LUẬN VĂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC TÌM HIỂU QUY TRÌNH SẢN XUẤT ENZYME BROMELAIN TỪ VỎ DỨA

Nghiên cứu enzyme còn có ý nghĩa thực tiễn rất quan trọng, đối với một số bệnh, đặc biệt là bệnh mang tính di truyền, có thể do thiếu hay mất hẳn một hoặc số enzyme trong các mô, các điề

HCM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

TÌM HIỂU QUY TRÌNH SẢN XUẤT ENZYME

BROMELAIN TỪ VỎ DỨA

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện : PHAN THỊ NGỌC CHÂU MSSV: 0811110006 Lớp: 08CSH2

TP Hồ Chí Minh, 2011

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng, khóa luận tốt nghiệp “Tìm hiểu quy trình sản xuất

enzyme Bromelain từ vỏ dứa” là công trình nghiên cứu của riêng tôi

Các số liệu sử dụng trong khóa luận la trung thực có nguồn gốc cụ thể, rõ ràng Nội dung khóa luận thực hiện trên cơ sở lý thuyết, kiến thức và co tham khảo thêm một số tài liệu, sách báo và tập chí theo danh mục của khóa luận

Sinh viên thực hiện

Phan Thị Ngọc Châu

MỤC LỤC

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu dề tài 2

1.2.1 Mục tiêu tổng quát 2

1.2.2 Mục tiêu cụ thể 2

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 3

2.1 Giới thiệu sơ luợc về enzyme 3

2.2 Enzyme protease 4

2.2.1.Giới thiệu sơ lược các enzyme protease 5

2.2.1.1 Protease động vật 5

2.2.1.2 Protease thực vật 5

2.2.1.3 Protease vi sinh vật 6

2.2.2 Ứng dụng enzyme protease 9

2.3 Enzyme bromelain thu nhận từ vỏ dứa 11

2.3.1 Giới thiệu enzyme bromelain 11

2.3.2 Tính chất vật lí của enzyme bromelain 11

2.3.3 Tính chất hoá học của enzyme bromelain 12

2.3.3.1 Cấu tạo hoá học 12

2.3.3.2 Cấu trúc không gian của bromelain 12

2.3.4 Hoạt tính của enzyme bromelain 13

2.3.4.1 Cơ chế tác động 13

2.3.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme Bromelain 14

2.3.5 Ứng dụng của enzyme Bromelain 15

2.3.5.1 Trong công nghiệp thực phẩm 15

2.3.6 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về enzyme bromelain 16

2.3.6.1 Tình hình nghiên cứu enzyme bromelain trong nước 16

2.3.6.2 Tình hình nghiên cứu enzyme bromelain ngoài nước 17

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

3.1 Vật liệu và hóa chất 18

3.1.1 Nguyên liệu 18

3.1.2 Hóa chất 18

3.1.3 Thiết bị 18

3.2 Quy trính tách chiết Enzyme Bromelain 19

3.2.1 Thuyết minh quy trình 20

3.2.2 khảo sát các tác nhân tủa enzyme bằng cồn 960, muối Ammonium sulfate (NH4)2SO4 và aceton (CH3COCH3) 20

3.2.2.1 Nguyên tắc 20

3.2.2.2 Tủa enzyme bằng cồn 960 20

3.2.2.3 Tủa enzyme bằng muối Ammonium sulfate (NH4)2SO4 21

3.2.2.4 Tủa enzyme bằng aceton (CH3COCH3) 21

3.2.3 Phương pháp xác định hàm lượng protein và hoạt tính bromelain từ dịch chiết enzyme 22

3.2.3.1 Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford 22

3.3 Enzyme cố định 28

3.3.1 Định nghĩa enzyme cố định 28

3.3.2 Tính chất ưu và nhược điểm của enzyme cố định 29

3.2.2.1 Ưu điểm 29

3.3.2.2 Nhược điểm 29

3.3.3 Một số phương pháp cố định enzyme 30

3.3.3.1 Phương pháp liên kết enzyme với vật liệu cố định (carrier binding) .30

3.3.3.2 Phương pháp hấp thụ vật lí (physical adsorption) 30

3.3.3.4 Phương pháp khâu mạch (cross – linking) 32

3.3.4 Cố định enzyme bromelain trên cơ chất Natrialginate bằng phương pháp nhốt 33

3.3.4.1 Đặc điểm, tính chất của Natrialginate 33

3.3.4.2 Tạo dung dịch Natrialginate 3% 33

3.3.4.3 Tiến hành cố định 33

3.3.4.4 Phương pháp xác định hiệu suất cố định protein và hiệu suất cố định hoạt tính của enzyme cố định 33

3.3.5 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố lý hóa đến hoạt tính của enzyme bromelain được cố định trên Natrialginate 34

3.3.5.1 Khảo sát ảnh hưởng của pH 34

3.3.5.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ 34

3.3.5.3 Khảo sát độ bền nhiệt 35

3.3.5.4 Khảo sát số lần tái sử dụng bromelain cố định trên Natrialginate 35 3.3.6 Tinh sạch enzyme bromelain bằng sắc ký lọc gel 35

3.3.6.1 Nguyên tắc 36

3.3.6.2 Thiết bị và hóa chất 36

3.3.6.3 Các bước tiến hành 36

3.3.6.4 Tính hiệu suất về hoạt tính enzyme Bromelain và độ tinh sạch của enzyme sau tinh sạch bằng sắc ký lọc gel 38

3.3.7 Xác định trọng lượng phân tử enzyme Bromelain bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamid (SDS – PAGE) 39

3.3.7.1 Nguyên tắc 39

3.3.7.2 Thiết bị và hóa chất 39

3.3.7.3 Phương pháp 41

3.3.7.4 Xác định trọng lượng phân tử của enzyme Bromelain 43

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44

4.1 Kết luận 44

4.2 Kiến nghị 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 46

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Tính chất vật lý của enzyme bromelain 11

Bảng 2.2 Ảnh hưởng của trạng thái và điều kiện bảo quản 15

Bảng 3.1 Tỷ lệ bằng cồn 96o đối với dịch enzyme từ vỏ dứa 20

Bảng 3.2 Nồng độ tủa bằng muối (NH4)2SO4 đối với dịch enzyme từ vỏ dứa 21

Bảng 3.3 Tỉ lệ tủa bằng aceton đối với dịch enzyme từ vỏ dứa 22

Bảng 3.4 Bảng số liệu dựng đường chuẩn albumin 24

Bảng 3.5 Bảng số liệu dựng đường chuẩn tyrosine 26

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1 Cấu trúc gian của enzyme protease 4

Hình 2.2 Nguồn enzyme protease từ thực vật 6

Hình 2.3 Vi khuẩn Clostridium 7

Hình 2.4 Vi khuẩn Bacillus 7

Hình 2.5 Nấm mốc 8

Hình 2.6 Xạ khuẩn 8

Hình 3.1 Thiết bị lọc gel áp suất thấp 35

Hình 3.2 Loại muối trước khi chạy sắc ký 38

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Hầu như mọi phản ứng hóa học trong cơ thể sống đều cần phải có vai trò xúc tác của enzyme – chất xúc tác sinh học Chính vì vậy, những nghiên cứu về enzyme

đã thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học ở các lĩnh vực liên quan khác nhằm tìm ra được những công dụng khác nhau của mỗi enzyme Nghiên cứu về công nghệ enzyme đã được tiến hành bởi nhiều tác giả như sử dụng phủ tạng của lò mổ để sản xuất pancrease, pepsin, tripsin, sử dụng mầm mạ để sản xuất amylase Đã có những thử nghiệm công nghệ như sản xuất amino acid từ nhộng tằm bằng protease, bột protein thịt bằng enzyme bromelain từ vỏ dứa…

Nghiên cứu enzyme còn có ý nghĩa thực tiễn rất quan trọng, đối với một số bệnh, đặc biệt là bệnh mang tính di truyền, có thể do thiếu hay mất hẳn một hoặc số enzyme trong các mô, các điều kiện không bình thường cũng có thể xuất hiện do hoạt tính dư thừa của một số enzyme đặc hiệu Do đó xác định hoạt tính của một số enzyme trong huyết tương, hồng cầu hoặc trong các mô là rất quan trọng trong việc chẩn đoán bệnh Enzyme đã trở thành các công cụ thực tế quan trọng không những trong y học mà cả trong công nghệ hóa học, trong chế biến thực phẩm…Đối với nước ta nguồn enzyme từ thực vật có triển vọng lớn vì nguồn nghiên liệu rất phong phú ( dứa, đu đủ,… ) Trong quá trình chế biến dứa đóng hộp chỉ sử dụng một phần của quả dứa, phần còn lại là phụ phẩm Nếu tận dụng được nguồn phế phẩm thì vừa

có thể giảm thiểu chất hữu cơ gây ô nhiễm môi trường vừa có thể sản xuất sản phẩm enzyme bromelain có từ cây dứa Enzyme bromelain có ba hoạt tính khác nhau: peptidase, amidase, esterase có thể phân hủy cả cơ chất tự nhiên lẫn cơ chất tổng hợp, chúng có giá trị kinh tế cao

Từ những lợi ích của enzyme bromelain mang lại, được sự chấp nhận của Khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ

Thành Phố Hồ Chí Minh, chúng tôi xin tiến hành thực hiện khóa luận “Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa”

1.2 Mục tiêu dề tài

1.2.1 Mục tiêu tổng quát

Quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa

Cố định enzyme bromelain trên Natrialginate

1.2.2 Mục tiêu cụ thể

Thu nhận dịch enzyme bromelain từ vỏ dứa

((NH4)2SO4 ) và aceton ( CH3COCH3 )

Cố định enzyme bromelain trên Natrialginate

Tinh sạch enzyme bromelain

Xác định trọng lượng phân tử enzyme bromelain bằng phương pháp điện di

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 2.1 Giới thiệu sơ luợc về enzyme

Enzyme là các chất xúc tác của hệ thống sinh học Chúng có khả năng xúc tác đặc biệt, thường là mạnh hơn nhiều so với các chất xúc tác tổng hợp Tác dụng xúc tác của chúng mang tính đặc hiệu đối với cơ chất, làm tăng đáng kể tốc độ các phản ứng hóa học xảy ra trong môi trường nước trong các điều kiện nhiệt độ và pH thích hợp Enzyme là một trong các chìa khóa để hiểu biết quá trình hoạt động sống của

tế bào Hoạt động trong những trật tự có tính tổ chức cao, chúng xúc tác hàng trăm phản ứng theo trật tự xác định trong các con đường trao đổi chất mà nhờ đó các chất dinh dưỡng bị phân hủy, năng lượng hóa học được lưu dữ và biến đổi, các đại phân

tử sinh học được tạo ra từ các chất tiền thân đơn giản Một số enzyme tham gia trong quá trình trao đổi chất là những enzyme điều hòa, chịu trách nhiệm đối với các tín hiệu trao đổi chất khác nhau bằng cách thay đổi hoạt tính xúc tác của chúng một cách thích hợp Thông qua hoạt động của enzyme điều hòa các hệ thống enzyme phối hợp chặt chẽ với nhau để tạo ra mối quan hệ hài hòa giữa các hoạt tính trao đổi chất cần thiết cho việc duy trì sự sống

Enzyme có trong mọi cơ thể sinh vật, nó không những làm nhiệm vụ xúc tác cho các phản ứng hóa học nhất định trong cơ thể sinh vật mà còn xúc tác cho các phản ứng ngoài tế bào Vì có nguồn gốc từ sinh vật cho nên enzyme thường được gọi là chất xúc tác sinh học ( biocatalisateur ) nhằm phân biệt với các chất xúc tác hóa học khác.Chính nhờ sự có mặt của enzyme mà nhiều phản ứng hóa học rất khó xảy ra trong điều kiện thường ở ngoài cơ thể (do cần nhiệt độ, áp suất cao, acid mạnh hay kiềm mạnh…) nhưng trong cơ thể nó xảy ra hết sức nhanh chóng, liên tục

và nhịp nhàng với nhiều phản ứng liên hợp khác trong điều kiện hết sức êm dịu, nhẹ

Đặc tính quan trọng nhất của enzyme là tính đặc hiệu Tính đặc hiệu là khả năng xúc tác chọn lọc, xúc tác sự chuyển hóa một hay một số chất nhất định theo một kiểu phản ứng nhất định: đặc hiệu cảm ứng và đặc hiệu cơ chất

Enzyme không thể tổng hợp bằng con đường hóa học Do đó muốn thu nhận enzyme chỉ có con đường duy nhất là thu nhận từ cơ thể sinh vật Tất cả các tế bào động vật, thực vật, vi sinh vật đều chứa enzyme nhưng mức độ enzyme thì hoàn toàn khác nhau

Hiện nay người ta khai thác enzyme từ ba nguồn cơ bản:

− Nguồn động vật

− Nguồn thực vật

− Nguồn vi sinh vật

2.2 Enzyme protease

Nhóm enzyme protease ( peptit – hidrolase 3.4) xúc tác quá trình thủy phân

cùng là axit amin Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thủy phân liên kết este và vận chuyển axit amin

Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật ( vi khuẩn, nấm, virus) đến thực vật ( đu đủ, dứa…) và động vật ( gan, dạ dày…) So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất có thể tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhât

Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thủy phân triệt để và đa dạng

Hình 2.1 Cấu trúc gian của enzyme protease

2.2.1.Giới thiệu sơ lược các enzyme protease

nghiên cứu và ứng dụng đầy đủ nhất Trong thực tế nhiều chế phẩm renin bị nhiễm pepxin (trong trường hợp thu chế phẩm renin ở bê quá thì khi đó dạ dày bê đã phát triển đầy đủ có khả năng tiết ra pepxin) thì khả năng đông tụ sữa kém đi

Gần đây có nghiên cứu sản xuất protease từ vi sinh vật có đặc tính renin như ở

các loài Eudothia Parasitica và Mucor Purillus

Các loại nội tạng khác: Gan, lá lách, thận, phổi, cơ hoành tim, dạ con, huyết, các loại bộ phận này đều chứa enzyme chúng tồn tại trong tế bào Chỉ có một số loại được sản xuất dưới dạng chế phẩm như: gan, tim lợn để tách aspartac-glutamate aminotransferase, huyết tương ( từ huyết ) để tách ra trombia ( Proenzyme chống đông máu )

2.2.1.2 Protease thực vật

Có 3 loại protease thực vật như Bromelain, Papain và Ficin Papain thu được

từ nhựa của lá, thân quả đu đủ (Carica papaya) còn bromelain thu từ quả, chồi dứa,

vỏ dứa ( Pineapple plant ) Các enzyme này được sử dụng để chống lại hiện tượng tủa trắng của bia khi làm lạnh ( chilling proofing ) do kết tủa protein Những ứng dụng khác của protease thực vật này là công nghệ làm mềm thịt và trong mục tiêu hóa Ficin thu được từ nhựa cây cọ ( Ficus carica) Enzyme được sử dụng thủy phân protein tự nhiên

Hình 2.2 Nguồn enzyme protease từ thực vật

2.2.1.3 Protease vi sinh vật

Enzyme protease phân bố chủ yếu vi khuẩn, nấm mốc, xạ khuẩn…gồm nhiều

loài thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clotridium, Streptomyces và một số

Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là Bacillus,

B.mesentericus, B.thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium

tổng hợp các protease hoạt động thích hợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu

Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp (pH 5-8) và

có khả năng chịu nhiệt thấp Các protease trung tính tạo ra dịch thủy phân protein thực phẩm ít đắng hơn so với protease động vật và tăng giá trị dinh dưỡng Các protease trung tính có khả năng ái lực cao đối với các amino acid ưa béo và thơm

Chúng được sinh ra nhiều bởi B.subtilis, B.mesentericus, B.thermorpoteoliticis, và một số giống chi Clostridium

Hình 2.3 Vi khuẩn Clostridium

Protease của Bacillius ưa kiềm có điểm đẳng điện bằng 11, khối lượng phân tử

từ 20.000-30.000 Ổn định trong khoảng pH 6-12 và hoạt động trong khoảng pH rộng 7-12

Hình 2.4 Vi khuẩn Bacillius

™ Nấm

Nhiều loại nấm có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được ứng dụng

trong công nghiệp thực phẩm là các chủng: Aspergillus oryzae, A.terricola,

A.fumigatus, A.saitoi, Penicillium chysogenum… Các loại nấm mốc này có khả

năng tổng hợp cả 3 loại protease: acid, kiềm và trung tính Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu là protease acid, có khả năng thủy phân protein ở pH 2.5-3

Một số nấm mốc như: A.candidatus, P.cameberti, P.roqueforti…cũng có khả

năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất phomat

Hình 2.5 Nấm mốc

™ Xạ khuẩn

Về phương diện tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên cúư ít hơn nấm mốc

và vi khuẩn Tuy nhiên ngưòi ta cũng đã tìm được một số chủng có khả năng tổng

hợp protease cao như: Streptomyces grieus, S.fradiae, Strerimosus…

Hình 2.6 Xạ khuẩn

Các chế phẩm protease từ xạ khuẩn được biết nhiều là pronase ( Nhật ) được

tách chiết từ S.grieus, enzyme này có đặc tính đặc hiệu rộng, có khả năng thủy phân

tới 90% liên kết peptide của nhiều protein thành amino acid

Từ S.fradiae cũng có thể tách chiết được keratinase thủy phân karetin Protease

từ S.fradiae cũng có hoạt tính elastase cao, do đó chúng được dùng trong nghiệp

chế biến thịt

Hầu hết các protease phân cắt protein ở các liên kết đặc hiệu, vì thế có thể sử dụng các enzyme này theo chiều phản ứng tổng hợp để tổng hợp các peptide định trước Yếu tố tăng cường quá trình tổng hợp bao gồm pH, các nhóm cacboxyl hoặc nhóm amine được lựa chọn để bảo vệ, khả năng kết tủa sản phẩm, phản ứng trong

đã được hoàn thiện nhờ sử dụng chế phẩm enzyme thực vật ( bromelain và papain )

và vi sinh vật để rút ngắn thời gian làm, cải thiện hương vị của nước mắm Tuy nhiên vẫn còn một số tồn tại cần phải hoàn thiện thêm về phần công nghệ

Trong công nghiệp sữa: Protease được dùng để sản xuất phomat nhờ hoạt tính

làm đông tụ của chúng Protease từ một số sinh vật như: A.candidus, P roqueti, B

mesentericus,…được dùng trong sản xuất phomat Trong công nghiệp sản xuất bánh

mì, bánh quy…protease được dùng làm giảm thời gian trộn, tăng độ dẻo và làm nhuyễn bột, tạo độ xốp và nỡ nhiều hơn

Trong sản xuất bia: Chế phẩm protease có ý nghĩa rất quan trọng trong việc

làm tăng độ bền của bia và rút ngắn thời gian lọc Protease của A.oryze được dùng

để thủy phân protein trong hạt ngũ cốc, tạo điều kiện xử lý bia tốt hơn

Trong công nghiệp da: Protease được sử dụng để làm mềm da nhờ sự thủy phân một phần protein của da, chủ yếu là collagen, thành phần chính làm cho da bị cứng Kết quả đã loại bỏ khỏi da các chất nhớt và làm cho da có độ mềm dẻo nhất định Trước đây để làm mềm da người ta thường dùng protease được phân lập từ cơ

quan tiêu hóa của động vật Hiện nay, việc đưa các protease tách từ vi khuẩn ( B

mesentericus, B subtilis ), nấm mốc ( A oryzae, A flavus ) và xạ khuẩn ( S.fradiae,

S griseus, S rimosus…) vào công nghiệp thuộc da đã đem lại nhiều kết quả và dần

dần chiếm một vị trí quan trọng

Trong công nghiệp dệt: Proteinase vi sinh vật được sử dụng để làm sạch tơ tằm, tẩy tơ nhân tạo để sợi được bóng, dễ nhuộm Protease có tác dụng thủy phân lớp protein serisine đã làm dính bết các sợi tơ tự nhiên, làm bong và tách rời các loại tơ tằm, đó dó làm giảm lượng hóa chất để tẩy trắng

Ngoài ra, protease còn được ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều nghành khác như: + Điều chế dịch đạm thủy phân dùng làm chất dinh dưỡng, chất tăng vị trong thực phẩm và sản xuất một số loại thức ăn kiêng

+ Protease của nấm mốc và vi khuẩn phối hợp với amylase tạo thành hỗn hợp enzyme dùng làm thức ăn gia súc có độ tiêu hóa cao, có ý nghĩa lớn trong chăn nuôi gia súc và gia cầm

+ Điều chế môi trường dinh dưỡng của vi sinh vật để sản xuất vaccine, kháng sinh,…

+ Sản xuất keo động vật, chất giặt tổng hợp để giặt tẩy các chất bẩn protein, sản xuất mỹ phẩm

+ Sử dụng nhiều enzyme protease để sản xuất thuốc hỗ trợ tiêu hóa, nấu cao động vật, chữa bệnh nghẽn mạch máu, tiêu viêm vết thương

2.3 Enzyme bromelain thu nhận từ vỏ dứa

2.3.1 Giới thiệu enzyme bromelain

Bromelain là enzyme có nhiều trong quả dứa, được phát hiện từ giữa thế kỉ 19 nhưng mới được nghiên cứu từ giữa thế kỉ 20 Ở nước ta nghiên cứu về bromelain được bắt đầu từ những năm 1968-1970

Bromelain là nhóm protease thực vật được thu nhận từ họ Bromeliaceae, đặc biệt là từ thân ( EC-3.4.22.32 ) và trái dứa ( EC-3.4.22.33 ) Ở mỗi bộ phận khác nhau thì bromelain có pH tối ưu khác nhau và cấu tạo cũng có sự khác nhau

Bromelain có trong toàn bộ cây dứa, nhưng nhiều nhất là trong quả Bromelain

là nhóm endoprotease có khả năng phân cắt các liên kết peptid nội phân tử protein

để chuyển phân tử protein thành các đoạn nhỏ gọi là các peptide ( Dương Thị Hương Giang, 2004)

Thành phần chủ yếu của Bromelain có chứa nhóm sulfurhydryl thủy giải protein Khi chiết tách và tinh sạch phân đoạn có chứa nhóm sulfhydryl của

bromelain thì thu được một enzyme thủy phân protein hiệu quả invitro ( Nguyễn

Đức Lượng, 2004)

2.3.2 Tính chất vật lí của enzyme bromelain

Bromelain tan nhẹ trong nước và glycerine nhưng không tan trong dung môi hữu cơ Murachi và cộng sự năm 1964 đã nghiên cứu về tính chất vật lý của enzyme bromelain trích từ cây dứa và thấy như sau:

Bảng 2.1.Tính chất vật lý của enzyme bromelain.( Nguyễn Đức Lượng, 2004)

2.3.3 Tính chất hoá học của enzyme bromelain

2.3.3.1 Cấu tạo hoá học

Bromelain là một protease nhưng nó khác với các protease thực vật khác như

papain, ficin ở chỗ nó là một glycoprotein, mỗi phân tử có glycan gồm 3 manose, 2

glucosamine, 1 xylose, và 1 fructose ( Nguyễn Đức Lượng 2004)

Các nghiên cứu ghi nhận, polypeptide của bromelain thân có acid amin đầu –

2.3.3.2 Cấu trúc không gian của bromelain

Murachi và Busan phân tích cấu trúc bậc 1 của bromelain và nhận thấy cách

sắp xếp amino acid trong phân tử bromelain như sau:

Ser – Val – Lys – Asn – Gln – Asn – Pro – Cys – Gly – Ala – Cys – Tryp –

Bromelain là một protease trong tâm hoạt động có chứa cysteine và hai sợi

polypeptide liên kết với nhau bằng cầu nối –S-S- (disulfur)

Tâm hoạt động –Cys đặt cách nhóm imidazole của histidine là 5Å

Chuỗi phân tử gấp nếp phức tạp thành dạng hình cầu

Trong phân tử bromelain thân có chứa nhóm sulfhydryl có vai trò chủ yếu

trong hoạt tính xúc tác và trong mỗi phân tử có tất cả 5 cầu nối disulfite Ngoài ra,

2 mg/g enzyme có vai trò duy trì cấu trúc không gian của enzyme

2.3.4 Hoạt tính của enzyme bromelain

Một số nghiên cứu cho thấy bromelain có hoạt tính khác nhau trên những cơ chất khác nhau Nếu cơ chất là hemoglobin thì khả năng phân giải của bromelain mạnh hơn papain gấp 4 lần, còn cơ chất là casein thì khả năng phân giải của hai enzyme này tương đương nhau Đối với các cơ chất tổng hợp thì khả năng phân giải của Bromelain yếu hơn papain

Bromelain có 3 hoạt tính khác nhau: peptidase, amidase và esterase, hoạt tính esterase ở bromelain hơn papain và ficin ( Nguyễn Đức Lượng 2004)

2.3.4.1 Cơ chế tác động

Hầu hết các tác giả đều thừa nhận vai trò của nhóm –SH của cystein, nhóm imidazole của histidine và nhóm disulfur trong hoạt động thủy phân của bromelain Nhóm –SH tham gia tạo thành acyl-thioester trung gian với nhóm carboxyl của cơ chất ( nơi các liên kết peptide bị cắt )

Nhóm imidazole làm chất trung gian nhận gốc acid và chuyển cho nhóm anion của chất nhận khác

Cầu nối S-S có vai trò duy trì cấu trúc không gian của bromelain Casein và hemoglobin là 2 cơ chất tự nhiên được dùng nhiều nhất

Đầu tiên, bromelain kết hợp với protein và thủy phân sơ bộ cho ra polypeptide

và acid amin Protein kết hợp với nhóm –SH của enzyme khiến nó bị ester hóa rồi nhóm imidazole sẽ khử ester để giải phóng enzyme, acid amin và peptide

hoạt động hình thành mercaptid phân ly yếu (nhưng vẫn còn khả năng tạo liên kết phối trí bổ sung với các nhóm chức năng khác của phân tử protein như amin, carboxyl…)

Do vậy nhóm –SH trong tâm hoạt động đã bị ester hóa bởi cơ chất, cấu trúc không gian được bảo vệ ổn định

2.3.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme bromelain

Giống như các loại chất sinh học khác, bromelain cũng bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH, ion kim loại, một số nhóm chức, phương pháp ly trích, phương pháp tinh sạch

Nhiệt độ của phản ứng xúc tác chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố: thời gian tác động càng dài thì nhiệt độ sẽ có những thay đổi làm ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme, nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, dạng tồn tại của enzyme

Biên độ pH khá rộng từ 3-10 nhưng pH tối ưu thường nằm trong khoảng 5-8 tùy cơ chất: gelatin:5-6, casein: 7-8 (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

™ Ảnh hưởng của các chất kìm hãm

Chất kìm hãm là những ion, phân tử vô cơ, hữu cơ, làm giảm hoạt mất hoạt tính của enzyme, có 2 loại chất kìm hãm:

- Chất kìm hãm cạnh tranh: là những chất kìm hãm thuận nghịch enzyme,

có cấu trúc tương tự như cấu trúc cơ chất, nên có khả năng cạnh tranh kìm hãm với

cơ chất ở trung tâm hoạt động của enzyme

- Chất kìm hãm không cạnh tranh: làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzyme theo hướng không có lợi cho hoạt tính xúc tác của enzyme

™ Ảnh hưởng của các chất hoạt hóa

Là những chất anion, các ion kim loại, chất hữu cơ, có tác dụng làm tăng hoạt tính xúc tác của enzyme trong giới hạn nồng độ xác định

Các ion kim loại thường gắn với phân tử protein tại các trung tâm hoạt động,

protease cystein, trung tâm hoạt động có nhóm –SH đều là hoạt chất hoạt hóa cho bromelain Ví dụ: Thioglycolic Acid, Cystein, Sulfid, Sisulfid, Cianit…

Bromelain bị ức chế bởi những ion hoặc hợp chất có ái lực mạnh hơn nhóm –

SH, các tác nhân oxi hóa, halogen hóa, ankyl hóa như: Iodoacetate, bromoacetate,

Các ion kim loại như: Fe, Cu, Ag, Sb, Zn có xúc tác làm ổn định cấu trúc phân

tử bromelain ( Nguyễn Đức Lượng )

™ Ảnh hưởng của trạng thái và điều kiện bảo quản

Bảng 2.2 Ảnh hưởng của trạng thái và điều kiện bảo quản

Hoạt tính (UI/mg protein) Điều kiện bảo quản

Nguyên liệu tươi 1600 1150

2.3.5 Ứng dụng của enzyme bromelain

2.3.5.1 Trong công nghiệp thực phẩm

Chỉ cần một phần enzyme bromelain là có khả năng thuỷ phân 1000 phần thịt Enzyme bromelain được rãi lên thịt dưới dạng bột hoặc được ngâm trong dung dịch enzyme hoặc tiêm dung dịch enzyme vào thịt để làm mềm thịt

Sử dụng trong quá trình đông tụ sữa: Thông thường để chế biến các sản phẩm

từ sữa người ta dùng renin Renin là loại enzyme được sử dụng làm đông tụ sữa truyền thống Tuy nhiên lượng renin sản xuất chưa đáp ứng đủ yêu cầu thực tế Gần

đây sử dụng enzyme thực vật trong chế biến sữa đang được phát triển, trong đó bromelain vỏ dứa đang được quan tâm vào mục đích này.

2.3.5.2 Trong y dược học

Bromelain còn có tác dụng làm giảm di căn của bệnh ung thư, liều dùng 200 –

300 mg/kg thể trọng kết hợp với hoá trị hay xạ trị Trong công nghiệp dược phẩm, nhiều hãng dược phẩm ở Châu Âu đã đưa bromelain vào thành phần thuốc Ở Mỹ

và Anh có thuốc Aranas do hãng W.H Roser điều chế

Chữa bệnh đau tim ( làm tan máu tụ gây đau tim )

Điều trị các bệnh nhiễm trùng ( Jayaran và ctv, 1991 )

Ngăn ngừa bệnh tiêu chảy ở heo con ( Chandler và Mynott, 1998 )

Chữa rối loạn tiêu hóa, giúp tiêu hóa chất đạm tốt, tăng khả năng đề kháng Phối hợp với kháng sinh trong điều trị các bệnh nhiễm trùng

Điều trị bong gân, căng cơ, đau và nhức cơ

Bromelain trong dứa là hợp chất thiên nhiên có khả năng ức chế protease HIV Nhờ tác dụng làm dễ tiêu hoá protein, bromelain được điều chế với vài chất khác để bổ sung hay điều trị sự thiếu protease tiêu hoá tự nhiên ( Nielsel và ctv,

2001 )

Thực phẩm chức năng mang tên tinh nghệ - dứa điều trị bệnh loét dạ dày, hành

tá tràng, đại tràng, viêm da, bảo vệ gan, mật Đó là thành quả nghiên cứu của các nhà khoa học tại Dự án hoạt chất sinh học Việt - Bỉ ( Viện Hóa học, Viện Khoa học

- công nghệ VN ) năm 2006

Ngoài ra bromelain còn dùng để thuỷ phân gan bò làm cao gan, thuốc bổ

2.3.6 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về enzyme bromelain

2.3.6.1 Tình hình nghiên cứu enzyme bromelain trong nước

Ở nước ta co nhiều công trình công bố về việc nghiên cứu sử dụng enzyme bromelain, các công trình công bố tập trung trong các lĩnh vực tách chiết, tinh sạch

và khả năng ứng dụng của enzyme này Một số công trình nghiên cứu về enzyme bromelain như:

Lê Thị Thanh Mai ( 1997 ) nghiên cứu các phương pháp tinh sạch và ứng dụng bromelain cho thấy có thể thu nhận bromelain theo phương pháp kết tủa bằng aceton hay cô đặc theo phương pháp siêu lọc rồi kết tủa bằng aceton, cũng như có thể tinh sạch bromelain theo phương pháp lọc gel sephadex G75 với hiệu suất cao Nghiên cứu này còn cho thấy có thể sử dụng bromelain để rút ngắn thời gian chế biến nước mắm

Dương Thị Hương Giang và Lê Thanh Hùng ( 2002 ) nghiên cứu điều kiện nhằm ổn định phương pháp tinh sạch bromelain bằng nước khóm thô cho thấy có thể thu nhận và tinh sạch enzyme bromelain bằng phương pháp sắc ký và trao đổi ion trên cột SP-Streamline với hiệu suất cao

Dương Thị Hương Giang và ctv ( 2005 ) nghiên cứu tinh sạch bromelain từ phụ phẩm vỏ dứa cho thấy có thể tinh sạch bromelain bằng phương pháp sắc ký gel

mở rộng với hệ thống cột Stream line 50 và gel trao đổi ion âm SP-Streamline XL với hiệu suất cao

2.3.6.2 Tình hình nghiên cứu enzyme bromelain ngoài nước

Theo Salem và ctv (1995) đã sử dụng tỉ lệ là 0,3% enzyme so với cá gồm papain, tripsin ,ficin và bromelain thêm vào cùng với 25% muối ngay từ lúc đầu của quá trình sản xuất nước mắm trên năm loại cá (sardine, macaroni, bolti, bourri và shark ) Kết quả cho thấy với 0,3% bromelain cho hàm lượng đạm tổng số cao nhất

so với các enzyme còn lại trên mẫu cá mòi ( sardine ) sau 180 ngày lên men và cao hơn so với mẫu đối chứng lên men cổ truyền là 30%

Liang và ctv (1999) nghiên cứu hoạt tính của bromelain sau khi bổ sung polyphenol trích ly từ trà xanh của Trung Quốc cho thấy tính bền nhiệt của bromelain được tăng lên

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu và hóa chất

3.1.1 Nguyên liệu

Vỏ quả dứa

3.1.2 Hóa chất

Hóa chất xác định hàm lượng protein: thuốc thử Bradford

Hóa chất xác định hoạt tính enzyme

Pipet thủy tinh: 1ml, 2ml, 5ml, 10ml

Pipet man các loại

Đầu típ các loại

Cốc thủy tinh 100ml, 250ml

Giá đựng ống nghiệm

Ống đong 50ml, 100ml, 500ml

3.2 Quy trính tách chiết Enzyme Bromelain

Aceton

Enzyme

3.2.1 Thuyết minh quy trình

Vỏ dứa sau khi thu nhận từ các cơ sở đưa đươc về phòng thí nghiệm Tại đây,

vỏ dứa được xay hoặc nghiền nát Sau đó, đem đi lọc thu được dịch lọc và mang dịch lọc này ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút Sau khi ly tâm loại bỏ cặn và thu

aceton

Li tâm các hỗn hộp dịch trên và thu được enzyme thô , chạy sắc ký enzyme thô

và thu được enzyme

sulfate (NH 4 ) 2 SO 4 và aceton (CH 3 COCH 3 )

3.2.2.1 Nguyên tắc

Các điều kiện thí nghiệm được tiến hành trong môi trường lạnh nhằm tránh làm mất hoạt tính enzyme và kết tủa thu được tốt hơn Cho tác nhân tủa đã làm lạnh vào dung dịch enzyme cần tủa giữ ở nhiệt độ lạnh vào bình tam giác Lắc đều hỗn hợp, để yên trong tủ lạnh 40 phút Sau đó đem ly tâm lạnh, lấy cặn hòa lại trong dung dịch đệm, bảo quản lạnh

3.2.2.2 Tủa enzyme bằng cồn 96 0

Cho dung dịch enzyme vào bình tam giác

enzyme

Khuấy đều