Nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc trung mô màng dây rốn người thành tế bào dạng tạo xương

Nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc trung mô màng dây rốn người thành tế bào dạng tạo xương

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Đỗ Minh Trung

NGHIÊN CỨU BIỆT HÓA TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ MÀNG DÂY RỐN NGƯỜI THÀNH TẾ BÀO DẠNG TẠO XƯƠNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

HÀ NỘI – 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Đỗ Minh Trung

NGHIÊN CỨU BIỆT HÓA TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ MÀNG DÂY RỐN NGƯỜI THÀNH TẾ BÀO DẠNG TẠO XƯƠNG

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 62 42 02 01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

1 PGS.TS Lê Văn Đông

2 GS.TS Đặng Thị Thu

LỜI CAM ĐOAN

Luận án này là sản phẩm khoa học thuộc đề tài “Nghiên cứu biệt hóa tế bào

gốc màng dây rốn thành tế bào xương” mã số: 106.99.174.09 do Học viện Quân y

chủ trì Luận án cũng sử dụng một phần kết quả của đề tài “Nghiên cứu xây dựng

ngân hàng tế bào gốc dây rốn khu vực Miền Nam và ứng dụng vào điều trị bệnh ở người” mã số ĐTĐL 2007-03 do Công ty cổ phần hóa dược phẩm Mekophar chủ trì

và Học viện Quân y là đơn vị phối hợp thực hiện

Là người tham gia trực tiếp thực hiện các nội dung thuộc đề tài được trình bày trong luận án này, tôi xin cam đoan những số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án là trung thực và chưa từng được các tác giả khác công bố trong các luận văn, luận án nào và đã được chủ nhiệm đề tài cho phép sử dụng vào luận án này

Hà Nội, ngày tháng năm 2013

Nghiên cứu sinh

Đỗ Minh Trung

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới Thượng tá PGS.TS

Lê Văn Đông - Chủ nhiệm Bộ môn Độc học và Phóng xạ Quân sự, Trưởng phòng Độc chất-Tế bào, Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học viện Quân y và GS.TS Đặng Thị Thu, Nguyên Phó viện trưởng Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Protein-Tôi xin chân thành cảm ơn tới PGS.TS Tô Kim Anh Viện trưởng, PGS.TS Nguyễn Thị Xuân Sâm, Trưởng bộ môn Hóa sinh – Vi sinh - Sinh học phân tử, PGS.TS Khuất Hữu Thanh, TS Lê Quang Hòa cùng các thầy cô giáo, các cán bộ phòng Hóa sinh – Vi sinh - Sinh học phân tử, Trung tâm nghiên cứu & phát triển công nghệ sinh học - Viện Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm và Viện Đào tạo Sau đại học – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã tận tình giúp đỡ, dạy bảo và động viên tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Đại tá GS.TS Hoàng Văn Lương – Phó Giám đốc Học viện Quân y cùng các cán bộ, nhân viên Phòng Protein-Độc chất -Tế bào, Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học viện Quân y và Ngân hàng Tế bào gốc MekoStem

đã động viên, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình công tác và thực hiện nghiên cứu

Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã động viên, khích lệ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi học tập và nghiên cứu

Hà Nội, ngày tháng năm 2013

Nghiên cứu sinh

Đỗ Minh Trung

MỤC LỤC

Trang

DANH MỤC CÁC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT i

DANH MỤC BẢNG iii

DANH MỤC HÌNH iv

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 3

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI 4

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 5

1.1 Tế bào gốc và công nghệ tế bào gốc 5

1.1.1 Tình hình nghiên cứu tế bào gốc nước ngoài 5

1.1.2 Tình hình nghiên cứu tế bào gốc trong nước 6

1.1.3 Tế bào gốc 7

1.1.4 Phân loại tế bào gốc 10

1.1.5 Tế bào gốc trung mô 14

1.1.5.1 Khái niệm 14

1.1.5.2 Đặc điểm 14

1.1.5.3 Tiềm năng biệt hóa của tế bào gốc trung mô 15

1.1.5.4 Các nguồn tế bào gốc trung mô 19

1.2 Ứng dụng của tế bào gốc 21

1.3 Các bệnh về xương khớp và tế bào gốc trong điều trị các bệnh về xương khớp 22

1.4 Dây rốn, tế bào gốc từ dây rốn 27

1.4.1 Mô học, giải phẫu và chức năng 27

1.4.2 Tế bào gốc trung mô từ màng bao dây rốn 27

1.4.3 Tế bào gốc từ màng dây rốn và tiềm năng ứng dụng 28

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32

2.1 Vật liệu nghiên cứu 32

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu: 32

2.1.2 Hóa chất và Máy móc thiết bị 32

2.2 Phương pháp nghiên cứu 34

2.2.1 Phân lập tế bào gốc trung mô từ màng dây rốn người 34

2.2.1.1 Thu thập và bảo quản dây rốn 34

2.2.1.2 Phân lập tế bào gốc trung mô từ màng dây rốn người 34

2.2.1.3 Nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc trung mô màng dây rốn 35

2.2.2 Kiểm định sản phẩm tế bào gốc 35

2.2.2.1 Định danh tế bào gốc bằng dấu ấn bề mặt 35

2.2.2.2 Kiểm tra tính gốc của tế bào gốc trung mô màng dây rốn 36

2.2.3 Biệt hóa in vitro tế bào gốc trung mô theo hướng thành tế bào tạo xương 36

2.2.3.1 Khảo sát môi trường cơ bản và nồng độ chất cảm ứng biệt hóa tế bào gốc trung mô thành tế bào tạo xương 36

2.2.3.2 Kiểm tra sự tích lũy canxi của tế bào sau biệt hóa bằng nhuộm alizarin red 38

2.2.3.3 Khả năng tích tụ canxi của tế bào tạo xương biệt hóa từ tế bào gốc trung mô 38

2.2.3.4 Xác định hoạt tính của Alkaline phosphates (ALP) 38

2.2.4 Tách chiết RNA và tiến hành phản ứng RT-PCR (Reverse Trancriptase - Polymerase Chain Reaction) 39

2.2.5 Phương pháp xác định số lượng tế bào nuôi cấy 43

2.2.6 Thu hoạch và bảo quản tế bào 44

2.2.7 Phục hồi tế bào sau bảo quản lạnh sâu 44

2.2.8 Cấy ghép tế bào tạo xương biệt hóa từ tế bào gốc trung mô màng dây rốn lên chuột nhắt đã gây suy giảm miễn dịch bằng hóa chất 45

2.2.8.1 Tạo mô hình chuột nhắt suy giảm miễn dịch 45

2.2.8.2 Cấy ghép tế bào tạo xương biệt hóa từ tế bào gốc trung mô màng dây rốn trên chuột 45

2.3.9 Nhuộm hematoxylin và eosin 46

2.2.10 Phương pháp xử lý số liệu 46

2.2.11 Đạo đức trong nghiên cứu 46

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44

3.1 Phân lập và nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc trung mô từ màng dây rốn người 47

3.1.1 Thu thập mẫu dây rốn 47

3.1.2 Khảo sát thời gian nuôi cấy mô tách màng dây rốn và khả năng bám dính 47

3.1.2.1 Thời gian nuôi cấy mô 47

3.1.2.2 Kết quả nuôi cấy màng dây rốn phân lập tế bào 49

3.1.3 Khảo sát môi trường cơ bản phân lập và nuôi cấy tế bào gốc 52

3.1.4 Thời gian nuôi cấy mô phân lập tế bào gốc trung mô 54

3.1.5 Khảo sát số lần cấy chuyển mô 60

3.1.6 Khảo sát thời gian cấy chuyển, nuôi cấy tăng sinh tế bào 62

3.2 Kiểm định sản phẩm tế bào gốc 64

3.2.1 Định danh tế bào bằng dấu ấn bề mặt 64

3.2.2 Kiểm tra tính gốc của tế bào gốc trung mô màng dây rốn 67

3.3 Biệt hóa tế bào gốc trung mô màng dây rốn thành tế bào dạng tạo xương 69

3.3.1 Khảo sát môi trường cơ bản để biệt hóa tế bào gốc trung mô màng dây rốn thành tế bào dạng tạo xương 69

3.3.2 Khảo sát nồng độ chất cảm ứng biệt hóa TBG trung mô màng dây rốn thành tế bào dạng tạo xương 71

3.3.3 Thời gian biệt hóa tế bào gốc trung mô màng dây rốn thành tế bào dạng tạo xương 75

3.3.4 Xác định hoạt tính Alkaline phosphatase (ALP) 78

3.3.4 Biệt hóa tế bào 80

3.4 Một số biến đổi phân tử của tế bào gốc trung mô màng dây rốn trong quá trình biệt hóa thành tế bào dạng tạo xương 84

3.5 Kết quả bước đầu thử nghiệm cấy ghép tế bào tạo xương biệt hóa từ tế bào gốc trung mô trên động vật 89

KẾT LUẬN 93

KIẾN NGHỊ 94

TÀI LIỆU THAM KHẢO 95

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 109

PHỤ LỤC 110

DANH MỤC CÁC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT

ALP Alkaline phosphatase: phosphatase kiềm

BU Busulfan

cDNA Complementary deoxyribonucleic acid

CY Cyclophosphamide

DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium

DMEM-LG Dulbecco’s Modified Eagle Medium Low Glucose

D-PBS Dulbecco's Phosphate buffer saline

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

FBS Fetal brovine serum: Huyết thanh bào thai bê

HLA Human leukocyte antigen: Kháng nguyên bạch cầu người IBMX 3-Isobutyl-1-methylxanthin

ICM Inner Cell Mass: Khối tế bào bên trong

IMDM Iscove's Modified Dulbecco's Medium

MSC Mesenchymal Stem Cell: Tế bào gốc trung mô

RNA Ribonucleic acid

RT-PCR Reverse trancriptase Polymerase chain reaction

TBG Tế bào gốc

TBTX Tế bào tạo xương

TGF-β Transforming growth factor beta

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Ứng dụng lâm sàng của tế bào gốc trung mô trong tái tạo xương 21

Bảng 2.1: Thành phần môi trường biệt hóa được khảo sát 37

Bảng 2.2: Nồng độ chất cảm ứng biệt hóa được khảo sát 37

Bảng 2.3: Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA 39

Bảng 2.4 Trình tự các cặp mồi sử dụng để nhận biết tế bào tạo xương bằng kỹ thuật RT-PCR 40

Bảng 3.1: Kết quả khảo sát thời gian nuôi cấy mô tách màng dây rốn 48

Bảng 3.2: Nuôi cấy mô phân lập tế bào 51

Bảng 3.3: Kết quả khảo sát môi trường cơ bản để nuôi cấy phân lập tế bào 52

Bảng 3.4: Lượng canxi tích lũy trong tế bào cảm ứng biệt hóa bằng các chất cảm ứng khác nhau ở những nồng độ khác nhau 72

Bảng 3.5: Kết quả OD khả năng tích tụ canxi của tế bào biệt hóa 77

Bảng 3.6: Hoạt tính Alkaline phosphatase 79

Bảng 3.7: Xác định khả năng tích tụ canxi trong 10 mẫu tế bào biệt hóa 82

Bảng 3.8: Hoạt tính Alkaline phosphatase của tế bào xương biệt hóa từ tế bào gốc trung mô màng dây rốn 83

Bảng 3.8: Kết quả gây suy giảm miễn dịch chuột bằng Busulfan 20mg/kg và Cyclophosphamide 50mg/kg 90

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Đặc tính chưa có chức năng chuyên biệt, có thể tạo ra nhiều loại tế bào khác

nhau của tế bào gốc tạo máu 8

Hình 1.2: Các hình thức phân bào 8

Hình 1.3: Ứng dụng của công nghệ tế bào gốc 9

Hình 1.4: Phân loại tế bào gốc theo loại mô hay theo nguồn gốc 12

Hình 1.5: Sự thay đổi, biểu hiện các dấu ấn trong quá trình biệt hóa TBG trung mô thành tế bào tạo xương và tế bào mỡ 17

Hình 1.6: Tiềm năng biệt hóa của tế bào gốc trung mô từ các nguồn khác nhau 20

Hình 1.7: Ứng dụng của Tế bào gốc trung mô được thử nghiệm trên lâm sàng 22

Hình 1.8: Nguồn lấy tế bào gốc dây rốn 29

Hình 1.9: Hình ảnh phác thảo về nuôi cấy, tuyển chọn, cấy ghép tế bào gốc trung mô (MSCs: ) từ tủy xương 30

Hình 3.1: Kết quả nhuộm HE xác định cấu trúc dây rốn 47

Hình 3.2: Tách màng dây rốn và cắt thành từng mảnh nhỏ 48

Hình 3.3 Nuôi cấy màng dây rốn phân lập tế bào 50

Hình 3.4: Kết quả khảo sát các môi trường phân lập tế bào 53

Hình 3.5: Kết quả thời gian nuôi cấy mô phân lập tế bào gốc trung mô 55

Hình 3.6: Kết quả hình ảnh phân lập tế bào gốc trung mô của 10/ 15 mẫu dây rốn 58

Hình 3.7: Kết quả khảo sát số lần cấy chuyển mô phân lập tế bào 61

Hình 3.8: Kết quả nhuộm HE của các miếng mô nuôi cấy phân lập tế bào gốc trung mô qua các lần cấy chuyển 62

Hình 3.9: Nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc trung mô 63

Hình 3.10: Kết quả phân tích biểu hiện một số marker bề mặt của tế bào thu nhận được sau khi cấy chuyền 3 lần 65

Hình 3.11: Kết quả biệt hóa tế bào gốc trung mô thành tế bào mỡ 68

Hình 3.12: Hình ảnh tế bào biệt hóa sau 21 ngày nuôi cấy được nhuộm bằng alizarin red 70

Hình 3.13: Giếng nuôi cấy và tế bào được biệt hóa ở các thời gian khác nhau được nhuộm với alizarin red 76 Hình 3.14: Kết quả xác định canxi theo thời gian biệt hóa tế bào 77 Hình 3.15: Hoạt tính Alkaline phosphatase ở các thời điểm cảm ứng biệt hóa khác nhau 78 Hình 3.16: Hình ảnh tế bào biệt hóa sau 21 ngày nuôi cấy được nhuộm bằng alizarin red 80 Hình 3.17: Xác định khả năng tích tụ canxi trong 10 mẫu tế bào biệt hóa 81 Hình 3.18: Xác định hoạt tính Alkaline phosphatase trong 10 mẫu tế bào biệt hóa từ tế bào gốc trung mô màng dây rốn 83 Hình 3.19: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RNA của tế bào gốc trung mô 85 Hình 3.20: Xác định dấu ấn ß-Actin, OC, ON của 10 mẫu tế bào tạo xương biệt hóa từ tế bào gốc trung mô màng dây rốn 87 Hình 3.21: : Xác định dấu ấn ALP, COL của 10 mẫu tế bào tạo xương biệt hóa từ tế bào 88 Hình 3.22: Hình ảnh sau 1 tháng cấy ghép tế bào tạo xương trên chuột suy giảm miễn dịch 90 Hình 3.23: Nốt can xi sau khi làm tiêu bản nhuộm hematoxylin và eosin 91 Hình 3.24: Quy trình biệt hóa tế bào gốc trung mô màng dây rốn thành tế bào tạo xương 92

ĐẶT VẤN ĐỀ

Tế bào gốc (TBG) là các tế bào chưa có chức năng chuyên biệt, có khả năng biệt hoá thành nhiều loại tế bào khác nhau Vì vậy, có thể sử dụng TBG để tạo ra tế bào mới thay thế cho các tế bào bị tổn thương hoặc mất chức năng, đem lại triển vọng trong điều trị một số bệnh nan y có liên quan đến thoái hóa hoặc thiếu hụt tế bào [8,11,14,15,19, 40,77,99]

Các bệnh về xương khớp là một nhóm bệnh thường gặp và có xu hướng ngày càng tăng, gây thiệt hại lớn về kinh tế do chi phí điều trị cũng như thiệt hại do giảm sức lao động

và nghỉ việc Chỉ riêng tại Mỹ, thống kê năm 1999 cho thấy chi phí cho nhóm bệnh này chiếm tới 2,5% GDP (khoảng 225 tỷ USD) nhưng năm 2004 đã lên tới 849 tỷ USD chiếm tới 7,7% GDP Ở Việt Nam cũng đã có nhiều nghiên cứu về dịch tễ các bệnh xương khớp đã được tiến hành: tỷ lệ loãng xương ở phụ nữ trên 50 tuổi tại Hà nội là 23%

và tại thành phố Hồ Chí Minh là 17% Cùng với sự gia tăng về tuổi thọ, ngoài các bệnh loãng xương và một số bệnh khác liên quan đến bệnh xương khớp, tổn thương sụn, thoái hóa khớp và cột sống đang trở thành vấn đề quan trọng Cùng với sự phát triển không ngừng của khoa học kỹ thuật, công nghệ tế bào gốc đã mở ra một hướng mới trong điều trị các bệnh về xương khớp và đã được ứng dụng ở nhiều quốc gia trên thế giới và một số bệnh viện trong nước Các kết quả điều trị cho thấy việc điều trị bằng tế bào gốc nói chung

và các tế bào gốc trung mô nói riêng có kết quả tốt trong tái tạo xương, sụn [30, 124, 138]

Ghép TBG từ tuỷ xương tự thân đã được dùng trên lâm sàng để điều trị thành công các trường hợp gãy xương lâu liền và khớp giả [5,6,7,9,10,16] Phương pháp điều trị thường là tiêm trực tiếp các tế bào gốc từ tuỷ xương vào ổ gãy xương Khi được tiêm vào ổ

gãy xương, các TBG trung mô của tủy xương biệt hoá in vivo thành các tế bào tạo xương

(TBTX) và tái tạo lại ổ gãy xương Ngoài ra các TBG trung mô từ tuỷ xương có thể được

phân lập và biệt hoá ex vivo thành các tế bào tạo xương trước khi được ghép trở lại ổ

khuyết xương của bệnh nhân [11,13,14,16] Tuy nhiên, qui trình thu thập TBG từ tủy xương tương đối phức tạp và số lượng TBG thu được không nhiều, nhất là ở bệnh nhân gãy xương lâu liền do nguyên nhân bệnh lý của xương và tủy xương

Dây rốn trẻ sơ sinh là nguồn cung cấp TBG có nhiều ưu điểm cả về phương diện kỹ thuật cũng như đạo đức Dây rốn có nhiều loại TBG bao gồm TBG tạo máu, TBG biểu mô, TBG trung mô, TBG nội mô chứa trong máu dây rốn, trong lớp gel Wharton hay trong lớp

màng bao dây rốn TBG dây rốn được thu thập ngay khi sinh và có thể bảo quản đông lạnh hay lưu giữ trong ngân hàng như một nguồn TBG dự trữ để sử dụng bất kỳ khi nào cho chủ nhân sinh học của mẫu tế bào TBG trung mô từ dây rốn tương tự như các TBG trung mô ở tủy xương, do đó có thể sử dụng chúng như một nguồn TBG thay thế cho TBG ở tủy xương [49,50,64]

Để ứng dụng điều trị vết thương xương sớm có kết quả, các TBG cần được biệt hóa thành tế bào tạo xương trước khi được cấy ghép vào ổ gãy xương Theo cách này, các TBG

trung mô được phân lập, sau đó được tăng sinh và biệt hóa in vitro thành các tế bào khi

quan sát dưới kính hiển vi có hình dạng giống tế bào tạo xương (gọi tắt là tế bào dạng tế bào tạo xương hay tế bào dạng tạo xương) bằng cách bổ sung các yếu tố kích thích biệt hóa và tạo xương vào môi trường nuôi cấy, bao gồm các cytokine, các vitamin và canxi Đặc biệt, để điều trị các khuyết hổng xương lớn như mất đoạn xương, các tế bào tạo xương còn được nuôi trong các giá đỡ giá đỡ tế bào, tạo thành vật liệu thay thế xương (hay xương nhân tạo) Từ đây, khi cấy ghép, các tế bào tạo xương trong đoạn xương nhân tạo sẽ kết hợp với các tế bào khác từ tổ chức xương lân cận hình thành cấu trúc xương mới hàn gắn khuyết hổng xương [12,13,14]

Xuất phát từ những cơ sở lý luận và thực tiễn nêu trên chúng tôi tiến hành nghiên

cứu đề tài: “Nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc trung mô màng dây rốn người thành tế bào

dạng tạo xương” với các mục tiêu sau:

1 Thu nhận và nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc trung mô từ màng bao dây rốn người làm vật liệu để biệt hóa tế bào

2 Biệt hoá in vitro tế bào gốc trung mô màng dây rốn người theo hướng thành tế bào dạng tạo xương nhằm ứng dụng điều trị tổn thương xương

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU:

1 Nghiên cứu áp dụng qui trình phân lập và nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc trung

mô từ màng dây rốn trẻ sơ sinh

2 Nghiên cứu minh chứng kiểm định tế bào phân lập được từ màng dây rốn người theo qui trình áp dụng là tế bào gốc trung mô

3 Nghiên cứu các điều kiện thích hợp biệt hóa của tế bào gốc trung mô từ màng dây rốn người thành tế bào dạng tạo xương in vitro (môi trường cơ bản, chất cảm ứng, thời gian )

4 Nghiên cứu một số biến đổi của tế bào gốc trung mô màng dây rốn trong quá trình biệt hóa thành tế bào dạng tế bào tạo xương

5 Thử nghiệm cấy ghép tế bào dạng tạo xương thu được sau biệt hóa từ tế bào gốc trung mô màng dây rốn người lên chuột nhắt đã gây suy giảm miễn dịch bằng hóa chất

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI

Từ nguồn tế bào gốc trung mô phân lập được từ dây rốn trẻ sơ sinh đã tiến hành biệt hóa các tế bào gốc trung mô này thành tế bào dạng tạo xương rồi cấy ghép thử nghiệm tế bào được biệt hóa trên mô hình chuột suy giảm miễn dịch bằng hóa chất

Đây là công trình lần đầu được nghiên cứu một cách hệ thống về quy trình thu nhận, nuôi cấy tăng sinh và biệt hóa tế bào gốc trung mô màng dây rốn người thành tế bào dạng tạo xương tại Việt Nam, mở ra một tiềm năng mới cho lĩnh vực y học tái sinh/tái tạo

sử dụng công nghệ tế bào gốc

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1.1 Tế bào gốc và công nghệ tế bào gốc

1.1.1 Tình hình nghiên cứu tế bào gốc nước ngoài

Nghiên cứu đầu tiên về TBG được thực hiện bởi Ernest A McCulloch và James E Till vào năm 1960 Theo các tác giả này thì TBG được chia thành hai nhóm: TBG phôi và TBG ở các mô của người trưởng thành

Năm 1981, Evans và Kaufman và Martin phân lập được TBG phôi từ phối tế bào bên trong của phôi túi (blastocyst) chuột nhắt [71]

Năm 1998, James Thomson và cộng sự ở đại học Wisconsin-Madison (Mỹ) đã thu nhận dòng TBG phôi người [71]

Năm 2001, Tìm ra một số phương pháp định hướng TBG biệt hóa in vitro tạo ra

các mô có thể dùng cho ghép mô

Năm 2003, Tạo được noãn bào từ TBG phôi chuột Điều này gợi ý rằng TBG phôi

có thể có tính toàn năng, bằng thực nghiệm có thể làm một tế bào “trẻ lại”

Năm 2005, các nhà nghiên cứu ở Đại học Kingston (Anh) đã tuyên bố phát hiện

trong máu cuống rốn một liên loại TBG giống TBG phôi, chúng được thu nhận và gọi là TBG giống TBG phôi phân lập từ máu cuống rốn (CBEs - Cord-blood-derived Embryonic-like stem cells) [43] Nhóm nghiên cứu này cũng đã thành công khi thử nghiệm biệt hóa các TBG nói trên thành các tế bào có chức năng sinh lý trưởng thành

Tháng 7/2005, Phan Toàn Thắng tại Đại học Quốc gia Singapore đã phân lập được nguồn tế bào gốc mới từ dây rốn người Các tế bào gốc này có khả năng ứng dụng cao trong điều trị

Tháng 8/2006, Kazutoshi Takahashi và Shinya Yamanaka đã tạo ra các TBG vạn năng cảm ứng iPS (induced pluripotent stem cells: Tế bào gốc vạn tiềm năng cảm ứng) Tháng 10/2007, Mario Capecchi, Martin Evans và Oliver Smithies đã nhận giải thưởng Nobel y sinh học cho các thành tựu nghiên cứu về TBG phôi trên chuột tạo ra các

cá thể con biến đổi di truyền mong muốn

Tháng 2/2008, nhóm nghiên cứu của nhà khoa học Baetge, của hãng Novocell (San Diego, Mỹ) đã thành công trong việc biệt hóa tế bào gốc phôi người thành tế bào sản xuất insulin, các tế bào này đã được thử nghiệm điều trị tiểu đường trên mô hình chuột và đã có kết tốt

1.1.2 Tình hình nghiên cứu tế bào gốc trong nước

Năm 1995, Bệnh viện Huyết Học-Truyền Máu Thành phố Hồ Chí Minh lần đầu sử dụng tuỷ xương (thực chất là liệu pháp tế bào gốc tạo máu) để ghép điều trị cho 1 bệnh nhân 27 tuổi bị bệnh bạch cầu mạn dòng tuỷ (CML) [25] Tiếp đó, năm 1996 thực hiện ghép tế bào gốc máu ngoại vi tự thân để điều trị bệnh lý ác tính về máu Năm 2002 bệnh viện này tiến hành ghép tế bào gốc tạo máu từ máu cuống rốn để điều trị bệnh bạch cầu cấp dòng lympho (ALL) [25] Sau đó Viện Huyết học truyền máu Trung ương cũng bắt đầu tiến hành nghiên cứu ghép tuỷ xương để điều trị bệnh suy tuỷ, một số bệnh lý máu ác tính

Từ năm 2004, Trung tâm Huyết học và Truyền máu - Bệnh viện TW Huế cũng đã triển khai ghép tế bào gốc từ máu ngoại vi để điều trị bệnh Lơ-xe-mi cấp [17] Tại Bệnh viện Trung ương Quân đội 108, năm 2004 đã tiến hành các ca ghép tế bào máu từ máu tự thân cho các bệnh nhân ung thư máu

Năm 2007, Bệnh viện Việt Đức và Bệnh viện Trung ương Quân đội 108 tiến hành ghép tế bào gốc từ tủy xương điều trị tổn thương xương khó lành hoặc khớp giả [13,14] Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh tiến hành các nghiên cứu cơ bản về tế bào gốc, biệt hóa

tế bào gốc trung mô dây rốn [22, 23] Năm 2009, Ngân hàng tế bào gốc dây rốn đầu tiên của Việt Nam được thành lập để lưu trữ các tế bào gốc từ mẫu mô dây rốn Hiện tại ở Việt Nam đang có một số ngân hàng tế bào gốc được thành lập Đó là ngân hàng tế bào gốc MekoStem của Công ty cổ phần Mekophar; ngân hàng TBG của Viện Huyết học - Truyền máu thành phố Hồ Chí Minh

Viện bỏng quốc gia, Học viện Quân y trong nhiều năm đã nghiên cứu trị liệu tế bào trong điều trị vết thương, vết bỏng, các tấm da nuôi cấy đã được chế tạo và sử dụng trong điều trị đạt kết quả tốt Viện bỏng quốc gia hiện nay đã nuôi cấy thành công nguyên bào sợi và tế bào sừng để điều trị vết thương, vết bỏng [1] Năm 2012 cũng tại Học viện Quân

y đã phân lập thành công tế bào gốc từ màng ối người [2]

Bên cạnh các nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc tạo máu được triển khai ở các cơ sở nêu trên, các nghiên cứu tế bào gốc phôi chuột nhắt và tế bào gốc phôi gà cũng đã được tiến hành tại hai trường Đại học khoa học tự nhiên thuộc Đại học Quốc gia Hà nội và Thành phố Hồ Chí Minh

Ở nước ta, ước tính hàng năm riêng nhu cầu điều trị bệnh máu bằng ghép tế bào gốc cũng đã khoảng 300 - 500 trường hợp Nhu cầu điều trị các khuyết hổng mô và suy chức năng tế bào/cơ quan rất lớn mà triển vọng có thể áp dụng trị liệu tế bào gốc càng là con số lớn hơn Tuy nhiên, lĩnh vực này vẫn còn biểu hiện nhiều hạn chế Đó là nguồn tế

bào gốc còn hạn chế (mới chỉ dừng lại từ dây rốn, tủy xương) đặc biệt là các nghiên cứu áp dụng tế bào gốc biệt hóa thành các dòng tế bào áp dụng điều trị còn chưa đạt hiệu quả cao

Tại nước ta, vết thương khuyết hổng xương do chấn thương hoặc do các bệnh lý khác nhau là vấn đề thường gặp trên lâm sàng Hậu quả thường dẫn đến xương không liền, khớp giả và các dị tật ảnh hưởng lớn đến vận động của bệnh nhân Để điều trị các tình trạng này đã có nhiều biện pháp điều trị khác nhau được tiến hành như ngoại khoa cố định xương, ghép xương tự thân hoặc ghép xương khác gen đồng loài (xương tươi, xương đông khô), ghép xương dị loài, ghép bột xương Tuy nhiên các biện pháp này không giải quyết được triệt để và nhiều trường hợp vẫn để lại dị tật như chi ngắn chi dài Gần đây Bệnh viện Việt Đức Hà Nội và Bệnh viện Trung ương Quân đội 108 đã tiến hành đề tài sử dụng ghép tuỷ xương tự thân (trong đó có các TBG) vào vết thương xương khó liền để điều trị, trong

đó có các trường hợp khớp giả xương chày [13,14] Song song với hướng ứng dụng lâm sàng đối với các TBG tự thân, các nghiên cứu biệt hoá TBG từ tuỷ xương, từ máu dây rốn thành tế bào xương cũng đã được tiến hành tại Phòng thí nghiệm Tế bào gốc của Trường Đại học KHTN, ĐH Quốc gia Tp Hồ Chí Minh Các tác giả đã tạo ra được các tế bào tích

tụ can-xi được hiển thị bằng các phương pháp nhuộm và kiểm tra các dấu ấn đặc hiệu

1.1.3 Tế bào gốc

Tế bào gốc (TBG) là các tế bào chưa có chức năng chuyên biệt, có tiềm năng phát triển thành nhiều loại tế bào khác nhau (hình 1.1) và có khả năng tự thay mới (Self-Renewal) [2,11,12,20,21,44,50,59] Các tế bào này là các tế bào chưa biệt hóa (Unspecialized Cell) hoặc đang ở những giai đoạn khác nhau nhưng chưa kết thúc quá trình biệt hóa (tế bào vạn tiềm năng, tế bào đa tiềm năng, tế bào ít tiềm năng, tế bào đơn tiềm năng), do vậy chúng có thể đi theo nhiều hướng khác nhau để tạo thành nhiều loại tế bào khác nhau

Hình 1.1: Đặc tính chưa có chức năng chuyên biệt, có thể tạo ra nhiều loại tế bào khác

nhau của TBG tạo máu (nguồn: Terese Winslow)

Tự thay mới là khả năng của các TBG tạo ra các tế bào giống hệt chúng về mức độ biệt hóa Thông thường các tế bào phân chia theo kiểu đối xứng (Symetric): từ 1 tế bào tạo

ra 2 tế bào giống hệt nhau; các TBG là các tế bào có khả năng phân chia không đối xứng (Asymetric): từ 1 tế bào tạo ra 2 tế bào không giống nhau (hình 1.2), 1 tế bào giống hệt tế bào ban đầu về mức độ biệt hóa, tế bào còn lại đã biệt hóa hơn sẽ tiếp tục phân chia như vậy để tạo thành các tế bào, cơ quan chuyên biệt Khả năng tự thay mới và đặc tính chưa

có chức năng chuyên biệt chính là cơ sở cho những tiềm năng ứng dụng to lớn của công nghệ TBG

Hình 1.2: Các hình thức phân bào

Nghiên cứu về TBG có thể cho ta thêm những hiểu biết về quá trình biệt hóa tế bào

và sự phát triển của cơ thể người Bản chất của quá trình biệt hóa là việc tắt các gen trong

vốn gen chung Hiểu rõ về quá trình này ta có thể chủ động tác động và kiểm soát để tạo ra các tế bào như mong muốn hoặc điều trị các bệnh di truyền

Trên cơ sở các TBG chưa hoàn tất quá trình biệt hóa và khả năng tăng sinh mạnh mẽ của chúng, các nhà khoa học có thể chủ động tạo ra các tế bào giống hệt nhau và ở các giai đoạn sinh lý, bệnh lý khác nhau rất gần với thực tế lâm sàng, điều này rất có ý nghĩa trong việc nghiên cứu cơ chế tác dụng cũng như độc tính của các loại thuốc hay các chế phẩm sinh học

Có thể nói ứng dụng quan trọng và rộng lớn nhất của công nghệ TBG là trong điều trị Trên cơ sở các TBG có thể biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau, chúng ta có thể chủ động nuôi cấy TBG trong ống nghiệm sau đó biệt hóa chúng thành các tế bào như tế bào cơ, tế bào xương, tế bào thần kinh, tế bào sụn, tế bào tuyến tụy, tế bào cơ tim (hình 1.3) rồi ghép vào cơ thể người bệnh để điều trị một số bệnh như các bệnh lý tim mạch, điều trị Parkinson, tiểu đường, trong lĩnh vực thẩm mỹ hay thúc đẩy quá trình liền xương… [31,35]

Hình 1.3: Ứng dụng của công nghệ TBG [31]

1.1.4 Phân loại tế bào gốc

Hiện nay có nhiều cách phân loại TBG, tùy theo các tiêu chí khác nhau cũng như sự tiếp cận công nghệ TBG ở các góc độ khác nhau

Theo mức độ tiềm năng biệt hóa có: TBG toàn năng (các tế bào của phôi dâu), TBG vạn tiềm năng (các tế bào tách từ khối tế bào bên trong của phôi nang), TBG đa tiềm năng (các tế bào tách từ ba lá phôi…), TBG ít tiềm năng (TBG tạo máu…), tế bào đơn tiềm năng (tế bào tiền thân hồng cầu…) [3,4]

Theo cách thức tạo ra các TBG có các TBG tự nhiên và các TBG nhân tạo (các TBG tạo ra từ công nghệ chuyển nhân và các TBG tạo ra từ công nghệ gen)

- Tế bào gốc phôi (embryonic stem cell), chính xác là các tế bào gốc từ phôi, được phân lập từ phôi (bất kỳ phần nào của phôi, không giới hạn chỉ vào các tế bào của khối tế bào bên trong phôi nang), là các tế bào gốc toàn năng hoặc vạn tiềm năng Để có được các

tế bào này thường phải hủy phôi Đã có những thông báo sinh thiết phôi lấy ra một số tế bào của phôi sau đó phôi vẫn phát triển bình thường Tuy nhiên còn nhiều nghi ngại về tính

an toàn của kỹ thuật này đối với phôi được sinh thiết, đặc biệt là sinh thiết khối tế bào bên trong của phôi nang để có được các tế bào gốc phôi “kinh điển”

- Tế bào gốc thai (fetal stem cell) được phân lập từ các mô của thai sau nạo phá thai, thường là đa tiềm năng hoặc vạn tiềm năng Việc nghiên cứu và sử dụng các tế bào này có ảnh hưởng khá nặng nề về đạo đức nghiên cứu, nên thường chỉ giới hạn vào mục đích tìm hiểu quá trình phát triển phôi thai

- Tế bào gốc nhũ nhi (infant stem cell) được phân lập từ trẻ sơ sinh hoặc các phần phụ của thai như dây rốn, nhau thai, màng ối, dịch ối… Các tế bào này thường là đa tiềm năng hoặc vạn tiềm năng Tùy theo cách thu thập có thể ảnh hưởng hoặc không ảnh hưởng đến đối tượng cho tế bào Chọc dịch ối trước khi sinh hoặc chọc tĩnh mạch dây rốn trước sinh để lấy tế bào gốc của em bé có trong dịch ối hoặc trong máu dây rốn có những nguy

cơ của các kỹ thuật này là nhiễm trùng, chảy máu, sẩy thai hoặc đẻ non… Tuy nhiên, lấy máu dây rốn từ dây rốn hoặc bánh nhau sau khi đã “mẹ tròn con vuông” vừa được tế bào

có thành phần giống hệt máu tĩnh mạch của trẻ sơ sinh lại không ảnh hưởng gì đến em bé Tương tự như vậy, lấy các tế bào từ mô dây rốn và bánh nhau sau khi sinh cũng không ảnh hưởng đến sức khỏe của em bé vì các thành phần này là sản phẩm bỏ đi sau khi sinh

- Tế bào gốc trưởng thành (adult stem cell) được phân lập từ các mô của người từ trẻ em đến người già Các tế bào này rất đa dạng, từ đa tiềm năng hoặc đơn tiềm năng Kỹ thuật thu thập ít nhiều đều ảnh hưởng đến sức khỏe của người cho nhưng mức độ dao động

rất lớn Ví dụ lấy răng sữa hoặc da qui đầu của trẻ sau khi rụng hoặc cắt bỏ để tách tế bào gốc không ảnh hưởng gì đáng kể đến trẻ; lấy dịch tủy xương để có tế bào gốc tủy xương của bệnh nhân hoặc người hiến tủy xương là kỹ thuật tương đối phức tạp có hưởng nhất định đến người cho vì ngoài việc thao tác chọc hút còn phải sử dụng thêm một số thuốc tác động lên tủy xương

- Tế bào giống tế bào gốc phôi (embryonic-like stem cell) hay tế bào gốc vạn tiềm năng cảm ứng (induced pluripotent stem cell: iPS): được tạo ra bằng cách cảm ứng các tế bào đã biệt hoá của cơ thể trở lại trạng thái giống như tế bào gốc phôi hay còn gọi là tế bào gốc nhân tạo Đây là kỹ thuật chủ yếu thao tác trong phòng thí nghiệm, người cho tế bào để cảm ứng (ví dụ tế bào da) bị ảnh hưởng rất ít, có thể là sinh thiết để lấy một miếng da nhỏ

- Tế bào gốc ung thư (cancer stem cell) được phân lập từ các khối u Các tế bào gốc này được coi là nguồn gốc của khối u Trong chiến lược trị liệu miễn dịch chống ung thư,

tế bào này đang được chú ý để làm vaccine chống ung thư với hy vọng điều trị được “tận gốc” ung thư Các tế bào gốc ung thư từ khối u của chính bệnh nhân hoặc khối u cùng loại của bệnh nhân khác được dùng làm vaccine kích thích hệ thống miễn dịch của bệnh nhân chống lại các thành phần của khối u

Hình 1.4: Phân loại TBG theo loại mô hay theo nguồn gốc (theo Lee E H và Hui J H P, 2006) [85]

Theo nguồn gốc hay theo loại mô có hai nhóm lớn đó là các TBG phôi (Embryonic Stem Cell) và các TBG trưởng thành (Adult Stem Cell), trong mỗi nhóm lại được chia nhỏ hơn thành nhiều loại TBG khác [33] Đây là cách phân loại hay sử dụng và trong khuôn khổ nghiên cứu

TBG phôi là các tế bào được tách ra từ khối tế bào bên trong (Inner Cell Mass – ICM)

của nụ phôi Phôi nang này có thể là các phôi thừa của quá trình thụ tinh trong ống nghiệm (In Vitro Fertilization) hoặc được tạo ra từ công nghệ chuyển nhân (Nuclear Transfer) Trong

những điều kiện nhất định, các tế bào này có thể biệt hóa thành bất kì loại tế bào nào trong cơ thể, về tiềm năng biệt hóa thì đây chính là các tế bào vạn tiềm năng [31] Hơn nữa các tế bào này còn rất non nên có khả năng tăng sinh rất mạnh mẽ, chúng có thể nhanh chóng tạo ra một

số lượng lớn các tế bào nếu được cung cấp đầy đủ các yếu tố cần thiết, do vậy các tế bào này

có tiềm năng rất lớn trong điều trị Đây cũng là loại tế bào được quan tâm nhiều nhất không chỉ vì tiềm năng ứng dụng to lớn của chúng mà còn vì vấn đề đạo đức xung quanh việc sử dụng các tế bào này bởi lẽ để thu được các tế bào này cần phải phá hủy phôi đồng nghĩa với việc “giết người” và điều này bị nhiều tổ chức và quốc gia lên án

TBG trưởng thành là các TBG phân lập từ trẻ sơ sinh và các thành phần có liên quan như màng ối, dây rốn; hoặc từ cơ thể trưởng thành [33] Theo loại mô các TBG trưởng thành lại được phân thành TBG trung mô (Mesenchymal Stem Cell), TBG tạo máu (Hematopoietic Stem Cell), TBG của biểu bì da (Epidermal Stem Cell), TBG của tủy xương (Bone marrow Stem Cell)…

Các tế bào gốc có rất nhiều triển vọng ứng dụng trong nghiên cứu cơ bản, nghiên cứu phát triển thuốc cũng như ứng dụng vào điều trị trên lâm sàng Trong nghiên cứu phát triển thuốc thì cần có những mô hình thử thuốc (cả tác dụng lẫn độc tính) càng giống với mô hình bệnh lý và có độ lặp lại cao qua các lần thử thì càng chính xác Thí dụ, muốn khảo sát tác dụng của một thuốc mới có khả năng chữa bệnh Alzheimer thì công nghệ tế bào gốc giúp tạo ra được hàng hoạt tế bào thần kinh giống hệt nhau để làm mô hình thử thuốc sát với bệnh Alzheimer nhất

Tiềm năng ứng dụng quan trọng nhất của tế bào gốc là ứng dụng lâm sàng qua trị liệu

tế bào gốc (stem cell therapy) Từ tế bào gốc có thể tạo ra các loại tế bào mới, mô mới để bổ sung hoặc thay thế cho các tế bào và mô cơ quan bị tổn thương hay mất chức năng Cho tới nay biện pháp hữu hiệu nhất để điều trị những trường hợp này là ghép mô, cơ quan - nhưng

nhu cầu ghép mô và tạng lại cao hơn rất nhiều so với nguồn cung cấp Từ một loại tế bào gốc

có thể biệt hoá thành nhiều loại tế bào chuyên biệt để điều trị cho các bệnh có thoái hoá hoặc chấn thương mất tế bào như các bệnh Alzheimer, chấn thương tuỷ sống, đột quỵ não, nhồi máu cơ tim, tiểu đường tụy và các tổn thương mô do bệnh tiểu đường, bỏng và nhiều bệnh khác Quy trình cơ bản của trị liệu tế bào gốc bao gồm các bước sau:

ƒ Thu hoạch, phân lập tế bào gốc từ các nguồn khác nhau (phôi hoặc từ các mô dây rốn, tuỷ xương, máu ngoại vi )

ƒ Biệt hoá, tăng sinh in vitro các tế bào gốc thành số lượng lớn các tế bào tiền thân của

loại tế bào cần bổ sung thay thế

ƒ Ghép tế bào tiền thân vào các khu vực tổn thương cần sửa chữa để cho chúng hội nhập với môi trường mới và tái tạo lại cấu trúc và chức năng của mô, cơ quan

1.1.5 Tế bào gốc trung mô

1.1.5.1 Khái niệm

Tế bào gốc trung mô là tế bào gốc trưởng thành, đa tiềm năng được thu nhận từ những

mô có nguồn gốc từ trung bì như: xương, sụn, chất nền tủy xương, mô xơ cơ ở khoảng giữa hai tổ chức, cơ vân, mô mỡ [79]

1.1.5.2 Đặc điểm

TBG trung mô được Fridenshtein phân lập đầu tiên từ tủy xương vào năm 1970 với tên gọi là: “các tế bào hình thành các cụm tế bào giống như nguyên bào sợi” (Fibroblast Clony Forming Cell) [33,58,63] do chúng có thể tạo ra 1 nhóm các tế bào giống hệt nguyên bào sợi Trong các nghiên cứu sau này Caplan, Simon và Prockop thấy rằng chúng có nguồn gốc từ trung mô do vậy chúng được gọi là các TBG trung mô Các tế bào này có thể là TBG thai, TBG nhũ nhi hay TBG người trưởng thành nhưng không còn là TBG phôi, hay nói cách khác đây chính là các TBG trưởng thành

Các TBG trung mô có hình dáng đặc trưng và giống các nguyên bào sợi: đó là các tế bào hình thoi, kích thước 20µm, có nhiều nhánh bào tương, nhân lớn, trong tế bào, lưới nội bào hạt rất phát triển

1.1.5.3 Tiềm năng biệt hóa của tế bào gốc trung mô

Mỗi loại tế bào được biệt hóa biểu hiện một số lượng gen nhất định của genome và mỗi một loại tế bào được hình thành qua một kiểu biểu hiện riêng của gen được điểu hòa Vì vậy sự biệt hóa tế bào là sự chuyển đổi từ một loại tế bào này thành một loại khác và nó liên quan đến một “công tắc” đóng một số gen đang hoạt động và mở một số gen chưa hoạt động Những thay đổi này dẫn đến tế bào biến đổi theo chiều hướng phù hợp với các yếu tố kích thích và sẽ tạo thành một kiểu tế bào chuyên biệt nào đó

TBG trung mô là các tế bào có khả năng tăng sinh mạnh mẽ và có thể biệt hóa tạo thành nhiều loại tế bào khác nhau như các tế bào mỡ, tế bào xương, tế bào sụn, tế bào cơ, tế bào thần kinh [9,18, 45,68]… nói cách khác đây chính là các tế bào tiền thân trưởng thành đa tiềm năng, chúng là nguồn cung cấp tế bào để bù đắp lại sự thiếu hụt mô Trong cơ thể dưới tác dụng của các tín hiệu từ các vết thương, ổ gãy xương, ổ viêm, hay chỉ là các điều kiện vi môi trường từ một vị trí đặc biệt nào đó các tế bào này sẽ được huy động và biệt hóa thành các

tế bào chuyên biệt

Khi nuôi cấy TBG trung mô in vitro, sau 70 lần phân chia các tế bào này vẫn không

thay đổi tiềm năng biêt hóa, điều này chứng tỏ tiềm năng tăng sinh to lớn của chúng TBG

trung mô có khả năng biệt hóa trong điều kiện in vitro, biệt hóa có thể được thực hiện theo

những phương pháp như:

- Sử dụng hóa chất cảm ứng biệt hóa: Một số hormone, cytokine, vitamin, các ion Ca2+ một số hóa chất hay sử dụng trong cảm ứng biệt hóa tế bào như Dexamethason, Indomethacin, Hydrocortison, TGF-β…với một hàm lượng và tỷ lệ nhất định tùy thuộc vào mỗi một loại tế bào [45,68] Các hóa chất tác động lên tế bào làm tế bào thay đổi sự biểu hiện của gen, hoặc đóng một số gen đang hoạt động và mở một số gen chưa hoạt động Những thay đổi này dẫn đến tế bào biến đổi theo chiều hướng phù hợp với kích thích, và sẽ tạo thành một kiểu tế bào chuyên biệt nào đó Ngoài ra, các nhân tố tăng trưởng thu nhận từ các dịch mô cũng được xem là chất biệt hóa định hướng

- Biệt hóa bằng các chất nền: biệt hóa bằng các chất nền dựa vào sự tương tác giữa tế

bào và chất nền trong nuôi cấy tế bào in vitro Tế bào hoạt động nằm trong chất nền ngoại bào

ECM (Extra cellular matrix) ECM có chứa các hợp chất cao phân tử như collagen, laminin, fibronectin Ngoài vai trò làm cấu trúc như một giá thể cho các tế bào, ECM còn có vai trò sinh lý như một vi môi trường của các tế bào Mỗi mô khác nhau có thành phần ECM của

riêng nó Do đó, việc bổ sung ECM thích hợp vào nuôi cấy in vitro giúp các tế bào gốc có thể biệt hóa thành các tế bào mong muốn

- Đồng nuôi cấy với các tế bào đã biệt hóa: Khi thực hiện đồng nuôi cấy, tế bào gốc và tế bào đã biệt hóa tương tác mật thiết với nhau, dẫn đến sự truyền các tín hiệu phân tử một cách hiệu quả gây ra sự biệt hóa ở tế bào gốc

- Kích thích vật lý: xung điện, các lực cơ học và xử lý nhiệt có thể làm tế bào gốc biệt hóa Nếu làm giảm nhiệt độ các tế bào cơ tim phôi chuột sẽ làm tăng sự biểu hiện của beta-TGF, tác nhân gây biệt hóa ở một số tế bào

- Các gốc tự do và dạng oxygen hoạt động: các gốc tự do và các dạng oxygen hoạt động

là những chất truyền tin nội bào quan trọng trong quá trình biệt hóa của tế bào

- Chuyển gen: phương pháp này thường được sử dụng để điều hòa sự biệt hóa tế bào gốc phôi Đưa gen cần chuyển vào tế bào nhằm bổ sung một số gen hoạt động vào hệ gen của tế bào gốc phôi, khởi động sự biệt hóa tế bào gốc theo con đường tạo thành tế bào chuyên hóa mong muốn

— Biệt hóa thành tế bào tạo xương:

Tế bào gốc trung mô có thể biệt hóa thành tế bào thuộc trung bì, ví dụ như tế bào tạo

xương, tế bào mỡ và sụn Để biệt hóa in vitro thành tế bào tạo xương, TBG trung mô được

cảm ứng biệt hóa trong môi trường nuôi cấy có bổ sung một hỗn hợp các hóa chất như dexamethasone, acid ascorbic, ß-glycerophosphate, calcitriol trong vài tuần và được chứng minh bằng sự biểu hiện của một số gen đặc hiệu và protein của tế bào tạo xương [45,68,119,126,139]

Về hình thái và các dấu ấn trong quá trình biệt hóa thành tế bào tạo xương, TBG trung

mô về hình thái chuyển từ hình thoi, giống nguyên bào sợi sang dạng lớn hơn, hình đa diện hoặc hạt đậu, sản sinh chất nền ngoại bào, chủ yếu là collagen type I, sau đó là tạo nền khoáng hóa và tích tụ canxi trong tế bào, có thể nhận biết được bằng kỹ thuật nhuộm với alizarin red hay von kossa Có biểu hiện tăng alkaline phosphatase (ALP) và tích lũy can xi trong quá trình biệt hóa Hoạt tính của enzym ALP cũng như khả năng tích lũy can xi có thể được định lượng bằng cách xét nghiệm đo màu [126] Ở mức độ phân tử, biệt hóa TBG trung mô thành tế bào tạo xương được điều khiển bởi sự tương tác giữa các hormon khác nhau và các yếu tố phiên

mã Nhân tố phiên phã Runx-2 (Runt-related transcription factor-2) ảnh hưởng đến sự biểu hiện của gen đặc hiệu cho xương như osterix (OSX), collagen type 1 alpha-1 (Col1a1),

osteocalcin (OC) và sialoprotein của xương (BSP), bằng cách gắn vào các promotor của những gen này [53] Nói chung, Runx-2, ALP, Col1a1, yếu tố tăng trưởng chuyển dạng - beta

1 (TGF-b1), osteonectin và bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) được biết đến là dấu hiệu đầu tiên của quá trình biệt hóa thành tế bào tạo xương Dấu ấn OC và osteopontin biểu hiện cuối trong quá trình biệt hóa thành tế bào tạo xương (hình 1.5) [45,139]

Hình 1.5: Sự thay đổi, biểu hiện các dấu ấn trong quá trình biệt hóa TBG trung mô thành tế

bào tạo xương và tế bào mỡ [139]

— Biệt hóa thành tế bào sụn:

Nếu muốn tạo ra tế bào sụn in vitro từ TBG trung mô thì cần nuôi cấy chúng trong môi

trường có bổ sung Dexamethasone, Ascorbic acid (AsA), Sodium private, proline, TGF-β1, Insulin, Transferrin, Selenius acid, Bovine serum albumin, Linoleic acid

Tế bào gốc trung mô được cảm ứng biệt hóa thành tế bào sụn, trong quá trình biệt hóa có

sự thay đổi từ hình thoi, giống nguyên bào sợi sang dạng hình tròn lớn Các tế bào được bao quanh bởi chất nền ngoại bào, bao gồm một mạng lưới collagen (chủ yếu là collagen type 2)

và tổng hợp proteoglycan và glycosaminoglycans có trọng lượng phân tử cao [28,45], có thể nhận biết được bằng cách nhuộm với alcian blue, toluidine blue và Safranin O và định lượng bằng các xét nghiệm đặc hiệu Protein Sox 9 (SRY-related high-mobility group box 9) là một yếu tố phiên mã đầu của tế bào sụn và kiểm soát sự biểu hiện của các gen collagen type 2, collagen type 9, collagen type 10, collagen type 11, aggrecan và protein liên kết sụn [45,139] trong quá trình biệt hóa collagen type 10 được sử dụng để xác định giai đoạn cuối của biệt hóa

Đặc biệt trong quá trình biệt hóa TBG trung mô để tạo ra các tế bào xương dưới tác dụng của các phosphatase kiềm đặc hiệu, các nhà khoa học lại thu được các tế bào mỡ và các

tế bào sụn Hiện tượng này giống như quá trình chuyển hướng biệt hóa để tạo ra các dòng tế bào trưởng thành khác không nằm trong lộ trình biệt hóa ban đầu Đặc điểm thú vị này được gọi là tính “uyển chuyển” (Plasticity) của các TBG trung mô và điều này đã làm cho tiềm năng ứng dụng trong điều trị của chúng ngày càng được mở rộng [24]

— Biệt hóa thành tế bào mỡ:

Trong cơ thể sống, TBG trung mô có thể nhận được tín hiệu cytokine cho biệt hóa tế

bào[112] Nhưng ở in vitro không thể nhận được tín hiệu đó từ các tế bào khác Vì vậy, cần

thiết có các yếu tố cảm ứng nhất định bổ sung vào môi trường nuôi cấy để biệt hóa thành tế

bào tạo mỡ Để biệt hóa in vitro thành tế bào mỡ của TBG trung mô, một số yếu tố cảm ứng

được hay được sử dụng đó là dexamethasone, indomethacin, 3-Isobutyl-1-methylxanthin - IBMX và insulin [17,26,113,133] Dexamethasone là một glucocorticoid tổng hợp có tác dụng như một chất kích thích mạnh trong quá trình biệt hóa các tế bào gốc trung mô Indomethacin là một loại thuốc kháng viêm không steroid có thể cảm ứng biệt hóa bằng cách kích hoạt PPARg (peroxisome proliferator-activated receptor gamma) IBMX tăng cường sự biểu hiện của PPARc2, LPL và điều chỉnh giảm sự biểu hiện các gen tạo xương như Runx-2

và osteopontin bằng cách kích hoạt protein kinase [45,68,105,126] Insulin tạo mỡ bằng cách gắn với IGF-1 như là sự biểu hiện của tiền tế bào tạo mỡ [140]

Trong quá trình biệt hóa TBG trung mô tành tế bào mỡ, TBG trung mô có thay đổi hình dạng tế bào, từ hình dạng hình thoi, giống nguyên bào sợi thành dạng hình cầu, có hiện chất nền ngoại bào như fibronectin, laminin, và collagen type 1, 3, 4, 5 và 6 Ban đầu là sự phát triển mạng lưới của fibronectin, sau là sự hình thành mạng lưới collagen [45] Cuối cùng của quá trình biệt hóa TBG trung mô thành tế bào mỡ là các tế bào có tích tụ các giọt mỡ, có thể nhận biết được thông qua quan sát trong quá trình biệt hóa hoặc được nhuộm Oil Red màu

đỏ Phân tích định lượng có thể được thực hiện bằng cách nhuộm tế bào với Oil Red mầu đỏ

và chiết xuất các thuốc nhuộm từ các tế bào với isopropanol hoặc xác định sự hoạt động của glycerol-3-phosphate dehydrogenase (GPDH) Các PPARc2 (peroxisome proliferation-activated receptor c2) đặc hiệu cho tế bào mỡ thuộc họ PPARs, cùng với C/EBP (CCAAT-enhancer-binding proteins), là một trong những yếu tố phiên mã điều hòa biểu hiện của gen chịu trách nhiệm cho cảm ứng và tiến triển của quá trình tạo mỡ Lipoprotein lipase (LPL) và chuỗi 2 của collagen type 6 được biết đến là dấu hiệu đầu tiên của quá trình biệt hóa tế bào

mỡ, trong khi leptin, FABP4/aP2 (fatty acid-binding protein-4) và adiponectin được biểu hiện trong giai đoạn cuối của quá trình biệt hóa [45,105,140]

1.1.5.4 Các nguồn tế bào gốc trung mô

Tế bào gốc trung mô có mặt trong nhiều mô khác nhau của cơ thể người Đầu tiên tủy xương được coi là nguồn TBG trung mô cơ bản, tuy nhiên những nghiên cứu sau này càng chỉ

ra nhiều nguồn tách TBG trung mô với số lượng lớn hơn tủy xương nhiều lần như màng nhau, màng dây rốn, màng ối, máu ngoại vi, máu cuống rốn, mô mỡ, gan [7]…trong đó màng bao dây rốn là một nguồn cung cấp TBG trung mô rất lý tưởng

Hình 1.6: Tiềm năng biệt hóa của tế bào gốc trung mô từ các nguồn khác nhau [139]

(MSC có thể thu thập được từ cơ xương, tủy xương, dây chằng, mô mỡ, nhau thai, dây rốn

và máu dây rốn TBG trung mô có tiềm năng biệt hóa thành tế bào có nguồn gốc trung mô như các tế bào mỡ, nguyên bào xương, sụn, các tế bào thần kinh từ lớp ngoại bì,

các tế bào gan và tế bào tụy)

TBG trung mô có nguồn gốc khác nhau cũng có các đặc tính tương tự nhau Tuy nhiên, một số công trình nghiên cứu đã công bố cho rằng TBG trung mô có nguồn gốc khác nhau thì

có một số khác biệt như khả năng tăng sinh, biểu hiện dấu hiệu bề mặt, tính đa tiềm năng và một số dấu hiệu cụ thể khác Những đặc điểm này có thể được sử dụng trong việc tìm các nguồn TBG trung mô tốt hơn có chất lượng để ứng dụng trong lĩnh vực y học tái tạo [117, 118] Trong các nguồn cung cấp TBG trung mô, nguồn thu thập từ các mô ở trẻ sơ sinh có nhiều ưu điểm đáng kể như tránh được thủ thuật xâm lấn mà thường đi kèm với nguy cơ nhiễm trùng so với các nguồn TBG trung mô từ các mô trưởng thành [139], TBG trung mô từ dây rốn có khả năng tăng sinh mạnh và có khả năng cấy ghép tốt hơn so với TBG trung mô từ

tủy xương [119, 120] Mặt khác, tỷ lệ thành công phân lập TBG trung mô từ máu dây rốn có thể đạt được hiệu suất 63% so với những nguồn TBG từ tủy xương và mô mỡ TBG trung mô

từ máu dây rốn cũng có tiềm năng biệt hóa thành tế bào mỡ [121, 122] TBG trung mô có nguồn gốc từ sụn bộc lộ cao hydrogen peroxide – yếu tố gây ra chết tế bào theo chương trình (apoptosis) và TBG từ mô mỡ có tỷ lệ tăng sinh cao và khi thiếu huyết thanh - gây ra chết tế bào theo chương trình [123] Thời gian nhân đôi của quần thể TBG trung mô từ mô mỡ bằng 3/4 của TBG trung mô từ tủy xương Thời gian nhân đôi TBG trung mô của mô mỡ có nguồn gốc từ các vùng khác nhau thì cũng khác nhau [124, 127] Ví dụ, TBG trung mô của mô mỡ có nguồn gốc từ các vùng nối (omental) khả năng tăng sinh chậm hơn so với TBG trung mô từ vùng dưới da [127] So với TBG trung mô từ các mô trưởng thành, TBG trung mô ở trẻ sơ sinh có khả năng ức chế miễn dịch mạnh mẽ hơn và tính sinh miễn dịch thấp hơn Vì vậy, đây như là một nguồn cung cấp tế bào rất hợp lý cho các ứng dụng điều trị [83,114,117,128,133]

1.2 Ứng dụng của tế bào gốc

Trên lâm sàng, tế bào gốc trưởng thành đã được sử dụng trong điều trị các bệnh tự miễn, tai biến mạch máu não, suy giảm miễn dịch, thiếu máu, nhiễm virus Ebstein-barr, tổn thương giác mạc, các bệnh máu, bệnh gan, tạo xương không hoàn chỉnh, tổn thương tủy sống, liền vết thương da, điều trị ung thư kết hợp với hóa chất và tia xạ (u não, u nguyên bào võng mạc, ung thư buồng trứng, các khối u đặc, ung thư tinh hoàn, đa u tủy, lơ-xê-mi, ung thư vú, u nguyên bào thần kinh, u lympho Non-Hodgkin, carcinoma tế bào thận) tái tạo cơ tim sau nhồi máu cơ tim, tiểu đường type I, tổn thương xương và sụn, bệnh Parkinson

Trong các loại TBG, tế bào gốc trung mô là một trong loại tế bào có thể phân lập, tăng sinh với một số lượng lớn và được sử dụng nhiều trên lâm sàng trong nhiều thập kỷ qua và như một mô hình điều trị mới cho một loạt các các bệnh Hiện nay, thử nghiệm lâm sàng dựa trên TBG trung mô đã được thực hiện ít nhất trên 12 loại bệnh lý khác nhau, với nhiều thử nghiệm đã hoàn thành và chứng minh được tính an toàn và hiệu quả Ứng dụng lâm sàng của TBG trung mô dựa trên những thuộc tính sinh học quan trọng đó là có khả năng biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau, tiết ra nhiều phân tử có hoạt tính sinh học có khả năng phục hồi kích thích các tế bào bị tổn thương và ức chế viêm và để thực hiện chức năng điều hòa miễn dịch

Các thử nghiệm lâm sàng đầu tiên sử dụng nuôi cấy tăng sinh TBG trung mô được công bố vào năm 1995 và 15 bệnh nhân được điều trị bằng tế bào tự thân [103] Từ thử

nghiệm này, một số thử nghiệm lâm sàng khác đã được tiến hành để kiểm tra tính khả thi và hiệu quả của liệu pháp ghép bằng TBG trung mô Ngày 12/12/2011, Cơ sở dữ liệu về thử nghiệm lâm sàng đã được thành lập (http://clinicaltrials.gov) cho thấy dữ liệu về 206 ca thử nghiệm lâm sàng có sử dụng TBG trung mô với phạm vi rất rộng cho các ứng dụng điều trị khác nhau (Hình 1.6 B) Hầu hết những thử nghiệm này trong giai đoạn I (nghiên cứu an toàn), pha II (Đánh giá về hiệu quả ở bệnh nhân), hoặc phối hợp các nghiên cứu giữa Pha I/II Chỉ có một số ít những thử nghiệm này trong pha III (so sánh phương pháp điều trị mới với các phương pháp điều trị tiêu chuẩn hoặc đã được biết đến) hoặc pha II / III (Hình 1.6 A) Nói chung, TBG trung mô được được dung nạp tốt, với hầu hết các thử nghiệm đã được công bố các tác dụng phụ ở mức độ trung bình, mặc dù một số cho thấy mức độ nhẹ và thoáng qua [124] Ngoài ra, nhiều thử nghiệm lâm sàng hoàn thành đã chứng minh hiệu quả của TBG trung mô trong điều trị bệnh thiếu máu cục bộ cơ tim cấp tính (Acute Myocardial Ischemia - AMI), đột quỵ, xơ gan, xơ cứng teo cơ (Amyotrophic Lateral Sclerosis - ALS) và tế bào ghép

chống lại túc chủ (graft-versus-host-disease – GVHD)

Hình 1.7: Ứng dụng của Tế bào gốc trung mô được thử nghiệm trên lâm sàng

A: phân loại theo pha; B: các loại bệnh [124]

1.3 Các bệnh về xương khớp và tế bào gốc trong điều trị các bệnh về xương khớp

Các bệnh về xương khớp là một nhóm bệnh thường gặp nhất trong mọi nhóm bệnh và

có xu hướng ngày càng tăng Là nhóm bệnh gây thiệt hại lớn về kinh tế, chỉ riêng tại Mỹ, năm

1999 chi phí cho nhóm bệnh này đẩ chiếm tới 2,5% tổng sản phẩm quốc nội (Gross Domestic Product - GDP), khoảng 225 tỷ USD (GDP của Mỹ năm 1999 khoảng 9.000 tỷ USD), trong đó: Chi phí cho bệnh loãng xương là 18 tỷ USD (năm 2001), con số này đã là 20 tỷ USD Chi phí cho bênh thoái hoá khớp khoảng 12 tỷ USD Chi phí cho bệnh viêm khớp dạng thấp là 10

tỷ USD Năm 2004 lên tới 849 tỷ USD chiếm tới 7,7% tổng sản phẩm quốc nội (GDP) của Mỹ Về mặt xã hội bệnh này gây đau đớn kéo dài cho hàng trăm triệu người, gây tàn phế cho nhiều triệu người và gắn liền với nghỉ việc, giảm năng suất lao động, hạn chế các hoạt động hàng ngày và làm giảm chất lượng cuộc sống

Nhiều nghiên cứu về dịch tễ đã được tiến hành ở nước ta: điều tra dịch tế vê bệnh loãng xương đã cho thấy tỷ lệ loãng xương ở phụ nữ trên 50 tuổi tại Hà nội là 23% và tại thành phố Hồ Chí Minh là 17% Cùng với sự gia tăng về tuổi thọ, ngoài các bệnh loãng xương

và một số bệnh khác liên quan đến bệnh xương khớp, tổn thương sụn, thoái hóa khớp và cột sống đang trở thành vấn đề quan trọng Theo thống kê năm 2002, tỷ lệ thoái hóa khớp ở Miền Bắc là 8,8% dân số, đặc biệt những người trên 40 tuổi Để điều trị các bệnh về xương khớp nói chung và các bệnh về thoái hóa khớp nói riêng hiện nay: ở mức độ nhẹ và trung bình, phương pháp điều trị nội khoa bao gồm phương pháp vật lý trị liệu hoặc kết hợp với thuốc giảm đau, kháng viêm Tuy nhiên, cùng với sự tiến triển của bệnh một số phương pháp điều trị bảo tồn khác như tiêm steroid là thuốc chống viêm hay acid hyaluronic Mặc dù có triệu chứng giảm đau tạm thời, cải thiện, có hiệu quả trong các trường hợp thoái hóa khớp gối, vai và các khớp khác, nhưng phương pháp này không giải quyết được tận gốc của bệnh và vẫn còn nhiều tranh luận quanh hiệu quả của phương pháp này Một số trường hợp tiến triển hay trường hợp bị nặng, phương pháp thay khớp là phương pháp điều trị duy nhất hiện nay Cùng với sự phát triển không ngừng của khoa học kỹ thuật, đặc biệt là sự phát triển của công nghệ tế bào gốc đã

mở ra một hướng mới trong điều trị các bệnh về xương khớp, đã được ứng dụng ở nhiều quốc gia trên thế giới và một số bệnh viện trong nước Các kết quả điều trị cho thấy việc điều trị bằng tế bào gốc nói chung và các tế bào gốc trung mô nói riêng có kết quả tốt trong tái tạo sụn khớp

TBG trung mô có tiềm năng tái tạo lại các mô bị tổn thương và cũng tiết ra các yếu tố tăng trưởng để tăng cường tái tạo mô Tùy thuộc vào bệnh lý cụ thể sẽ đưa ra phương pháp điều trị bằng TBG cũng khác nhau

Các phương pháp trong y học tái tạo đã được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi để cải thiện và chữa các bệnh về xương khớp Gãy xương và thay khớp giả là bệnh lý phổ biến Tuy nhiên, trong những điều kiện và khả năng cung cấp xương hay thu hoạch xương tự thân cũng rất hạn chế, đồng thời đi kèm bệnh tật, liên quan đến cấy ghép dị loài có nguy cơ bị thải loại Chính vì vậy hiện nay TBG trung mô dường như là ứng cử viên có triển vọng nhất để tái tạo, sửa chữa các bệnh về xương do tiềm năng biệt hóa thành tế bào tạo xương của TBG trung mô [116] Lý do chính cho việc sử dụng TBG trung mô trong tái tạo và sửa chữa xương là dựa trên khả năng trực tiếp tạo ra các nguyên bào xương (osteoprogenitor cells) Các bằng chứng cho thấy rằng tác động trên lâm sàng về tiềm năng của TBG trung mô không chỉ trực tiếp biệt hóa thành tế bào tạo xương, mà còn gián tiếp trong việc tiết ra các yếu tố ảnh hưởng bởi việc sản xuất các cytokine tham gia trong quá trình tạo xương như bFGF, VEGF, PDGF và TGF-β [129]

Ngoài việc sử dụng TBG trung mô trên lâm sàng trong điều trị gãy xương hoặc tiêm trực tiếp vào các mô xung quanh như các bệnh về xương đã được thực hiện như điều trị đối với bệnh nhân xương không liền bằng TBG tủy xương [130] Bên cạnh đó kỹ thuật mô về xương cũng hay sử dụng các vật liệu vô cơ trong tạo cấu trúc 3 chiều của giàn giáo (scaffold)

có ảnh hưởng đến khả năng tăng sinh và biệt hóa tế bào như hydroxyapatite, calcium phosphate, calcium carbonate Ngoài các vật liệu trên các vật liệu sinh học được sử dụng làm giàn giáo có nguồn gốc tự nhiên như collagen, fibrin, agarose, alginate, gelatin, tơ tằm, hyaluronic axit hoặc vật liệu được tổng hợp như polyglycolides, polylactides Giàn giáo phải được đánh giá cao với các lỗ xốp liên kết với nhau có đường kính ít nhất là 100 mm cho phép

tế bào tăng trưởng và tạo mạch (vessels) và kích thước lỗ từ 100 đến 400 mm là lý tưởng Một

số nghiên cứu công bố về việc sử dụng giàn giáo kết hợp TBG trung mô tự thân cấy chuyển trên giàn giáo trước khi cấy ghép xương cũng đã được sử dụng để điều trị gãy xương lâu liền [131,132] Mặc dù kết hợp của yếu tố tăng trưởng và giàn giáo có nhiều ưu điểm nhưng hiện nay vẫn còn là một cách tiếp cận đầy hứa hẹn TBG trung mô biến đổi về gen biểu hiện các yếu tố tăng trưởng hoặc các yếu tố phiên mã bằng chuyển các yếu tố này và biểu hiện trong TBG trung mô thông qua vector virus hoặc vector không phải virus là một trong những hướng nghiên cứu mới Sử dụng vector virus trong chuyển gen và cho hiệu quả biểu hiện cao các yếu

tố tạo xương BMP-2 đã được chuyển vào TBG trung mô là yếu tố cảm ứng hình thành xương

đã được thử nghiệm điều trị các khuyết tật về xương trên chuột Trong một nghiên cứu khác

TBG từ tủy xương đã được thay đổi gen BMP4 sử dụng để sửa chữa các khuyết tật trong xương trên thỏ [132, 133] Tuy nhiên, cho đến nay chưa có nghiên cứu thử nghiệm trên lâm

sàng sử dụng ex vivo TBG trung mô biến đổi gen bởi vì sự cần thiết cần phải xác định đảm

bảo an toàn và phù hợp trước khi điều trị

Bảng 1.1: Ứng dụng lâm sàng của tế bào gốc trung mô trong tái tạo xương [30]

Tác giả Chẩn đoán Ứng dụng bệnh

nhân (n)

1993

Xương dài khó lành

Tiêm tủy xương tự thân qua da 20

17/20 trường hợp liền trong 5 tháng

Kettunen et al

2002

Xương chày chậm hoặc không liền

Tiêm tủy xương tự thân qua da 41

Có hiệu quả đối với các kỹ thuật mở Hernigou et al

số lượng mô sẹo Goel et al

2005

Xương chày không liền

Tiêm tủy xương tự thân qua da 20

15 trong số 20 ca cho thấy xương liền

Điều trị hoại tử xương

Hernigou and

Beaujean

2002

Hoại tử chỏm xương đùi

Tiêm tập trung tủy xương tự thân

116 (189 hông)

Kết quả rất tốt trong giai đoạn đầu tiêm của

số lượng lớn các tế bào tiền thân cấy ghép có kết quả tốt hơn

Gangji et al

2004

Hoại tử chỏm xương đùi

Tiêm tập trung tủy xương tự thân

13 (18 hông)

Giảm đau đáng kể, tiến triển và cải thiện chức năng

Hernigou et al

2009

Hoại tử chỏm xương đùi

Tiêm tập trung tủy xương tự thân

342 (534 hông)

Số lượng lớn các tế bào tiền thân là yếu tố

dự báo cho kết quả thành công

Tăng cường liền cột sống (Enhancing spinal fusions)

Neen et al

2006

Liền cột sống Tủy xương tự thân

trên collagen I - tổng hợp

hydroxyapatite-50

Khả năng chữa bệnh tương tự ghép xương xốp tự thân xương Gan et al

2008

Liền cột sống Tủy xương tập trung

Sau 34,5 tháng 95,1% trường hợp cho thấy

Tiêm nội soi tủy xương tự thân 71

Kết quả kém hơn so với tiêm methylprednisolone

Park et al

2008

U nang xương đơn giản

Cấy ghép tủy xương

tự thân kết hợp với ghép xương đồng loài hoặc bột xương

20 (23 nang)

Tiêm hỗn hợp tủy xương xương và bột bột xương là một giải pháp hiệu quả để mở

ra hướng điều trị Zamzam et al

2009

U nang xương đơn giản

Tiêm tủy xương tự thân qua da 28

Điều trị an toàn và hiệu quả

Làm đầy các khuyết tật xương

Salama and

Weissman

1978

Khuyết tật về xương khác nhau

Ghép khác loài với tủy xương 28

Kết quả đã được "hài lòng nhất"

J¨ager et al

2009

Thiếu hụt xương

Vùng tủy xương tự thân/ tiêm TBG trung mô

10

Có thể là một lựa chọn đầy hứa hẹn để ghép xương tự thân

Marcacci et al

2007

Mất xương lớn

TBG trung mô tự thân được tăng sinh

Ứng dụng khác

Hendrich et al

2009

Rối loạn lành xương khác nhau

Tập trung tủy xương

Ứng dụng tăng sinh

TBG trung mô in vitro với PRP

28 (51 mở xương)

Không tăng cường làm lành xương bằng MSC/PRP

Trong hai thập kỷ qua, Các phương pháp nghiên cứu và ứng dụng trong lĩnh vực Y học

tái tạo đã được triển khai rộng rãi để cải thiện chữa các bệnh về xương khớ hoặc thậm chí tạo

ra các mô xương chức năng để thay thế xương bị mất Rất nhiều nghiên cứu in vitro đã được

thực hiện với nhiều loại tế bào gốc khác nhau để tái tạo xương Tiềm năng lớn đầy hứa hẹn là

khả năng biệt hóa của TBG thành tế bào xương để tăng cường khả năng chữa bệnh về xương

Các nghiên cứu ứng dụng chủ yếu là TBG trung mô trưởng thành, chưa có nghiên cứu ứng

dụng nào với TBG phôi thai, do những mối quan tâm về đạo đức, do đó chỉ có các tế bào gốc

trưởng thành được thực hiện Hiện nay sử dụng liệu pháp tế bào trong y học tái tạo để điều trị

các bệnh về xương chủ yếu tiếp cận điều trị với các bệnh nhân bị khiếm khuyết xương cục bộ

hoặc bệnh lý hệ thống của bộ xương Tủy xương tự thân hoặc tế bào gốc trung mô tự thân đã được cấy ghép thành công trong một số bệnh nhân gãy xương, liền khuyết tật xương, điều trị khớp giả, u nang xương, hoại tử xương (Ứng dụng lâm sàng có liên quan được tóm tắt trong bảng 1.1) Như vậy ứng dụng TBG trung mô hiện nay trong điều trị dường như là ứng cử viên đầy hứa hẹn cho việc tái tạo xương [30,136]

1.4 Dây rốn, tế bào gốc từ dây rốn

1.4.1 Mô học, giải phẫu và chức năng

Dây rốn được hình thành vào khoảng tuần thứ 4 trong quá trình phát triển của phôi do màng ối phát triển đã ép túi noãn hoàng, cuống phôi Dây rốn dài khoảng 40 cm tới 60 cm, bao bên ngoài là lớp nội sản mạc, bên trong là lớp chất “thạch” Wharton xen kẽ với 2 động mạch và

1 tĩnh mạch rốn [41,47] Dây rốn có chức năng đảm bảo sự liên tục giữa thai nhi với bánh nhau, từ đó thực hiện quá trình trao đổi chất giữa thai nhi và cơ thể mẹ

1.4.2 Tế bào gốc trung mô từ màng bao dây rốn

Dây rốn là nơi tập trung TBG rất dồi dào, trong đó máu dây rốn chứa các TBG tạo máu (Hematopoietic Stem Cell) và TBG trung mô, màng bao dây rốn chứa các TBG trung mô và các TBG biểu mô (Epithelial Stem Cell) [54] Việc nghiên cứu các TBG tạo máu từ máu dây rốn đã được tiến hành khá lâu, trong khi đó tới năm 2005 các nhà khoa học thuộc Đại học Quốc Gia Singapore mới lần đầu tiên phân lập thành công các tế bào này từ màng bao dây rốn Tuy đây là một nguồn TBG trung mô còn tương đối mới mẻ nhưng đã nhanh chóng tỏ rõ những ưu điểm vượt trội với các lý do sau:

Dây rốn được coi là rác thải y tế, việc thu nhận TBG từ dây rốn được tiến hành sau khi cuộc sinh nở thành công do vậy không vi phạm đạo đức cũng như không làm tổn thương sản phụ và em bé

Dây rốn chứa một số lượng TBG rất dồi dào, ước tính 1 cm2 màng bao dây rốn có thể cung cấp 2 triệu TBG trung mô Như vậy đây có thể coi là nguồn TBG trung mô vô tận

Có thể chủ động kiểm soát tình trạng các bệnh truyền nhiễm như HIV, viêm gan B, viêm gan C… đối với các mẫu nghiên cứu bằng các xét nghiệm trước sinh đối với sản phụ

Kỹ thuật thu TBG trung mô từ màng bao dây rốn tuy mới nhưng cũng không quá phức tạp và tốn kém

Các TBG trung mô từ màng bao chính là các TBG nhũ nhi, mới trải qua 9 tháng 10 ngày phát triển nên còn rất “trẻ” do vậy chúng có khả năng tăng sinh rất mạnh mẽ và tiềm năng biệt hóa rất lớn có thể tạo ra nhiều loại tế bào khác nhau như tế bào cơ, tế bào xương, tế bào thần kinh, tế bào mỡ, tế bào sụn…

Các TBG trung mô từ màng bao dây rốn không còn là các TBG phôi do vậy không còn khả năng tạo ra u quái

Các nghiên cứu miễn dịch thải ghép đã chỉ ra rằng các tế bào này có tính sinh miễn dịch thấp do có chứa ít kháng nguyên hòa hợp mô HLA lớp II đồng thời còn tồn tại các kháng nguyên hòa hợp mô của thai (HLA-G) có tác dụng ức chế miễn dịch nên dễ được

cơ thể nhận chấp nhận khi cấy ghép từ người này sang người khác Do vậy có thể coi đây là một “đặc ưu miễn dịch” của các TBG trung mô từ màng bao dây rốn

1.4.3 Tế bào gốc từ màng dây rốn và tiềm năng ứng dụng

Màng ối bao phủ bánh nhau và lớp ngoài cùng của dây rốn Về hình thái học, màng ối mỏng che phủ phần bánh nhau sau đó dày dần lên để che phủ dây rốn và thành da khi tiếp cận với thai Ngày nay, các tế bào gốc trung mô đã được tách từ bánh nhau, màng ối và lớp thạch (Wharton’Jelly), ở thành mạch máu dây rốn và ở cả dịch ối

Các nghiên cứu miễn dịch về các dấu ấn bề mặt tế bào và HLA của tế bào gốc dây rốn cho thấy chúng có nguồn gốc từ thai nhi chứ không phải từ người mẹ Ngoài việc tế bào gốc

có ít kháng nguyên HLA lớp II, các tế bào gốc dây rốn còn bộc lộ HLA-G là loại kháng nguyên hoà hợp tổ chức có chức năng sinh lý là ức chế miễn dịch giúp cho thai nhi không bị phản ứng thải bỏ miễn dịch từ người mẹ (bản chất thai nhi khi nằm trong bụng mẹ cũng là một

mô ghép khác gen đồng loài) Việc HLA-G bộc lộ trên bề mặt tế bào gốc phân lập từ dây rốn

đã giúp cho chúng dễ được chấp nhận ở một cơ thể khác, vì thế tế bào gốc dây rốn có ưư điểm hơn các loại tế bào gốc khác khi ghép cho một cơ thể khác Như vậy về khía cạnh miễn dịch ghép các vật liệu thay thế da được chế tạo từ các nguồn tế bào gốc dây rốn sẽ có ưu điểm nổi trội hơn rất nhiều so với các vật liệu thay thế da được chế tạo từ các tế bào da đồng loài đang được dùng hiện nay Do tế bào da đồng loài, nhất là tế bào sừng, có khả năng kích thich sinh miễn dịch thải ghép rất mạnh nên thông thường việc ghép vật liệu thay thế da bằng các nguồn

tế bào này hoặc thậm chí ghép da đồng loài thì khả năng tồn tại của mảnh ghép đó trên vết thương cũng chỉ trong vòng 2-3 tuần và các lần ghép sau thì thời gian tồn tại trên vết thương càng ngắn