Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu vật liệu khởi đầu phục vụ chọn tạo giống đậu xanh kháng bệnh khảm vàng

DANH MỤC BẢNG TT 1.1 Một số loài hoang dại và loài trồng thuộc chi Vigna với tên thường gọi và nguồn gốc phát sinh 6 2.1 Nguồn gốc các nguồn gen đậu xanh được đánh giá khả năng kháng b

LỜI CAM ĐOAN

i liệu trích dẫn đã được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Tác giả luận án

Bùi Thị Thu Huyền

BÙI THỊ THU HUYỀN

NGHIÊN CỨU VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU PHỤC VỤ CHỌN TẠO GIỐNG ĐẬU XANH KHÁNG BỆNH

KHẢM VÀNG

LUẬN ÁN TIẾN SỸ NÔNG NGHIỆP

HÀ NỘI – 2016

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

- -

BÙI THỊ THU HUYỀN

NGHIÊN CỨU VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU PHỤC VỤ CHỌN TẠO GIỐNG ĐẬU XANH KHÁNG BỆNH

KHẢM VÀNG

LUẬN ÁN TIẾN SỸ NÔNG NGHIỆP

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

1 PGS.TS Hà Viết Cường

2 TS Trần Danh Sửu

HÀ NỘI – 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận

án là do tôi thực hiện Các số liệu và kết quả nghiên cứu đã nêu trong luận án là trung thực và chưa được ai công bố trên bất kỳ một công trình nghiên cứu nào khác Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ đã được cám ơn, các tài liệu trích dẫn đã được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Tác giả luận án

Bùi Thị Thu Huyền

Nghiên cứu sinh biết ơn những ý kiến đóng góp quý báu của các Thầy

Cô công tác tại Ban Đào tạo sau đại học - Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam trong suốt quá trình học tập tại đây

Nghiên cứu sinh xin chân thành cảm ơn các cán bộ, bạn bè đồng nghiệp công tác tại Bộ môn Nhân giống và đánh giá nguồn gen, Bộ môn Đa dạng sinh học Nông nghiệp – Trung tâm Tài nguyên Thực vật, Trung tâm nghiên cứu Bệnh cây nhiệt đới – Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Phòng Virus học và Phòng chỉ thị Phân tử - Trung tâm Rau Thế giới đã chia sẻ kinh nghiệm, giúp đỡ động viên trong suốt quá trình thực hiện luận án

Nghiên cứu sinh xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới Ban Lãnh Đạo Trung tâm Tài nguyên Thực vật, Chủ nhiê ̣m tiểu dự án GIZ tại Viê ̣t Nam, TS Nguyễn Thi ̣ Lan Hoa, Chủ nhiê ̣m Dự án GIZ tại AVRDC, TS Lawrence Kenyon, HTX Nam An Nghiệp, huyện Tuy An, Phú Yên đã tạo điều kiện học tập và giúp đỡ tận tình trong quá trình thực hiện nghiên cứu này

Cuối cùng, nghiên cứu sinh xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên khích lệ trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận án

Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận án

Bùi Thị Thu Huyền

1.1.2 Đặc điểm nông sinh học và yêu cầu sinh thái của cây đậu xanh 6

1.1.4 Tình hình nghiên cứu, sản xuất đậu xanh trên thế giới và Việt Nam 8

1.2.2 Các chỉ thị ADN dùng cho đánh giá đa dạng di truyền đậu xanh 14

1.2.3 Nghiên cứu đa dạng di truyền cây đậu xanh bằng chỉ thị phân tử 14

1.3.8 Đánh giá nguồn gen và chọn giống đậu xanh kháng bệnh khảm vàng 26

1.4 Nghiên cứu lập bản đồ di truyền và ứng dụng trong cải tiến giống

1.4.5 Tiềm năng ứng dụng những thành tựu nghiên cứu hệ gen đậu xanh

1.5 Nghiên cứu sử dụng chỉ thị phân tử và lập bản đồ phân tử ở Việt Nam 43

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 44

2.4.3 Phương pháp đánh giá khả năng kháng bệnh khảm vàng trên đậu xanh 50

3.1 Phân lập và xác định virus gây bệnh khảm vàng trên đậu xanh 583.1.1 Kết quả thu mẫu bệnh khảm vàng trên cây đậu xanh, các cây họ đậu

3.1.2 Thiết kế mồi phát hiện các virus gây hại trên cây đậu xanh và các cây

3.1.3 Kết quả chuẩn đoán bệnh virus trên đậu xanh và các cây họ đậu khác

3.1.5 Kết quả phân tích nguồn gốc phát sinh loài của MYMV từ các trình tự

3.2 Đánh giá khả năng kháng bệnh khảm vàng trên đồng ruộng và đặc điểm

3.2.2 Đánh giá đặc điểm nông sinh học của các mẫu giống đậu xanh 79

3.3 Đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen đậu xanh 863.3.1 Thống kê các chỉ tiêu đánh giá đa dạng di truyền bằng chỉ thị DArT 87

3.4.2 Đánh giá kiểu gen kháng bệnh khảm vàng bằng giải trình tự 1063.4.3 Lập bản đồ liên kết di truyền, bản đồ vật lý của quần thể

3.4.4 Lập bản đồ QTL cho tính kháng bệnh khảm vàng trên đậu xanh 111

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ADN Acid Deoxyribo Nucleic Axít Deoxyribonucleic

AFLP Amplified Fragment Length

Polymorphism

Đa hình chiều dài đoạn phân cắt được nhân bội

A,C,G,T Adenine, Cytosine,

Guanine, Thyamine

BSA Bulked Segregant Analysis Phân tích phân ly nhóm

CAPS Cleaved Amplified

EST Expressed Sequence Tag Đoa ̣n trình tự biểu hiê ̣n (là một đoạn

trình tự ngắn của một chuỗi cDNA) GBS Genotyping by Sequencing Đánh giá kiểu gen bằng giải trình tự

H Observerd Heterogeneity Hê ̣ số di ̣ hợp

ISSR Inter-Simple Sequence

Repeat

Trình tự xen giữa các SSR

MAS Marker Assisted Selection Chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử

NBS-LRR Nucleotide binding site –

leucine rich repeat

Vị trí liên kết nucleotide tại những Vùng lặp lại giàu leucine

PIC Polymorphism Information

Content

Hệ số đa dạng gen

PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp

QTLs Quantitative trait loci Những locut tính trạng số lượng RAPD Randomly amplified

SFR Super Fine Resolution Đô ̣ phân giải cao

SSRs Simple sequence repeats Những trình tự lặp lại đơn giản

SNP Single nucleotide

polymorphisms

Đa hình một nucleotid

DANH MỤC BẢNG

TT

1.1 Một số loài hoang dại và loài trồng thuộc chi Vigna với tên

thường gọi và nguồn gốc phát sinh

6

2.1 Nguồn gốc các nguồn gen đậu xanh được đánh giá khả năng

kháng bệnh khảm vàng tại Phú Yên

44

3.4 Trình tự của các cặp mồi chống lưng được thiết kế để khuếch đại

toàn bộ ADN-A và ADN-B của MYMV thu thập từ Việt Nam

67

chiều dài hoàn chỉnh (full length)

71

3.6 Thống kê mức độ nhiễm bệnh khảm vàng của tập đoàn đậu xanh

tại Phú Yên vụ Hè 2012 và 2013

74

3.7 Danh sách các nguồn gen đậu xanh có khả năng kháng bệnh

khảm vàng được đánh giá tại Phú Yên qua 2 năm 2012 và 2013

75

3.8 Kết quả phân tích ANOVA về ổn định tính kháng của các nguồn

gen đậu xanh nghiên cứu qua các năm

77

3.9 Thời gian sinh trưởng và chiều cao cây của các nguồn gen đậu

xanh trong tập đoàn

82

3.10 Tham số thống kê và phân bố các yếu tố cấu thành năng suất và

năng suất của các nguồn gen trong tập đoàn đậu xanh

84

3.11 Danh sách các mẫu giống đậu xanh triển vọng trong tập đoàn

3.15 Mối quan hệ giữa chất lượng và các thành phần khác của các

chỉ thị DArT với 54 nguồn gen đậu xanh

3.18 Phân tích quy luật di truyền tính kháng bệnh khảm vàng của

quần thể đậu xanh F2:3 trên đồng ruộng

101

3.19 Một số đặc điểm nông sinh học chính của hai dòng đậu xanh F5

triển vọng: dòng 148 và dòng 178

105

3.21 Tổng hợp lập bản đồ di truyền đậu xanh dựa trên chỉ thị SNP 110 3.22 Các QTL quy định tính trạng kháng MYMV của quần thể

đậu xanh F2:3 lập bản đồ

113

3.23 Trình tự ADN chứa chỉ thị SNP liên kết với các vùng QTL chính 114

3.26 Danh sách các chỉ thị được lựa chọn cho việc đánh giá chỉ thị 119

DANH MỤC HÌNH

TT

hình

3.2 Định vị các vùng thu thập mẫu bệnh khảm vàng chính tại Việt

3.5 Cây phát sinh loài của begomovirus gây hại cây họ đậu xây dựng

dựa trên trình tự nucleotide đầy đủ ADN-B

70

3.6 Tỉ lệ phản ứng của các nguồn gen đậu xanh với bệnh khảm vàng

vụ Hè năm 2012 và 2013 tại Phú Yên

74

3.7 Biểu đồ nhiệt độ, lượng mưa tại Phú Yên 2010-2012 76 3.8 Độ ổn định tính kháng của các nguồn gen đậu xanh kháng bệnh

qua các năm

77

3.9 Động thái tăng triệu chứng bệnh của các nguồn gen đậu xanh

kháng bệnh so với đối chứng nhiễm bệnh

77

3.10 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR các nguồn gen kháng NM92,

NM94, VC3960-88 sử dụng cặp mồi MY-AF1/R1

78

3.11 Các giống đậu xanh kháng bệnh khảm vàng được chọn lọc

tại Tùy Hòa, Phú Yên năm 2012-2013

3.14 Phân bố kiểu hình kháng bệnh khảm vàng của quần thể F2:3 đậu xanh 98

3.16 Phân lớp kiểu hình kháng bệnh MYMV của 200 dòng và 71 dòng

quần thể đậu xanh F2:3

100

3.19 Phân ly kiểu hình tính kháng của quần thể đậu xanh tuân theo

quy luật phân phối chuẩn

104

3.22 Biểu đồ biểu diễn số lượng đoạn đọc ngắn trên mỗi mẫu thu được

từ giải trình tự

107

3.24 Bản đồ vật lý gồm 11 nhiễm sắc thể của quần thể đậu xanh

NM94xKPS2 (được lập bằng GBS)

111

3.25 Các vùng QTL chính của tính trạng kháng MYMV của quần thể

đậu xanh trên các nhiễm sắc thể và giá trí LOD của nó

114

3.26 Vị trí các vùng QTL trên bản đồ vật lý của đậu xanh bằng SMR 116

3.27 Vị trí các vùng QTL trên bản đồ vật lý của đậu xanh bằng CIM 118

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek.) là một trong những cây thực

phẩm họ đậu quan trọng ở Châu Á nói chung, khu vực Nam Á và Đông Nam

Á nói riêng trong đó có Việt Nam Đậu xanh rất giàu và cân đối protein, thời gian sinh trưởng ngắn, có khả năng chịu hạn, thích ứng rộng với môi trường Tuy nhiên, năng suất đậu xanh hiện nay còn thấp và biến động lớn giữa các quốc gia Nguyên nhân chính làm cho năng suất đậu xanh thấp là do sâu bệnh hại và thiếu giống kháng sâu bệnh

Một trong những bệnh hại nghiêm trọng nhất đến canh tác đậu xanh là

bệnh khảm vàng hay còn gọi là bệnh hoa lá đậu xanh (Mungbean yellow

mosaic virus – MYMV) Đây là bệnh phổ biến trên cây đậu xanh ở các nước

như Ấn Độ, Bangladesh, Sri Lanka và Thái Lan Bệnh không chỉ gây hại trên đậu xanh mà còn gây hại trên một số loài cây họ đậu khác như đậu xanh đen, đậu tương, đậu cowpea … Nguyên nhân gây bệnh là do một hoặc nhiều

virus thuộc chi Begomovirus (họ Geminivirus) gây ra và được lan truyền bởi vectơ truyền bệnh là bọ phấn (Bemisia tabaci Genn.) Bệnh khảm vàng đã

từng gây hại rất nghiêm trọng, làm mất 100% năng suất tại Ấn Độ và Thái Lan, gây thiệt hại kinh tế trên 300 triệu USD (Varma, 1992)

Bệnh khảm vàng do có phổ ký chủ rộng và được truyền bởi bọ phấn theo

cơ chế không bền vững nên việc kiểm soát bằng hóa học không khả thi và gây nguy hại đến môi trường Sử dụng các giống kháng bệnh được đánh giá mang lại hiệu quả tối ưu, là cách ổn định và an toàn để quản lý dịch bệnh Do vậy, nghiên cứu xác định nguồn gen kháng là công việc được quan tâm không chỉ

ở Việt Nam mà ở nhiều quốc gia khác trên thế giới và một số nguồn gen kháng bệnh khảm vàng trên đậu xanh đã được phát hiê ̣n

Với sự phát triển nhanh chóng của công nghệ chỉ thị phân tử, nhiều locut gen kháng sâu bệnh chính đã được định vị trên bản đồ bộ gen của cây đậu xanh Chỉ thị phân tử liên kết vớ i tính kháng bê ̣nh khảm vàng trên đâ ̣u xanh cũng đã được báo cáo nhưng các chỉ thị này đều liên kết xa với tính trạng Trong số các chỉ thị phân tử, SNP là chỉ thị thế hệ mới, có số lượng cao trong

bộ gen do vậy được ứng dụng tốt cho tăng mật độ chỉ thị, lập bản đồ QTL và chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử với nhiều thông tin Sự phát triển nhanh chóng của các công nghệ giải trình tự thế hệ mới đã giúp dễ dàng phát hiện các SNP trên toàn bộ hệ gen Điều này gợi mở cho việc ứng dụng chỉ thị SNP trong chọn tạo giống cây trồng nhờ chỉ thị phân tử

Tại Việt Nam, đậu xanh là cây đậu đỗ đứng thứ ba sau lạc và đậu tương Đậu xanh được trồng từ Bắc vào Nam Diện tích trồng đậu xanh của Việt Nam năm 2015 là 90.950 ha trong đó các tỉnh Bắc Trung Bộ, Nam Trung Bộ

và Tây Nguyên là vùng trồng chính với 67,8% diện tích trồng cả nước (2015) Bệnh khảm vàng trên cây đậu xanh đã được quan sát ở Việt Nam với các triệu chứng điển hình từ những năm 1980 (Phan Hữu Trinh và cs., 1986) Bệnh gây mất năng suất từ 20-70% trên các diện tích trồng Tuy nhiên, cho đến nay chưa có nghiên cứu nào xác định virus gây bệnh khảm vàng cũng như xác định gen kháng bệnh Vì thế, công tác đánh giá khả năng kháng bệnh khảm vàng của tập đoàn đậu xanh để tìm ra nguồn gen kháng bệnh, nghiên cứu xác định cơ sở di truyền tính kháng, lập bản đồ định vị gen kháng sẽ góp phần thúc đẩy công tác khai thác, sử dụng các nguồn gen kháng làm nguồn vật liệu cho chương trình chọn tạo giống đậu xanh kháng bệnh ở nước ta

Xuất phát từ yêu cầu thực tế sản xuất đậu xanh, nhằm cung cấp thêm cơ

sở khoa học và vật liệu cho công tác chọn tạo giống đậu xanh kháng bệnh,

chúng tôi đã tiến hành đề tài: "Nghiên cứu vật liệu khởi đầu phục vụ chọn tạo

giống đậu xanh kháng bệnh khảm vàng"

2 Mục tiêu của đề tài

Tìm hiểu, xác định bản chất di truyền tính kháng bệnh khảm vàng trên cây đậu xanh ở mức phân tử, giới thiệu nguồn vật liệu cho công tác chọn tạo giống đậu xanh kháng bệnh

Mục tiêu cụ thể của đề tài:

- Xác định được virus gây bệnh khảm vàng trên đậu xanh tại Việt Nam

- Xác định được di truyền tính kháng bệnh khảm vàng ở cây đậu xanh

- Xác định được các QTL kháng bệnh khảm vàng

- Giới thiệu được một số nguồn gen đậu xanh triển vọng làm vật liệu khởi đầu cho công tác chọn tạo giống đậu xanh kháng bệnh khảm vàng và năng suất cao tại Việt Nam

3 Ý nghi ̃a khoa ho ̣c và thực tiễn của đề tài

Việc xác định được nguyên nhân gây bệnh khảm vàng trên cây đậu xanh tại Việt Nam là MYMV, xác định nguồn gen kháng bệnh, đánh giá đa dạng di truyền, thiết lập bản đồ gen kháng ở giống đậu xanh làm cơ sở khoa ho ̣c cho công tác chọn tạo giống đậu xanh kháng bệnh

Xác định di truyền tính kháng bệnh và các chỉ thị SNP liên kết với gen kháng bệnh khảm vàng ở giống đậu xanh nhập nội NM94 không chỉ nhằm xác định nguồn gen kháng mà còn có ý nghĩa thực tiễn cao trong việc khai thác hiệu quả các nguồn gen kháng bê ̣nh phục vụ công tác cho ̣n ta ̣o giống đâ ̣u xanh kháng bê ̣nh

4 Những đóng góp mới của luận án

Đây là đề tài đầu tiên ở Việt Nam đã xác định được virus gây bệnh khảm vàng trên cây đậu xanh là MYMV

Đã thiết lập được bản đồ di truyền gồm 11 liên kết tương ứng với 11 nhiễm sắc thể trên bộ gen của cây đậu xanh dựa trên chỉ thị SNP bằng phương

pháp GBS

Đã xác định được vị trí các QTL kháng bệnh khảm vàng trên bản đồ di

truyền và bản đồ vật lý ở nguồn gen đâ ̣u xanh nhâ ̣p nô ̣i NM94

5 Đối tươ ̣ng và pha ̣m vi nghiên cứu

5.1 Đối tượng nghiên cứu

Bệnh khảm vàng hại đậu xanh do côn trùng môi giới truyền bệnh là bọ phấn và các đặc điểm nông sinh học của các nguồn gen đậu xanh được thu thập

ở Việt Nam và nhập nội có nguồn gốc địa lý khác nhau

5.2 Phạm vi nghiên cứu

Nghiên cứu bản chất di truyền tính kháng bệnh virus trên cây đậu xanh ở mức phân tử và đặc điểm hình thái nông học của cây đậu xanh bản địa và nhập nội Giới thiệu nguồn vật liệu cho công tác chọn tạo giống đậu xanh kháng bệnh và năng suất tại Việt Nam

Các thí nghiệm của đề tài được thực hiện ta ̣i phòng thí nghiê ̣m, hê ̣ thống nhà lưới, nhà kính của Trung tâm Tài nguyên Thực vật, Trung tâm Bệnh cây nhiệt đới, Học viện Nông nghiệp Việt Nam và Trung tâm Rau Thế giới (AVRDC, Đài Loan), HTX Nam An Nghiệp, huyện Tuy An, Phú Yên trong giai đoạn từ năm 2011 đến năm 2015

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI 1.1 CÂY ĐẬU XANH

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại của cây đậu xanh

Đậu xanh có nguồn gốc từ Ấn Độ và được thuần hóa từ 1500 năm trước công nguyên Các loài đậu xanh trồng sau đó được du nhập đến Đông Nam Á, Châu Phi, Châu Úc, Châu Mỹ và Tây Ấn Một số lượng lớn đậu xanh, cả dạng hoang dại và dạng trồng, có mặt rộng khắp trên các vùng đồng bằng của tiểu lục địa Ấn Độ Đậu xanh cũng được phát hiện ở vùng Tây Bắc dãy Himalayas, trên độ cao 1850 m so với mặt nước biển và phân bố khắp vùng nhiệt đới (Mogotsi, 2006)

Đậu xanh đã từng được phân loại là Phaseolus aureus Roxb trước khi được chuyển sang chi Vigna (Lambrides và Godwin, 2006) Chi Vigna có liên quan chặt chẽ với chi Phaseolus tạo thành một nhóm phân loại phức tạp, vì vậy được gọi là phức hệ Phaseolus-Vigna

Verdcourt (1970) đã đề xuất chi Phaseolus chỉ dành riêng cho những

loài thuộc Châu Mỹ Theo đề xuất của ông, đậu xanh và họ hàng thân thuộc

của nó đã được chuyển sang chi Vigna

Gần đây, đậu xanh được xếp vào họ Fabaceae Có hai loài đậu xanh được thuần hóa là Vigna radiata (đậu xanh) và Vigna mungo (đậu xanh đen) Verdcourt (1970) đã tách V radiata được chia thành ba nhóm phụ: V

radiata var radiata (đậu xanh trồng hiện nay), V radiata var sublobata

(dạng hoang dại) và V radiata var glabra (có thân, lá và quả nhẵn)

Một số đậu thuộc chi Vigna gần gũi với đậu xanh (Bảng 1.1 và Hình 1.1)

Bảng 1.1 Một số loài hoang dại và loài trồng thuộc chi Vigna

V glabrescens (Marechal, Mascharpa

Stainier)

Đậu xanh vỏ xám Nam Á

Hình 1.1 Quan hệ di truyền giữa các loài thuộc chi Vinga (Gupta et al, 2014)

1.1.2 Đặc điểm nông sinh học và yêu cầu sinh thái của cây đậu xanh

Đậu xanh là cây họ đậu lấy hạt làm thực phẩm quan trọng ở Châu Á trong đó có Việt Nam Đậu xanh là cây trồng hàng năm, thân thẳng đứng, chiều cao cây đạt từ 0,15 - 1,25m (Lambrides và Godwin, 2006) Lá dạng lá kép ba, các lá chét có hình elip hoặc oval Hoa mọc thành chùm từ 3 - 40 hoa, tràng hoa có màu vàng hoặc hơi xanh Quả dài, hình trụ, trên bề mặt quả có nhiều lông Mỗi quả có từ 7 - 20 hạt nhỏ, hình elip hoặc hình khối Màu sắc hạt rất đa dạng: thường có màu xanh nhưng cũng có thể có màu vàng, màu ô liu, màu nâu, màu nâu tím hoặc đen, đốm

Đậu xanh là cây sinh trưởng, phát triển nhanh, ưa ấm, có thể chín rất nhanh trong các điều kiện ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới nơi nhiệt độ tối

ưu vào khoảng từ 28 - 30°C và luôn cao hơn 15°C

Đậu xanh không yêu cầu lượng nước lớn (lượng mưa từ 600 – 1000 mm/năm) và có khả năng chịu hạn tốt, ngược lại mẫm cảm với úng (Mogotsi, 2006)

Đậu xanh dễ tính, có thể trồng ở nhiều chân đất khác nhau nhưng thích hợp nhất ở chân đất cát pha hoặc đất thịt nhẹ thoát nước tốt với pH từ 5 - 8 và cũng chịu được mặn (Mogotsi, 2006)

1.1.3 Giá trị kinh tế và giá trị sử dụng của cây đậu xanh

Đậu xanh là cây trồng có giá trị kinh tế cao Hạt đậu xanh giàu đạm và được trồng phổ biến cho mục đích sử dụng hạt khô Trong hạt đậu xanh, hàm lượng protein cao (22 - 28%), tinh bột (60 - 65%), hàm lượng chất sắt và a-xít folic cao hơn so với các cây họ đậu khác (Keatinge et al, 2011) Đậu xanh là nguồn cung cấp protein chính cho người Châu Á để giúp cân bằng dinh dưỡng cho chế độ ăn chay

Hạt đậu xanh là mặt hàng xuất khẩu có giá trị, được dùng để chế biến ra nhiều loại thực phẩm ngon, bổ, hấp dẫn như các loại bột dinh dưỡng, các loại bánh, chè, nấu xôi đỗ và một số loại đồ uống giải khát Lá non và ngọn của cây đậu xanh có thể được dùng làm rau hoặc muối dưa (Nguyễn Mạnh Chính

và cs., 2008) Giá đỗ làm từ đậu xanh được tiêu thụ trong bữa ăn hàng ngày ở nhiều quốc gia Châu Á kể cả Việt Nam

Đậu xanh còn có giá trị trong y học Theo y học cổ truyền Việt Nam, hạt đậu xanh có vị ngọt, mùi tanh, tính mát, để cả vỏ tính hàn, có công dụng giải nhiệt, giải độc rất tốt

Một số bộ phận từ cây đậu xanh cũng hữu dụng để làm thức ăn chăn nuôi Ở Việt Nam, người dân sử dụng thân cây đậu xanh già để làm thức ăn rất giàu dinh dưỡng cho gia súc (Nguyễn Mạnh Chính và cs., 2008)

Trồng cây đậu xanh còn có tác dụng cải tạo và bồi dưỡng đất Nhờ hệ rễ

đậu xanh có các nốt sần, chứa các vi khuẩn cộng sinh thuộc chi Rhizobium

nên có khả năng cố định đạm cung cấp cho cây và để lại lượng đạm đáng kể trong đất sau khi thu hoạch từ 36-70kg N/ha/năm Vì vậy, đất sau khi trồng đậu xanh sẽ trở nên tơi xốp và giàu dinh dưỡng hơn (Pha ̣m Văn Thiều, 2009) Ngoài ra, cây đậu xanh là cây trồng có thời gian sinh trưởng ngắn nên có thể tham gia vào nhều công thức canh tác (luân canh, xen canh, gối vụ), góp phần nâng cao giá trị sử dụng đất

1.1.4 Tình hình nghiên cứu, sản xuất đậu xanh trên thế giới và Việt Nam

1.1.4.1 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống đậu xanh

Công tác chọn tạo giống đậu xanh trên thế giới được tiến hành theo một

số hướng chính sau: tạo giống cho năng suất cao, tạo giống nâng cao chất lượng, tạo giống có khả năng chống chịu tốt, tạo giống có khả năng kháng sâu bệnh

AVRDC là trung tâm dẫn đầu trên thế giới về nghiên cứu đậu xanh và đã đạt được những tiến bộ đáng kể trong việc phát triển các dòng đậu xanh mới Các dòng đậu xanh tốt nhất ở đây đã được chuyển giao cho các nhà chọn giống trên khắp thế giới Con đường tạo giống đậu xanh chủ yếu là lai hữu tính và đột biến Một số giống đậu xanh siêu trội đã được phát triển cho vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Các giống này đều chín sớm và chín đồng bộ (55-

65 ngày), năng suất và khả năng chống chịu bệnh cao Các giống này bao gồm: Chainat 60 (Thái Lan), BPI Mg7 (Philippines) và Merpati (Indonesia) (Somta et al., 2009)

Tại Ấn Độ, một chương trình chọn tạo giống đậu xanh đáng chú ý được thiết lập tại Trường đại học Nông nghiệp Punjab, Ludhiana Chương trình này

đã cho ra đời rất nhiều giống đậu xanh với các mục tiêu khác nhau như: có loại hình sinh trưởng trung bình, cây khỏe mập, phát triển nhanh, chống chịu tốt với điều kiện khó khan như: chống đổ, chịu hạn… và có tiềm năng năng suất cao, ổn định, hàm lượng protein cao, ngắn ngày phục vụ sản xuất (Nair et al., 2014)

Thái Lan cũng là quốc gia gặp hái được nhiều thành công trong công tác chọn tạo giống đậu xanh Các dòng đậu xanh triển vọng từ AVRDC tiếp tục được nghiên cứu đánh giá tại Thái Lan Các giống đậu xanh có nguồn gốc từ AVRDC cho năng suất cao hơn giống địa phương 37% và kháng bệnh được đưa vào sản xuất như KPS2, Chainat 60… và đang phủ kín hầu hết diện tích trồng đậu xanh tại Thái Lan (Shanmugasundaram et al., 2010)

Tại Việt Nam, từ những năm 1980 đến nay, nước ta có thêm nhiều cơ sở nghiên cứu về đậu xanh như: Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, Học Viện Nông nghiệp Việt Nam cùng nhiều cơ sở nghiên cứu khác

Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam trong giai đoạn 2001-2005 đã tiến hành đánh giá 2.024 lượt mẫu giống đậu xanh trong đó có 150 mẫu giống địa phương Kết quả đã xác định được 9 mẫu giống đạt năng suất cao từ 1,8-2,2 tấn/ha, thời gian sinh trưởng 70-75 ngày như: đậu xanh Quảng Bạ, mỡ Hải Dương, Chianat 36, Chianat 56, Chianat 72… trong đó giống Chianat 36 và Chianat 72 có nguồn gốc từ Thái Lan có thể sử dụng trực tiếp để nghiên cứu các biện pháp kỹ thuật và mở rộng sản xuất (Trần Đình Long và cs., 2005) Trung tâm Tài nguyên Thực vật là Ngân hàng gen cây trồng Quốc gia nơi lưu giữ rất nhiều nguồn gen đậu xanh được thu thập trong cả nước và nhập nội Từ năm 2003-2005, Trung tâm đã tiến hành mô tả đánh giá 172 mẫu giống đậu xanh và chọn lọc được 3 mẫu giống có tiềm năng phục hồi có

SĐK 4461, 6492 và 6694 có thể tiến hành thí nghiệm so sánh giống và khảo nghiệm và giới thiệu ra sản xuất (Bùi Phương Mỹ Dung và cs., 2006)

Năm 2009, Cục Trồng trọt, Bộ Nông nghiệp và PTNT đã công bố 17 giống đậu xanh được công nhận từ năm 1988-2007 Trong đó có 6 giống được lai tạo và chọn lọc trong nước là V123, T135, VN99-1, VN99-3, HL33-6, HL42-8, còn lại là các giống nhập nội và đánh giá chọn lọc (Cục Trồng trọt, 2009) Giống đậu xanh mới được giới thiệu vào sản xuất gần đây nhất là ĐX11 được nhập nội từ Thái Lan (Nguyễn Văn Bộ và cs., 2009)

Nghiên cứu chọn tạo giống đậu tương, đậu xanh và biện pháp kỹ thuật trong hệ thống canh tác với cây ngô giai đoạn 2006-2008 đã chọn tạo được hai giống đậu xanh ĐXVN4 và ĐXVN5 có nhiều ưu điểm như tiềm năng năng suất cao, chống chịu sâu bệnh khá (Nguyễn Thị Thanh, 2009)

Tác giả Nguyễn Ngọc Quất và cs., (2014) đã tuyển chọn và khảo nghiệm giống đậu xanh ĐX14 ở các tỉnh phía Bắc Trong vụ Hè, giống ĐX14 có thời gian sinh trưởng 73-75 ngày, năng suất trung bình đạt 1.883-1960kg/ha và chin tập trung thuận lợi cho thu hoạch

Tạ Minh Sơn và cs., (2006) đã nghiên cứu chọn lọc thành công giống đậu xanh NTB01 Đây là giống có hạt xanh mỡ thích hợp với thị hiếu tiêu dùng trong nước cũng như xuất khẩu Sau đó, từ dòng phân ly NTB01 đã chọn lọc ra giống đậu xanh NTB02, có thời gian sinh trưởng 85-90 ngày, nhiễm nhẹ với các bệnh héo rũ, phấn trắng, đốm nâu, giống chịu hạn và chống

đổ tốt Năng suất thực thu đạt 2.200-2.500kg/ha cao hơn giống NTB01 từ 350 – 390 kg/ha (Nguyễn Trung Bình và cs., 2014)

Kết quả khảo nghiệm 12 giống đậu xanh vụ hè 2012 tại Gia Lai cho thấy: Các giống đậu xanh có thời gian sinh trưởng trung bình từ 60-64 ngày Năng suất thực thu biến động từ 820 – 1.280 kg/ha, giống đậu xanh HL251

đạt năng suất thực thu cao nhất 2.280 kg/ha vượt đối chứng (cao sản) 20,4% năng suất (Nguyễn Thị Thanh Duyên và cs., 2012)

Giống đậu xanh HLĐX10 thích hợp với điều kiện sinh thái vùng Đồng bằng sông Cửu Long có thời gian sinh trưởng 62-65 ngày Giống chín tập trung, tỷ lệ chín lần 1 đạt 75-85% năng suất, nhiễm nhẹ bệnh đốm nâu Năng suất đạt từ 1.820 – 2.200 kg/ha vượt so với đối chứng từ 23-34% (Nguyễn Văn Chương và cs., 2014)

1.1.4.2 Tình hình sản xuất đậu xanh

Đậu xanh được trồng rộng khắp thế giới với hơn 6 triệu ha mỗi năm trong đó tập trung chủ yếu ở Châu Á (chiếm 90%) Ấn Độ là nước có diện tích trồng lớn nhất thế giới với 3 triệu ha chiếm 50% diện tích trồng trên toàn thế giới, tiếp theo là Trung Quốc và Myanmar (Hình 1.2)

Hình 1.2 Diện tích đậu xanh của một

số nước trên thế giới (Nair et al, 2012)

Hình 1.3 Sản lượng đậu xanh của một

số nước trên thế giới (Nair et al, 2012)

Sản lượng đậu xanh trung bình hàng năm trên thế giới từ 3,0 - 4,0 triệu tấn (Weinberger, 2003) Ấn Độ cũng là nước có sản lượng đậu xanh lớn nhất thế giới, theo sau là Trung Quốc (chiếm 19%) (Hình 1.3) Tuy nhiên, Ấn Độ lại là nước có năng suất đậu xanh thấp nhất thế giới (dưới 400kg/ha; Hình 1.4) so với các quốc gia khác Thái Lan là nước xuất khẩu chính và sản lượng tăng

22% mỗi năm kể từ năm 1980-2000 (Lambrides và Godwin, 2006) Mặc dù được trồng ở rất nhiều nước ở Châu Phi, nhưng đậu xanh không phải là cây trồng chính ở đây (Mogotsi, 2006)

Hình 1.4 Năng suất TB của một số nước trên thế giới (Nair et al, 2012)

Ở Việt Nam, cây đậu xanh được trồng rải rác khắp nơi trong cả nước Diện tích trồng đậu xanh từ năm 2012-2015 biến động từ 88.180 – 98.200 ha với năng suất từ 1.026 – 1.098kg/ha Trong đó diện tích đậu xanh năm 2012 đạt cao nhất và sau đó có xu hướng giảm trong khi năng suất bình quân cả nước có xu hướng tăng dần và đạt năng suất cao nhất năm 2015

Đậu xanh được phát triển trên 7 vùng sinh thái trong cả nước Diện tích sản xuất đậu xanh giữa các vùng sinh thái trong năm 2015 đạt từ 4.880 – 25.120 ha trong đó có 3 vùng có diện tích sản xuất đậu xanh lớn nhất là Tây Nguyên (25.120 ha), Bắc Trung Bộ (18.470 ha), Nam Trung Bộ (18.090 ha) (Bảng 1.2)

Năng suất đậu xanh bình quân cả nước đạt khá cao nhưng có sự chệnh lệch lớn giữa các vùng sinh thái Năm 2015, năng suất đậu xanh biến động từ

861 – 1.719 kg/ha Trong đó, Đồng bằng song Cửu Long đạt năng suất cao nhất cả nước (1.719 kg/ha), tiếp đó là Đồng bằng song Hồng (1511 kg/ha) Mặc dù vùng Tây Nguyên, Bắc Trung Bộ, Duyên hải Nam Trung Bộ có diện

tích trồng đậu xanh lớn nhất cả nước nhưng lại là vùng đạt năng suất thấp Năng suất đậu xanh tại Tây Nguyên thấp nhất cả nước (861 kg/ha), Bắc Trung

Bộ (938 kg/ha), Duyên hải Nam Trung Bộ (1.169 kg/ha) (Bảng 1.2)

Bảng 1.2 Diện tích và năng suất đậu xanh ở Việt Nam

Vùng

ĐB sông Hồng 4,10 4,80 4,51 4,88 1.463 1.458 1.452 1.511 Trung du và MN

phía Bắc 9,50 8,30 7,62 7,03 1.095 1.060 1.004 1.016 Bắc Trung Bộ 20,70 20,50 18,65 18,47 865 815 965 938 Duyên hải Nam

Trung Bộ 19,00 18,80 17,55 18,09 1.132 1.160 1.172 1.169 Tây Nguyên 27,00 26,20 24,57 25,12 837 847 861 861 Đông Nam Bộ 9,60 8,60 8,00 9,61 1.083 1.081 1.190 1.237

ĐB sông Cửu

Long 8,30 6,60 7,28 7,76 1.506 1.576 1.591 1.719

Nguồn: Viện Quy hoạch Thiết kế Nông nghiệp, 2016

1.2 ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY ĐẬU XANH

1.2.1 Kích thước bộ gen cây đậu xanh

Đậu xanh là cây trồng tự thụ, có bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội 2n=2x=22

và có kích thước bộ gen nhỏ, ước tính khoảng 579 Mbp Kích thước này

tương tự như kích thước của các loài khác trong chi Vigna (Somta và

Srinives, 2007) Ngoài ra, đậu xanh còn có kích thước ADN lạp thể là 151 kbp (Tangphatsornruang et al, 2010) và kích thước ADN ti thể là 401 kbp (Alverson et al, 2011) Mới đây nhất, Kang et al (2014) đã có bước đột phá trong nghiên cứu trình tự bộ gen đậu xanh và những dấu hiệu tiến hóa trong các loài

thuộc chi Vigna bằng phương pháp de novo assembly sử dụng kỹ thuật đánh giá

kiểu gen bằng giải trình tự (GBS) Tuy nhiên, nghiên cứu về bộ gen của cây đậu xanh còn rất ít và đi sau các cây họ đậu khác

1.2.2 Các chỉ thị ADN dùng cho đánh giá đa dạng di truyền đậu xanh

Đánh giá đa dạng di truyền là vấn đề quan trọng đối với tài nguyên di truyền thực vật Các chỉ thị phân tử ADN cung cấp những công cụ hữu ích cho việc nghiên cứu đa dạng di truyền và các kỹ thuật xây dựng quần thể cho việc phân tích các chỉ thị phân tử được dùng để đánh giá đa dạng di truyền

trong chi Vigna như chỉ thi ̣ RAPD (Datta et al, 2012), chỉ thi ̣ AFLP (Tatikonda et al, 2009), chỉ thi ̣ SSR (Gupta et al, 2012), chỉ EST-SSR (Gupta

et al, 2014), chỉ thi ̣ SNP (Moe et al, 2011; Van et al, 2013), chỉ thi ̣ DArT (Diversity Arrays Technology) (Yang et al, 2006; Vu et al, 2012) …

Trong các loại chỉ thị ADN trên, chỉ thị SSR, do là chỉ thị đồng trội và có mức độ đa hình cao nên rất được ưa chuộng sử dụng trong nghiên cứu cấu trúc di truyền và mối quan hệ giữa các loài (Sangiri et al, 2008; Gupta et al, 2013) Chỉ thị DArT được coi là hữu ích ứng dụng trong chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử (Marker Assisted Selection - MAS) do chi phí thấp, hàm lượng thông tin cao và bao phủ toàn bộ bộ gen (Gupta et al, 2010, Vu et al, 2012)

1.2.3 Nghiên cứu đa dạng di truyền cây đậu xanh bằng chỉ thị phân tử

Một trong những ứng dụng của chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống cây trồng là đánh giá đa dạng di truyền Trong phân loại học, chỉ thị phân tử phản ánh được các biến dị di truyền về trình tự ở cả vùng mã hóa và không mã hóa

Sử dụng chỉ thị phân tử trong xác định khoảng cách di truyền giữa các nguồn gen đậu xanh là một trong những ứng dụng hiệu quả cho chọn giống nhờ chỉ thị phân tử Vì vậy đã có nhiều công trình nghiên cứu sử dụng chỉ thị phân tử

để đánh giá đa dạng di truyền cây đậu xanh

Nghiên cứu sử dụng 19 mồi SSR của đậu azuki trên cây đậu xanh gồm

415 nguồn gen đậu xanh trồng (V radiata var radiata), 189 nguồn gen đậu xanh hoang dại (V radiata var sublobata) và 11 nguồn gen đậu xanh bán

hoang dại từ các vùng địa lý khác nhau đã chỉ ra rằng đậu xanh có sự đa dạng

cao nhất ở Nam Á Kết quả này đã củng cố quan điểm cho rằng tiểu lục địa

Ấn Độ là trung tâm thuần hóa đậu xanh (Somta và Srinives, 2007) Kết quả cũng chỉ ra Úc và Pupua New Guinea là trung tâm đa dạng của loài đậu xanh hoang dại

Một tập đoàn hạt nhân gồm 106 nguồn gen thể hiện sự đa dạng di truyền cao nhất của đậu xanh cũng đã được thiết lập (Sangiri et al, 2008)

Đánh giá đa dạng di truyền sử dụng chỉ thị RAPD cho thấy có sự tương đồng gần trong các giống đậu xanh trồng (Lakhanpaul et al, 2000) Nghiên cứu cho thấy đậu xanh có một nền di truyền hẹp như đã được khẳng định thêm trong các nghiên cứu khác sử dụng chỉ thị RAPD và ISSR (Betal et al, 2004; Datta et al, 2012) và cả các nghiên cứu sử dụng các chỉ thị SSR và EST-SSR (Gupta et al, 2013)

Somta et al (2009) đã sử dụng 241 mồi SSR từ đậu xanh, azukibean, đậu cowpea và đậu trạch để xác định khoảng cách di truyền của 39 nguồn gen đậu xanh bố mẹ ưu tú Kết quả đã có 48 chỉ thị SSR đa hình được phát hiện Các nguồn gen bố mẹ được đánh giá có mức độ đa dạng di truyền cao Tổng cộng

175 allen được dò với ngưỡng từ 2-19 allen/1 chỉ thị với chỉ số PIC từ 0,049 đến 0,883 Các chỉ thị SSR đa hình này có thể được sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền của tập đoàn đậu xanh với số lượng lớn hơn

Wang et al (2012) cũng đã đánh giá đa dạng di truyền của 65 nguồn gen đậu xanh có nguồn gốc từ Đông và Nam Á, Mỹ và Guatemala sử dụng 15 chỉ thị SSR Kết quả đã dò được 47 allen với số allen mỗi locut ở ngưỡng từ 2-6, trung bình là 3,13 và PIC là 0,28 Các nguồn gen tác giả nghiên cứu chia thành hai nhóm chính Một nhóm gồm các nguồn gen có nguồn gốc Đông và Nam Á, nhóm còn lại có nguồn gốc Mỹ và Guatemala

Các chỉ thị SNP cũng được nhiều nhà nghiên cứu sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền trên các đối tượng cây trồng khác nhau Tuy nhiên, dữ liệu SNP cho đậu xanh hiện nay còn rất ít

Chỉ thị DArT có rất nhiều ưu điểm so với các chỉ thị phân tử khác như RFLP, RAPD, AFLP, SSR và SNP (những chỉ thị thường dùng để lập bản đồ QTL và bản đồ so sánh) Trong khi hầu hết các chỉ thị phụ thuộc vào trình tự ADN và số liệu hóa dựa trên phân tích điện di gel hoặc polyacrylamide với thông tin thấp, chi phí cao thì kỹ thuật DArT thu được thông tin cao với các máy móc thiết bị ngày càng đạt chuẩn Kỹ thuật này cho phép tạo ra một nhiều chỉ thị nhanh chóng, phân bố trên toàn bộ bộ gen với chi phí thấp (Kilian et al, 2005)

Kỹ thuật DArT được phát triển ban đầu trên lúa (Jaccoud et al, 2001) và sau đó được nghiên cứu ứng dụng cho các loài có có kích thước bộ gen lớn hơn và phức tạp hơn như lúa mạch (5.000 Mbp) (Castillo et al, 2013), yến mạch lục bội (11.000 Mbp) (Tinker et al, 2009) Gần đây DArT đã được ứng dụng thành công trên các đối tượng cây trồng khác như cây sắn (Xia et al, 2005), chuối (Risterucci et al, 2009), và cây cao lương (Mace et al, 2008) Ứng dụng thành công DArT trên cây đậu triều (Yang et al, 2006) là tiền đề cho việc ứng dụng kỹ thuật này để đánh giá đa dạng di truyền trên các cây họ đậu Vu et al (2012) đã phát triển các thư viện chỉ thị DArT cho đậu xanh và đậu tương Tác giả đã sử dụng 2 phương pháp làm giảm độ phức tạp của bộ

gen đậu xanh và đậu tương là phức hợp enzyme cắt hạn chế PstI/TaqI và

PstI/BstNI Kết quả thu được từ hai phương pháp này trong khi đối với đậu

xanh không có sự khác biệt trong việc tạo ra các dòng đa hình thì đậu tương

có sự khác biệt đáng kể

Tại Việt Nam, nghiên cứu đa dạng di truyền cây trồng bằng các chỉ thị phân tử đã được tiến hành trên nhiều đối tượng cây trồng khác nhau tuy nhiên

đánh giá đa dạng di truyền trên cây đậu xanh còn rất ít Hiện nay mới có 2 công trình công bố đánh giá đa dạng di truyền đậu xanh sử dụng mồi RAPD

và SSR của Điêu Thị Mai Hoa và cs (2005) và Nguyễn Vũ Thanh Thanh và

cs (2006)

1.2.4 Đa dạng nguồn gen cây đậu xanh

Phát triển nguồn gen đậu xanh sẽ tạo điều kiện cho công tác đánh giá và

sử dụng tốt hơn các tập đoàn nguồn gen đậu xanh ở nhiều nước trên thế giới Trung tâm Rau màu Châu Á (AVRDC) được thành lập năm 1971, là trung tâm chính trên thế giới lưu giữ, nghiên cứu cải tiến nguồn gen đậu xanh Hiện nay, AVRDC đang lưu giữ 6742 nguồn gen của 10 tập đoàn lớn nhất của nguồn gen đậu xanh trên thế giới (AVGRIS, 2014) Phần lớn nguồn gen đậu xanh lưu giữ tại đây có nguồn gốc từ Ấn Độ (2788 nguồn gen), tiếp theo là Iran (583 nguồn gen) Thái Lan cũng là nước đóng góp số lượng nguồn gen đậu xanh vào ngân hàng gen hạt ở AVRDC với 442 nguồn gen Nguồn gen đậu xanh có nguồn gốc từ Việt Nam đang được AVRDC lưu giữ là 122 nguồn (AVGRIS, 2014)

Ngoài ra, nhiều tập đoàn đậu xanh hoang dại được các nhà khoa học Úc

và Nhật Bản thu thập đã làm tăng nguồn gen đậu xanh hoang dại trên thế giới (Lawn và Rebetzke, 2006; Tomooka et al, 2006) Để sử dụng các nguồn tài nguyên đa dạng thu được từ các nguồn gen hoang dại và nguồn gen canh tác một cách hiệu quả cho nghiên cứu và tạo giống, phương pháp tạo dựng tập đoàn hạt nhân đã được ứng dụng rộng rãi (Kojima et al, 2005)

Tại Trung Quốc, công tác thu thập và đánh giá nguồn gen cây họ đậu đã được tiến hành từ cuối những năm 1970 (Cheng và Tian, 2011) Đến cuối năm

2005, đã có hơn 30.000 nguồn gen được thu thập và bảo tồn tại ngân hàng gen cây trồng quốc gia Trung Quốc trong đó có 5.211 nguồn gen đậu xanh

Tại Việt Nam, công tác thu thập, bảo tồn và đánh giá, khai thác nguồn gen cây họ đậu nói chung và cây đậu xanh nói riêng khá được chú trọng Hiện nay, Trung tâm tài nguyên thực vật đang lưu giữ 2756 nguồn gen cây họ đậu với 23 loài khác nhau, chiếm 17,5% số nguồn gen được lưu giữ (Nguyen Nien Chau et al, 2012) Trong số nguồn gen cây họ đậu đang được lưu giữ tại đây, cây đậu tương chiếm nhiều nhất với hơn 600 nguồn gen, đậu xanh đứng thứ 2 với hơn 500 nguồn gen Ngoài ra, đậu xanh cũng như các cây họ đậu khác cũng được lưu giữ là tập đoàn công tác tại các cơ quan nghiên cứu, các viện, trung tâm và các trường đại học có nội dung nghiên cứu về cây họ đậu trong cả nước, thiết lập thành một mạng lưới lưu giữ và nghiên cứu về nhóm cây này Như vậy, mặc dù cây đậu xanh có xuất xứ đa dạng, nguồn gen hoang dại phong phú nhưng các giống đang trồng đại trà trong sản xuất trên thế giới lại có nền di truyền hẹp, đã trở thành thách thức cho công tác chọn tạo và cải tiến giống đậu xanh hiện nay Vì thế nghiên cứu đa dạng di truyền cây đậu xanh sẽ giúp tìm kiếm những cặp lai bố mẹ có khoảng cách di truyền xa để cải tiến những đặc tính

về chất lượng, chống chịu mong muốn thu được ở cây đậu xanh

1.3 NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ BỆNH KHẢM VÀNG ĐẬU XANH

1.3.1 Bệnh khảm vàng hại đậu xanh và lịch sử phát hiện

Bệnh khảm vàng là một trong những bệnh gây hại nghiêm trọng trên cây đậu xanh Bệnh được quan sát thấy lần đầu tiên vào năm 1955 tại ruộng thí nghiệm của Viện nghiên cứu Nông nghiệp Ấn Độ (IARI), New Delhi, Ấn Độ (Nariani, 1960)

Không chỉ xuất hiện và gây hại ở Ấn Độ, bệnh cũng được phát hiện gây hại trên cây họ đậu tại một số quốc gia khác thuộc khu vực Nam Á và Đông Nam Á như Philippines (Benigno và Favali-Hedayat, 1977), SriLanka (Shivanathan, 1983), Thái Lan (Thongmeearkom et al, 1981), Papua New Guinea (Pearson, 1981), Bangladesh (Akanda et al, 1992), Pakistan (Saleem

et al, 1998), Myammar (Han et al, 2001) cho thấy đây là bệnh quan trọng gây hại trên đậu xanh

Hình 1.5: Phân bố bệnh khảm vàng ở Châu Á (Karthikeyan et al, 2014)

Bệnh khảm vàng xuất hiện trên đậu xanh với các triệu chứng điển hình tại Việt Nam được báo cáo từ năm 1986 (Phan Hữu Trinh và cs., 1986) Tính đến thời điểm trước nghiên cứu của đề tài, bệnh khảm vàng được quan sát thấy trên những cánh đồng trồng đậu xanh ở Việt Nam chỉ dựa vào triệu chứng bệnh, chưa có các nghiên cứu chuyên sâu về virus gây bệnh

1.3.2 Triệu chứng và tác hại do bệnh khảm vàng gây ra

Nariani (1960) là người đầu tiên báo cáo về bệnh khảm vàng hại đậu xanh và mô tả các triệu chứng một cách tỉ mỉ và đầy đủ nhất (Hình 1.6) Trên cây đậu xanh, triệu chứng đầu tiên của bệnh xuất hiện trên các lá non ở dạng các chấm hoặc đốm màu vàng mịn nằm rải rác trên bề mặt lá Lá kép kế tiếp được sinh ra trên ngọn xuất hiện các mảng màu xanh và màu vàng xen kẽ nhau không theo quy tắc Kích thước lá không bị ảnh hưởng nhiều

nhưng thỉnh thoảng cũng thấy các vùng diện tích lá màu xanh hơi nhô lên và các lá xuất hiện các nếp nhăn nhẹ và giảm kích thước Diện tích lá vùng màu vàng sẽ tăng lên ở các lá mới ra và cuối cùng một số lá ở trên ngọn cây sẽ biến vàng hoàn toàn Những cây bị bệnh thường chín muộn và ra ít hoa, ít quả Kích thước của quả bị giảm và kích thước hạt thu được từ những quả của cây bị bệnh thường nhỏ

Hình 1.6 Triệu chứng bệnh khảm vàng trên đậu xanh

Bệnh khảm vàng làm giảm năng suất đáng kể trên nhiều loài cây họ đậu Mức độ giảm năng suất trên cây họ đậu bị bệnh phụ thuộc vào thời điểm nhiễm bệnh và mức độ nghiêm trọng của triệu chứng (Varma, 1992) Giảm số quả/cây, số hạt/quả và trọng lượng hạt là các yếu tố chính gây mất năng suất Vào năm 1977, tại miềm Bắc Thái Lan đã xảy ra một đại dịch khảm vàng đậu xanh Bệnh đã gây thiệt hại gần như toàn bộ năng suất trên các cánh đồng trồng đậu xanh bị bệnh (Thongmeearkom et al, 1981)

Việc ước tính thiệt hại một cách chính xác do bệnh khảm vàng gây ra trên đồng ruộng của nông dân là rất khó khăn khi mức độ thiêt hại biến động

từ năm này sang năm khác và khác nhau từ giống này sang giống khác Tuy nhiên ước tính thiệt hại trên đậu tương, đậu xanh và đậu xanh đen là vượt qua

300 triệu USD (Varma, 1992) Bệnh khảm vàng hại đậu xanh tại Ấn Độ xuất hiện và gây hại trên diện rộng, có thể gây mất 100% năng suất cho thấy mức

độ nguy hiểm của bệnh (Manjunath et al, 2013)

Tại Việt Nam, mặc dù chưa có một nghiên cứu chính thức nào về thiệt hại do MYMV gây ra đối với đậu xanh nhưng đã có những ước đoán về thiệt hại của bệnh gây mất năng suất từ 20-70% (Phạm Văn Thiều, 2009)

1.3.3 Virus gây bệnh khảm vàng và đặc điểm cấu trúc bộ gen

Virus chính gây bệnh khảm vàng trên đậu xanh đã được xác định là

Mungbean Yellow Mosaic Virus (MYMV) Virus này thuộc chi Begomovirus,

họ Geminiviridae Các begomovirus được chia thành hai dạng với bộ gen

khác nhau là dạng có bộ gen đơn và dạng có bộ gen kép (Brown et al, 2012) MYMV là một begomovirus có bộ gen kép bao gồm hai phân tử ADN-A và ADN-B MYMV đã được giải trình tự bộ gen hoàn chỉnh lần đầu tiên tại Ấn

Độ

Cấu trúc hệ gen và các chức năng gen của begomovirus hệ gen kép

Bộ gen của MYMV, cũng như các begomovirus có bộ gen kép, gồm hai phân tử ADN-A và ADN-B hoàn toàn khác biệt nhau Hai phân tử bộ gen chia sẻ một trình tự ngắn khoảng 200 nucleotite gần như đồng nhất, được gọi

là vùng bảo thủ hay vùng chung (common region – CR) Tổ chức bộ gen của các begomovirus có bộ gen kép được trình bày tại Hình 1.7

Phân tử ADN-A điển hình có kích thước khoảng 2,8 kb và có các gen được sắp xếp theo cả hai chiều Trên phân tử ADN-A có một vùng liên gen không mã hóa (intergenic region – IR) Vùng IR chứa các yếu tố khởi động (promoter) và trình tự bảo thủ TAATATTAC nằm trong vòng nút của cấu trúc kẹp tóc và các chuỗi lặp đảo gọi là “iteron”

Phân tử ADN-A của begomovirus gồm 6 khung đọc mở (ORF) được định hướng theo cả hai chiều kim đồng hồ và mã hóa 6 protein Các protein

này chịu trách nhiệm nhân bản virus, quy định tính đặc hiệu ký chủ, lắp ghép virus và khả năng lan truyền qua vector Mặc dù các gen được đặt tên dựa trên các chức năng chúng đảm nhiệm, nhưng các chức năng có thể khác nhau

trong chi Begomovirus (Vanitharani et al, 2005)

Hình 1.7 Cấu trúc hệ gen của Begomovirus bộ gen kép (Ha, 2008)

Theo chiều kim đồng hồ có hai gen AV1 và AV2 như sau:

Gen AV1 mã hóa cho protein vỏ (CP, coat protein) của virus, quy định chức năng truyền qua vectơ, vận chuyển bộ gen virus vào và ra khỏi nhân tế bào ký chủ và vận chuyển bộ gen virus giữa các tế bào

Gen AV2 mã hóa cho protein AV, quy định khả năng gây bệnh, có liên quan đến sự vận chuyển bộ gen virus giữa các tế bào và tham gia vào sự tích

tụ và phân bố ADN của virus trong tế bào ký chủ (Sharma et al, 2011)

Ngược chiều kim đồng hồ có 4 gen AC1, AC2, AC3, AC4 như sau: Gen AC1 mã hóa protein Rep, chịu trách nhiệm nhân bản bộ gen virus (Nash et al, 2011)

Gen AC2 mã hóa protein TrAP, kích hoạt quá trình phiên mã của virus

và ức chế hệ thống phòng thủ của cây (Mubin et al, 2010)

Gen AC3 mã hóa protein tăng cường tái sinh Nó cũng kích thích sự nhân bản ADN của virus (Pasumarthy et al, 2011)

Gen AC4 mã hóa protein AC4 có chức năng chưa được rõ ràng Đối với một số virus, nó là yếu tố quyết định khả năng gây bệnh và ức chế quá trình bất hoạt gen hậu phiên mã của tế bào ký chủ (Sunitha et al, 2013)

Trong phân tử ADN-B của begomovirus bộ gen kép chứa hai khung đọc

mở sắp xếp theo chiều ngược nhau gọi là BV1 và BC1 Đây là hai gen mã hóa cho 2 protein đều liên quan đến việc di chuyển virus

Trên chiều kim đồng hồ có ORF BV1 mã hóa protein con thoi (NSP, nuclear shuttle protein) có chức năng chính là vận chuyển bộ gen virus vào và

ra khỏi nhân tế bào Trên chiều ngược kim đồng hồ có ORF BC1 mã hóa protein vận chuyển (MP, movement protein) có chức năng vận chuyển bộ gen virus giữa các tế bào ký chủ (Malik et al, 2005)

1.3.4 Con đường lây truyền bệnh

MYMV được lây truyền ngoài tự nhiên duy nhất qua vectơ truyền bệnh

bọ phấn Bemisia tabaci (Genn.) theo cách tuần hoàn (Nariani, 1960)

Bỏ đói bọ phấn trước lây nhiễm không phải yếu tố quyết định nhưng cũng làm tăng hiệu quả truyền bệnh Sau khi tiếp nhận virus, cần thời gian khoảng 3 giờ sống trong vectơ để sự lây nhiễm có thể xảy ra Để hiệu quả lây truyền bệnh đạt 100%, mật độ bọ phấn cần từ 4-10 con/cây Bọ phấn cái là vectơ truyền virus tốt hơn và cũng giữ virus được lâu hơn (10 ngày) so với bọ phấn đực (3 ngày) (Rathi và Nene, 1974)

Hình 1.8 Vectơ truyền bệnh – Bọ phấn (Bemisa tabaci)

MYMV, cũng như các begomovirus khác, không truyền qua tiếp xúc cơ học Tuy nhiên chủng virus MYMV thu được từ Thái Lan lại có thể lây truyền qua tiếp xúc cơ giới (Honda et al, 1983) và có thể truyền qua ghép (Akhtar và Haq, 2003)

1.3.5 Điều kiện sinh thái của vectơ và virus

Trong tự nhiên, bệnh được lây truyền qua bọ phấn nên môi trường sống ảnh hưởng đến quần thể vectơ và sự lan truyền MYMV là rất quan trọng

Bọ phấn sinh trưởng tốt nhất dưới điều kiện nóng và ẩm Tại các vùng cận nhiệt đới với các mùa khác biệt, bọ phấn cư trú trên các đám cây bụi với mật độ thấp trong mùa đông và những tháng mùa hè khô Ở vùng nhiệt đới,

bọ phấn xuất hiện hầu như quanh năm với mật độ quần thể phụ thuộc vào điều kiện thời tiết (Varma, 1992)

Các yếu tố môi trường cũng ảnh hưởng đến sự phát tán MYMV Trong điều kiện nóng ẩm, virus phát tán nhanh hơn (Srivastava và Prajapati, 2012; Rashid et al, 2013)

1.3.6 Phổ ký chủ của virus

Phổ ký chủ của hầu hết các chủng MYMV chỉ hạn chế trong các loài thuộc nhóm cây họ đậu như đậu xanh, đậu xanh đen, đậu cowpea, đậu lima, đậu Hà Lan, đậu triều, đậu tương, đậu ngài, ngoại trừ chủng có thể gây bệnh trên các loại cỏ thông thường không thuộc nhóm cây họ đậu (Varma, 1992) Sehrawat và Yadav (2014) đã tiến hành đánh giá đồng ruộng các loài

thuộc chi Vigna và kết quả cho thấy rằng các loại đậu xanh, đậu xanh đen, đậu

cowpea, đậu lima, đậu Hà Lan, đậu triều, đậu tương, đậu ngài đều bị nhiễm bệnh MYMV ở giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng muộn hoặc nhiễm MYMV

ở giai đoạn sinh trưởng sinh thực làm quả bị lép Tuy nhiên đậu nho nhe

(Vigna umbellata) không biểu hiện triệu chứng của bệnh khảm vàng trong

suốt quá trình sinh trưởng phát triển Như vậy loài này có thể được coi là kháng bệnh khảm vàng

Hình 1.9 Các loài thuộc chi Vigna bị bệnh khảm vàng gây ra bởi MYMV

1.3.7 Nghiên cứu nguồn kháng virus và vectơ

Đánh giá tính kháng thường được tiến hành sàng lọc trên điều kiện đồng ruộng ở những vùng có áp lực bệnh lớn xen kẽ với các hàng giống nhiễm bệnh cao Sàng lọc trong điều kiện đồng ruộng được hỗ trợ bằng sử dụng bọ phấn mang virus Nguồn gen kháng là các nguồn gen không biểu hiện triệu chứng, hoặc có các vòng chết hoại tử, hoặc có ít hơn 10% thiệt hại của khảm vàng, hoặc bị ảnh hưởng ở giai đoạn muộn

Nguồn kháng có thể là kháng virus MYMV, kháng vectơ của nó hoặc kháng cả hai (Varma, 1992) Tính kháng MYMV cũng được xác định trên

nguồn đậu xanh hoang dại Vigna radiata var sublobata là tổ tiên của đậu

xanh trồng và có các gen kháng có thể được chuyển sang cho các dạng đậu

xanh thương mại hay nguồn kháng ở các loài khác thuộc chi Vigna như nho nhe (V umbrelata) (Sehrawat và Yadav, 2014)

Lá biểu hiện các triệu chứng bệnh

Thiệt hại 100%

năng suất nếu bị bệnh từ giai đoạn cây con

1.3.8 Đánh giá nguồn gen và chọn giống đậu xanh kháng bệnh khảm vàng

Để chọn tạo giống kháng bệnh, nghiên cứu di truyền gen kháng và tìm kiếm nguồn kháng là công việc rất quan trọng Đã có nhiều báo cáo về di truyền tính kháng bệnh khảm vàng trên các loài cây trồng khác nhau Cả tính nhiễm bệnh và kháng bệnh đều có thể là tính trội Tính kháng của đậu xanh với MYMV đã được đánh giá và báo cáo Một số công trình nghiên cứu đã chỉ ra rằng di truyền tính kháng của MYMV được kiểm soát bằng đa gen Tính kháng được quy định bằng đơn gen lặn (Reddy, 2009; Sudha et al, 2013a), một gen trội (Gupta et al, 2005), hai gen lặn (Ammavasai et al, 2004; Singh et al, 2013) và các gen lặn bổ sung (Dhole và Reddy, 2012)

Cho đến nay, biện pháp sử dụng giống kháng là hướng hạn chế thiệt hại

an toàn nhất đối với bệnh khảm vàng trên đậu xanh Biện pháp này đã được

áp dụng và ghi nhận kết quả tốt và là biện pháp kinh tế nhất Tuy nhiên, khó khăn là nguồn gen kháng trên đồng ruộng còn rất hạn chế Chọn giống kháng bệnh khảm vàng đã được các nhà virus học và các nhà chọn tạo giống cây trồng tiến hành từ những năm 1970 Công tác chọn tạo giống kháng bệnh là

sự phối kết hợp của nhiều phương pháp chọn lọc, lai tạo với giống đậu xanh kháng bệnh, lai trong loài và lai khác loài với nguồn kháng MYMV cao, gây đột biến nhân tạo trên đậu xanh

Chọn lọc

Công tác đánh giá, sàng lọc nguồn gen đậu xanh kháng MYMV đã được tiến hành và tạo ra nhiều giống đậu xanh mới nhờ phương pháp chọn lọc Trong số đó có những giống kháng bệnh MYMV Từ năm 1977 đến 2003, hơn 8000 nguồn gen và các dòng lai cải tiến của đậu xanh đã được sàng lọc tính kháng các bệnh MYMV dưới các điều kiện tự nhiên và nhân tạo (Singh

et al, 2006b) Một số nguồn kháng đã được xác định và được sử dụng cho chương trình chọn tạo giống quốc gia và quốc tế Trong số các nguồn kháng

này, có cả những nguồn kháng được với nhiều bệnh như MYMV, BLS, CLS Những năm sau đó, công việc này vẫn được tiến hành và công bố các giống kháng đã được đưa ra sản xuất

Trong điều kiện tự nhiên, Shad et al (2006) đã tiến hành đánh giá 254 dòng về tính kháng MYMV Kết quả chỉ ra được một số dòng mặc dù áp lực bệnh cao nhưng vẫn chống chịu và cho năng suất tốt

Trong điều kiện lây nhiễn nhân tạo, Akhtar et al (2011) tiến hành đánh giá khả năng kháng bệnh của 162 nguồn gen đậu xanh từ 8 vùng địa lý khác nhau bằng phương pháp ghép Kết quả đánh giá thu được 100% nguồn gen có triệu chứng bệnh và phản ứng với bệnh biến động đáng kể

Thí nghiệm đánh giá bệnh khảm vàng trong điều kiện nhân tạo sử dụng phương pháp lây nhiễm nhờ vi khuẩn (agroinnoculation) cũng được Sudha et

al (2013b) tiến hành trên 79 nguồn gen đậu xanh sử dụng 2 chủng MYMV khác nhau có tên là VA 221 và VA 239 Kết quả thu được 3 nguồn gen ML

1108, KMG 189 và SP 84 biểu hiện kháng chủng VA 221, 77 nguồn gen nhiễm chủng VA 239 Chỉ có 1 nguồn gen ML 818 kháng chủng VA 239 nhưng lại nhiễm chủng VA 221

Lai tạo

Từ các dòng đậu xanh kháng MYMV có thể tiến hành lai với các giống đậu xanh nhiễm MYMV nhưng có năng suất cao, chất lượng tốt để tạo ra các giống mới vừa cho năng suất và kháng bệnh Các dòng nhiễm bệnh cao có thể được trồng xen kẽ với các dòng kiểm tra theo từ 2-3 hàng 1 hàng nhiễm cao

để làm đối chứng (F2-F4) Các dòng kháng từ trung bình đến kháng MYMV cao với các đặc điểm tính trạng quan tâm khác tốt như năng suất cao, cây thẳng đứng, ra hoa, ra quả tập trung có thể được chọn lọc cá thể từ F2/F3 Theo phương pháp này, nhiều giống đậu xanh vừa kháng bệnh, vừa có năng