tìm thấy (mg/100g) n = 3

Độ thu hồi (%)

Bảng 10: Kết quả độ thu hồi với nền mẫu sữa đậu nành

Các thông số Các acid amin Hàm l−ợng trong mẫu

(mg/100ml) n = 3

Hàm l−ợng chuẩn thêm vào (mg/100ml)

Hàm l−ợng cuối (mg/100ml) n = 3

Độ thu hồi (%)

Qua kết quả trờn hiệu suất thu hồi của cả 3 loại nền đều trờn 90% trong khoảng tuyến tớnh Độ

thu hồi với nền mẫu là đậu phụ cao hơn so với nền mẫu là hạt đỗ tương và thấp nhất là trờn nền

mẫu sữa đậu nành Do đú cú thể kết luận, phương phỏp này cho phộp xỏc định hàm lượng cỏc

acid amin cú độ thu hồi đều trong khoảng 92 - 99%

4.2 Khảo sỏt và chuẩn húa phương phỏp phõn tớch daidzein và genistein

4.2.1 Lựa chọn cột tỏch và điều kiện sắc ký

Đề tài đó khảo sỏt một số pha động trong phõn tỏch isoflavon và sử dụng cỏc cột sắc ký hiện cú,

bao gồm cột Novapak (150mm x 3,9 mm, 5 àm, Waters, Mỹ), cột Symmetry C18 (150mm x 3,9

mm, 5 àm, Waters, Mỹ), cột Luna (2) C18 (250mm x 3,9 mm, 5 àm, Phenomenex, Mỹ) Hệ pha

động chớnh đó được ỏp dụng rộng rói trong cỏc nghiờn cứu trờn thế giới là hỗn hợp acid acetic

0,1-1% và acetonitril Kết quả khảo sỏt đó lựa chọn được hệ pha động phự hợp là hỗn hợp acid

acetic 0,1 % và acetonitril 80% trong acid acetic 0,1% Chương trỡnh dung mụi thớch hợp để tỏch

được cỏc isoflavon trong đậu tương (dịch chiết thu được từ một trong cỏc quy trỡnh khảo sỏt ở

mục 4.2.2) như sau:

Pha động A: Acid acetic 0,1 %

Pha động B: Acetonitril 80% trong acid acetic 0,1%

Chương trỡnh dung mụi: Bảng 11

Bảng 11: Chương trình dung môi pha động phân tích daidzein và genistein

Thời gian (phút) Tốc độ dòng (ml/ phút) Tỷ lệ % A Tỷ lệ % B

độ buồng cột là 35oC Sắc đồ chuẩn daidzein và genistein thu được theo điều kiện phân tích này được thể hiện ở hình 2

4.2.2 Điều kiện chiết xuất isoflavon

Để lựa chọn được điều kiện chiết xuất isoflavon phù hợp, một số phương pháp trên thế giới đã được áp dụng và khảo sát tại phòng thí nghiệm Dịch chiết và dịch làm sạch các isoflavon được phân tích trên sắc ký lỏng để xác định khả năng chiết xuất dựa vào sự có mặt của các pic isoflavon đối chiếu với tài liệu đã công bố Các quy trình chiết xuất đã khảo sát bao gồm:

Quy trình 1: Áp dụng theo Hutabarat và cộng sự [15]

1 g bột đậu xay mịn(hoặc 25 ml sữa đậu nành) /bình cầu 100 ml

↓ Thêm 10ml HCl 2M + 40ml ethanol 96% + 0,02g BHT

↓ Lắc đều, siêu âm 20 phút

↓ Đun hồi lưu ở 80oC trong 1 giờ

↓

Để nguội, định mức vừa đủ 50ml bằng ethanol 96%

↓ Lọc, bơm vào HPLC

Quy trình 2: Theo Hsieh và cộng sự [18]

2 g bột đậu xay mịn /ống ly tâm 30ml

↓ Thêm 10 ml hexan, lắc đều, siêu âm 30 phút

↓

Ly tâm 3500 v/phút trong 10 phút, loại bỏ dịch trong

↓ Thêm 2ml hexan, vortex kỹ, ly tâm, loại bỏ lớp hexan (2 lần)

↓ Bã: dùng đũa thủy tinh đánh tơi cho bay hết dung môi

↓ Thêm 10 ml acetone + 2 ml HCl 0,1M

↓ Siêu âm 1 giờ

↓

Ly tâm 3500 v/phút trong 30 phút

↓ Hút toàn bộ dịch trong vào ống nghiệm 30 ml, thổi khô

↓ Hòa tan cặn bằng 5 ml MeOH, định mức 10 ml bằng MeOH

↓ Bơm vào HPLC

Quy trình 3: Theo Murphy và cộng sự [19]

1 g mẫu

↓ Thêm 10 ml acetonitril, 2 ml HCl 0,1M và 5 ml nước cất

↓ Khuấy hoặc lắc qua đêm ở nhiệt độ phòng

↓ Chuyển vào ống ly tâm, ly tâm 3000 vòng/ phút

↓ Hút lấy dịch chiết trong vào ống nghiệm sạch

↓ Thổi khô dịch chiết bằng khí nitơ

↓ Hòa tan bằng methanol 50% và định mức 100ml

↓ Lọc qua màng PTFE 0,45 µm

↓ HPLC

Dịch chiết thu được từ 3 quy trình nói trên được bơm vào sắc ký lỏng, xác định các pic tách được và so sánh với các tài liệu đã công bố Kết quả so sánh cho thấy đối với quy trình 1, dịch chiết thu được gồm chủ yếu là daidzein và genistein (hình 3) Theo phương pháp này, các isoflavon dạng kết hợp (glycosid) trong đậu tương bị thủy phân thành dạng tự do (daidzin thành daidzein, genistin thành genistein) Tuy nhiên nếu áp dụng phương pháp này sẽ không phân biệt được daidzein và genistein dạng tự do và dạng kết hợp trong đậu tương Một số nghiên cứu gần đây [16] cho thấy isoflavon dạng glycosid khi vào cơ thể sẽ bị các men tiêu hóa (ở nước bọt và ruột non) chuyển thành dạng tự do như daidzein và genistein và được hấp thụ vào cơ thể Tuy nhiên một nghiên cứu khác cho thấy isoflavon glycosid cũng có khả năng tăng cường sự hấp thụ các isoflavon qua ruột non [5] Vì vậy, đề tài lựa chọn phương pháp không thủy phân để xác định cả các isoflavon dạng tự do và dạng kết hợp, nhằm tạo cơ sở cho các nghiên cứu kế tiếp

So sánh hai phương pháp chiết xuất 2 (hình 4) và phương pháp 3 (hình 5) cho thấy cả hai quy trình đều chiết được các loại isoflavon chủ yếu, cả dạng tự do và dạng kết hợp Tuy nhiên, quy trình 2 phải áp dụng việc loại chất béo trước khi chiết xuất, tốn dung môi và thời gian phân tích, có thể ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi Vì vậy, phương pháp thứ 3 (theo Murphy và cộng sự) được lựa chọn để tiếp tục khảo sát và chuẩn hóa phương pháp phân tích đối với đậu tương và hai sản phẩm chế biến

Hình 2: Sắc đồ chuẩn daidzein và genistein Cột Luna C18 (2), tốc độ dòng 1ml/phút Gradient

như Bảng 11 Detector PDA ở 260 nm

Hình 3: Sắc đồ các isoflavon thu được theo quy trình 1 Cột Luna C18 (2), tốc độ dòng 1ml/phút

Gradient như Bảng 11 Detector PDA ở 260 nm