Nghiên cứu công nghệ sản xuất chế phẩm nấm sợi ứng dụng trong sản xuất rượu cao độ

Tính cấp thiết và mục tiêu nghiên cứu của đề tài Trong sản xuất rượu cao độ của Nhật Bản tiếng Nhật có tên là Shochu ở giai đoạn nuôi Koji gạo được cấy bào tử mốc và nuôi để tạo hệ enz

BỘ CÔNG THƯƠNG

VIỆN CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

–––––––––––––––––––––––––––––––

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI R-D CẤP BỘ

CHẾ PHẨM NẤM SỢI ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT

2 kÝ hiÖu ch÷ viÕt t¾t

- CFU: §¬n vÞ h×nh thµnh khuÈn l¹c (Colony Forming Unit)

- PDA: Potato Dextrose Agar

- UI: §¬n vÞ ho¹t lùc enzim

- Mpa: §¬n vÞ ®o ¸p suÊt

3 Tổng quan

3.1 Cơ sỏ pháp lí/ xuất xứ của đề tài

Đề tài được thực hiện theo hợp đồng nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ với mã số 83.08.RD/HĐ-KHCN giữa Bộ Công nghiệp và Viện Công nghiệp thực phẩm kí ngày 28 tháng 01 năm 2008

3.2 Tính cấp thiết và mục tiêu nghiên cứu của đề tài

Trong sản xuất rượu cao độ của Nhật Bản (tiếng Nhật có tên là Shochu) ở giai đoạn nuôi Koji (gạo được cấy bào tử mốc và nuôi để tạo hệ enzim có tác dụng thủy phân tinh bột trong giai đoạn lên men) bào tử mốc giống là một yếu tố quan trọng quyết định chất lượng của Koji

Trong nghiên cứu trước đây của chúng tôi thực hiện tại Viện Công nghiệp Thực phẩm về sản xuất rượu cao độ theo công nghệ Nhật Bản thì thấy rằng việc sử dụng chế phẩm mốc dạng bột nhập từ Nhật Bản có rất nhiều ưu điểm như giúp cho quá trình nuôi Koji ổn định, hoạt lực enzim cao, chất lượng rượu cao Điều này cho thấy rằng để duy trì chất lượng rượu cao độ một cách ổn định bền vững thì việc tạo ra một loại chế phẩm bào tử mốc dạng bột công nghiệp tương tự như sản phẩm của Nhật là rất cần thiết cho công nghệ sản xuất rượu mới này

Ngoài ra đối với rượu truyền thống tại các làng nghề hiện nay thì hình thức cung cấp giống mốc chủ yếu vẫn là dạng bánh men Tuy nhiên công nghệ sản xuất bánh men vẫn rất thủ công dựa trên kinh nghiệm gia truyền nên chất lượng bánh men không đồng đều giữa các mẻ, do vậy ảnh hưởng nhiều đến chất lượng rượu Chính vì lý do này mà rượu truyền thống chủ yếu mới được sản xuất ở quy mô nhỏ, không thể sản xuất được

ở quy mô công nghiệp, do vậy rất khó kiểm soát chất lượng và mang nhiều nguy cơ nguy hại cho người tiêu dùng Do vậy việc tạo ra dạng chế phẩm bào tử mốc sẽ giúp cho các làng nghề rượu cổ truyền Việt Nam có một hình thức cung cấp giống mốc ổn định, chất lượng tốt do sử dụng bào

tử của các chủng giống thuần chủng, đã được tuyển chọn phù hợp theo các đặc tính công nghệ Điều này sẽ giúp chất rượu của các làng nghề ổn

định hơn, hiệu suất thu hồi rượu cao hơn Đây sẽ là một sản phẩm vi sinh mới giúp cho công nghệ sản xuất rượu cổ truyền của Việt Nam được hoàn thiện hơn và có thể là tiền đề ban đầu để đưa rượu cổ truyền của Việt Nam

ra sản xuất tại quy mô công nghiệp, tạo được sản phẩm rượu có chất lượng cao và ổn định

Mục tiêu nghiên cứu của chúng tôi trong đề tài này là tạo được chế phẩm bào tử nấm mốc có hoạt lực cao dùng làm giống cho giai đoạn ủ mốc tạo enzim (giai đoạn đường hoá) trong sản xuất rượu cao độ từ tinh bột

3.3 Nội dung nghiên cứu

Để đạt được mục tiêu nghiên cứu nhóm đề tài “Nghiên cứu công

nghệ sản xuất chế phẩm nấm sợi ứng dụng trong sản xuất rượu cao

độ” đã thực hiện các nội dung nghiên cứu sau:

1 Lựa chọn chủng nấm mốc có hoạt lực thuỷ phân tinh bột cao dùng trong sản xuất rượu cao độ

2 Lựa chọn nguyên liệu gạo phù hợp

3 Nghiên cứu môi trường và điều kiện nuôi cấy thu nhận bào tử mốc

4 Nghiên cứu chế độ sấy và bảo quản cho hoạt lực chế phẩm ổn định

5 Nghiên cứu phối trộn chế phẩm mốc đa chủng

3.4 Nấm mốc

Nấm mốc là tên chung để chỉ các nấm hiển vi có cấu tạo dạng sợi Chúng phát triển rất nhanh trên nhiều nguồn cơ chất hữu cơ khi gặp khí hậu nóng ẩm Màu sắc của nấm mốc được xác định bởi màu các bào tử do

nó sinh ra như: xanh, vàng, trắng, đen, nâu

3.4.1 Đặc điểm cấu tạo [5, 6]

Tế bào nấm mốc có các thành phần cơ bản như tế bào nấm nói chung cũng như tế bào của các vi sinh vật nhân chuẩn khác bao gồm các phần: thành tế bào, màng tế bào, nhân, không bào, ty thể, mạng lưới nội chất Thành tế bào dày khoảng 0,2àm, có cấu tạo khá vững chắc do vừa

có cấu trúc bản mỏng vừa có cấu trúc dạng sợi Màng tế bào thường tách khỏi thành tế bào ở một vài chỗ, dày khoảng 7x10-3àm, được cấu tạo chủ yếu bởi lipit và protein

Chất nguyên sinh là dịch keo trong suốt, không màu, luôn chuyển

động từ phần sợi nấm già sang phần sợi nấm non hoặc từ các sợi nấm sinh dưỡng đến các sợi nấm làm nhiệm vụ sinh sản

Nhân tế bào thường có kích thước rất nhỏ, đường kính 2-3 àm, hình cầu hoặc hình trứng Số lượng nhân trong tế bào không ổn định

3.4.2 Đặc điểm sinh học của nấm mốc [4]

Nấm mốc có dạng hình sợi phân nhánh hoặc không phân nhánh, cấu tạo đơn bào hoặc đa bào Sợi nấm có kích thước bề dày đường kính từ 1-10 àm hoặc 20 àm, chiều dài có khi lên tới vài chục cm Khi nấm mốc phát triển sẽ tạo thành hệ sợi nấm hay còn gọi là khuẩn ty Có hai loại khuẩn ty: khuẩn ty khí sinh phát triển trên bề mặt môi trường và khuẩn ti dinh dưỡng ăn sâu vào môi trường đặc (còn gọi là khuẩn ty cơ chất) Đến giai đoạn trưởng thành từ các khuẩn ty khí sinh sẽ hình thành các cơ quan sinh sản gọi là bào tử Một số loại nấm mốc đơn bào bậc thấp như lớp

Phycomycetes, trong đó điển hình là Mucor, Rizopus, khuẩn ty thường

không có vách ngăn, toàn bộ khuẩn ty được coi là một tế bào phân nhánh,

đa nhân Các khuẩn ty có vách ngăn thì tạo nên cơ thể đa bào như

Penicillium, Aspergillus

Nấm mốc không có diệp lục tố, do đó không có khả năng tiến hành quang hợp như các loại cây xanh Chúng sống nhờ khả năng hấp thụ các thức ăn hữu cơ có sẵn qua bề mặt của khuẩn ty, đó là các cơ thể kí sinh hoặc hoại sinh

3.4.3 Nấm mốc dùng trong sản xuất các loại thực phẩm cổ truyền [2]

Nấm mốc dùng để đường hóa các nguồn nguyên liệu tinh bột trong

sản xuất rượu là Asp oryzae, Asp flavus, Asp usami, Asp awamorii Mốc Aspergillus đã được dùng phổ biến trong sản xuất tương, nước

chấm ở các nước phương Đông từ lâu đời Giống mốc này có hệ khuẩn ty (hệ sợi) không màu hoặc vàng nhạt Khuẩn ty phân nhánh có nhiều vách ngăn tế bào Tế bào có hạch nhân Cuống đính bào tử không phân nhánh dài và thẳng, đầu phình to thành chóp, nang hình cầu, hình bán cầu hoặc hình chùy xung quanh đầu có nhiều cuống nhỏ Tùy loài có cuống nhỏ

1 tầng hoặc 2 tầng Tất cả cuống nhỏ có hình chai và gọi là tế bào hình chai, khi trưởng thành sinh ra các đính bào tử ở đầu cuống Các đính bào

tử xếp thành chuỗi dài và càng tận cùng càng lớn dần Những chuỗi đính bào tử xếp đối xứng tỏa tròn trên chóp nang Đính bào tử điển hình thường hình cầu, đơn bào, đa hạch, bề mặt xù xì Do cuống sinh bào tử và

đính bào tử có màu sắc, nên màu của chúng trở thành màu của khuẩn lạc

mốc Các khuẩn lạc của mốc Aspergillus thường là: vàng, vàng lục, đen,

tro, nâu vv

Aspergillus oryzae còn gọi là mốc vàng Đầu tiên có màu vàng lục

sau có mầu nâu thẫm Chiều cao của cuống sinh bào tử 1-2 mm Mốc này sinh ra các enzim amylaza, invectaza, maltaza, proteaza và catalaza Mốc

phát triển trong khoảng nhiệt độ 15-40oC, tối thích 30-32oC Trong giống này có nhiều chủng được dùng trong sản xuất rượu, sản xuất nước chấm

Aspergillus flavus cũng gọi là mốc vàng rất giống Aspergillus oryzae, chỉ khác là kích thước nhỏ hơn, các tầng cuống hình trùy mang

đính bào tử và khuẩn lạc có màu trội về xanh lục hơn Lúc đầu khuẩn lạc mốc có màu vàng sáng, sau chuyển thành màu nâu ôliu Chiều cao của cuống sinh bào tử là 0,4-1 mm Mốc này sinh ra các hệ enzim giống

Aspergillus oryzae, đặc biệt là proteaza rất hoạt động và chế phẩm tinh

khiết của enzim này được dùng làm tác nhân ổn định bia ở một số môi trường có chất béo (trên lạc) mốc này có thể sinh ra độc tố aflatoxin

Aspergillus niger thường gọi là mốc đen Sợi mốc màu trắng nhưng

đính bào tử màu đen Từ cuống đầu tiên mọc tiếp 2-4 nhánh cuống nhỏ rồi mới tiếp đến các đính bào tử Mốc sinh ra enzim amylaza, invectaza, maltaza, proteaza, pectinaza, glucozooxydaza Mốc này được dùng trong sản xuất rượu, sản xuất axit xitric, axit fumaric Proteaza do mốc này hoạt

động ở pH 2,5-3,5, còn proteaza của Aspergillus oryzae không hoạt động

ở vùng pH này

Aspergillus niger có hoạt tính amylaza đường hóa khác nhau ở những

chủng khác nhau Một số chủng được sử dụng để đường hóa tinh bột trong sản xuất rượu hoặc xiro glucoza Mốc này có thể chịu được pH thấp, nhiệt độ thích hợp là 30-35oC và dễ phát triển trên môi trường tinh bột

Aspergillus awamorii và Aspergillus usami gần với Aspergillus niger có khả năng sinh ra nhiều dextrinaza và glucoamylaza, còn amylaza

sinh ra ít hoặc trung bình Mốc này được dùng nhiều trong công nghiệp rượu để đường hóa tinh bột

Aspergillus kawachii là loại nấm mốc trắng được sử dụng rộng rãi

để nuôi Koji trong sản xuất rượu Shochu của Nhật Bản Mốc này tạo ra

axit xitric và các enzim thủy phân như α-amylaza và glucoamylaza rất cần thiết cho quá trình đường hóa

3.4.4 Dinh dưỡng của nấm mốc [5, 6]

Nấm là những sinh vật dinh dưỡng hóa năng hữu cơ, chúng chỉ có khả năng thu nhận năng lượng từ môi trường bên ngoài nhờ quá trình oxy hóa hiếu khí hoặc quá trình lên men kị khí các chất hữu cơ ngoại bào Kiểu dinh dưỡng cacbon hữu cơ này được gọi là kiểu dinh dưỡng cacbon

dị dưỡng Nấm mốc là những loài hiếu khí hoàn toàn và có kiểu cacbon dị dưỡng thuộc loại hoại sinh, có nghĩa là có khả năng phân giải xác sinh vật, sử dụng các chất hữu cơ để làm chất dinh dưỡng

3.4.4.1 Nguồn thức ăn cacbon

Nấm mốc có thể sử dụng nguồn thức ăn cacbon khác nhau và không có những đòi hỏi nghiêm ngặt đối với một loại thức ăn cacbon Nhiều loài nấm mốc còn có khả năng đồng hoá cả các hợp chất hữu cơ rất bền vững hoặc rất độc đối với nhiều sinh vật khác (các hợp chất n-alcal, ancaloid, phenol, nhiều chất kháng sinh ) Đối với nguồn thức ăn hữu cơ phức tạp như: xilan, tinh bột, xenlulo, kitin trước hết nấm mốc phải sinh

ra các enzim để phân huỷ các hợp chất này thành các hợp chất đơn phân

tử sau đó mới đồng hoá được chúng

3.4.4.2 Nguồn thức ăn Nitơ

Các loài nấm mốc khác nhau có thể có nhu cầu khác nhau đối với nguồn thức ăn nitơ Nấm mốc thường có khả năng sử dụng cả nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ

Nhiều loài nấm mốc có khả năng đồng hoá cả muối amôn và

nitơrat Nhiều loài thuộc chi Fusarium có khả năng đồng hoá nitơ trong

khí NH3 Nhiều loài nấm mốc thuộc chi Aspergillus flavus, Trichoderma

nignorum, có khả năng đồng hoá trực tiếp nitơ phân tử

Ngoài các nguồn nitơ vô cơ, nhiều loài nấm mốc có thể sử dụng nguồn nitơ hữu cơ (protein, pepton, peptit, axit amin vv )

3.4.4.3 Các nguyên tố khoáng

Bằng các phương pháp phân tích quang phổ, người ta đã xác định

được tất cả các chất khoáng có trong tế bào nấm mốc Về các nguyên tố

đại lượng, có thể kể đến: S, P, K, Ca, Mg, Fe, chúng thường chiếm từ vài phần nghìn đến vài phần trăm trọng lượng khô Các nguyên tố vi lượng có

Mn, Mo, Zn, Cu, Co, Ni, B

Hàm lượng các nguyên tố khoáng trong tế bào nấm mốc không những thay đổi tuỳ thuộc và điều kiện nuôi cấy, thành phần môi trường, thời gian nuôi cấy

3.4.5 Độc tố nấm [14]

Trong số hơn 10.000 loài nấm được biết đến, có khoảng 50 loài nấm mốc gây hại cho người và vật nuôi vì chúng sản sinh ra độc tố, người

ta thường gọi tên chúng là độc tố nấm (mycotoxin) Độc tố nấm là những

sản phẩm trao đổi thứ cấp của nấm mốc như Aspergillus, Furasium,

Penicillium Những loài nấm mốc này có thể phát triển trong lúc canh tác,

lúc thu hoạch, lúc dự trữ, lúc sản xuất chế biến thức ăn khi gặp điều kiện thuận lợi Theo số liệu của Tổ chức Nông lương Thế giới (FAO) thì khoảng 25% tổng số lượng ngũ cốc nhiễm mycotoxin

Độc tố nấm mốc ở mỗi nơi là khác nhau do điều kiện khí hậu của từng khu vực Chẳng hạn Aflatoxin thì thường được tìm thấy ở khu vực nhiệt đới, trong khi Zearalenon thường được tìm thấy ở xứ ôn đới Mycotoxin không những hiện diện trong các hạt ngũ cốc, các loại hạt mà còn chuyển qua thịt, sữa, trứng và các sản phẩm từ nuôi trồng thuỷ sản như tôm, cá Thiệt hại kinh tế do mycotoxin gây ra có thể lên đến hàng triệu USD mỗi năm và ảnh hưởng nhiều nhất cho các nhà chăn nuôi, sản xuất thực phẩm và thức ăn gia súc

Bảng 3.1 Các dấu hiệu do nhiễm độc tố nấm

- T-2 và Diacetoxycripenol - Lở loét miệng, mất tính ngon

miệng, da và ruột bị bong tróc, sưng tấy

- Zearaleuone - Rối loạn sinh sản

- Vomitoxin - Chán ăn, da bị nhiễm nấm

- Fumoni và Momlifosumin - Rối loạn thần kinh, gan bị hư nát

- Aflatoxin - Gan bị nhiễm độc, suy yếu hệ

thống miễn nhiễm

- Dehratoxin và Citrinin - Thận nhiễm độc, bệnh Gout

Aflatoxin là độc tố nấm đáng sợ nhất Có nhiều chủng nấm tiết ra

độc tố này, nhưng Aspergillus flavus là loài nấm mốc sản sinh ra lượng

aflatoxin lớn nhất, nguy hiểm nhất Hiện có 4 loại aflatoxin đã được xác

định là B1, B2, G1, G2 (phân biệt ký tự “B” và “G” theo màu huỳnh

quang xanh da trời và xanh lá cây khi chiếu tia cực tím lên bản tách các

vết sắc ký lớp mỏng aflatoxin) Trong đó aflatoxin B1, G1 là hai chất có

tính độc nhất và được nghiên cứu khá kỹ

Ngoài việc gây ngộ độc cấp tính (liều gây chết người khoảng

10mg), độc tố aflatoxin còn được xem là nguyên nhân gây xơ gan và ung

thư Người ta đã biết aflatoxin là một trong những chất gây ung thư gan

mạnh nhất, tác động qua đường miệng Nếu hấp thu một tổng lượng

2,5mg aflatoxin trong thời gian 89 ngày có thể dẫn đến ung gan hơn 1

năm sau Vụ dịch năm 1960 ở miền Nam và Đông nước Anh khi 10 vạn

gà tây từ 4-6 tuần tuổi ăn phải lạc mốc bị chết đã làm mọi người sửng sốt

Các con vật bị chết sau 1 tuần khi thấy xuất hiện triệu chứng đầu tiên:

biếng ăn, sã cánh, lù dù rõ rệt Mổ gà chết đều thấy mô gan bị phá hủy và

có sự tăng tế bào biểu mô của ống dẫn mật Độc tố aflatoxin rất bền với nhiệt, khi đem lạc mốc rang lên, mặc dù nhiệt độ rất cao, các bào tử của nấm mốc bị tiêu diệt, nhưng độc tố của chúng vẫn không bị phá huỷ hoàn toàn

Người ta đã phân lập được nhiều loài mốc khác nhau trên gạo,

nhưng có 2 chủng hay gặp nhất là Aspergillus và Penicillium Rất nhiều loài mốc được phát hiện trên gạo có tính độc, thuộc các chủng Penicillium

khác nhau và tạo nên các màu nâu, vàng Nguy hiểm hơn cả là chủng

nấm mốc Penicillium islandicum tạo nên màu “gạo vàng Thái Lan” Đây

là chủng mốc được xem là nguyên nhân chủ yếu gây mốc gạo trong kho

Để phát triển, nấm mốc cần phải có môi trường phù hợp, đó là độ

ẩm cao và nhiệt độ nóng ấm thích hợp Aspergillus flavus chủ yếu xâm

nhập được khi hạt lạc chứa 15-20% hàm lượng nước, nếu hàm lượng nước dưới 9% thì nó không thể phát triển được Vì vậy cách chống mốc tốt nhất

là phơi khô, loại hết những hạt giập vỡ, nhăn nheo hoặc nghi mốc để tránh bào tử mốc nhanh chóng lan sang các hạt lạc bình thường khác

3.4.6 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi mốc [4, 5, 6, 7] 3.4.6.1 ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ đóng vai trò chủ yếu trong quá trình sinh trưởng của sợi nấm, nó cũng tác động đến việc sản sinh bào tử và sự nảy mầm của chúng Mỗi loài nấm mốc có khoảng nhiệt độ sinh trưởng và phát triển nhất định Phần lớn nấm mốc phát triển trong khoảng 15-32oC và sinh trưởng tốt nhất ở khoảng 25-30oC Một số ít loài nấm mốc có thể sinh trưởng ở cả các kho lạnh đến -6oC, thậm chí -20oC như Cladosporium

herbarum, một số loài thuộc chi Penicilium Ngược lại, loài Asp flavus

vẫn phát triển tốt ở 35oC Một số ít loài khác có nhiệt độ tăng trưởng đến

50oC Căn cứ vào nhiệt độ tăng trưởng, các loài nấm mốc được chia thành

5 nhóm: nhóm ưa nóng, nhóm chịu nóng, nhóm ưa nhiệt trung bình, nhóm

chịu lạnh, nhóm ưa lạnh Nhiệt độ tối thích cho đa số các chủng nấm mốc

là 28-32oC Nếu nhiệt độ xuống dưới 24oC hay trên 45oC nấm mốc sẽ phát triển chậm

3.4.6.2 ảnh hưởng của độ ẩm

Mọi quá trình trao đổi chất của tế bào vi sinh vật đều xảy ra trong môi trường nước Tuy nhiên nhu cầu về nước đối với từng loài, từng chủng

và thời kỳ phát triển khác nhau có khác nhau Trong những nhân tố tác

động vào sự phát triển của nấm mốc, độ ẩm có vai trò rất lớn Độ ẩm của môi trường cũng như độ ẩm tương đối của không khí là yếu tố quan trọng quyết định sự sinh trưởng của hệ sợi nấm và sự sản sinh bào tử

3.4.6.3 ảnh hưởng của độ thoáng khí

Nấm mốc hoàn toàn hiếu khí và chỉ phát triển được trong điều kiện

thoáng khí Các loài như Mucor và Trichoderma là những loài cần nhiều oxy Một lượng nhỏ khí cacbon là cần thiết cho bào tử Aspergillus nảy

mầm nhưng nếu nồng độ này quá cao lại ức chế sự phát triển của chúng Khi nuôi cấy nấm mốc bằng phương pháp bề mặt cần chú ý tới độ dày khối môi trường để đảm bảo độ thoáng khí cần thiết cho sự phát triển của nấm mốc

3.4.6.4 ảnh hưởng của pH môi trường

pH của môi trường cũng ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm mốc Phần nhiều nấm mốc phát triển trong phạm vi pH từ 4-8 nhưng một số nấm mốc có khả năng chịu được những cơ chất có pH axit hơn hoặc kiềm hơn Tuy nhiên khi dùng phương pháp nuôi cấy bề mặt, pH môi trường ít làm ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm mốc vì môi trường rắn có tính đệm cao

3.5 Sản xuất chế phẩm bào tử nấm mốc

3.5.1 Giới thiệu công nghệ làm bánh men cổ truyền Việt Nam [9,11]

Tại Việt Nam công nghệ sản xuất rượu cao độ cổ truyền đã có từ lâu đời Một hình thức chế phẩm mốc và men giống phổ biến nhất dùng cho sản xuất rượu chính là bánh men cổ truyền, đây là một phức hệ các loại vi sinh vật dùng để làm giống gốc trong quá trình ủ cơm và lên men Bánh men thường được sản xuất ở quy mô nhỏ theo kinh nghiệm và các chủng giống sử dụng làm bánh men thường là các chủng tự nhiên hoạt lực không cao, quy trình làm thủ công nên rất dễ nhiễm tạp các vi sinh vật không có lợi Do vậy chất lượng bánh men thường không đồng đều nên dẫn tới chất lượng rượu cổ truyền thường không ổn định Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu được thực hiện để nâng cao chất lượng bánh men, tuy nhiên tính ổn định của chế phẩm vi sinh vật này cũng chưa được thực sự cải thiện đáng kể Hiện nay ở Việt Nam cũng xuất hiện một số loại sản phẩm giống dạng bột dùng cho sản xuất rượu có nguồn gốc từ Trung Quốc, tuy nhiên đây là các sản phẩm nguồn gốc không rõ ràng và chất lượng rượu sản xuất ra không cao thường gây đau đầu cho người uống

3.5.1.1 Hệ vi sinh vật trong bánh men

Trong bánh men chứa một phức hệ các vi sinh vật bao gồm: nấm mốc, giả nấm men, nấm men

Các loại nấm mốc chủ yếu trong bánh men là Aspergillus, Mucor,

Rhizopus, đó là các loại nấm mốc phổ biến có trong không khí Các loại

nấm mốc này thường có thành phần và tỷ lệ rất khác nhau tùy thuộc vào từng loại bánh, từng vùng sản xuất, từng hộ Các loại nấm mốc

Aspergillus, Mucor, Rhizopus khi phát triển trên môi trường với cơ chất là

tinh bột có khả năng sinh tổng hợp enzim amylaza để thủy phân tinh bột thành đường Trong đó đáng chú ý nhất là các chủng thuộc giống

Aspergillus, các chủng này có khả năng sinh tổng hợp enzim amylaza cao,

đặc biệt là glucoamylaza

Các chủng giả nấm men thuộc loài Endomycopsis có vai trò quan trọng trong bánh men, đặc biệt là các chủng Endomycopsis fibulliger Khi phát triển trên môi trường cơ chất là tinh bột Endomycopsis fibulliger có

khả năng sinh tổng hợp enzim glucoamylaza cao để thủy phân tinh bột thành đường glucoza

Các loại nấm men để giúp quá trình lên men đường thành rượu Trong đó đáng chú ý nhất là các loại nấm men thuộc chủng

Saccharomyces cerevisiae, chủng này thường có hoạt lực lên men mạnh

3.5.1.2 Công nghệ làm bánh men

Sản xuất bánh men chính là sản xuất hỗn hợp các hệ vi sinh vật cần thiết cho quá trình sản xuất rượu Bản chất của bánh men là nuôi cấy và bảo quản vi sinh vật trên môi trường tinh bột sống ở trạng thái khô Sau quá trình tạo bánh, ủ và sấy tới độ ẩm bảo quản, các vi sinh vật được chuyển từ trạng thái hoạt động sang trạng thái nghỉ Chúng sẽ hoạt động nhanh chóng trở lại trong điều kiện môi trường thích hợp (độ ẩm, chất dinh dưỡng, nhiệt độ), sinh sản, phát triển đồng thời sinh tổng hợp phức

hệ enzim đường hóa

Nguyên liệu chính để sản xuất bánh men là gạo và các vị thuốc bắc, nam hoặc các loại lá, củ, quả Gạo để sản xuất bánh men thuốc bắc thì

được ngâm và nghiền ướt thành bột mịn Đối với bánh men lá gạo được nghiền khô thành bột Gạo để sản xuất bánh men được lựa chọn rất kỹ, thường là các loại gạo cũ không bị mốc, mọt

Thuốc bắc hoặc các loại lá, củ, quả được sử dụng với thành phần và

tỷ lệ khác nhau, tùy thuộc vào kinh nghiệm gia truyền của từng làng nghề Mỗi bài thuốc khác nhau ảnh hưởng đến hương vị của từng lọa rượu Các

vị thuốc để sản xuất bánh men thường được nghiền nhỏ để dùng dần

Người ta thường sử dụng men giống gốc làm giống để gây men Men giống gốc là bánh men có chất lượng tốt của mẻ trước để lại, được nghiền nhỏ trước khi phối trộn làm men

Để sản xuất bánh men người ta phối trộn tỷ lệ hỗn hợp thuốc bắc (bánh men thuốc bắc) hoặc các loại lá, củ, quả (bánh men lá), gạo và men giống theo kinh nghiệm Sau đó bổ sung nước để nhào bột tới độ ẩm khoảng 50-55%, tạo bánh, xếp vào các khay đã đựng sẵn trấu, ủ men đến khi các bánh men xốp phồng đều, bề mặt có hệ sợi mốc trắng, có mùi rượu thơm Sau đó lấy ra hong khô tự nhiên hoặc sấy khô thu được bánh men cho sản xuất rượu

3.5.2 Giới thiệu công nghệ sản xuất Tane Koji Nhật Bản [1, 12, 16]

Tane Koji theo tiếng Nhật có nghĩa là hạt mốc giống Nuôi cấy mốc

để sản xuất tương hoặc xì dầu ở các nước phương Đông có từ thời cổ xưa Trước đây bào tử nấm mốc có từ thiên nhiên rơi vào trong xôi gạo và mọc lên mốc làm tương hay làm rượu Theo phương pháp truyền thống có từ thời Muromachi (XIII-XV) thì mốc được sản xuất trên gạo hấp chín theo

tỷ lệ 96% gạo, 4% tro của một số lá cây như camellia, zelkova nuôi cấy

ở nhiệt độ 34-36oC trong 7 ngày Loại sản phẩm này được gọi là Tane Koji

Năm 1884 J Takamine (Nhật Bản) đã nuôi cấy Asp oryzae trên

gạo, sau đó thay gạo bằng cám mì và thu được chế phẩm enzim bằng cách chiết qua nước rồi kết tủa bằng cồn Năm 1914 mốc này được dùng rộng rãi trong sản xuất rượu ở Mỹ theo qui trình công nghệ của Takamine và

được dùng phổ biến trên thế giới để đường hóa các nguồn nguyên liệu tinh bột trước khi lên men rượu cho đến nay

Hiện nay tại Nhật có khoảng 6 nhà máy chuyên sản xuất chế phẩm bào tử mốc giống (Tane Koji) và cung cấp cho toàn bộ các nhà máy rượu trên toàn nước Nhật Không chỉ rượu mà nhiều sản phẩm khác như nước

chấm, tương… là những sản phẩm mà có trải qua giai đoạn nuôi Koji cũng sử dụng các chế phẩm bào tử dạng bột như vậy (mỗi một sản phẩm khác nhau sử dụng một loại bào tử của chủng giống riêng biệt) Tại các công ty sản xuất mốc giống các chủng nấm mốc thuần chủng như

Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Aspergillus kawachii… được nuôi

trên những môi trường đặc hiệu để thu nhận lượng bào tử lớn và sau đó

được hoàn thiện thành dạng sản phẩm bào tử dạng bột và nhà sản xuất rượu mua dạng chế phẩm này dùng trực tiếp cho quá trình nuôi Koji trong sản xuất rượu Điều này giúp chất lượng rượu sản xuất ra luôn ổn định do

sử dụng các chủng giống công nghiệp, thuần chủng, hoạt lực cao và giúp cho quy trình công nghệ làm Koji tại các cơ sở sản xuất rượu trở nên đơn giản, dễ thao tác hơn

3.5.2.1 Các sản phẩm Tane Koji được sử dụng trong sản xuất rượu Shochu

Hiện nay ở Nhật có 3 loại Tane Koji được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp sản xuất rượu cao độ Shochu đó là: Tane Koji đen, Tane Koji trắng và Tane Koji vàng Các tên gọi này xuất phát từ màu của các bào tử nấm mốc

Tane Koji đen được sản xuất từ chủng Aspergillus awamorii, chủng

mốc đen thường được dùng chủ yếu trong sản xuất Shochu truyền thống ở Nhật Bản do tạo nhiều axit xitric Tane Koji trắng được sản xuất từ chủng

Aspergillus kawachii, chủng đột biến từ Aspergillus awamorii Hiện nay

loại mốc trắng này đang rất được ưa chuộng ở Nhật bởi vì chủng này tạo hương thơm rất đặc trưng Tane Koji vàng được sản xuất từ chủng

Aspergillus oryzae Chủng này không sản sinh nhiều axit xitric trong quá

trình nuôi Koji nên thường chỉ dùng khi phối trộn với chủng mốc đen

3.5.2.2 Công nghệ sản xuất Tane Koji

Bào tử giống gốc Trộn đều

Đưa vào khay

Vào phòng nuôi

Nuôi cấy ở điều kiện thích hợp

Chế phẩm Tane Koji

Thuyết minh qui trình công nghệ

A Xử lý nguyên liệu gạo

Vo gạo: với số lượng gạo nhiều thì sử dụng thiết bị chuyên dụng Sau khi

vo lượng nước hấp thụ vào gạo khoảng 10%

Ngâm gạo: mục đích của quá trình ngâm là cho gạo hấp thụ nước để dễ

chín khi hấp Gạo được ngâm trong nước có nhiệt độ 15-16oC, thời gian từ 12-15 giờ Sau khi ngâm gạo lượng nước hấp thụ vào gạo khoảng 30%

Đồ gạo: gạo sau khi ngâm nước được làm ráo rồi đưa vào thiết bị hấp,

thường thời gian đồ gạo kéo dài từ 30 đến 50 phút tùy từng loại gạo Trong quá trình đồ gạo, gạo hấp thụ thêm 10% nước Sau khi đồ gạo, tiến hành cân xác định lại khối lượng gạo đồ Nếu tỉ lệ khối lượng gạo đồ/khối lượng gạo ban đầu đạt khoảng 140 -150% là đạt yêu cầu

Làm nguội: sau khi đồ gạo được tãi ra làm nguội đến nhiệt độ 37oC rồi trộn bào tử mốc giống có tên gọi Tsubujyo

B Quá trình nuôi Tane Koji

Sau khi được cấy giống mốc, gạo đồ được chuyển vào các khay nuôi bằng gỗ, rồi đưa vào phòng nuôi, nhiệt độ phòng giữ khoảng 32oC,

độ ẩm không khí trong phòng là 80-90%, thời gian nuôi khoảng 5-6 ngày Các khay nuôi được xếp chồng lên nhau cứ 5 khay một và được đặt trên các giá đỡ Hàng ngày tiến hành đảo trộn khối ủ và đảo vị trí các khay nuôi sao cho nhiệt độ giữa các khay đồng đều và đạt nhiệt độ yêu cầu trong quá trình nuôi

Điều kiện phòng nuôi: diện tích phòng khoảng 15m2/100 kg gạo Trong phòng nuôi có hệ thống điều khiển nhiệt độ, độ ẩm và thiết bị thông khí Tường bao quanh, trần và mái của phòng nuôi được làm bằng vật liệu giữ ấm

3.5.3 Nguyên liệu sử dụng cho sản xuất chế phẩm bào tử mốc

Gạo là nguyên liệu chính để sản xuất chế phẩm bào tử mốc và có

ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng của sợi nấm cũng như việc sản sinh bào tử Gạo là loại nông sản sẵn có ở Việt Nam Các số liệu thống kê về sản lượng lúa trong cả nước được trình bày ở bảng 3.2

Bảng 3.2 Sản lượng lúa cả nước (nghìn tấn) [8]

Sản lượng Năm Lúa đông

vụ, ngoài ra còn phụ thuộc vào kỹ thuật chế biến và bảo quản

Tinh bột

Đánh giá chất lượng gạo người ta chú trọng đến tỷ lệ giữa amyloza

và amylopectin có trong tinh bột, tỷ lệ này ở mỗi loại gạo rất khác nhau Trong tinh bột gạo tẻ hàm lượng amyloza vào khoảng 18-26%, trong tinh bột gạo nếp hầu như chỉ có amylopectin

Bảng 3.3 Hàm l−ợng amyloza của một số loại gạo [13]

Hàm l−ợng amyloza

TT Loại gạo Protein

(% chất khô)

(% chất khô)

Phân loại

Mức độ gelatin hóa

7 Bao Thai Hồng 8,19 24,36 Trung bình Thấp

bình

bình

15 IR-62030 8,04 24,15 Trung bình Thấp

Protein

Mỗi một loại gạo, hay cùng một loại gạo ở các vùng khí hậu, thổ

nh−ỡng khác nhau, có tỷ lệ và thành phần protein khác nhau Nh−ng chủ

yếu là orezinin thuộc nhóm glutelin, ngoài ra còn có globulin, locozin và

prolamin So với một số loại ngũ cốc khác nh− lúa mỳ, lúa mạch thì

thành phần protein trong gạo thấp, nh−ng trong cấu trúc protein lại chứa

đủ các loại axit amin không thay thế

Bảng 3.4 Hàm l−ợng các axit amin không thay thế của gạo [13]

Các chất béo trong hạt gạo chỉ tập trung ở lớp ngoài (vỏ cám) và

phôi hạt Chủ yếu là các axit béo ch−a no nh−: axit oleic chiếm tới 42,4%,

axit linoleic chiếm tới 30%, axit panmatic chiếm tới 15,5% thành phần

chất béo của hạt gạo

Vitamin

Gạo chứa nhiều loại vitamin: B1, B2, PP, E, D trong đó vitamin

B1 chiếm một hàm l−ợng lớn Gạo lật B1 chiếm 0,5 mg%, gạo xát B1

chiếm 0,2 mg% Các vitamin chủ yếu tập trung ở lớp vỏ alơron và ở phôi

của hạt

Các chất khoáng

Gạo chứa một hàm lượng đáng kể các chất khoáng: Ca, Mg, Fe,

Zn Tùy từng loại gạo, thời vụ, vùng địa lý mà tỷ lệ, thành phần các chất

khoáng trong gạo khác nhau

3.5.3.2 Sự thay đổi thành phần hóa học của hạt gạo trong quá trình

chế biến

Sau quá trình làm sạch, hàm lượng chất béo và protein của hạt lúa

thực tế không có gì thay đổi Riêng hàm lượng tro giảm, hàm lượng

xelluloza giảm chủ yếu do râu thóc đã được tách bỏ đi

Bảng 3.5 Sự thay đổi thành phần hóa học của thóc trong quá trình

Sau khi xay, trấu được tách ra và người ta thu lấy gạo xay Thành

phần hóa học của gạo xay và trấu được ghi lại ở bảng 3.6

Bảng 3.6 Thành phần hóa học của các sản phẩm sau khi xay [3]

Xát gạo nhằm mục đích tách đến mức tối đa các lớp vỏ quả, vỏ hạt

và alơron Tùy theo cường độ xát (mức bóc cám) cao hay thấp mà thành phần hóa học của gạo thành phẩm khác nhau khá nhiều

Bảng 3.7 Sự thay đổi thành phần hóa học của gạo theo mức độ xát[3]

Hàm lượng, % theo chất khô

Tên sản

phẩm Protein Chất béo Tinh bột Tro XellulozaGạo lật (xay) 8,6-10,1 1,5-2,0 76,8-82,5 1,32-1,70 0,86-1,60Gạo xát 1 lần 8,1-9,9 1,4-1,9 78,4-85,8 1,20-1,40 0,6-1,2 Gạo xát 2 lần 7,9-9,6 1,3-1,6 80,0-87,1 1,10-1,26 0,5-1,1 Gạo xát 3 lần 7,8-9,4 1,0-1,1 83,0-88,0 0,98-1,14 0,4-0,8 Gạo xát 4 lần 7,7-9,3 0,7-0,9 84,5-89,0 0,70-0,98 0,2-0,5 Gạo xát 5 lần 7,6-9,2 0,5-0,6 09,8 0,48-0,72 0,1-0,4

Gạo càng xát kỹ thì hàm lượng xelluloza càng thấp và như vậy độ tiêu hoá của gạo sẽ tăng Nhưng do quá trình xát đã loại đi các lớp vỏ và một phần lớp alơron nên hàm lượng protein và chất béo trong gạo cũng giảm đi Đặc biệt hàm lượng các vitamin giảm đi rất rõ rệt Trong quá trình xát gạo lượng vitamin có thể mất đi đến 56-81% tuỳ theo từng loại gạo

Trong quá trình xát gạo, hàm lượng amyloza của tinh bột gạo tăng lên, như vậy có nghĩa là tinh bột ở lớp ngoài của hạt gạo có chứa ít amyloza hơn các lớp trong

Bảng 3.8 Sự thay đổi hàm lượng amyloza trong quá trình xát gạo [3]

Hàm lượng amyloza (% theo tinh bột của thóc) Loại gạo

Tám Thơm Chiêm Chanh Mộc Tuyền Nếp Cái Gạo xay (lật) 17,8 25,2 19,2 rất ít

4 Thực nghiệm

4.1 Phương pháp tiến hành nghiên cứu :

4.1.1 Phương pháp phân tích hóa lý và hóa sinh

- Xác định độ ẩm theo phương pháp sấy đến 105oC trong 3 giờ đến trọng lượng không đổi

- Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Kieldan

- Xác định hàm lượng axit bằng phương pháp trung hòa

- Xác định hoạt độ enzim α-amylaza theo phương pháp của Nhật

Nguyên tắc: đo cường độ màu tạo thành giữa phản ứng của tinh bột và enzim α-amylaza có trong mẫu cần phân tích với Iod là chất hiện màu Hoạt độ enzim α-amylaza là số gam tinh bột tan được chuyển hóa thành các dextrin có phân tử lượng khác nhau khi sử dụng 1g chế phẩm enzim ở 40oC trong thời gian 30 phút

Công thức tính:

HđA =

10

100x75,12xt

- Xác định mật độ tế bào bằng buồng đếm hồng cầu

- Xác định số lượng bào tử sống trên môi trường PDA

- Xác định số lượng bào tử nảy chồi trên môi trường thạch có 1% tinh bột

4.1.3 Phương pháp đánh giá cảm quan theo TCVN 3217-79

Cách lấy mẫu:

- Tiến hành lấy mẫu theo TCVN 378-70 và TCVN 1275-72

- Lượng mẫu lấy theo yêu cầu của hội đồng cảm quan nhưng không quá 4 lít

- Mẫu được bảo quản cho tới khi thử nghiệm ở nơi không có ánh nắng mặt trời chiếu thẳng vào và ở nhiệt độ không quá 25oC

Tiến hành thử mẫu:

Cho rượu mẫu vào đầy chai thủy tinh, chai đó đã được tráng bằng nước cất và rượu mẫu thử nghiệm, ngay sau đó tiến hành kiểm tra độ trong và màu sắc dưới ánh sáng tự nhiên hay nhân tạo

Rót rượu mẫu vào khoảng một phần ba thể tích cốc thủy tinh, cốc

đó đã được tráng bằng nước cất và rượu mẫu thử nghiệm, ngay sau đó tiến hành kiểm tra mùi, vị

Sau khi cảm quan xong một mẫu phải nghỉ từ 5-10 phút Trong thời gian nghỉ, súc miệng bằng nước đun sôi để nguội không có mùi, vị lạ

Bảng 4.1 Hướng dẫn đánh giá cảm quan rượu TCVN 3217-79 [10]

Yêu cầu

5 Chất lỏng trong suốt, không vẩn đục và vật

thể lạ nhỏ, màu hoàn toàn đặc trưng cho sản phẩm

4 Chất lỏng trong suốt, không vẩn đục, có ít vật

3 Chất lỏng trong, có tương đối nhiều vật thể lạ

nhỏ, màu hơi khác một ít so với màu đặc trưng của sản phẩm

2 Chất lỏng hơi đục, có khá nhiều vật thể lạ nhỏ

thô trầm trọng màu khác nhiều so với màu

đặc tr−ng của sản phẩm

1 Chất lỏng đục nhiều lắng cặn, có nhiều vật thể

lạ nhỏ trầm trọng, thô, màu không đặc tr−ng cho sản phẩm

0 Có mùi lạ khó chịu của sản phẩm hỏng

5 Hòa hợp, êm dịu, hậu tốt, hoàn toàn đặc tr−ng

Bảng 4.2 Bảng qui định đánh giá mức chất lượng rượu [10]

STT Mức chất lượng

Số điểm chung

Yêu cầu tối thiểu về điểm trung bình chưa có trọng lượng của hội đồng cảm quan

Vị: 4,8

Vị: 3,8

3 Loại trung bình 11,2-15,1 Mỗi chỉ tiêu: 2,8

4 Lọai kém 7,2-11,1 Mỗi chỉ tiêu: 1,8

5 Loại rất kém 4,0-7,1 Mỗi chỉ tiêu: 1,0

6 Loại hỏng 0-3,9 Mỗi chỉ tiêu nhỏ hơn 1,0

4.2 Thiết bị, dụng cụ, nguyên vật liệu và hoá chất sử dụng cho nghiên cứu

4.2.1 Nguyên liệu

- Các loại gạo: Nếp cái hoa vàng, Nếp Thủy Tiên, Nếp Mộc Tuyền, Nếp Thái Bình, P4, Bắc Hương, Tám Xoan, X21, X123, Khang Dân và C70 mua tại Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam

- Chủng nấm mốc: Aspergillus awamorii, Aspergillus niger, Aspergillus

oryzae, Aspergillus kawachii do chuyên gia JICA cung cấp

4.2.2 Các loại hoá chất

Các loại hóa chất tinh khiết của hãng Merck (Đức), BDH (Anh)

4.2.3 Thiết bị nghiên cứu

- Tủ cấy vô trùng Biolock Scientific – Pháp

- Cân phân tích độ chính xác 0,0001g Presisa 62A – Thụy Điển

- Cân điện tử độ chính xác 0,1g Ohaus CT1200 – Mỹ

- Máy ly tâm Universal 12A - Đức