Nghiên cứu xây dựng phương pháp chuẩn phân tích hoocmon clenbuterol trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký khối phổ (gc-ms)

Mục tiêu của đề tài là : Xây dựng qui trình chuẩn để phân tích Clenbuterol trong các mẫu thực phẩm có độ chính xác cao bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ GC/MS.. Hai thiết bị này có kh

BỘ CÔNG THƯƠNG

VIỆN CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

–––––––––––––––––––––––––––––––

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI R-D CẤP BỘ

CHUẨN PHÂN TÍCH HOOCMON CLENBUTEROL TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP

Phần I: Tổng quan

1.1 Cơ sở pháp lý của đề tài :

Đề tài thực hiện theo Hợp đồng nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ số 89.08.RD/HĐ-KHCN ký ngày 28 tháng 01 năm 2008 giữa Bộ Công Thương và Viện Công nghiệp thực phẩm.(Phụ lục kèm theo)

1.2 Tính cấp thiết và mục tiêu nghiên cứu của đề tài.-

Clenbuterol thuộc nhóm β- agonist, có công thức hóa học C12H18Cl2N2O

được sử dụng rộng rãi như là một chất tăng trọng, nó được bổ sung vào thức

ăn chăn nuôi (TĂCN) lợn, gà, bò nhằm kích thích sinh trưởng, tăng tỷ lệ nạc, nhằm giảm chi phí thức ăn Tuy nhiên, lượng Clenbuterol tồn dư trong vật nuôi

có tác động xấu đến sức khoẻ con người như: làm rối loạn nhịp tim, run cơ, co thắt phế quản, phù nề, liệt cơ, tăng huyết áp Các nước Châu âu từ 1988 đã cấm đưa Clenbuterol vào thức ăn chăn nuôi, Mỹ cấm năm 1991

ở Việt nam, từ năm 2002 theo quyết định số 54/QĐ-BNN của Bộ trưởng

Bộ NN& PTNT ký ngày 20/06/2002 đã cấm sản xuất, nhập khẩu, lưu thông và

sử dụng Clenbuterol trong sản xuất và kinh doanh thức ăn chăn nuôi Mặc dù vậy, việc sử dụng Clenbuterol trộn vào thức ăn chăn nuôi chưa phải đã hết do những mối “lợi” từ tác dụng của Clenbutarol đem lại Những kết quả nghiên cứu của Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam cho thấy, trong 83 mẫu thức ăn hỗn hợp và đậm đặc của 12 công ty có 9 mẫu dương tính ( chiém 10,8%) Kết quả thử nhanh trên 80 mẫu thịt có 05 mẫu dương tính ( Chiếm 6,25%) Kết quả của Chi cục Thú y thành phố HCM cũng cho thấy, trong 334 mẫu khả nghi có tồn dư Clenbuterol cao thì có 52 mẫu dương tính (chiếm 15.57%)

Gần đây nhất, cuối năm 2006, đầu năm 2007 Cục Chăn nuôi đã cùng với các Sở NN-PTNN của 64 tỉnh, thành phố tổ chức lấy mẫu TĂCN tại các đại

lý, các trang trại chăn nuôi và cơ sở sản xuất TĂCN để kiểm tra; đã nhận đựơc kết quả 114 mẫu phân tích có 19 mẫu dương tính ( chiếm 6,4%) Rõ ràng, kiểm soát hàm lượng Clenbuterol trong thức ăn chăn nuôi và trong thực phẩm

là việc phải làm thường xuyên Nhằm góp phần giải quyết yêu cầu cấp thiết của xã hội và công tác kiểm soát VSAT thực phẩm , chúng tôi tiến hành đề tài : “Nghiên cứu xây dựng phương pháp chuẩn phân tích hocmon Clenbuterol trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC/MS) “ Mục tiêu của đề tài là :

Xây dựng qui trình chuẩn để phân tích Clenbuterol trong các mẫu thực phẩm

có độ chính xác cao bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC/MS)

1.3 Đối tượng, phạm vi và nội dung nghiên cứu

Từ đặc tính và mục đích sử dụng Clenbuterol, dễ dàng nhận thấy các sản phẩm thực phẩm có khả năng chứa dư lượng Clenbuterol không thể nào khác

là thịt gia súc và các sản phẩm từ thịt Tuy nhiên nguồn cung tạo dư lượng chất

độc hại này lại xuất phát từ thức ăn chăn nuôi, vì vậy kiểm soát tận gốc để phòng ngừa và tránh rủi ro là rất cần thiết Vì lý do đó, chúng tôi tiến hành xây dựng qui trình phân tích Clenbuterol bằng sắc ký khí khối phổ cho hai đối tượng là thức ăn chăn nuôi và thịt động vật Những nội dung chính của đề tài nghiên cứu bao gồm :

a Nghiên cứu lựa chọn điều kiện tách, làm sạch và làm giàu mẫu Clenbuterol tách chiết từ mẫu

b Xác định điều kỉện phân tích Clenbuterol trên máy GC/MS

c Xác định hiệu suất thu hồi mẫu, khả năng phát hiện của phương pháp

d áp dung phương pháp đã xây dựng để khảo sát một số mẫu thịt và sản phẩm thực phẩm khác trên địa bàn Hà Nội; so sánh kết quả kiểm tra với một

số phòng thí nghiệm khác

1.4 Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

1.4.1 Nghiên cứu ứng dụng phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC/MS)

Sự kết hợp giữa phương pháp sắc ký và phương pháp khối phổ (GC/MS) tạo nên một phương pháp phân tích đặc biệt có hiệu quả trong lĩnh vực hoá phân tích Hai thiết bị này có khả năng bổ sung và hỗ trợ cho nhau trong quá trình phân tích (GC: tách, MS: phát hiện), vì vậy phương pháp này được sử dụng rất hữu hiệu cho quá trình khảo sát, định lượng các chất [13] Hai kỹ thuật trên ghép nối với nhau có thể tách và định lượng các chất có nồng độ 10-8 gram hoặc nhỏ hơn nữa, đây là nồng độ rất khó phát hiện ở các phương pháp phân tích công cụ Ngoài ra, với sự kết nối này, những mẫu không bền trong thời gian bảo quản cũng có thể được phân tích một cách thuận lợi, đặc biệt là việc phân tích các hỗn hợp phức tạp Nhờ đó, có thể tiết kiệm khá nhiều thời gian thực nghiệm vì phân lập mẫu theo nguyên tắc điều chế trước khi đưa vào khối phổ do vậy giảm nhẹ yêu cầu kỹ thuật đối với các kỹ thuật viên

Sơ đồ hệ sắc ký khí khối phổ có thể mô tả tóm tắt như sau:

Về cơ bản, thiết bị sắc ký sử dụng cột nhồi hoặc cột mao quản có thể ghép nối thiết bị khối phổ loại hội tụ chùm tia đơn hoặc kép [2], [17] Có nhiều giải pháp kỹ thuật khác nhau để thực hiện việc ghép nối trong hệ thống Với thiết bị hiện đại ngày nay toàn bộ dòng khí thoát ra (khí mang và mẫu) từ cột

nhồi hoặc cột mao quản được chuyển thẳng vào bộ phận chiết khí mang trung gian, sau đó được đưa trực tiếp vào nguồn ion hoá mẫu Thiết bị chiết khí mang trung gian có thể có những cấu trúc khác nhau, nhưng khi làm việc chúng phải tuân theo một nguyên lý chung là khuếch tán qua hệ thống lỗ xốp hoặc khếch tán trong một thiết bị tách khuếch tán phân tử

Sắc ký đồ được ghi lại từ tín hiệu của dòng ion tổng cộng Những sắc đồ thu được từ tín hiệu dòng ion hoá và detector ion hoá ngọn lửa nói chung tương

tự nhau

Sắc ký khối phổ đã được sử dụng rộng rãi, đặc biệt nó có thể giúp phát hiện các cấu tử trong hỗn hợp phức tạp Nhiều cải tiến quan trọng đã được áp dụng,

đặc biệt trong phân tích các hợp chất sinh hoá Ngoài ra các chương trình xử lý

số liệu khi ghép nối với máy tính khiến quá trình phân tích trở nên đơn giản hơn và cho phép thu được những kết quả đáng tin cậy

Phổ khối được sử dụng như một detector đặc biệt, có độ nhạy cao Trong trường hợp này, các thiết bị sẽ cho các giá trị số khối khác nhau và dòng ion

đáp ứng được tập hợp và ghi lại dưới dạng một sắc đồ (phân mảnh khối) Quá trình này cho phép xác định được cả các mẫu có nồng độ rất nhỏ (tới 10-10g)

Về nguyên tắc hoạt động của detector khối phổ, khi cho một chất ở trạng thái khí va chạm với một dòng electron thì phân tử chất có thể bị tách ra một hoặc hai electron để trở thành các ion dương mang điện tích 1 hoặc 2; cũng có thể quá trình va chạm này làm phân tử chất tiếp nhận thêm electron để trở thành ion âm, gọi là ion hoá phân tử Khi va chạm mạnh hơn thì phân tử còn có thể

bị phá vỡ ra thành nhiều phần khác nhau mang điện tích dương hay âm Sự phá

vỡ này hoàn toàn phụ thuộc vào năng lượng va chạm, dẫn đến các cách phá vỡ phân tử khác nhau Các ion này sẽ được tách và đo khối lượng sau đó ghi trên sắc phổ đồ

Về kỹ thuật phân tích khối phổ phải tuân thủ các bước gồm:

Hoá khí chất mẫu: mẫu được dẫn vào bình chứa, ở đó áp suất có thể giảm

tới 10-6 mmHg, sau đó dòng khí này được dẫn vào buồng ion hoá để sản ra các ion, lượng mẫu có thể ghi nhận được rất nhỏ 10-13 g/giây

Ion hoá mẫu, có thể sử dụng các phương pháp:

- Ion hoá nhờ các tia hay các phần tử mang năng lượng (electron, photon, hạt nhân)

- Ion hoá nhờ điện trường mạnh

- Ion hoá nhờ sự phòng điện

- Ion hoá nhờ sự phòng điện

- Ion hoá nhờ sự đốt nóng (nguồn nhiệt Lazer)

- Ion hoá nhờ tương tác ion (ion hoá học)

Trên thực tế hiện nay, người ta sử dụng phương pháp ion hoá qua sự va chạm electron

Phương pháp va chạm electron là dòng khí được dẫn đi qua một dòng electron thẳng góc với nó, tuỳ thuộc năng lượng của dòng electron này lớn hay nhỏ mà các ion được sản ra nhiều hay ít (nhìn chung năng lượng này khoảng 70ev)

Tách các ion theo khối lượng, về nguyên tắc việc tách này dựa trên sự khác

nhau về khối lượng của ion hơn là sự khác nhau về điện tích Trước tiên người

ta tăng tốc độ cho các ion, nhờ cho qua một điện trường mạnh, vận tốc của các ion được tính theo công thức :

- e : Điện tích ion

- U : Thế tăng tốc

- m : Khối lượng

- V : Vận tốc

Tốc độ này ở trong máy phân tích đạt 100km/s Sau khi tăng tốc, các ion

được bay qua một từ trường, đường bay của chúng sẽ bị lệch khác nhau do tác dụng của từ trường với bán kính lệch R được tính theo công thức:

C3H7 - banzothiophen ở giá trị m/z 176, alkyl benothiophen C10H10S m/z

162 và alkyl naphtalen C12H12 m/z 160 Người ta cũng phát hiện ra 5 đồng phân của alkyl benzothiophen

- Phân tích các hợp chất hữu cơ có trong nước ngầm: rất nhiều thực nghiệm

đẫ được tiến hành để phân tích lượng vết của các hợp chất hữu cơ tồn tại trong nước Khả năng ứng dụng của phương pháp sắc ký khí - khối phổ đối với việc định tính và định lượng các hợp chất hữu cơ độc hại trong các mẫu nước thải sinh hoạt, nước thải công nghiệp ngày càng nhiều Tuy nhiên việc phân tích các hợp chất hữu cơ chứa trong nước tương đối khó khăn bởi chúng thay đổi rất nhanh và ở nồng độ rất nhỏ Vì lý do đó đầu tiên người

ta phải sử dụng khối phổ ký để cắt nhỏ các cấu tử, sau đó từ sắc ký khối phổ đồ này kết hợp với các ion mảnh được thể hiện trên các pic, cùng số liệu thời gian lưu của cột để xác định thành phần và nồng độ của chúng

- Phân tích các cấu tử polyclorua: trong phân tích naphtalen clorua bằng sắc

ký khí – khối phổ, người ta sử dụng phương pháp so sánh cường độ pic (intensity matching method) Trong phương pháp này, các đồng phân tự nhiên của các thành phần chứa các nguyên tử clo hoặc brom trong phân tử cũng có thể được xác định để khẳng định sự có mặt của hợp chất polyclorua

- Phân tích nitrosamin: nitrosamin là một trong những chất gây ung thư, sự tồn tại của nó trong môi trường rất nguy hiểm đối với đời sống con người Mức độ độc hại của nitrosamin rất cao, vì vậy nó thu hút được sự chú ý của rất nhiều nhà khoa học Có thể sử dụng nhiều phương pháp để xác định nitrosamin như GC, LC Tuy nhiên đối với chất này thì GC/MS vẫn là phương pháp không thể thiếu vì sử dụng GC/MS ta có thể xác định được cấu trúc hoá của các thành phần N- nitroso, đây là ưu điểm lớn của phương pháp

- Ngoài các nghiên cứu, ứng dụng trên, hiện nay phương pháp GC/MS còn

được sử dụng rất nhiều trong phân tích dư lượng các chất bảo vệ thực vật, các chất kích thích, các hoá chất độc dễ bay hơi

ở trong nước, việc tiếp cận với các kỹ thuật phân tích mới, đặc biệt là kỹ thuật sắc ký khá phổ biến từ khoảng những năm 90, đây là thời kỳ một số phòng thí nghiệm của các trường đại học, các Viện nghiên cứu được trang

bị các hệ thống sắc ký hiện đại Với sắc ký khí khối phổ (GC/MS) tuy chưa nhiều nhưng bắt đầu có các nghiên cứu ứng dụng của các trường đại học như Đại học Khoa học Tự nhiên với nghiên cứu: “ Phân tích các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi trong nước bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ, dùng

kỹ thuật lấy mẫu bay hơi”; “ Nghiên cứu xác định PANs trong khí thải nhà máy giấy Bãi Bằng”, của tác giả Phạm Hùng Việt và cộng sự; “Nghiên cứu xác định Chloramphenicol trong mẫu sinh học bằng phương pháp sắc ký khí – khối phổ”, của tác giả Vũ Công Sáu tuy nhiên chưa có công bố trong nước nào về nghiên cứu ứng dụng GC/MS để xác định Clenbuterol trong thực phẩm

1.4.2 Nghiên cứu xác định Clenbuterol

Clenbuterol, 4-amino – alpha- tert-butylaminomethyl – 3,5 – dichlorobenzyl alcohol, là một beta- agonist có công thức hóa học

C12H18Cl2N2O; phân tử lượng 277,18 trong đó C: 52,00%, H: 6,54%, Cl: 25,58%, N: 10,11%, O: 5,77%

ở Việt Nam, hiện nay phương pháp xác định Clenbuterol chủ yếu dựa vào phương pháp Eliza, nhưng phương pháp này cho độ tin cậy chưa cao nên kết

OH H N Cl

H2N

Cl

quả kiểm nghiệm đang còn gây nhiều tranh cãi Để xác định hàm lượng Clenbuterol trong các mẫu TĂCN Bộ NN&PTNN đã phải gửi mẫu thử sang Singapore để kiểm tra Việc làm này đã gây mất nhiều chi phí về tiền của và thời gian

Hiện nay, trên thế giới các phương pháp dùng phát hiện Clenbuterol gồm: phương pháp Eliza, Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), Sắc ký lỏng hiệu năng cao khối phổ (LC/MS), Sắc ký khí khối phổ (GC/MS ) trong các phương pháp nêu trên, phương pháp Eliza có ưu điểm phát hiện nhanh, mang tính sàng lọc các mẫu thử nhưng có độ tin cậy và độ chính xác không cao Để định lượng chính xác hàm lượng Clebuterol, người ta thường sử dụng phương pháp HPLC/MS hoặc GC/MS Tuy nhiên phương pháp HPLC/MS có

độ nhậy thấp hơn, chi phí đắt hơn so với phương pháp GC/MS; vì vậy xu hướng xác định dư lượng Clenbuterol bằng phương pháp GC/MS ngày càng

được quan tâm ở nhiều nước

Theo các tạp chí phân tích chuyên ngành, những phương pháp phát hịên Clenbuterol và beta- agonists khác trong các mẫu sinh học đã được công bố trên thế giới có thể thấy: những phương pháp này phát hiện ở nhiều mức độ khác nhau, từ phương pháp miễn dịch enzyme (EIA- enzyme immunoassays), sắc ký bản mỏng (TLC- thin layer chromatography) tới sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC- high performance liquid chromatography) và sắc ký khí khối phổ (GC/MS – gas chromatography- mass spectrometry) [9] (Girault and

Fourtillan, 1990; Blanchflower et al., 1993; Wilson et al., 1994; Kingston et

al., 1995; Batjoens et al., 1996; Gigosos et al, 1996; Abou- Basha and Aboul- Enen, 1996; Sangiorgi and Curatolo, 1997) Do có sự trùng hợp về các phản ứng của beta- agonists và một số steroit, các phương pháp EIA và RIA (radio immunoassay) không xác định đầy đủ, chính xác sự hiện diện của các beta-agonists trong các mẫu sinh học; do đó cần thiết phải sử dụng phương pháp có tính đặc hiệu cao HPLC và GC đáp ứng được điều này nhưng lại không xác

định được cấu trúc và các thông tin đầy đủ để khẳng định chắc chắn Clenbuterol Khắc phục thiếu sót này, một kỹ thuật có độ nhạy, sự chọn lọc, phát hiện cao có thể khẳng định kết quả đó là phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC/MS- gas chromatography- mass spectrometry)

Việc nghiên cứu ứng dụng phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC/MS) để phân tích và định lượng Clenbuterol đã được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm ngay từ khoảng những năm 1993 – 1996 (Blanchflower et al., 1993; Garcia- Regueiro et al., 1993; Kingston et al., 1995; Batijoens et al., 1996) Ngoài ra cũng đã có những công bố về nghiên cứu ứng dụng GC-MS-MS để xác định Clenbuterol nhưng chưa nhiều

Một hướng khác là ứng dụng sắc ký lỏng cao áp (HPLC) để xác định Clenbuterol cũng đã được quan tâm Tác giả E Ciranni Signoretti, C D’Arpino và F Latorre đã nghiên cứu phát hiện Clen buterol trong nước ngọt (Journal of Chromatography, 473; 301-304) [5]

ở Trung quốc, ít khi có việc vi phạm pháp luật khi sử dụng Clenbuterol vào thức ăn chăn nuôi vì thường được thay thế bằng Ractopamine Tuy nhiên việc kiểm soát đồng thời cả Ractopamine và Clenbuterol trong thức ăn chăn nuôi

được các cơ quan chức năng của Chính phủ quản lý nghiêm ngặt Việc phát hiện Clenbuterol và Ractopamine hyđrochlorie trong thức ăn chăn nuôi và thịt

động vật được sử dụng phương pháp HPLC với detector điện hoá (Turberg et al., 1994), khả năng phát hiện là 1mg/kg Năm 2005, Zhang và cộng sự đã phát triển phương pháp, sử dụng detector huỳnh quang để phát hiện Ractopamine trong thức ăn chăn nuôi Với nghiên cứu này tác giả đã đưa giới hạn phát hiện lên 0,5 mg/kg Khi sử dụng kỹ thuật LC-UV để phát hiện Clenbuterol, Chang có thể tìm ra Clenbuterol ở giới hạn 0,05 mg/kg

Ngoài các nghiên cứu trên, một và tác giả trên thế giới còn sử dụng phương pháp Sắc ký khí – quang phổ hồng ngoại chuyển hoá fourier để khẳng định sự

có mặt của các beta- agonists trong mẫu (T.Visser, M J Vredenbreg and A.PJM Jong), các công bố này cho thấy khi sử dụng kỹ thuật này khả năng phát hiện các beta – agonists khá cao [22]

Ngoài các nghiên cứu lựa chọn các phương pháp để phát hiện Clenbuterol nói riêng, các beta- agonists nói chung, các nhà khoa học trên thế giới (Milagro Reig, Natalia Batlle, Jose Luis navarro, Fidel Toldra) cũng rất quan tâm đến các nghiên cứu làm ổn định chúng trong quá trình phân tích [16] Chiết tách, xử lý và làm sạch mẫu luôn là vấn đề quan tâm đối với các nhà phân tích Trong nghiên cứu xác định dư lượng Clenbuterol, một số tác giả đã

đề cập đến xử lý mẫu nước tiểu bằng chiết pha rắn (SPE) ( Christin Berggren, Sami Bayoudh, David Sherington, Kees Ensing – Department of Analytical Chemistry and Toxicology, University Centre for Pharmacy, Antonius Deusinglaan 1, 9713 AV Groningen, Netherlands; Department of Pure and Applied Chemistry, University of Strathclyde), hay trong các mẫu thức ăn gia súc và chế phẩm sinh học (Gianfranco Brambilla, Maurizio Fiori, Barbara Rizzo, Vittorio Crescenzi, Giancarlo Masci- laboratorio Medicina Veterinaria, Viale Regina Elena 299, 1-00161 Rome, Italy; Department of Chemistry, University of Rome, Italy) Các nghiên cứu này đều cho thấy khi sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn (SPE), các mẫu phân tích được làm sạch và làm giầu lên rất nhiều [4]

1.5 Các phương pháp xác định Clenbuterol:

Hiện nay các phương pháp cơ bản được sử dụng để xác định dư lượng Clenbuterol gồm có: phương pháp EIA, phương pháp HPLC, phương pháp

GC, ( mở rộng có phương pháp LC – MS, và phương pháp GC- MS) [8] [9] [18] [24]

- Phương pháp EIA hay ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) là phương pháp thử nghiệm miễn dịch, gắn enzyme theo phương pháp cạnh tranh trực tiếp Dung dịch chiết xuất từ mẫu được trộn với conjugate (kết

gắn) Hỗn hợp được chuyển vào các giếng phủ kháng thể, tại đó chất cần phân tích và conjugate cạnh tranh nhau để gắn kết với kháng thể Phương pháp này sử dụng kit thử được chế tạo sẵn, ưu điểm là đơn giản, dễ thao tác, cho kết quả nhanh (chỉ trong vòng 1 giờ); tuy nhiên độ chính xác không thật cao, để khẳng định kết quả vẫn phải sử dụng kết hợp với phương pháp khác

- Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), về nguyên tắc, kỹ thuật tách bằng HPLC giống với sắc ký cột truyền thống, tuy nhiên HPLC dùng bơm cao áp, cột nhồi nhỏ; các cấu tử phát hiện bằng các detector có độ nhậy cao ứng dụng phương pháp này, có thể sử dụng detector UV hoặc detector điện hoá, khối phổ (LC-MS) để phát hiện Clenbuterol; các cột tách

có thể là C8 hoặc C18 với kích thước: 250 x 4,5mm, 5um hoặc 150 x 3,9

mm, 5um; 150 x 2,1mm, 5um; 150 x 2,1mm, 3um; 50 x 2,1mm, 1,7um

- Phương pháp sắc ký khí (GC): Phương pháp này liên quan đến sự tương tác giữa pha hơi và pha lỏng nên khó phát hiện các chất không bay hơi Có hai loại sắc ký khí là sắc ký khí – lỏng (pha tĩnh là chất lỏng) và sắc ký khí rắn (pha tĩnh là chất rắn) Mẫu được bơm vào buồng bơm mẫu có nhiệt độ cao đủ để mẫu có thể hoá hơi, khí mang sẽ kéo các cấu tử phân tích qua cột Tại đây sẽ

có sự tương tác với pha tĩnh dẫn đến thời gian lưu của các cấu tử sẽ khác nhau Các cấu tử sẽ lần lượt ra khỏi cột và đi vào detector Detector sẽ cho tín hiệu khi có mặt một chất hoặc một nhóm chức nào đó Tín hiệu của detector sẽ làm biến đổi tín hiệu điện tỷ lệ với lượng cấu tử

Tín hiệu được khuyếch đại và ghi lại thành sắc ký đồ Việc phát hiện

được sử dụng nhiều với việc kết hợp quang phổ hồng ngoại (gas chromatography – fourier transform infrared spectrometry), hay khối phổ (MS) [22]

- Chiết bằng dung môi

- Sử dụng các chất hoạt động bề mặt

+ Sản phẩm dầu lipit ( bơ, phomat, dầu béo ) Cần phá vỡ màng polypeptit trong chất béo và dầu mỡ

- Dùng dung môi phân cực

- Dung dịch axit, kiềm, chất hoạt động bề mặt

+ Sản phẩm rau quả: Cần phá vỡ tế bào thực vật bằng nghiền, đồng hoá sau

đó chiết bằng dung môi thích hợp

3.Làm sạch, làm giầu mẫu

- Loại bỏ các tạp chất gây nhiễu

- Nâng cao độ tinh khiết, độ đậm đặc của chất cần phân tích

- Đảm bảo an toàn cho cột phân tích ( HPLC,GC)

Nếu K > 99/1 thì coi nh− chất X đã chuyển hết vào A

Các điều kiện để chiết:

- Dung môi chiết phải có độ tinh khiết cao

- Dung môi hoà tan tốt chất chiết nh−ng không tốt với các chất khác trong mẫu

Dùa trªn sù c©n b»ng ph©n bè cña chÊt ph©n tÝch trong m«i tr−êng vµ giät dung m«i chiÕt Cã hai ph−¬ng ph¸p:

Pha tÜnh ph©n cùc, cho phÐp c¸c chÊt t¹p nhiÔm kh«ng ph©n cùc ®i qua

vµ gi÷ l¹i c¸c cÊu tö cÇn ph©n tÝch ph©n cùc

Dïng t¸ch c¸c chÊt tõ dung m«i kh«ng ph©n cùc lªn bÒ mÆt chÊt ph©n cùc ( Silica pha th−êng, Florisil pha th−êng )

- Pha ng−îc:

Pha tÜnh kh«ng ph©n cùc, sÏ gi÷ l¹i chÊt ph©n tÝch kh«ng ph©n cùc, cho phÐp chÊt ph©n cùc ®i qua

Dùng tách các chất phân tích khỏi một pha động phân cực vào một chất không phân cực ( chất hấp phụ ) ( C8- C18 )

- Cặp đôi ion:

Pha tĩnh không phân cực, việc lưu giữ và rửa giải các chất gần theo kiểu cơ chế pha ngược

- Trao đổi ion:

Trên bề mặt chất hấp phụ có chứa nhóm ion chức năng Có thể dùng chúng như kiểu pha thường hoặc pha ngược, các chất phân tích trao đổi ion với chất nhồi cột và được tách giữ trên cột

Lựa chọn kích cỡ và khối lượng chất nhồi cột: Việc lựa chọn này ảnh hưởng trực tiếp đến việc tách, làm sạch và hiệu suất thu hồi mẫu Khả năng thu hồi mẫu kém thường xẩy ra khi kích thước và khối lượng chất nhồi trong ống không thích hợp Sự quá lớn của lớp chất nhồi sẽ dẫn đến sự rửa giải không hoàn toàn, ngược lại lớp chất nhồi quá nhỏ sẽ khiến cho việc lưu giữ mẫu không tốt

Trường hợp chưa biết chắc chắn có thể áp dụng phương pháp lựa chọn tối ưu: bắt đầu bằng một lượng chất nhồi trung bình ( 200mg hoặc 500 mg) Nếu quan sát thấy khả năng lưu giữ mẫu hoàn toàn thì có thể giam bớt lượng chất nhồi và dung dịch rửa giải Ngược lại, nếu quá trình lưu mẫu không hoàn toàn thì phải tăng lượng chất nhồi và dung dịch rửa giải

2.1.2 Xác định khả năng thu hồi mẫu, LOD và LOQ

Nghiên cứu khả năng thu hồi mẫu bằng cách bổ sung một lượng mẫu chuẩn biết trước vào mẫu sau đó tiến hành các điều kiện phân tích đã lựa chọn

để đánh giá

• Xác định hiệu suất thu hồi

0

2 1

x m

m m

=

Trong đó : m 1 : lượng chất xác định được trong mẫu tự tạo (àg)

m 2 : Lượng chất xác định được trong mẫu trắng (àg)

m0 : Lượng chất chuẩn trong hỗn hợp dùng để cho vào mẫu

tự tạo (àg)

R : Độ thu hồi (%)

• Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn xác định (LOD)

Giới hạn phát hiện LOD (Limit of detection) là lượng nhỏ nhất của chất phân tích có thể phát hiện được đảm bảo sự khác biệt với mẫu trắng tới 95%; thông thường lấy gấp 3 lần độ lệch chuẩn của tín hiệu nhiễu

Giá trị LOD được tính :

LOD = 3 (N/S)xC

Trong đó : N : Độ nhiễu trung bình đường nền

S : Chiều cao pic của chất cần phân tích

C: Nồng độ chất

Giới hạn xác định LOQ (Limit of quantification) là lượng nỏ nhất của chất cần phân tích có trong mẫu thử có thể định lượng được trong điều kiện tiến hành phép thử Thông thường LOQ được lấy từ 3 đến 5 lần LOD

2.1.3 Tạo sự ổn định, phù hợp cho chất phân tích

Để đảm bảo tính ổn định và phù hợp cho điều kiện phân tích, chất cần phân tích sẽ được chuyển đổi nhờ tạo dẫn xuất Nguyên tắc chung, phương pháp sắc ký khí làm việc dựa vào việc mẫu phải được chuyển thành dạng hơi trong điều kiện thực nghiệm Một số chất ở dạng bình thường có thể không

phân tích được bằng phương pháp sắc ký khí.Tuy nhiên, các hợp chất này có thể sử dụng phương pháp sắc ký khí để phân tích nếu chúng được chuyển hoá thành các dẫn xuất tương ứng dễ bay hơi Dẫn xuất hoá, ngoài việc làm tăng khả năng bay hơi của các cấu tử cần phân tích, còn làm chuyển hoá những nhóm phân cực của các cấu tử thành những nhóm không phân cực tương ứng, như vậy hạn chế khả năng hấp phụ mạnh trong quá trình sắc ký do tương tác của các nhóm phân cực gây ra

2.1.4 Phương pháp ngoại chuẩn

Phương pháp này tiến hành bằng cách lập đường chuẩn với các nồng

độ mẫu khác nhau và diện tích pic tương ứng của các nồng độ cấu tử cần xác

định

2.1.5 Phương pháp nội chuẩn

Người ta thêm vào mẫu một lượng xác định của chất được chọn làm nội chuẩn Chất nội chuẩn có thể là chất lạ, cũng có thể là một cấu tử nào đó có sẵn trên sắc đồ Nếu là chất lạ thì thời gian lưu của nó phải gắn với thời gian lưu của cấu tử cần phân tích

2.1.6 Phương pháp tự nội chuẩn

Phương pháp tự nội chuẩn là phương pháp sử dụng chính cấu tử cần phân tích bổ sung thêm vào mẫu Sau đó so sánh sắc ký đồ của mẫu trước và sau khi bổ sung mẫu chuẩn

2.2 Trang thiết bị, dụng cụ và hóa chất nghiên cứu chính

Thiết bị, dụng cụ

- Bể rửa dụng cụ ( pipet ) siêu âm

Untrasonic LC 60H, SIBATA

- Bộ khử ion nước Barnstead

Compact ultrapur water system LF Bernstead

- Tủ sấy dụng cụ DG-82 Yamato

Drying Oven DG-82

- Cân kỹ thuật BV 320D Shimadzu

Balance BV 320 Shimadzu

- Máy nghiền mẫu IKA MF10

Analytical Mill IKA MF 10

- Máy ly tâm HETTICH- Rotina 35R

Centrifuger HETTICH Rotina 35 R

- Bộ chiết pha rắn Supel.Co

- Máy lắc Voxtex, hãng IKA

- Bình định mức: dung tích 5ml, 10ml, 50ml, 100ml hãng Dural, Đức

- Phễu chiết loại 100ml, 200ml,300ml

- Ông nghiệm dung tích 15 ml đã silan hóa

- Bình cầu cô quay, các loại ống đong, pipet,

Hóa chất

- Methanol, loại dùng cho sắc ký, hãng Merk

- Axit chlohydric (HCl) loại dùng cho sắc ký, hãng Merk

- Axít perchloric (HCl04): loại dùng cho sắc ký, hãng Merk

- Isopropanol, loại dùng cho sắc ký, hãng Merk

- Ethyl acetate, loại dùng cho sắc ký, hãng Merk

- Amonium hydroxyt, loại dùng cho sắc ký, hãng Merk

- Toluen,loại dùng cho sắc ký, hãng Merk

- Amoni acetate, loại dùng cho sắc ký, hãng Wako Japan

- N- methyl- N- (trimethylsilyl) trifluoro acetomide (MSTFA) : loại dùng cho phân tích sắc ký, hãng Sigma, USA

- Trimethylchlorosilane (TMCS), hãng Nacalai tesque, Japan

- Clenbuterol hydrochloride, hãng Dr Ehrenstorfer, Germany

- Acebutolol hyhrochloride, hãng Sigma.USA

- Khí Nitơ : Độ tinh khiết 99,99%

- Cột làm sạch: C18, SCX,

-

2.3 Kết quả nghiên cứu và thảo luận

2.3.1 Nghiên cứu lựa chọn điều kiện tách, làm sạch và làm giầu mẫu

Việc chiết tách, làm sạch và làm giầu mẫu là khâu rất quan trọng cho mọi quá trình phân tích, đặc biệt là những chất phân tích có hàm lượng nhỏ trong mẫu (dạng dư lượng) ảnh hưởng của giai đoạn này rất lớn, có thể chiếm tới 70% sai số của cả quá trình phân tích Trong nội dung nghiên cứu của đề tài này, để đảm bảo cho việc chiết tách, làm sạch và làm giàu Clenbuterol từ mẫu chúng tôi tiến hành xử lý mẫu theo các bước sau:

a Xử lý mẫu sơ bộ: Mẫu nghiên cứu được nghiền nhỏ bằng máy nghiền

và máy đồng hoá để phá vỡ tế bào (đối với thịt) và tăng cường khả năng tiếp xúc của mẫu với dung môi chiết ở bước tiếp theo, tạo điều kiện cho quá trình chiết mẫu được triệt để

b Chiết tách:

Chiết tách là bước quan trọng trong quá trình phân tích, mục đích của bước này là lựa chọn dung môi để chuyển toàn bộ chất cần phân tích vào dung môi chiết Có nhiều loại dung môi có thể sử dụng, tuy nhiên dung môi lựa chọn cần hoà tan tốt nhất các chất cần chiết và không tạo phản ứng hoá học với chất chiết Trên cơ sở tài liệu tham khảo và thực tiễn nghiên cứu, chúng tôi lựa chọn ba dung môi chiết tách gồm:

Bảng 1 Nghiên cứu lựa chọn dung môi chiết tách

STT Dung môi chiết tách Khả năng chiết tách

(Độ thu hồi mẫu (%)