Thực hành hóa sinh học bài 1 quy tắc làm việc trong phòng thí nghiệm hóa sinh

Loại bỏ tạp chất - Chuyển toàn bộ dung dịch thử vào bình định mức dung tích 250 ml và tráng lại bằng nư c toàn bộ lượng nư c trong bình khoảng 150 ml... - Dung dịch Fehling xem trang 4 B

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG

MỤC LỤC

1 Một số hình cảnh báo nguy hiểm 1

2 Thao tác an toàn 2

3 Sơ cứu trong phòng thí nghiệm 2

4 Pha hóa chất 2

BÀI 2 SACCHARIDE 4 I ĐỊNH TÍNH 4 1 Kiểm tra tính khử của một số saccharide bằng dung dịch Fehling 4

2 Phản ứng của tinh bột v i iodine 4

II ĐỊNH LƯỢNG 5 1 Xác định hàm lượng đường khử theo phương pháp Bertrand (theo TCVN 4075 – 2009) 5

2 Xác định hàm lượng đường khử theo phương pháp DNS (3,5-dinitrosalicylic acid) 8 BÀI 3 LIPID 12 I ĐỊNH TÍNH LIPID 12 1 Tính tan và sự tạo thành nhũ tương của glyxerit 12

2 Phản ứng xà phòng hóa 12

3 Sự tạo thành acid béo tự do 13

II ĐỊNH LƯỢNG LIPID 13 1 Xác định chỉ số acid của chất béo (TCVN 6127: 2010) 13

2 Xác định chỉ số xà phòng hóa của chất béo (TCVN 6126 : 2015) 14

3 Xác định chỉ số peroxide của chất béo (theo TCVN 6121:2010) 15

4 Xác định chỉ số iodine của chất béo (theo TCVN 6122:2015) 16

5 Định lượng lipid bằng phương pháp Soxhlet 17

6 Xác định hàm lượng lipid tổng số theo phương pháp Folch 18

BÀI 4 PROTEIN VÀ AMINO ACID 20 I ĐỊNH TÍNH 20 1 Phản ứng kết tủa thuận nghịch của protein bằng muối trung tính 20

2 Sự biến tính protein 20

3 Phản ứng màu biuret 22

II ĐỊNH LƯỢNG 23 1 Xác định hàm lượng protein hoà tan theo phương pháp Bradford 23

2 Định lượng protein hoà tan theo phương pháp Lowry 25

3 Xác định hàm lượng nitrogen amino acid theo phương pháp chuẩn độ formol (theo TCVN 3707 – 1990) 27

III BÁO CÁO 29

1 Phản ứng của vitamin C (ascorbic acid ) v i iodine, v i methylene blue 30

2 Phản ứng tạo thành thiocrom của vitamin B1 (Thiamine) 31

3 Phản ứng vitaminB6 (pyridoxine) v i FeCl3 31

4 Phản ứng của vitamin A (Retinol) v i H2SO4 31

II ĐỊNH LƯỢNG 32 1 Xác định hàm lượng vitamin C theo phương pháp chuẩn độ iodine 32

2 Xác định hàm lượng vitamin C theo phương pháp 2,6 diclorophenolindophenol (DCPIP) (theo TCVN 6427-2:1998) 33

III BÁO CÁO 36 BÀI 6: ENZYME 37 I ĐỊNH TÍNH 37 1 Kiểm tra hoạt tính của enzyme amylase 37

2 Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH t i hoạt tính của amylase 37

II ĐỊNH LƯỢNG 38 2 Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson cải tiến 41

mct: khối lượng chất tan

mdd: khối lượng dung dịch

nct: số mol chất tan

LỜI MỞ ĐẦU

Bài giảng “Thực hành hóa sinh” là tài liệu chính thức dành cho sinh viên năm thứ 2 các

ngành: công nghệ thực phẩm, công nghệ chế biến, công nghệ sau thu hoạch và công nghệ sinh học

V i thời lượng 30 tiết, nội dung thực hành gồm các bài sau:

Bài 1: Quy Tắc làm việc trong phòng thí nghiệm Hóa sinh

BÀI 1 QUY TẮC LÀM VIỆC TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH

I NỘI QUY

1 Sinh viên phải tham gia đầy đủ các buổi thực hành Trường hợp bất khả kháng, phải viết giấy phép và bù bài vào nhóm tiếp theo

nhóm mình

5 Trang phục đúng quy định: mặc áo blouse, quần dài, mang khẩu trang, dép quai hậu hoặc giày bệt, cột tóc gọn gàng

II KỸ THUẬT PHÒNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH

1 Một số hình cảnh báo nguy hiểm

2 Thao tác an toàn

2.1 Làm việc với hóa chất

- Phải đọc kỹ các thông tin ghi trên nhãn chai lọ đựng hóa chất

- Phải thao tác trong tủ hút v i các hóa chất bay hơi như: acid, kiềm nóng, các dung môi hữu cơ (chloroform, hexan, ethe, …), …

- Phải thêm từ từ acid hoặc kiềm vào nư c khi pha loãng, không làm ngược lại

- Tuyệt đối không hút hóa chất bằng miệng

- Không để hóa chất dễ cháy nổ gần nơi nguồn nhiệt

2.2 Làm việc với trang thiết bị trong phòng thí nghiệm

- Đối v i thiết bị, máy móc: Chỉ sử dụng khi đã được hư ng dẫn và phải tuân thủ tuyệt đối sự hư ng dẫn của cán bộ PTN hoặc của giảng viên Phải ghi nhật ký và vệ sinh đúng cách sau mỗi lần sử dụng

- Đối v i dụng cụ thủy tinh: thao tác cẩn thận tránh để vỡ (khi vỡ phải bỏ vào đúng nơi quy định của phòng thí nghiệm, không bỏ thùng rác), khi đun và khi pha kiềm hoặc pha loãng acid phải dùng dụng cụ thủy tinh chịu nhiệt và thao tác trong tủ hút

3 Sơ cứu trong phòng thí nghiệm

- Bỏng (nhiệt, acid, kiềm): xả nhanh và nhiều nư c tại nơi bị bỏng

- Trầy xư c da, chảy máu: xả nhiều nư c trư c khi băng bó

- Điện giật: ngắt cầu giao tổng của phòng trư c khi sơ cứu

- Hỏa hoạn tại phòng thí nghiệm: v i ngọn lửa nhỏ dùng khăn chuyên dụng để dập tắt,

v i ngọn lửa l n dùng bình xịt cứu hỏa Trường hợp bị cháy lên người: lăn vài vòng xuống đất, các bạn khác dùng khăn to, bình xịt để dập

4 Pha hóa chất

a Nồng độ phần trăm

- w w :

(%) 100

b Nồng độ mol/l: là số mol chất tan có trong 1 lit dung dịch:

dd

ct M

n' ct là số đương lượng mol chất tan

Z

M

(OH-) hay ion tham gia phản ứng trung hòa

d Mỗi liên hệ giữa một số công thức

- mo t và p ầ trăm:

M

d C

C M

*

% 100

m V M

Z m Z C

v i các chất oxy hoá, nhóm chức -CHO trong đường khử bị oxy hoá thành axit cacboxylic (hoặc muối cacboxylat tương ứng)

Khi phản ứng v i đường có tính khử, Cu2+ trong thuốc thử Fehling bị khử thành Cu+ tồn tại trong hợp chất Cu2O có màu đỏ gạch

1.2 Tiến hành thí nghiệm

uyê ệu, óa c ất

- Các dung dịch saccharide: glucose, lactose, saccharose, maltose, tinh bột

- Thuốc thử Fehling gồm 2 thành phần Fehling A và Fehling B Cách pha như sau:

+ Fehling B: (1) Hòa tan 346 g KNaC4H4O6.4H2O (kali natri tactrat) vào khoảng 400ml

nư c; (2) hòa tan 120g NaOH trong khoảng 200ml nư c Trộn (1) và (2), định mức lên 1000ml

Dung dịch Fehling: trộn Fehling A v i Fehling B theo t lệ thể tích 1:1

- Đun các ống nghiệm trên nồi cách thủy khoảng 5-10 phút

- Ghi nhận màu các ống nghiệm, giải thích và kết luận

2 Phản ứng của tinh bột v i iodine

2.1 Cơ sở lý thuyết

Tính chất hóa học đặc trưng của tinh bột là tạo phức màu xanh v i iodine Tính chất này

do thành phần amylose của tinh bột quyết định Màu xanh có thể bị mất đi khi đun nóng

và được hồi phục lại sau khi làm lạnh Tuy nhiên nếu đun nóng quá mạnh, các liên kết

hydro giữa các phân tử glucose trong chuỗi amylose không hình thành lại được nữa, màu

sẽ không hồi phục được

- Ghi nhận kết quả và giải thích sự khác nhau giữa 2 thí nghiệm trên

II ĐỊNH LƯỢNG

1 Xác định hàm lượng đường khử theo phương pháp Bertrand (theo TCVN 4075 – 2009)

1.1 Cơ sở lý thuyết

trong môi trường kiềm để định lượng các loại aldose, ketose hay các disaccharides có tính khử Ion Cu 2+ có trong dung dịch

tạo thành bị oxy hóa bởi

Fe3+ theo phương trình:

Cu2O +Fe2(SO4)3 + H2SO4 = 2CuSO4 + 2FeSO4 + H2O Ion Fe2+ sinh ra bị oxy hóa bởi KMnO4 (potassium permanganate) theo phương trình:

10FeSO4 + 2KMnO4 +8H2SO4 = 5 Fe2(SO4)3 + K2SO4 + MnSO4 + 8H2O

sugar) trong mẫu thí nghiệm

1.2 Thực hành

1.2.1 uyê ệu, óa c ất

a Lấy mẫu

- Mẫu rắn (kẹo, bánh, ): cân mẫu chính xác đến 0,1 mg, sao cho trong 100ml dịch mẫu

có không quá 0,5g đường khử Hòa tan phần mẫu thử bằng 100 ml nư c cất

- Mẫu mật ong: cân chính xác 5 ±0,001 g vào cốc thủy tinh dung tích 50 ml

- Mẫu nư c ngọt đóng chai: pha loãng v i độ pha loãng thích hợp, sao cho nồng độ đường trong dịch kiểm tra nằm trong gi i hạn chính xác của phương pháp

b Loại bỏ tạp chất

- Chuyển toàn bộ dung dịch thử vào bình định mức dung tích 250 ml và tráng lại bằng

nư c (toàn bộ lượng nư c trong bình khoảng 150 ml)

- Thêm vào bình 10 ml dung dịch ZnSO4 1M lắc đều � thêm 20ml NaOH 1M, lắc đều

- Thêm nư c đến vạch định mức, chuyển toàn bộ ra bình tam giác 500ml lắc đều và để yên 10 phút, lọc qua giấy lọc khô, sạch, thu được dung dịch mẫu thử

- dung dịch Phenolphtalein 1% trong cồn 600

- Dung dịch Fehling (xem trang 4)

Bư c 1: Đun mẫu v i dung dịch Fehling dư

Lấy chính xác 25ml mẫu thử vào bình tam giác 250ml, thêm 50ml dung dịch Fehling

Bư c 2: Lọc rửa kết tủa t i pH trung tính

Lọc, rửa kết tủa v i nư c cất nóng, bằng bình hút lọc chân không t i pH trung tính (thử bằng giấy quỳ)

Chú ý: không để kết tủa tiếp xúc trực tiếp v i không khí

Bư c 3: Hòa tan kết tủa bằng dung dịch Bertrand

Bư c 4: Chuẩn độ Fe2+

hồng nhạt bền 30 giây thì ngừng chuẩn độ

1.2.4 Kết quả

Hàm lượng đường khử tính theo glucose, biểu thị bằng phần trăm khối lượng, được tính

100

*

*(%)

2

1 1

V m

V m

Trong đó: m1 là khối lượng đường quy đổi theo Bảng A.1, tính bằng miligam (mg)

V1 thể tích dung dịch mẫu thử, tính bằng mililit (ml);

V2 là thể tích dung dịch mẫu thử lấy để xác định, tính bằng mililit (ml);

m là khối lượng mẫu, tính bằng gam (g);

1000 là hệ số quy đổi gam thành miligam;

Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, chênh lệch kết quả giữa hai lần xác định đồng thời là ± 0,01% Lấy kết quả chính xác đến 0,01%

Bảng A.1 - Lượng đường glucose quy đổi theo thể tích dung dịch kali pemanganat dùng để chuẩn độ

Khối lượng

glucose, mg

(1)

Thể tích dung dịch KMnO4 0,02M, ml (2)

Chú ý: lượng mẫu lấy tùy thuộc vào từng mẫu cụ thể, sao cho thể thích KMnO4 chuẩn độ nằm trong bảng A1

2 Xác định hàm lượng đường khử theo phương pháp DNS (3,5-dinitrosalicylic acid)

2.1 Cơ sở lý thuyết

Thuốc thử DNS (3,5-dinitrosalicylic acid) có màu vàng tươi, trong môi trường kiềm sẽ bị khử bởi đường khử tạo thành 3-amino 5-nitrosalixylat có màu cam đỏ đến nâu đỏ, hấp thụ ánh sáng cực đại ở bư c sóng 540 nm Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng t lệ thuận v i hàm lượng đường khử trong một phạm vi nhất định Dựa vào đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khiết v i thuốc thử DNS từ đó tính ra hàm lượng đường khử trong mẫu thí nghiệm

2.2 Thực hành

a Chuẩn bị mẫu

Tùy thuộc vào loại nguyên liệu mà có cách chuẩn bị dung dịch đường khác nhau

Trường hợp nguyên liệu không chứa quá nhiều tinh bột hoặc inulin, có thể chiết đường từ nguyên liệu bằng nư c cất: v i nguyên liệu khô như hạt, lá, quả khô, cân 1-2 g nguyên liệu (đã được nghiền nhỏ và sấy khô đến khối lượng không đổi); v i nguyên liệu tươi như rau quả, cân 5-10 g nguyên liệu Nghiền nguyên liệu v i bột thu tinh hay cát sạch sau đó

Tiến hành trích ly 2-3 lần để chiết tách đường Chuyển toàn bộ hỗn hợp vào bình định mức 250 ml Để nguội đến nhiệt độ phòng Kết tủa protein bằng chì axetat hoặc chì nitrat

(khoảng 10 ml), lắc đều và để lắng 5-10 phút Định mức bằng nư c cất đến vạch định mức, lọc qua giấy lọc để thu dịch đường

Trường hợp nguyên liệu chứa nhiều tinh bột hoặc inulin như khoai lang, sắn, khoai tây,

làm lạnh không khí Tiến hành trích ly 2-3 lần như trên sau đó lọc qua giấy lọc để thu dịch đường Làm bay hơi rượu bằng cách đun cách thu nhẹ Trường hợp này không cần kết tủa protein vì lượng protein chuyển vào dung dịch không nhiều

Trường hợp nguyên liệu chứa nhiều acid hữu cơ (như cà chua, dứa, chanh, khế, ) cần chú ý trong quá trình đun chiết, đường saccharose có thể bị thu phân một phần Do đó

cần xác định riêng đường khử và riêng saccharose Trư c khi đun cách thu hỗn hợp phải được trung hoà acid bằng dung dịch Na2CO3 bão hoà t i pH 6,4 - 7,0

Đối v i các mẫu kẹo, phương pháp lấy mẫu được thực hiện theo TCVN 4067 – 1985: mẫu kẹo được đập nhỏ, sau đó cân chính xác 1-3g kẹo hoà tan trong 100 ml nư c cất ấm

a Dựng đường chuẩn glucose

Pha dãy glucose chuẩn từ 0,2-1 mg/ml Lấy 1 ml dung dịch các dung dịch glucose chuẩn

có nồng độ khác nhau này cho vào các ống nghiệm Thêm vào mỗi ống 3 ml thuốc thử

là nư c cất Vẽ đường chuẩn glucose v i trục tung là mật độ quang, trục hoành là hàm lượng (mg/ml) glucose

b Xác định lượng đường khử trong mẫu thí nghiệm

Hút 1 ml dịch mẫu có chứa đường vào các ống thí nghiệm Thêm vào mỗi ống 3 ml thuốc thử DNS Đun sôi cách thu trong 5 phút Lấy mẫu ra và làm nguội về nhiệt độ phòng

Đo OD540nm V i những mẫu có lượng đường khử thấp, thêm 0,1 mg glucose vào mỗi mẫu Cứ 3 ml thuốc thử DNS này sẽ phản ứng hết v i khoảng l0 mg glucose Đối v i dịch đường đậm đặc, cần pha loãng mẫu sao cho mẫu đem phân tích chứa 4 mg đường khử hoặc ít hơn, sao cho khi đo mật độ quang nằm trong khoảng 0,2-0,8

Dựng đường chuẩn glucose

Nồng độ glucose (g/ml)

Từ đường chuẩn glucose y = ax + b và giá trị mật độ quang đo được tính ra hàm lượng

đường khử trong ống thí nghiệm Căn cứ vào hệ số pha loãng và tổng thể tích dịch đường trong mẫu ban đầu để tính ra hàm lượng đường khử trong nguyên liệu

( ⁄ ) C: hàm lượng đường trong nguyên liệu (mg/g)

X: hàm lượng đường khử trong 1ml dung dịch mẫu pha loãng (mg/ml)

n, m: lần lượt là độ pha loãng và khối lượng mẫu ban đầu

III BÁO CÁO

vào hiện tượng thu được của thí nghiệm?

đó? Giải thích hiện tượng thu được từ thí nghiệm định tính số 2? Những yếu tố nào dẫn đến sự mất màu của tinh bột và iốt sau khi đun?

sau:

- Vì sao phải rửa sạch kết tủa đến pH trung tính? Làm thế nào để kiểm tra kết bư c rửa kết tủa đã đạt yêu cầu?

Nhũ tương hoá là hiện tượng giọt chất béo dễ bị phân tán thành nhiều giọt nhỏ nhờ tác nhân gây nhũ hoá Các chất gây nhũ tương hoá có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt của giọt chất béo, chất béo bị phân tán thành vô số hạt nhỏ nhờ đó nên dễ dàng phân tán trong môi trường

1.2 Thực hành

T ết bị, dụ cụ: ống nghiệm, pipet 5ml, ống hút nhỏ giọt

T ế à t ệm:

- Chuẩn bị 4 ống nghiệm sạch và đánh số thứ tự 1 – 4 cho các ống nghiệm

- Cho vào ông nghiệm 1 – 4 các hoá chất sau:

Ống nghiệm số 1: 2 ml nư c + 1 ml dầu thực vật

+ 1 ml dầu thực vật Ống nghiệm số 3: 2 ml xăng + 1 ml dầu thực vật

H2 OH OH

OH 3NaOH

T ết bị, dụ cụ: cốc 50 ml, đũa thu tinh, ống nghiệm

T ế à t ệm:

Cho vào cốc mỏ 50 ml: 2ml dầu ăn + 10ml dung dịch NaOH đặc (≥10%) trong cồn Vừa đun vừa khuấy đến khi thấy váng màu vàng nhạt (khoảng 15 phút) Lấy đũa thủy tinh v t một ít váng cho vào ống nghiệm, thêm nư c cất, lắc mạnh thấy bọt xà phòng

- Giải thích và viết phản ứng xà phòng hóa lipid

3 Sự tạo thành acid béo tự do

3.1 Cơ sở lý thuyết

Xà phòng là muối natri hoặc kali của acid béo Dư i tác dụng của acid vô cơ đặc, acid béo được giải phóng, không tan trong nư c mà nổi trên mặt nư c

3.2 Thực hành

T ết bị, dụ cụ: bình tam giác dung tích 100ml, đũa thủy tinh, ống nhỏ giọt

T ế à t ệm

t i khi môi trường có pH acid (thử bằng giấy quỳ) � cách thủy 10 phút

- Quan sát váng nổi trên mặt nư c

- Giải thích và viết phương trình phản ứng

II ĐỊNH LƯỢNG LIPID

1 Xác định chỉ số acid của chất béo (TCVN 6127: 2010)

- Thiết bị: Cân phân tích, máy khuấy từ

- Dụng cụ: 3 bình tam giác 250m, bộ buret 25ml, pipet 25ml, ống đong 100ml

1.2.3 T ế à t ệm

Cân 20 – 25 g dầu thực vật cho vào bình nón 250 ml � thêm 50 ml đến 100 ml hỗn hợp dung môi ethanol: dietyl ete (1:1)  hòa tan phần mẫu phân tích bằng cách làm nóng nhẹ

 thêm 5 giọt chỉ thị phenolphthalein  chuẩn độ bằng dung dịch chuẩn KOH 0,1M (vừa chuẩn độ vừa khuấy mẫu bằng máy khuấy từ) Việc chuẩn độ được coi là kết thúc khi thêm một giọt kiềm sẽ tạo ra màu hồng nhạt và bền trong ít nhất 30 giây

1.2.4 T ết quả

Chỉ số acid (WAV) được tính theo công thức sau:

Trong đó:

C (M)): nồng độ của dung dịch NaOH đã sử dụng

V (ml): thể tích của dung dịch NaOH đã sử dụng

m (g): khối lượng mẫu phân tích

2 Xác định chỉ số xà phòng hóa của chất béo (TCVN 6126 : 2015)

O O

CH C

OH

OH 3KOH

số xà phòng hoá của lipid

Lấy 2 g mẫu + 25 ml KOH cho vào bình nón 250 ml Nối bộ sinh hàn v i bình nón chứa mẫu, đặt bình lên bếp đun nóng và đun sôi từ từ, thỉnh thoảng lắc nhẹ trong suốt thời gian đun (60 phút) Sau khi đun để cho nhiệt độ bình trở về nhiệt độ phòng sau đó thêm 0,5 ml dung dịch phenolphtalein và chuẩn độ v i HCl 0,5M cho đến khi màu hồng của chất chỉ thị biến mất Tiến hành phép thử mẫu đối chứng theo trình tự như trên nhưng thay bằng 2

l  ( 0  1)* *56,1

trong đó:

Vo (ml): thể tích HCl đã sử dụng trên mẫu đối chứng

V1 (ml): thể tích HCl đã sử dụng trên mẫu phân tích

C (M): Nồng độ dung dịch HCl

m (g): khối lượng mẫu phân tích

3 Xác định chỉ số peroxide của chất béo (theo TCVN 6121:2010)

3.1 Cơ sở lý thuyết

3.2.1 uyê ệu, óa c ất

Dung dịch acid axetic/isooctane 6/4 (v/v), Dung dịch KI bão hòa, dung dịch chuẩn

Na2S2O3 0,01N (bảo quản trong chai tối màu, nhiệt độ phòng, sử dụng trong thời gian 30 ngày sau khi pha); dung dịch tinh bột

3.2.2 T ết bị, dụ cụ

- Máy khuấy từ

- Bộ buret

- Bình tam giác 250ml, đũa thủy tinh, pipet

3.2.3 T ế à t ệm

Cho 5 g mẫu + 50 ml dung dịch acid axetic/isooctan vào bình nón, sau đó cho thêm 0,5

ml dung dịch KI bão hòa Đậy bình nón và khuấy nhẹ trên máy khuấy từ trong 15 phút Thêm 100 ml nư c cất và chuẩn độ ngay lượng iodine giải phóng bằng dung dịch chuẩn

Na2S2O3 0,01N đến màu vàng cam rồi vàng nhạt Thêm 0,5 ml dung dịch tinh bột thì chuyển từ màu tím đến không màu Ngừng chuẩn độ khi dung dịch trở nên không màu trong 15 hoặc 30 giây

Phép thử v i mẫu đối chứng được thực hiện đồng thời v i phép thử trên mẫu phân tích, thay 5 g mẫu bằng 5 g nư c cất

3.2.4 T ết quả

Chỉ số peroxide (PV) tính được bằng công thức sau:

m

C Vo V

PV  (  )* *1000Trong đó: V (ml): thể tích dung dịch Na2S2O3 dùng trong mẫu phân tích

Vo (ml): thể tích dung dịch Na2S2O3 dùng trong mẫu đối chứng

C (M): nồng độ dung dịch Na2S2O3

m (g): Khối lượng mẫu phân tích

4 Xác định chỉ số iodine của chất béo (theo TCVN 6122:2015)

4.1 Cơ sở ý t uyết

- Chỉ số Iodine là số gam I2 cộng vào các liên kết không no của 100 gam chất béo

- Hòa tan phần mẫu phân tích trong dung môi và cho thêm thuốc thử Wijs Sau thời gian quy định, bổ sung dung dịch KI và nư c, chuẩn độ iôt được giải phóng bằng dung dịch chuẩn natri thiosulfat

4.2 Thực hành

4.2.1 uyê ệu, óa c ất

Dung dịch KI; dung dịch tinh bột; dung dịch Na2S2O3 0,1M; hỗn hợp dung môi xyclohexan/acid acetic (1:1 (v/v)); Thuốc thử Wijs: Là dung dịch ICl 0,1M trong acid acetic Thuốc thử Wijs được bảo quản trong tối ở nhiệt độ < 30oC Có thể sử dụng thuốc thử Wijs bán trên thị trường nhưng chú ý thời gian sử dụng

Trộn đều 5 g mẫu + 25 ml hỗn hợp dung môi (xyclohexan/acid acetic) trong bình nón 250

ml sau đó thêm 25 ml thuốc thử Wijs vào hỗn hợp, lắc đều và để trong tối khoảng 1h Thêm 20 ml dung dịch KI + 150 ml nư c và lắc đều rồi chuẩn độ bằng dung dịch

Na2S2O3 cho đến khi mất hết màu vàng của iôt Thêm một vài giọt dung dịch tinh bột và tiếp tục chuẩn độ cho đến mất màu xanh hoàn toàn Ghi lại thể tích dung dịch Na2S2O3cần dùng để đạt đến điểm kết thúc chuẩn độ là V2 ml

Phép thử mẫu đối chứng được tiến hành tương tự như trên nhưng không bổ sung 5 g mẫu Thể tích dung dịch Na2S2O3 cần dùng để đạt đến điểm kết thúc chuẩn độ là V1 ml

w l 12,69* * 1 2



V1 (ml): thể tích dung dịch Na2S2O3 đã dùng trong mẫu đối chứng

V2 (ml): thể tích dung dịch Na2S2O3 đã dùng trong mẫu phân tích

m (g): khối lượng mẫu phân tích

5 Định lượng lipid bằng phương pháp Soxhlet

5.1 Cơ sở lý thuyết

Lipid hoà tan tốt trong các dung môi không phân cực do đó phương pháp này sử dụng dung môi không phân cực như ete ethylic nhằm tách hết lipid có trong mẫu nguyên liệu Xác định khối lượng mẫu còn lại sau khi chiết lipid để có thể tính toán được hàm lượng lipid

- Cân m (g) mẫu (5 – 5,5g) cho vào cối sứ sau đó giã nhỏ mẫu

- Chuyển mẫu đã giã nhỏ vào trong túi giấy và xác định khối lượng ban đầu (mo)

- Sắp xếp các gói mẫu vào bộ phận chính của hệ thống Soxhlet

- Lắp ống sinh hàn, sau đó đặt thiết bị vào nồi cách thủy (34-360C)

- Cho dung môi (ete ethylic) vào bình cầu (khoảng 1/3 thể tích bình cầu)

- Tiến hành nâng nhiệt hệ thống nồi cách thu để chiết hết lipid ra khỏi mẫu (6-8h)

- Sau khi chiết rút, lấy gói mẫu ra sấy ở 30 – 40oC để loại dung môi, rồi sấy ở 100-105oC cho đến khi trọng lượng không đổi (mt)

Chú ý: Quá trình chiết rút phải thực hiện trong tủ hút Sau khi thí nghiệm xong, ete dư sẽ

được chưng cất thu hồi để sử dụng lần sau

5.2.4 T Kết quả

Lượng lipid tổng số có trong nguyên liệu được tính theo công thức:

100

*)(

m

m m



Trong đó: X (%): Hàm lượng lipid tổng số

mo (g): Trọng lượng gói nguyên liệu trư c khi chiết rút lipid

mt (g): Trọng lượng gói nguyên liệu sau khi chiết rút lipid và sấy ở 105oC

m (g): Khối lượng mẫu ban đầu

6 Xác định hàm lượng lipid tổng số theo phương pháp Folch

6.1 Cơ sở lý thuyết

Sử dụng hỗn hợp dung môi Chloroform:Methanol (2:1(v/v)) để hoà tan tất cả lipid trong mẫu, tách l p và chiết qua phiễu lọc nhiều lần Sau khi làm bay hơi hết dung môi, cân chất khô còn lại và tính ra hàm lượng lipid tổng số trong 100g mẫu

6.2.3 T ế à t ệm

a Tách lipid từ mẫu

Cân m (g) (m: 1 – 1,5 g) mẫu cho vào ống thủy tinh 20ml sau đó cho thêm 5*m

(ml) methanol, 10*m (ml) chloroform và 200 µg BHT Đồng hóa 1 phút, ngâm mẫu trong dung môi khoảng 10 phút Sau khi ngâm, cho mẫu vào ống xilanh có lót giấy lọc GF/C ở

dư i đáy cho dịch mẫu chảy xuống hết hoàn toàn Cho thêm 5 ml methanol, 10ml chloroform vào ống nghiệm 20 ml, đồng hóa trong 20 giây sau đó dung dịch này vào xilanh và dùng pitton để ép tống dung dịch còn lại trong xilanh xuống phễu chiết 100 ml Cho thêm 7,5ml NaCl 0,9% vào phễu chiết chứa dịch mẫu Đảo trộn ngược phễu chiết nhiều lần và giữ mẫu ở 5oC trong 4 giờ để dịch mẫu phân chia thành 2 l p

b Chiết rút dung dịch lipid

Tách l p dư i (chứa lipid hoà tan trong dung môi) cho chảy vào phễu chiết thể tích 100

các tạp chất được loại như muối, protein….)

c Định lượng lipid

Tiến hành cô quay chân không dịch chiết (Vdm) ở 37oC đến khi thể tích còn lại khoảng 1ml Cho vào bình cầu 2 – 3 ml chloroform sau đó chuyển mẫu qua bình định mức 5ml, tráng rửa bình cầu nhiều lần và định mức bằng chloroform vừa đủ 5ml

đến khối lượng không đổi

m

dm

V T m

V m m



Trong đó: X (%): Hàm lượng lipid tổng số tính theo trọng lượng khô của mẫu

m (g): Trọng lượng mẫu

Vdm (ml): Thể tích định mức sau xử lý

Vm (ml): Thể tích mẫu sau xử lý lấy để sấy

T (%): Hàm lượng chất khô của mẫu

III BÁO CÁO

sao?

lượng lipid

và phương pháp Folch)