(Đồ án hcmute) khảo sát loại enzyme và điều kiện xử lý enzyme để tạo hạt nano tinh bột từ tinh bột hạt bơ

Trong nghiên cứu này, hạt nano tinh bột sẽ được tạo ra bằng các phương pháp: xử lý enzyme glucoamylase, xử lý enzyme pullulanase, sử dụng kết hợp 2 enzyme glucoamylase và pullulana

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

GVHD: TS VŨ TRẦN KHÁNH LINH SVTH: NGUYỄN ĐÌNH TOÀN

KHẢO SÁT LOẠI ENZYME VÀ ĐIỀU KIỆN XỬ LÝ ENZYME

ĐỂ TẠO HẠT NANO TINH BỘT TỪ TINH BỘT HẠT BƠ

S K L 0 0 8 4 5 4

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC VÀ THỰC PHẨM

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

MÃ SỐ: 2021-16116217

KHẢO SÁT LOẠI ENZYME VÀ ĐIỀU KIỆN

XỬ LÝ ENZYME ĐỂ TẠO HẠT NANO TINH BỘT TỪ TINH BỘT HẠT BƠ

GVHD: TS VŨ TRẦN KHÁNH LINH SVTH: NGUYỄN ĐÌNH TOÀN

MSSV: 16116217

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 12/2021

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin gửi lời cám ơn chân thành sâu sắc đến cô Vũ Trần Khánh Linh, giảng viên Khoa Công nghệ Hóa học và Thực phẩm và cô Lê Ngọc Liễu, giảng viên trường Đại học Quốc tế - Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn, truyền đạt những kinh nghiệm, những kiến thức chuyên môn cũng như những kỹ năng cần thiết để

em có thể thực hiện thí nghiệm một cách hiệu quả và khoa học

Để hoàn thành quá trình nghiên cứu và hoàn thiện luận văn, lời đầu tiên em xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến quý thầy cô trong bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm, khoa Công Nghệ Hóa Thực Phẩm, trường Đại học Sư Phạm Kỹ Thuật Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện về cơ sở, vật chất cho chúng tôi học tập và nghiên cứu tại trường Cảm ơn thầy cô

đã nhiệt tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức nền tảng cho em trong suốt những năm học qua

Sau cùng em xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ em trong suốt thời gian qua

Vì kiến thức và kinh nghiệm còn hạn hẹp nên bài luận văn không tránh khỏi những thiếu sót Kính mong nhận được sự góp ý từ quý Thầy/ Cô để đề tài của em có thể hoàn thiện hơn

Xin chân thành cảm ơn!

TP.HCM, ngày 17 tháng 12 năm 2021

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan toàn bộ nội dung được trình bày trong khóa luận tốt nghiệp là do chính tôi thực hiện Tôi xin cam đoan các nội dung được tham khảo trong khóa luận tốt nghiệp đã được trích dẫn chính xác và đầy đủ theo qui định

Ngày 17 tháng 12 năm 2021

Ký tên

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN iii

LỜI CAM ĐOAN iv

MỤC LỤC xii

DANH MỤC HÌNH xvii

DANH MỤC BẢNG BIỂU xix

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT xx

TÓM TẮT KHÓA LUẬN xxi

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 2

1.3 Nội dung nghiên cứu 2

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3

1.4.1 Ý nghĩa khoa học 3

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 4

2.1 Tổng quan về tinh bột hạt bơ 4

2.2 Tổng quan về nano tinh bột (SNPs) 4

2.2.1 Giới thiệu 4

2.2.2 Tính chất của hạt nano tinh bột 5

2.3 Ứng dụng của nano tinh bột 6

2.4 Phương pháp tạo ra hạt nano tinh bột 7

2.4.1 Phương pháp thủy phân bằng acid 7

2.4.2 Phương pháp xử lý enzyme 8

2.4.3 Xử lý theo phương pháp vật lý 8

2.4.4 Phương pháp kết tủa (nanoprecipitation) 10

2.4.5 Phương pháp nhũ tương – liên kết chéo (emulsion-crosslinking) 10

2.5 Tổng quan về glucoamylase (GAs) 10

2.5.1 Phân loại 11

2.5.2 Nguồn gốc 11

2.5.3 Tính chất 12

2.6 Tổng quan về pullulanase 12

2.6.1 Phân loại 13

2.6.2 Nguồn gốc 14

2.6.3 Tính chất của pullulanase 14

CHƯƠNG 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

3.1 Nguyên liệu, hóa chất 15

3.1.1 Hạt quả bơ 15

3.1.2 Enzyme 15

3.1.3 Hóa chất 15

3.2 Quy trình sản xuất tinh bột hạt bơ sử dụng trong nghiên cứu 15

3.2.1 Sơ đồ quy trình sản xuất tinh bột hạt bơ sử dụng trong nghiên cứu: 15

3.2.2 Thuyết minh quy trình: 16

3.3 Quy trình thu nhận hạt nano tinh bột theo phương pháp kết tủa nano kết hợp với tiền xử lý enzyme 17

3.3.1 Sơ đồ quy trình công nghệ: 18

3.3.2 Thuyết minh quy trình 18

3.4 Quy trình thu nhận hạt nano tinh bột (SNPs) theo phương pháp xử lý acid kết hợp với xử lý enzyme 19

3.4.1 Sơ đồ quy trình thu nhận hạt nano tinh bột (SNPs) theo phương pháp xử lý acid kết hợp với xử lý enzyme: 20

3.4.2 Thuyết minh quy trình 20

3.5 Nội dung nghiên cứu 22

3.5.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme glucoamylase và thời

gian thủy phân đến tính chất hạt nano tinh bột (SNPs) 23

3.5.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme pullulanase và thời gian thủy phân đến tính chất hạt nano tinh bột (SNPs) 24

3.5.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của việc sử dụng kết hợp 2 loại enzyme glucoamylase và pullulanase đến tính chất của hạt nano tinh bột (SNPs) 25

3.5.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của xử lý sulfuric acid kết hợp xử lý enzyme pullulanase đến tính chất hạt nano tinh bột (SNPs) 26

3.5.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát hình thái và cấu trúc hóa học của các mẫu hạt nano tinh bột (SNPs) 27

3.6 Các phương pháp phân tích 27

3.6.1 Phân tích hình thái hạt nano tinh bột 27

3.6.2 Phân bố kích thước hạt 28

3.6.3 Khả năng hoà tan của hạt nano tinh bột 28

3.6.4 Phương pháp phân tích thành phần hóa học của hạt nano tinh bột 29

3.6.5 Phương pháp xác định hiệu suất thu hồi nano tinh bột 29

3.6.6 Phương pháp xử lý số liệu thống kê 29

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 30

4.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme glucoamylase và thời gian thủy phân đến tính chất hạt nano tinh bột 30

4.1.1 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme glucoamylase và thời gian thủy phân đến kích thước hạt nano tinh bột 30

4.1.2 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme glucoamylase và thời gian thủy phân đến hiệu suất thu hồi nano tinh bột 31

4.1.3 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme glucoamylase và thời gian thủy phân đến khả năng hòa tan của hạt nano tinh bột 32

4.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme pullulanase và thời gian thủy phân đến tính chất hạt nano tinh bột 33

4.2.1 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme và thời gian thủy phân của pullulanase đến

kích thước hạt nano tinh bột 33

4.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme và thời gian thủy phân của pullulanase đến hiệu suất thu hồi nano tinh bột 34

4.2.3 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme và thời gian thủy phân của pullulanase đến khả năng hòa tan của hạt nano tinh bột 35

4.3 Khảo sát ảnh hưởng của việc sử dụng kết hợp 2 loại enzyme glucoamylase và pullulanase đến tính chất của hạt nano tinh bột (SNPs) 36

4.3.1 Ảnh hưởng của việc sử dụng kết hợp 2 loại enzyme glucoamylase và pullulanase đến kích thước hạt nano tinh bột 36

4.3.2 Ảnh hưởng của việc sử dụng kết hợp 2 loại enzyme glucoamylase và pullulanase đến hiệu suất thu hồi nano tinh bột 38

4.3.3 Ảnh hưởng của việc sử dụng kết hợp 2 loại enzyme glucoamylase và pullulanase đến khả năng hòa tan của hạt nano tinh bột 39

4.4 Khảo sát ảnh hưởng của xử lý sulfuric acid kết hợp xử lý enzyme pullulanase đến tính chất hạt nano tinh bột 40

4.4.1 Ảnh hưởng của xử lý sulfuric acid kết hợp xử lý enzyme pullulanase đến kích thước hạt nano tinh bột 40

4.4.2 Ảnh hưởng của xử lý sulfuric acid kết hợp xử lý enzyme pullulanase đến hiệu suất thu hồi hạt nano tinh bột 42

4.4.3 Ảnh hưởng của xử lý sulfuric acid kết hợp xử lý enzyme pullulanase đến khả năng hòa tan của hạt nano tinh bột 43

4.5 Khảo sát hình thái và cấu trúc hóa học của các mẫu hạt nano tinh bột (SNPs) 44

4.5.1 Khảo sát hình thái của hạt nano tinh bột 44

4.5.2 Khảo sát thành phần hóa học của hạt nano tinh bột 46

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48

5.1 Kết luận 48

5.2 Kiến nghị 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49PHỤ LỤC 54

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Sơ đồ mô hình hoạt động của các enzyme thủy phân tinh bột 11Hình 2.2 Cấu trúc không gian của phức hệ PulA-maltotetraose 13Hình 3.1 Quy trình thu tinh bột hạt bơ trong nghiên cứu 16Hình 3.2 Sơ đồ quy trình thu nhận hạt nano tinh bột bằng phương pháp xử lý enzyme trong nghiên cứu 18Hình 3.3 Sơ đồ quy trình thu nhận hạt nano tinh bột bằng phương pháp xử lý acid kết hợp với xử lý enzyme trong nghiên cứu 20Hình 3.4 Sơ đồ danh sách nội dung nghiên cứu 22Hình 4.1 Kích thước hạt trung bình của các mẫu tinh bột được thủy phân bởi enzyme glucoamylase 30Hình 4.2 Hiệu suất thu hồi nano tinh bột của các mẫu tinh bột thủy phân bởi enzyme glucoamylase 31Hình 4.3 Khả năng hòa tan trong nước lạnh (CWS) và khả năng hòa tan trong 32Hình 4.4 Kích thước hạt trung bình của các mẫu tinh bột thủy phân bởi enzyme pullulanase

ở nồng độ và thời gian thủy phân khác nhau 34Hình 4.5 Hiệu suất thu hồi nano tinh bột của các mẫu tinh bột thủy phân bởi enzyme pullulanase ở các nồng độ và thời gian thủy phân khác nhau 35Hình 4.6 Khả năng hòa tan trong nước lạnh (CWS) và khả năng hòa tan trong nước nóng (HWS) của các mẫu tinh bột được thủy phân bởi enzyme pullulanase 35Hình 4.7 Kích thước hạt trung bình của các mẫu tinh bột thủy phân bởi hỗn hợp enzyme glucoamylase và pullulanase 37Hình 4.8 Hiệu suất thu hồi nano tinh bột của các mẫu tinh bột thủy phân bởi hỗn hợp enzyme pullulanase và glucoamylase 38Hình 4.9 Khả năng hòa tan trong nước lạnh (CWS) và khả năng hòa tan trong nước nóng (HWS) của các mẫu tinh bột thủy phân bởi hỗn hợp enzyme glucoamylase và pullulanase ở các nồng độ và thời gian thủy phân khác nhau 39Hình 4.10 Kích thước hạt trung bình của các mẫu tinh bột tiền xử lý bằng sulfuric acid kết hợp với xử lý enzyme pullulanase 41Hình 4.11 Hiệu suất thu hồi nano tinh bột của các mẫu tinh bột xử lý sulfuric acid kết hợp với xử lý enzyme pullulanase 42

Hình 4.12 Khả năng hòa tan trong nước lạnh (CWS) và khả năng hòa tan trong nước nóng (HWS) của các mẫu tinh bột xử lý sulfuric acid kết hợp xử lý enzyme pullulanase 43Hình 4.13 Kết quả chụp FE-SEM (trái) và kết quả đo phân bố kích thước hạt DLS (phải) của các mẫu P200-180, G200-180, GPc-180, AP200-180 45Hình 4.14 Phổ FTIR của các mẫu P200-180, G200-180, GPc-180, AP200-180 46

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 3.1 Điều kiện thí nghiệm của các mẫu trong thí nghiệm 1 23

Bảng 3.2 Điều kiện thí nghiệm của các mẫu trong thí nghiệm 2 24

Bảng 3.3 Điều kiện thí nghiệm của các mẫu trong thí nghiệm 3 25

Bảng 3.4 Điều kiện thí nghiệm của các mẫu trong thí nghiệm 4 26

Bảng 4.1 Khả năng hòa tan trong nước lạnh (CWS) và khả năng hòa tan trong nước nóng (HWS) của các mẫu P200-180, G200-180, GPc-180 40

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

SNPs: hạt nano tinh bột (Starch nanoparticles)

SNC: tinh thể hạt nano tinh bột (Starch nanocrystal)

GAs: glucoamylase

CWS: khả năng hòa tan trong nước lạnh (Cold water solubility0 HWS: khả năng hòa tan trong nước nóng (Hot water solubility) OECD: Tổ chức Hợp tác và Phát triển kinh tế

TÓM TẮT KHÓA LUẬN

Trong những năm gần đây, các hạt nano tinh bột đã thu hút được nhiều sự chú ý bởi

vì các thuộc tính độc đáo của chúng khác biệt đáng kể so với các loại vật liệu nano khác như tính tương thích sinh học cao, khả năng phân hủy sinh học cao, chi phí thấp và không độc hại Hạt quả bơ là một nguồn nguyên liệu có hàm lượng tinh bột cao (71.9% khối lượng khô), tuy nhiên hiện nay hạt bơ đang được xem là phế thải của ngành công nghiệp chế biến thịt quả bơ Trong nghiên cứu này, hạt nano tinh bột sẽ được tạo ra bằng các phương pháp: xử lý enzyme glucoamylase, xử lý enzyme pullulanase, sử dụng kết hợp 2 enzyme glucoamylase và pullulanase, xử lý sulfuric acid kết hợp với xử lý enzyme pullulanase Trong mỗi phương pháp, ta sẽ tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nồng độ mỗi loại enzyme, thời gian thủy phân bằng enzyme đến kích thước hạt, khả năng hòa tan và hiệu suất thu hồi hạt nano tinh bột Bên cạnh đó, các mẫu có kích thước hạt nhỏ nhất của mỗi phương pháp

sẽ được sử dụng để khảo sát hình thái và thành phần hóa học của hạt nano tinh bột Kết quả của nghiên cứu cho thấy điều kiện tối ưu để tạo nano tinh bột từ tinh bột hạt bơ là sử dụng enzyme pullulanase với nồng độ 200 U/g tinh bột và thủy phân trong vòng 180 phút

kể so với các loại vật liệu nano khác như tính tương thích sinh học cao, khả năng phân hủy sinh học cao, chi phí thấp và không độc hại (Haaj và cộng sự, 2016; Rostamabadi và cộng sự, 2019)

Do đó, ngày càng có nhiều nghiên cứu quan tâm đến việc sử dụng tinh bột làm nguyên liệu cho quá trình tạo hạt nano tinh bột phục vụ cho nhiều ứng dụng khác nhau như làm chất vận chuyển thuốc (nanodrug delivery) (Rodrigues và cộng sự, 2012; Simi và cộng sự, 2007; Xiao và cộng

sự, 2006), màng sinh học ăn được (Ginting và cộng sự, 2018; González và cộng sự, 2015; Shi

và cộng sự, 2013), vật liệu composite có khả năng phân hủy sinh học (Angellier và cộng sự, 2005; Kristo và cộng sự, 2007)

Hiện nay, hầu hết các hạt nano tinh bột đều được điều chế từ các chế phẩm tinh bột có sẵn trên thị trường như tinh bột ngô, tinh bột khoai mì Ngoài những nguồn nguyên liệu truyền thống

này, hạt quả bơ (Persea americana) cũng là nguồn nguyên liệu tiềm năng để sản xuất nano tinh

bột vì hạt của quả bơ có hàm lượng tinh bột cao đến 71.9% (Domínguez và cộng sự, 2014) Tuy nhiên, chúng đang được xem như phế thải của ngành công nghiệp chế biến các sản phẩm từ thịt quả bơ và chỉ có một số ít nghiên cứu để tạo ra các sản phẩm có giá trị kinh tế từ hạt bơ, như việc tách hợp chất sinh học, tinh dầu, tinh bột từ hạt bơ (Gómez và cộng sự, 2014) Mặc dù có hàm lượng tinh bột cao nhưng số lượng các nghiên cứu về thu nhận hạt tinh bột từ quả bơ và ứng dụng của chúng lại rất hạn chế, như Chel-Guerrero và cộng sự (2016), Luis Gustavo Lacerda

và cộng sự (2014) chỉ nghiên cứu về việc tách tinh bột từ hạt bơ nhưng chưa có nghiên cứu nào

về ứng dụng thực tiễn của chúng

Đã có nhiều nghiên cứu về phương pháp điều chế hạt nano tinh bột (SNPs) và tinh thể nano tinh bột (Starch nanocrystal – SNC) như thủy phân bằng acid (Dufresne và cộng sự, 1996), thủy phân bằng enzyme và kết tinh nano (Miao và cộng sự, 2009), đồng nhất áp suất cao và tạo

nhũ tương – liên kết chéo (emulsion-crosslinking) (Kim và cộng sự, 2015), các phương pháp vật lý (Campelo và cộng sự, 2020) Các phương pháp điều chế hạt nano tinh bột cần hướng đến mục tiêu tiết kiệm chi phí, thời gian và dễ dàng mở rộng quy mô sản xuất So sánh với các phương pháp khác thì phương pháp xử lý acid kết hợp với xử lý enzyme và phương pháp xử lý enzyme là các phương pháp đầy hứa hẹn do không cần thiết bị chuyên dụng, điều kiện vận hành không quá phức tạp, chi phí hợp lý, giảm tối thiểu nguy cơ tạp nhiễm mẫu (Campelo và cộng

sự, 2020)

Các loại enzyme phổ biến thường được sử dụng trong sản xuất hạt nano tinh bột là amylase, β-amylase, glucoamylase Enzyme glucoamylase (E.C.3.2.1.3) được sử dụng nhiều trong sản xuất nano tinh bột do có khả năng thủy phân dễ dàng liên kết α-1,4-glucosidic trong mạch polysaccharide, và thủy phân chậm hơn đối với các liên kết α-1,6-glucosidic (Svensson

α-và cộng sự, 1982) Enzyme pullulanase (EC 3.2.1.41) là một enzyme cắt nhánh (debranching) quan trọng, đã được sử dụng rộng rãi để thủy phân liên kết α-1,6 glucosidic trong tinh bột, pullulan và các oligosaccharide liên quan (Hii và cộng sự, 2012) Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu về việc ứng dụng pullulanase để sản xuất nano tinh bột từ tinh bột hạt bơ

Từ các lý do trên, nghiên cứu này được thực hiện nhằm tạo hạt nano tinh bột từ tinh bột hạt bơ sử dụng phương pháp xử lý enzyme và so sánh với phương pháp xử lý acid kết hợp với enzyme Qua đó xác định điều kiện tối ưu để tạo hạt nano tinh bột

1.2 Mục tiêu đề tài

Đề tài “Khảo sát loại enzyme và các điều kiện xử lý enzyme để tạo hạt nano tinh bột từ tinh bột hạt bơ” được thực hiện nhằm mục tiêu khảo sát ảnh hưởng của loại enzyme, nồng độ enzyme và thời gian thủy phân đến kích thước, hình thái, khả năng hòa tan và hiệu suất thu hồi nano tinh bột từ tinh bột hạt bơ Ngoài ra, phương pháp xử lý acid kết hợp với xử lý enzyme cũng được thực hiện để so sánh với kết quả thu được của phương pháp xử lý enzyme

1.3 Nội dung nghiên cứu

Đề tài “Khảo sát loại enzyme và các điều kiện xử lý enzyme để tạo hạt nano tinh bột từ tinh bột hạt bơ” gồm có các nội dung cụ thể như sau:

- Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme glucoamylase và thời gian thủy phân đến tính chất hạt nano tinh bột (SNPs)

- Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme pullulanase và thời gian thủy phân đến tính chất hạt nano tinh bột (SNPs)

- Khảo sát ảnh hưởng của việc sử dụng kết hợp 2 loại enzyme glucoamylase và pullulanase đến tính chất của hạt nano tinh bột (SNPs)

- Khảo sát ảnh hưởng của xử lý sulfuric acid kết hợp xử lý enzyme pullulanase đến tính chất hạt nano tinh bột (SNPs)

- Khảo sát hình thái và cấu trúc hóa học của các mẫu hạt nano tinh bột (SNPs)

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

1.4.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả của nghiên cứu này là nền tảng cho các nghiên cứu chuyên sâu hơn, góp phần xác định điều kiện tối ưu để tạo hạt nano tinh bột từ tinh bột hạt bơ bằng phương pháp xử lý enzyme pullulanase Từ đó có thể nghiên cứu ứng dụng tạo nano tinh bột từ các nguồn tinh bột khác

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn

- Nghiên cứu và tìm ra được sản phẩm có giá trị kinh tế và tiềm năng cao từ hạt bơ

- Tìm ra phương pháp điều chế hạt nano tinh bột với giá thành thấp và dễ dàng mở rộng quy mô sản xuất

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN

2.1 Tổng quan về tinh bột hạt bơ

Quả bơ (Persea americana) là loại trái cây có vỏ màu xanh sẫm, thịt quả màu xanh đậm,

giàu béo, giá trị cảm quan cao và có giá trị thương mại cao (Chel-Guerrero và cộng sự, 2016) Ngày nay, quả bơ được sử dụng ngày càng nhiều trong công nghiệp thực phẩm để tạo ra các sản phẩm kem, maiyonnaise, kem phết bánh sandwich, các sản phẩm quả đóng hộp và đông lạnh (Khatoon, 2009) Ngoài ra, quả bơ còn được sử dụng trong ngành công nghiệp mỹ phẩm và dược phẩm

Hạt bơ chiếm 16% khối lượng chất khô của quả bơ, là một phụ phẩm trong công nghiệp chế biến quả bơ (Dabas và cộng sự, 2011) Nghiên cứu về một nhóm các giống bơ cho thấy thành phần của hạt bơ bao gồm: 71,9% carbohydrate, 4,8% protein, 4,6% lipid, 3,9% chất xơ, 3,4% tro và 8,7% độ ẩm (Domínguez và cộng sự, 2014)

Tinh bột là một polysaccharide đồng nhất cấu thành từ hai thành phần là amylose và amylopectin trong đó amylose gồm các đơn vị D-glucose liên kết với nhau thông qua liên kết α-1,4- glycosidic tạo thành một mạch thẳng, còn amylopectin bao gồm các D-glucose liên kết với nhau thông qua các liên kết α-1,4 và α-1,6 glycosidic, tạo thành các mạch nhánh Hàm lượng amylose trong tinh bột hạt bơ đạt 14.94 – 15.78%, hàm lượng amylopectin đạt 84.22 – 85.06% tùy thuộc giống hạt bơ sử dụng (Chel-Guerrero và cộng sự, 2016) Hạt tinh bột từ hạt bơ có hình bầu dục, độ mịn cao, kích thước khoảng 5 – 35μm tương tự như hạt tinh bột từ hạt ngô (1 – 25μm) Nghiên cứu so sánh về nhiệt độ hồ hóa giữa các loại tinh bột từ các nguồn nguyên liệu khác nhau (hạt bơ, khoai tây, ngô) cho thấy phạm vi nhiệt độ hồ hóa cao của tinh bột từ hạt

bơ cao hơn (62 – 75oC) so với tinh bột khoai tây (56 – 67oC) và tinh bột ngô (64 – 72oC) cho thấy tinh bột từ hạt bơ có độ liên kết chặt chẽ hơn (Kahn, 1987)

2.2 Tổng quan về nano tinh bột (SNPs)

2.2.1 Giới thiệu

Hạt nano tinh bột (Starch nanoparticles – SNPs) được định nghĩa là các hạt tinh bột có kích thước của ít nhất một chiều nhỏ hơn 1000 nm (Campelo và cộng sự, 2020) Hơn nữa, trong các nghiên cứu thường có yêu cầu về kích thước nghiêm ngặt hơn, tức là phải có ít nhất một chiều có kích thước nhỏ hơn 300 nm (Sun và cộng sự, 2014)

2.2.2 Tính chất của hạt nano tinh bột

a Kích thước hạt nano tinh bột

Theo Sandhu và cộng sự (2017), tinh thể nano tinh bột là các tiểu cầu kết tinh được hình thành do sự phân hủy của hạt tinh bột bằng cách thủy phân Để xác nhận và đánh giá kích thước của các hạt nano tinh bột, các phép đo bằng kính hiển vi lực nguyên tử (Atomic force microscope – AFM) được thực hiện trên hạt tinh thể nano tinh bột (SNC) từ các nguồn gốc khác nhau Các nghiên cứu gần đây ghi nhận SNC thu được có kích thước khác nhau: 40-70 nm đối với tinh bột khoai tây (G Chen và cộng sự, 2008); 30–80 nm cho tinh bột đậu (Y Chen và cộng sự, 2008);

và 70–100 nm đối với sáp tinh bột ngô (Namazi và cộng sự, 2010) Kích thước của các hạt nano tinh bột thay đổi theo các nguồn thực vật và kỹ thuật sử dụng để sản xuất nano tinh bột (Le Corre và cộng sự, 2014; Sandhu và cộng sự, 2017) Theo Sandhu và cộng sự (2017), kích thước của các hạt nano bị ảnh hưởng bởi hàm lượng amylose; hàm lượng amylose cao hơn, các hạt nano được tạo ra lớn hơn

b Tính chất lưu biến

Tính chất lưu biến của dịch huyền phù SNP rất quan trọng đối với quá trình xử lý Tính chất lưu biến của dịch huyền phù SNP cũng có vai trò rất quan trọng để đánh giá khả năng ứng dụng trong công nghiệp của hạt nano tinh bột (Sandhu và cộng sự, 2017) Không có mối quan

hệ cụ thể nào được tìm thấy giữa độ nhớt và kích thước SNC, độ dày, diện tích bề mặt hoặc bề mặt cụ thể Đối với một nồng độ khối lượng nhất định, hạt càng nhỏ thì càng có nhiều hạt trong dung dịch và tương tác giữa các hạt cao hơn, dẫn đến độ nhớt của huyền phù cao hơn Thật vậy SNC có kích thước hạt dưới 100 nm Các huyền phù có SNC với kích thước 600 nm hoặc thấp hơn cho thấy hiện tượng mỏng khi cắt (Kim và cộng sự, 2015)

c Khả năng phân huỷ sinh học

Kümmerer và cộng sự (2011) đã nghiên cứu khả năng phân hủy sinh học của các hạt nano hữu cơ trong môi trường nước thông qua quy trình chuẩn hóa của Tổ chức Hợp tác và Phát triển kinh tế (OECD) về thử nghiệm đóng chai (CBT) SNC cho thấy sự phân hủy nhanh hơn đáng

kể trong 7 ngày đầu tiên so với ghi nhận đối với tinh bột vĩ mô và râu cellulose Sau 28 ngày, SNC đạt tỷ lệ phần trăm phân hủy là 60%, đây là giới hạn loại trừ do OECD xác định về khả năng phân hủy sinh học Để so sánh, râu xenluloza đạt 53% và ống nano cacbon (CNT) và

fullerene hoàn toàn không bị phân hủy Hơn nữa, không có hạt nào được tìm thấy là độc hại đối với các vi sinh vật cần thiết cho quá trình hấp thụ oxy (Kümmerer và cộng sự, 2011)

d Đặc tính biến đổi nhiệt

Phương pháp đo nhiệt lượng quét vi sai (DSC) đã được sử dụng rộng rãi để nghiên cứu đặc tính biến đổi nhiệt của tinh bột Sự thay đổi dòng nhiệt được quan sát có sự chuyển tiếp bậc một (nóng chảy) và chuyển tiếp bậc hai (chuyển tiếp tinh thể) của các polyme Nhiều nhà khoa học quan sát thấy rằng thủy phân acid có ảnh hưởng đáng kể đến nhiệt độ nóng chảy và entanpy của tinh bột gốc như nhiệt độ đầu (To) của các hạt nano tinh bột được tạo ra bởi quá trình thủy phân acid thấp hơn so với các hạt tinh bột ban đầu trong khi nhiệt độ cực đại (Tp) Bên cạnh đó, nhiệt độ nóng chảy cuối (Tc) và entanpy nóng chảy (∆H) cao hơn so với các hạt tinh bột ban đầu, nhiệt độ chuyển hóa tinh thể (Tg) thấp hơn đối với các hạt nano tinh bột đã được quan sát

so với các loại tinh bột gốc (Kim và cộng sự, 2012; Kim và cộng sự, 2009; Shi và cộng sự, 2012) Kết quả này chỉ ra rằng sự phân tách của các chuỗi tinh bột có thể dẫn đến sự sắp xếp lại của nó làm tăng độ kết tinh (Sandhu và cộng sự, 2017)

2.3 Ứng dụng của nano tinh bột

Các hạt nano tinh bột đã thu hút được nhiều sự chú ý bởi vì các thuộc tính độc đáo của chúng khác nhau đáng kể so với các loại vật liệu khác như tính tương thích sinh học, khả năng phân hủy sinh học, chi phí thấp và không độc hại (Haaj và cộng sự, 2016; Rostamabadi và cộng

sự, 2019) Do đó, ngày càng có nhiều nghiên cứu quan tâm đến việc sử dụng tinh bột làm nguyên liệu cho quá trình tổng hợp hạt nano tinh bột cung cấp cho nhiều ứng dụng khác nhau SNPs có vai trò rất quan trọng để cải thiện các đặc tính cơ học, nhiệt độ của màng polyme thực vật Việc

bổ sung các hạt nano này trong màng có thể làm giảm tính thấm nước, bảo vệ thực phẩm khỏi

sự hấp thụ độ ẩm và cải thiện các sai số cơ học của màng, tạo ra các màng dẻo hơn với khả năng chống thấm cao hơn các tác động cơ học (Campelo và cộng sự, 2020)

SNPs có thể được sử dụng để cải thiện hệ nhũ tương thực phẩm Nhũ tương thực phẩm phải ổn định trong quá trình bảo quản, và việc sử dụng chất ổn định là cần thiết để duy trì độ ổn định của nhũ tương Để hệ nhũ tương thực phẩm được ổn định, đã có các nghiên cứu sử dụng SNPs làm chất ổn định hệ nhũ tương như: nhũ tương của tinh bột ngô/ dầu đậu đất (Lu và cộng

sự, 2018) và tinh bột khoai môn/ triglyceride chuỗi trung bình (Shao và cộng sự, 2018) Kết quả cho thấy sự ổn định vật lý tốt hơn và giữ các hợp chất chủ yếu do tạo ra các hạt nhỏ hơn Tuy

nhiên, cần gia nhiệt hệ nhũ tương lên 80oC trong 2 giờ dẫn đến khả năng tách pha cao và cần có nhiều nghiên cứu hơn để làm rõ hơn ứng dụng này của nano tinh bột (Kim và cộng sự, 2015) Việc sử dụng SNPs trong các hệ thống bao bọc có thể là một sự thay thế thú vị cho việc ứng dụng các vật liệu mới làm chất mang các hợp chất hoạt tính sinh học Santoyo‐Aleman và cộng sự (2019), đã nghiên cứu sản xuất các hạt nano tinh bột chuối xanh bằng cách sử dụng kết tủa nano với việc bổ sung acetone và etanol, và nhận thấy hiệu quả đóng gói lớn hơn 95% đối với b-caroten Quá trình này cũng cải thiện sự giải phóng b-carotene được kiểm soát trong các

mô hình tiêu hóa mô phỏng, cho thấy tiềm năng của nó như một phương tiện để đóng gói và phân phối các hợp chất hoạt tính sinh học Ahmad và cộng sự (2019) đã nghiên cứu quá trình đóng gói catechin bằng SNP của thân cây Sen và hạt dẻ nước, và báo cáo rằng trong quá trình tiêu hóa mô phỏng, các hạt nano tạo ra sự bảo vệ tốt cho catechin chống lại các cuộc tấn công của enzyme (Ahmad và cộng sự, 2019) Các hạt nano tinh bột có thể đi vào nhiều mô sinh học nhờ kích thước nhỏ và khả năng di động, các hạt nano tinh bột có kích thước lớn hơn 230 nm

có thể tập trung lại trong các cơ quan, đặc biệt là ở lá lách do kích thước mao mạch của cơ quan này (Kreuter, 1991)

2.4 Phương pháp tạo ra hạt nano tinh bột

Các tác giả đã chỉ ra rằng quá trình thủy phân hướng tới amylose, và các hạt nano tinh bột

đã được biến đổi thành phần hóa học, dẫn đến sản xuất tinh bột có hàm lượng amylose khác nhau, do đó ảnh hưởng đến năng suất quá trình, hình dạng tinh thể và các ứng dụng công nghiệp,

mở ra một lĩnh vực mới của nghiên cứu Một số phương pháp sản xuất các hạt nano tinh bột được đề cập dưới đây, được phân loại là các phương pháp chuẩn và độc đáo, chú trọng vào các nghiên cứu trong 5 năm qua (Campelo và cộng sự, 2020)

2.4.1 Phương pháp thủy phân bằng acid

Các nghiên cứu đầu tiên về sản xuất tinh thể nano tinh bột đã được công bố bởi Dufresne

và cộng sự (1996), người đã điều chỉnh phương pháp thủy phân bằng acid được sử dụng để sản xuất tinh thể nano cellulose Nghiên cứu này tạo ra tinh bột kích thước nano bằng phương pháp thủy phân bằng acid sử dụng sulfuric acid (H2SO4) hoặc acid clohydric (HCl) ở nhiệt độ dao động từ 25 đến 55oC Angellier và cộng sự (2004) đã nghiên cứu quá trình thủy phân các hạt nano tinh bột bằng acid nhằm mục đích thu được năng suất cao hơn, sử dụng năm biến số: nhiệt

độ, nồng độ acid, nồng độ tinh bột ngô sáp, thời gian thủy phân và kích thích Hỗn dịch được

tạo ra sau 5 ngày phản ứng, sử dụng H2SO4 3,16 M ở 40oC và 100 vòng/ phút, có hiệu suất của quá trình là 15,7% đối với nồng độ tinh bột là 14,69% trọng lượng

Cần có các nghiên cứu sâu hơn để tối ưu hóa quy trình nhằm đạt năng suất cao hơn, đặc điểm cấu trúc của tinh bột nano, bao gồm hàm lượng amylose và phân bố chiều dài chuỗi nhánh amylopectin Ngoài ra, có thể khám phá các phân tích nhiễu xạ tia X, đo nhiệt lượng quét vi sai và các phương pháp luận khác để hiểu cấu trúc ống nano và tính ổn định hoặc sắp xếp lại cấu trúc trong quá trình bảo quản (Campelo và cộng sự, 2020)

2.4.2 Phương pháp xử lý enzyme

Các lựa chọn thay thế khác cho quá trình thủy phân bằng acid bao gồm việc sử dụng các enzyme để thủy phân các chuỗi tinh bột Sun và cộng sự (2014) đã nghiên cứu việc sử dụng pullulanase trong sản xuất các hạt nano tinh bột ngô sáp Các tác giả đã tạo ra các hạt nano trong phạm vi 60 – 120 nm với độ tinh thể tương đối gần 55% và năng suất quá trình trên 85% Pullulanase là một carbohydrase thủy phân các liên kết glycosidic α-1,6 thành amylopectin chuỗi nhánh, khi các liên kết α-1,6 tạo ra các nhánh nằm trong vùng vô định hình của amylopectin (Sun và cộng sự, 2014) Miao và cộng sự đã sử dụng pullulanase trong tinh bột ngô sáp đã hồ hóa, và quan sát thấy rằng thời gian và nồng độ enzyme có thể làm thay đổi tỷ lệ của vùng đường tinh thể và vô định hình (Miao và cộng sự, 2009) LeCorre và cộng sự (2012) đã khảo sát ảnh hưởng của ba loại enzyme tác động lên tinh bột là α-amylase, β-amylase và glucoamylase và chứng minh được rằng việc xử lý sơ bộ với enzyme glucoamylase làm giảm đáng kể thời gian điều chế tinh bột bằng cách tạo ra một con đường để acid khuếch tán vào trong hạt tinh bột, từ đó làm cho các vùng vô định hình trong hạt tinh bột dễ bị thuỷ phân hơn Tuy nhiên, các tác giả đã tập trung vào sản xuất tinh bột tiêu hóa chậm hơn là tinh bột kích thước nano Những phát hiện đó có thể dẫn đến những kết quả mới, một khi sự giảm liên kết α-1,6 và

sự gia tăng chuỗi mạch thẳng liên kết α-1,4 của các hạt nano tinh bột được quan sát, cho thấy rằng SNP được phân nhánh bằng enzyme có thể khác về cấu trúc so với biến đổi hóa học (Campelo và cộng sự, 2020)

2.4.3 Xử lý theo phương pháp vật lý

a Phương pháp xử lý bằng sóng siêu âm

Xử lý bằng sóng siêu âm (20 kHz và 50 W) cũng có thể được sử dụng trong sản xuất hạt nano tinh bột từ tinh bột sắn Trong một nghiên cứu so sánh, các tác giả báo cáo rằng Hoa Kỳ

đã dẫn đến tăng năng suất quá trình (từ 30 lên 93,18%), với các hạt nhỏ hơn (112,02–70,97 nm) khi so sánh với quá trình thủy phân bằng acid (Campelo và cộng sự, 2020) Nghiên cứu của Minakawa và cộng sự (2019) đã sử dụng sóng siêu âm ở tần số 20 kHz và nhận thấy rằng các hạt nano tinh bột từ ngô, sắn và khoai mỡ có kích thước hạt tương ứng trong khoảng 36–68 nm, 35–65 nm và 8–32 nm Nó cũng được quan sát thấy giá trị màu xanh lam thấp hơn trong tinh bột kích thước nano khi so sánh với tinh bột bản địa, cho thấy sự phân hủy của các lớp vô định hình (amylose) của các hạt tinh bột (Minakawa và cộng sự, 2019) Sihem Bel Haaj và cộng sự (2012) cũng đã tiến hành thí nghiệm cho 100ml dịch tinh bột huyền phù với hàm lượng rắn là 1.5% vào một hộp thuỷ tinh và ủ trong bồn nước ở nhiệt độ ổn định tại 8 ± 1 oC Sau đó truyền sóng âm với công suất 80% trong vòng 75 phút Kết quả thu được là kích thước hạt giảm xuống còn 100-200 nm sau khi sử dụng phương pháp siêu âm trong 75 phút, riêng ngô sáp khi sử dụng phương pháp này thì sau 60 phút đã giảm kích thước xuống còn 80 nm (Haaj và cộng sự, 2013)

b Phương pháp siêu âm nhiệt

Quá trình siêu âm nhiệt có thể được sử dụng để giảm thời gian xử lý để tạo ra các hạt nano tinh bột bằng cách thủy phân bằng acid Các thông số khác nhau bao gồm đặc điểm tinh bột và acid, nhiệt độ, và thời gian siêu âm được đánh giá để đánh giá năng suất quá trình, kích thước hạt, tải trọng bề mặt và độ kết tinh của tinh bột ngô có kích thước nano (82,2–360 nm) Các tác giả báo cáo độ kết tinh trên 35% ở 40 C và 45 phút của quá trình Năng suất của quá trình bị ảnh hưởng mạnh bởi nhiệt độ và thời gian xử lý, với các giá trị nằm trong khoảng 5–20% vào cuối quá trình Thời gian xử lý ngắn có thể là một giải pháp thay thế cho việc sản xuất tinh bột kích thước nano ở quy mô công nghiệp (Campelo và cộng sự, 2020)

c Phương pháp xay nghiền

Xay nghiền là một kỹ thuật sạch với môi trường để sản xuất các hạt nano tinh bột, và có thể ảnh hưởng trực tiếp đến các đặc tính hóa lý của tinh bột, tạo thành các hạt nano vô định hình hơn Patel và cộng sự (2016); Lu và cộng sự (2018) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các biến quá trình trong quá trình sản xuất hạt nano ngô thông qua nghiền môi trường có khuấy (lần lượt là 266,4–309,8 nm và 700 nm) Cả hai tác giả đều quan sát thấy sự giảm mạnh độ ổn định của hạt nano khi tăng thời gian xay nghiền (Lu và cộng sự, 2018; Patel và cộng sự, 2016)

2.4.4 Phương pháp kết tủa (nanoprecipitation)

Kết tủa nano bao gồm việc thêm từ từ dung dịch polyme loãng vào dung dịch không dung môi hoặc liên tiếp thêm chất không dung môi vào dung dịch polyme, do đó dẫn đến sự hình thành các hạt polyme có kích thước nano Những ưu điểm bao gồm thu được các hạt hệ mét nano đồng nhất hơn và ít sử dụng các dung môi độc hại hơn (Campelo và cộng sự, 2020) Chin

và cộng sự (2011) đã điều chế nano tinh bột bằng phương pháp này và thu được kết quả là tỷ lệ thể tích của dung dịch tinh bột với ethanol càng nhỏ thì kích thước hạt nano càng nhỏ khi với tỷ

lệ 1:10 thì kích thước hạt là 5µm còn với tỷ lệ 1:20 thì kích thước hạt đã giảm xuống với kích thước từ 300 – 400 nm Kết tủa nano là một công nghệ có triển vọng hơn khi so sánh với các phương pháp tổng hợp khác, vì nó là một kỹ thuật đơn giản, chi phí thấp và ít rủi ro về nguy cơ tạp nhiễm mẫu Các nghiên cứu về SNP thu được bằng kết tủa nano đã báo cáo kích thước hạt trong khoảng 200–700 nm, 163–216 nm và 60–123 nm đối với SNP của tinh bột ngô sáp, khoai

mì và ngô sáp (Campelo và cộng sự, 2020)

2.4.5 Phương pháp nhũ tương – liên kết chéo (emulsion-crosslinking)

Emulsion-crosslinking là phương pháp mới đang được quan tâm và nghiên cứu trong thời gian gần đây Phương pháp này dựa trên tương tác của pha nước có chứa các chất ưa nước tự nhiên như tinh bột và chất liên kết chéo trong pha dầu với sự có mặt của chất nhũ hoá Hệ nhũ tương có thể tạo ra các hạt nhỏ thông qua phản ứng liên kết chéo dù kích thước của hạt vẫn ở mức micro (Kim và cộng sự, 2015)

Hiện nay có rất nhiều phương pháp có thể được sử dụng để thủy phân tinh bột tạo hạt nano Tuy nhiên, phương pháp xử lý enzyme vẫn là phương pháp thường được sử dụng để tọa hạt nano tinh bột do có khả năng tạo ra hạt nano có kích thước nhỏ từ 60 – 120 nm, hiệu suất cao Trong nghiên cứu này, 2 phương pháp xử lý enzyme và xử lý enzyme kết hợp với xử lý acid được sử dụng để tạo hạt nano tinh bột từ tinh bột hạt bơ

2.5 Tổng quan về glucoamylase (GAs)

Glucoamylase (1,4-α-glucan glucohydrolase, E.C.3.2.1.3) xúc tác giải phóng glucose từ đầu không khử của tinh bột, glycogen và gluco-oligosaccharides

D-Hình 2.1 Sơ đồ mô hình hoạt động của các enzyme thủy phân tinh bột

Các hình lục giác đại diện cho các đơn vị glucose, các liên kết đã bị thuỷ phân

được biểu thị bằng các hình lục giác màu trắng bị ngắt liên kết

Hình 2.1 biểu thị các vị trí cắt liên kết của các enzyme thủy phân trên các phân tử tinh bột

Từ hình cho thấy các phân tử GAs chủ yếu xúc tác thủy phân tại các liên kết α-1,4-glucosidic

và một phần nhỏ các liên kết kết α-1,6-glucosidic với tốc độ chậm hơn, do đó glucoamylase vẫn

có đặc tính cắt nhánh (debranching activity) nhưng yếu hơn nhiều so với pullulanase (Ganghofner và cộng sự, 1998a; Soccol và cộng sự, 2006) Với đặc tính trên, glucoamylase được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu để tạo hạt nano tinh bột Một số nghiên cứu có sử dụng glucoamylase để tạo hạt nano tinh bột: nghiên cứu của Hao và cộng sự (2018) sử dụng phương pháp xử xý acid kết hợp xử lý enzyme tạo ra hạt nano tinh bột có kích thước 70 – 250 nm; LeCorre và cộng sự (2012) đã tạo ra hạt nano tinh bột có kích thước 50 – 100 nm bằng phương pháp xử lý acid kết hợp với xử lý enzyme

2.5.1 Phân loại

Glucoamylase được phân làm hai nhóm chính dựa trên khả năng chuyển hoá tinh bột và β-dextrin giới hạn thành glucose gồm một nhóm chuyển hoá tinh bột và β-dextrin giới hạn hoàn toàn thành glucose, nhóm còn lại chuyển hoá 80% tinh bột và 40% β-dextrin giới hạn thành glucose Tuy nhiên, các α-dextrin và panose được thuỷ phân hoàn toàn thành glucose bởi cả hai nhóm (Fleming, 1968)

2.5.2 Nguồn gốc

a Nấm (fungi)

Hiện nay, GAs sử dụng trong công nghiệp được thu nhận chủ yếu từ Aspergillus niger và

Rhizopus oryzae do tính ổn định nhiệt tốt cũng như hoạt tính cao của chúng ở các giá trị pH gần

trung tính (Mohamed và cộng sự, 2007) Ngoài ra, GAs cũng có thể được tổng hợp từ các loại

nấm ưa nhiệt như Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspegillus niger, Aspergillus

oryzae, Aspergillus terreus, Mucor rouxians, Mucor javanicus, Neurospora crassa, Rhizopus delmar spp, Rhizopus andyza Arthrobotrys amerospora (Norouzian và cộng sự, 2006)

b Vi khuẩn

Ngoài các nguồn GAs từ các loại nấm ưa nhiệt thì còn có thể thu GAs từ các loài vi khuẩn

kỵ khí như Clostridium thermosaccharolyticum và C thermohydrosulfuricum hoặc từ một số loài vi khuẩn hiếu khí như Stearothermophilus, Flavobacterium sp, Lactobacillus amylovorus,

Halobacterium sodamense, Sclerotinia sclerotiorum, Sclerotium rolfsii (Soccol và cộng sự,

2006)

c Nấm men

Ngoài nấm và vi khuẩn, số loài nấm men như Candida antartica, Saccharomycopsis

fibuligera, Pichia subpelliculosa, Saccharomyces diasticus cũng được nghiên cứu cho thấy là

có khả năng thu nhận GAs

2.5.3 Tính chất

GAs từ các loài nấm ưa nhiệt lại có nhiệt độ tối ưu cao hơn như Humicola grisea,

Acremonium sp và A terreus có nhiệt độ tối ưu ở 60oC; Thermomyces lanuginosus,

Streptosporangium sp., Clostridium thermosaccharolyticum có nhiệt độ tối ưu là 70oC; hay

C thermohydrosulfuricum có nhiệt độ tối ưu ở 75oC (Soccol và cộng sự, 2006)

Trong khi đó, các GAs có nguồn gốc từ vi sinh vật có nhiệt độ tối ưu thấp hơn như: GAs

thu nhận từ R delema và A oryzae có nhiệt độ tối ưu là 40oC; GAs thu được từ A niger,

A oryzae, Monascus kaoliang, Mucor rouxinos, Penicillium oxalicum có nhiệt độ tối ưu nằm

trong khoảng từ 50 – 55oC (Miah và cộng sự, 1977; Pandey, 1990; Selvakumar và cộng sự, 1996)

Đã có nhiều báo cáo đã chỉ ra rằng GAs có khả năng chịu được pH acid cao hoặc gần

trung tính để đạt điều kiện hoạt động tối ưu như GAs từ Humicola lanuginose có pH tối ưu là 4.9 và 6.6, C cerebella và C rolfsii có thể hoạt động ổn định ở pH 9.0 (Pandey, 1995)

2.6 Tổng quan về pullulanase

Ngày nay, pullulanase (EC 3.2.1.41) hay còn được biết với tên gọi là α-dextrin 6-glucanohydrolase, pullulan 6-glucanohydrolase,limit dextrinase, and amylopectin

6-glucanohydrolase Pullulanase đang được sử dụng ngày càng nhiều trong các ngành sản xuất tinh bột Đây là một enzyme cắt nhánh (debranching) quan trọng, đã được sử dụng rộng rãi để thủy phân liên kết α-1,6 glucosidic trong tinh bột, amylopectin, pullulan và các oligosaccharid liên quan (Hii và cộng sự, 2012) Với các đặc điểm trên, enzyme pullulanase thường được ứng dụng trong nghiên cứu để thủy phân tạo hạt nano tinh bột Một số nghiên cứu sử dụng pullulanase trong sản xuất nano tinh bột: Sun và cộng sự (2014) đã sử dụng pullulanase để thủy phân tinh bột và thu được hạt nano tinh bột có kích thước 60 – 120 nm; Qiu và cộng sự (2016) thu được hạt nano tinh bột có kích thước 20 – 100 nm bằng phương pháp xử lý tinh bột bằng enzyme pullulanase kết hợp với kết tủa nano

Hình 2.1 cho thấy các phân tử tinh bột khi phản ứng với pullulanase sẽ bị thủy phân chủ yếu tại liên kết α-1,6 glucosidic, tạo nên đặc tính cắt nhánh (debranching activity) cho enzyme pullulanase

Hình 2.2 Cấu trúc không gian của phức hệ PulA-maltotetraose

Cấu trúc không gian của pullanase có thể được chia làm 4 miền: N1 (xanh lam), N2 (xanh lá cây), A (chuỗi xoắn α màu xanh ngọc, sợi nhánh β màu tím) và C (màu vàng) Ion Canxi được biểu thị bằng một hình cầu màu cam và các maltotetraose được biểu thị như

những mô hình hình que (Xu và cộng sự, 2014)

2.6.1 Phân loại

Các enzyme pullulanase được phân loại thành 2 nhóm dựa trên đặc tính cơ chất và sản phẩm tạo thành Pullulanase type I có thể thủy phân hiệu quả các liên kết α-1,6 glucosidic trong pullulan và polysaccharide phân nhánh Pullulanase type II, còn được gọi là amylopullulanase, nổi bật trong ngành công nghiệp chế biến tinh bột do có khả năng cắt nhánh thông qua thủy

phân các liên kết α-1,6 và α-1,4 glucosidic; ngoài ra pullulanase type II còn có thể thủy phân các liên kết α-1,4 glucosidic trong tinh bột, amylose và amylopectin (Hii và cộng sự, 2012)

2.6.2 Nguồn gốc

Pullulanase là enzyme có nguồn gốc từ các loại vi sinh vật khác nhau như Bacillus

acidopullulyticus, Kebsiella planticola, Bacillus demificans, thermophilic Bacillus sp AN-7, Bacillus cereus FDTA-13, Geobacillus stearothermophillus (Hii và cộng sự, 2012)

2.6.3 Tính chất của pullulanase

Nghiên cứu của Ganghofner và cộng sự (1998b) về amylopullulanase cho thấy pullulanase đạt điều kiện hoạt động tối ưu trong khoảng pH 5,0 – 5,5 Nhiệt độ hoạt động tối ưu của enzyme pullulanase thường nằm trong khoảng 55 – 75oC Nghiên cứu của Hii và cộng sự (2012) cho thấy một số loại enzyme pullulane type II có nhiệt độ hoạt động tối ưu lên tới 90 – 100oC Dựa trên những tài liệu đã tổng hợp được, chưa có nghiên cứu nào sử dụng enzyme pullulanase để thủy phân tạo hạt nano tinh bột từ tinh bột hạt bơ Vì vậy, trong nghiên cứu này pullulanase được sử dụng để thủy phân tạo hạt nano tinh bột từ tinh bột hạt bơ Khảo sát nồng

độ và thời gian thủy phân tối ưu để tạo hạt nano tinh bột, ảnh hưởng của loại enzyme và xử lý sulfuric acid đến tính chất hạt nano tinh bột thu được

CHƯƠNG 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

3.1 Nguyên liệu, hóa chất

3.1.1 Hạt quả bơ

Hạt quả bơ (Persea americana) được mua tại cửa hàng sinh tố 80 Hữu Nghị (địa chỉ: số

80 Hữu Nghị, Bình Thọ, Thủ Đức, Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam)

3.2 Quy trình sản xuất tinh bột hạt bơ sử dụng trong nghiên cứu

Quy trình tách hạt tinh bột được tiến hành dựa theo phương pháp của (Chel-Guerrero và cộng sự, 2016) với một số sửa đổi:

3.2.1 Sơ đồ quy trình sản xuất tinh bột hạt bơ sử dụng trong nghiên cứu:

Hình 3.1 Quy trình thu tinh bột hạt bơ trong nghiên cứu 3.2.2 Thuyết minh quy trình:

a Loại bỏ vỏ hạt

- Mục đích: loại bỏ vỏ hạt bơ

- Cách thực hiện: dùng dao cắt vỏ hạt, sau đó lột bỏ vỏ hạt bơ

b Cắt nhỏ hạt bơ

- Mục đích: làm giảm kích thước của hạt bơ, tăng hiệu quả khi chần

- Cách thực hiện: cắt nhỏ hạt bơ thành dạng từng lát mỏng từ 1 – 2mm

c Chần

- Mục đích: bất hoạt enzyme oxy hóa polyphenol

Xay Chần (80 oC, 15 phút) Cắt nhỏ

Bỏ vỏ Hạt bơ

Tinh bột hạt bơ

NaHSO3 (1500 ppm SO2)

Ly tâm Lọc

Sấy

- Cách thực hiện: hạt bơ sau khi đã cắt nhỏ sẽ được chần trong nước sôi ở nhiệt độ 80oC trong 15 phút

d Xay

- Mục đích: phá vỡ tế bào của hạt, giải phóng tinh bột trong các tế bào của hạt

- Cách thực hiện: cho phần hạt bơ đã chần vào dung dịch NaHSO3 (nồng độ tương đương

1500 ppm SO2) theo tỷ lệ 1:5 (w/v), sau đó xay bằng máy xay sinh tố trong vòng 3 phút Sau đó ngâm phần dịch hạt bơ đã xay, đồng thời khuấy trộn trong 1 giờ

e Lọc

- Mục đích: loại bỏ xơ và các phân tử có kích thước lớn

- Cách thực hiện: lọc qua rây 80 mesh, loại bỏ phần xơ phía trên và thu lấy dịch chứa tinh bột rồi lắng dịch tinh bột trong 4 giờ, sau đó loại bỏ phần dịch trong

f Ly tâm

- Mục đích: loại bỏ NaHSO3 và các phân tử có kích thước nhỏ

- Cách thực hiện: rửa lại tinh bột thu được bằng nước cất, sau đó ly tâm ở 3500rpm trong

12 phút

g Sấy

- Mục đích: sấy khô tinh bột đã thu được để bảo quản

- Cách thực hiện: tinh bột sau đó được sấy khô ở 60oC trong 12h bằng máy sấy đối lưu, sau đó rây qua rây có kích thước 0.125 cm

3.3 Quy trình thu nhận hạt nano tinh bột theo phương pháp kết tủa nano kết hợp với tiền xử lý enzyme

Quy trình thu nhận hạt nano tinh bột được thực hiện dựa trên phương pháp của (Qiu và cộng sự, 2016) với một vài sửa đổi:

3.3.1 Sơ đồ quy trình công nghệ:

Hình 3.2 Sơ đồ quy trình thu nhận hạt nano tinh bột bằng phương pháp

xử lý enzyme trong nghiên cứu 3.3.2 Thuyết minh quy trình

Đối với mẫu thủy phân bằng enzyme glucoamylase: lấy 1g tinh bột hoà vào 10mL dung dịch đệm acetate (0.1M và pH=5), sau đó đun cách thủy để hồ hóa tinh bột trong 30 phút

b Thuỷ phân với enzyme

- Mục đích: thủy phân amylose và amylopectin trong dung dịch

Thuỷ phân bằng enzyme Làm nguội

Dung dịch đệm phosphate/citrate

Hồ hóa Tinh bột hạt bơ

Sản phẩm

Enzyme

Sấy thăng hoa