LUẬN VĂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC TÌM HIỂU TUYẾN TRÙNG KÝ SINH SÂU HẠI VÀ QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT TUYẾN TRÙNG KÝ SINH SÂU HẠI

Nâng cao khả năng hoạt ñộng của các sinh vật có ích ngoài tự nhiên bao gồm - Xác ñịnh thành phần và hiêu quả các loài côn trùng ký sinh, ăn thịt có ích và các tác nhân gây bệnh trên cơ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

TÌM HIỂU TUYẾN TRÙNG KÝ SINH SÂU HẠI VÀ QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT TUYẾN TRÙNG KÝ

SINH SÂU HẠI

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện : LƯU VĂN THUYẾT MSSV: 207111057 Lớp: 08CSH1

công nghệ TP HCM Em xin cam ñoan bài khoá luận của Em với ñề tài “tìm hiểu tuyến trùng ký sinh sâu hại và quy trình công nghệ sản xuất tuyến trùng

ký sinh sâu hại” Hoàn toàn ñược thực hiện dựa trên năng lực của Em Tuyệt ñối không sao chép tài liệu của người khác, nội dung và số liệu trong bài của

Em là trung thực với những mục có nguồn gốc từ tài liệu tham khảo ñược trích dẫn rõ ràng cả tên tác giả và ñề tài nghiên cứu Nếu bài khoá luận của

Em có gì gian dối em xin chịu trách nhiệm hoàn toàn

Người thực hiện

Lưu Văn Thuyết

Danh mục các bảng vi

Danh mục hình ảnh vii

Lời nói ñầu 1

CHƯƠNG 1: CƠ SỞ LÝ LUẬN CỦA BIỆN PHÁP SINH HỌC 1.1 Vị trí của biện pháp sinh học trong hệ thống tổng hợp bảo vệ cây trồng 2

1.1.1 Biện pháp hoá học giữ vị trí quan trọng trong BVTV từ những năm ñầu thế của thế kỷ XX 2

1.1.2 Hạn chế của thuốc hoá học và vai trò của biện pháp sinh học trong BVTV vào thập kỷ 80 – 90 thế kỷ XX 3

1.2 ðấu tranh sinh học trong tự nhiên là cơ sở, nền tảng của công nghệ sinh học trong BVTV 4

1.1.2 Khái niệm về ñấu tranh sinh học 4

1.2.2 Cơ sở khoa học của ñấu tranh sinh học trong bảo vệ thực vật 4

1.2.3 Các nhóm vi sinh vật có ích trong ðTSH 5

CHƯƠNG 2: NHỮNG THÀNH TỰU CƠ BẢN CỦA BIỆN PHÁP ðẤU TRANH SINH HỌC 2.1 Các hướng chính của ñấu tranh sinh học 6

2.1.1 Nâng cao khả năng hoạt ñộng của các sinh vật có ích ngoài tự nhiên bao gồm 6

2.2.2 Nghiên cứu tạo ra các chế phẩm sinh học và các vũ khí sinh học khác ñể ứng dụng trong phòng trừ các vi sinh vật gây hại bao gồm 6

2.3 Nhóm chế phẩm ứng dụng cho phòng trừ sâu bệnh tại Việt Nam 7

CHƯƠNG 3: SINH HỌC CỦA TUYẾN TRÙNG 3.1 Giới thiệu về tuyến trùng kí sinh côn trùng 11

3.2 Cơ chế xâm nhập, ký sinh và gây bệnh của tuyến trùng EPN 13

3.2.1 ðặc tính sinh học của tuyến trùng EPN 13

3.2.2 Sự xâm nhập vào côn trùng vật chủ của tuyên trùng 18

3.2.3 Thời gian sinh trưởng và phát triển của tuyến trùng 19

3.3 Quan hệ tương tác giữa tuyến trùng và vi khuẩn cộng sinh 20

3.3.1.Vai trò của tuyến trùng trong tổ hợp 20

3.3.2.Vai trò của vi khuẩn cộng sinh trong tổ hợp 22

3.3.3 Vai trò của tổ hợp chống lại hệ thống bảo vệ của côn trùng 22

3.3.4 Cơ chế chống lại các vi sinh vật gây bệnh khác 25

3.4 Sự di chuyển của tuyến trùng EPN 26

3.5 Khả năng sinh sản của một số chủng EPN trong côn trùng vật chủ 26

3.5.1 Khả năng sinh sản của một chủng EPN trong BSL 27

3.5.2 Tương quan giữa số lượng nhiễm và sản lượng IJs 28

3.5.3 Khả năng sinh sản của một số chủng EPN trong sâu hại 29

CHƯƠNG 4: CÔNG NGHỆ NHÂN NUÔI TUYẾN TRÙNG 4.1 Lựa chọn công nghệ thích hợp 31

4.2 Công nghệ nhân nuôi in vivo 33

4.2.1 Xâm nhiễm tuyến trùng vào ấu trùng BSL 34

4.2.2 Thu hoạch tuyến trùng IJs 35

4.2.3 Chuẩn bị cho bảo quản 37

4.3 Công nghệ nhân nuôi in vitro 37

4.3.1 Phân lập VKCS 38

4.3.2 Chuẩn bị môi trường nhân nuôi tổ hợp tuyến trùng 39

4.3.3 Chuẩn bị dụng cụ nhân nuôi 40

4.3.7 Xử lý sự cố 42

4.3.8 Bảo quản IJs 44

CHƯƠNG 5: HIỆU LỰC PHÒNG TRỪ SÂU HẠI CỦA MỘT SỐ CHỦNG EPN 5.1 Cơ sở ñánh giá hiệu lực gây chết của các chủng EPN 46

5.2 Hiệu lực gây chết của một số chủng EPN trong ñiều kiện phòng thí nghiệm 47

5.2.1 Hiệu lực gây chết sâu hại của chủng S_TK10 47

5.2.2 Hiệu lực phòng trừ sâu của S-TX1 50

5.2.3 Hiệu lực gây chết của chủng H-MP11 51

5.2.4 Hiệu lực gây chết của chủng H-NT3 53

CHƯƠNG 6: KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 6.1 Kết luận 57

6.2 ðề nghị 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO 58

ðTSH: ðấu tranh sinh học

Bảng 3.2: Danh sách các loài vi khuẩn cộng sinh với EPN

Bảng 5.1: Hiệu lực gây chết sâu khoang của chủng S-TK10

Bảng 5.2: Hiệu lực gây chết sâu xanh bướm trắng của chủng S-TK10 Bảng 5.3: Hiệu lực gây chết bọ hung ñen của chủng S-TK10

Bảng 5.4: Hiệu lực gây chết sâu xanh của chủng S-TX1

Bảng 5.5: Hiệu lực gây chết sâu xanh của H-MP11

Bảng 5.6: Hiệu lực diệt sâu xanh da láng của H-MP11

Bảng 5.7: Hiệu lực gây chết sâu keo da láng ở chủng H-NT3

Bảng 5.8: Hiệu lực gây nhiễm sâu xám của chủng H-NT3

Bảng 5.9: Hiệu lực gây chết bọ hung ñen của chủng H-TN3

Hình 3.2: Chu trình xâm nhập và phát triển của EPN Hình 4.1: Ấu trùng BSL

Hình 4.2: Nhân nuôi EPN trong bình tam giác

LỜI MỞ ðẦU

Sâu hại luôn là mối ñe doạ của nền sản xuất nông nghiệp Trong ñiều kiện nóng ẩm của Việt Nam, mối nguy hại này càng nặng nề hơn ðể phòng trừ sâu hại, bảo vệ năng suất cây trồng, trước ñây nông dân chủ yếu dựa vào biện pháp hóa học Việc lạm dụng thuốc hóa học ñã gây ra nhiều mối nguy hại cho cho môi trường và sức khỏe của cộng ñồng Cân bằng sinh thái bị phá

vỡ, sâu hại ngày càng kháng lại thuốc, môi trường ñất và nước ô nhiễm nặng

nề nhưng ñáng lo ngại hơn là vấn ñề tồn lưu thuốc trong sản phẩm nông nghiệp và ñộng vật ăn chúng gây ảnh hưởng nghiêm trọng ñến sức khoẻ con người Trước yêu cầu bức thiết ñó các nhà khoa học ñã không ngừng nghiên cứu tìm kiếm một phương pháp phòng trừ hiệu quả mà không gây nguy hại cho môi trường và sức khoẻ con người Chính vì vậy mà phương pháp bảo vệ thực vật bằng biện pháp sinh học ñã ra ñời

Trong số các tác nhân sinh học dùng trong ñấu tranh sinh học thì tuyến trùng ñược ñánh giá cao vì phổ ký chủ rộng, có thể sử dụng phòng trừ nhiều loài sâu hại Nhiều nghiên cứu về tuyến trùng ñã ñược tiến hành ở Việt Nam, quy trình công nghệ sản xuất tuyến trùng cũng ñược thử nghiệm Chế phẩm tuyến trùng có thể hoạt ñộng tốt trên ñồng ruộng ñể phòng trừ sâu hại Xuất

phát từ thực tiễn trên, sinh viên tiến hành “tìm hiểu tuyến trùng ký sinh sâu hại và quy trình công nghệ sản xuất tuyến trùng ký sinh sâu hại” nhằm

ứng dụng công nghệ sinh học ñể mở rộng chế phẩm này trong sản xuất, bảo

vệ cây trồng

CHƯƠNG 1: CƠ SỞ LÝ LUẬN CỦA BIỆN PHÁP SINH HỌC

1.1 Vị trí của biện pháp sinh học trong hệ thống tổng hợp bảo vệ cây trồng

1.1.1 Biện pháp hoá học giữ vị trí quan trọng trong BVTV từ những năm ñầu thế của thế kỷ XX

Những năm ñầu của thế kỷ XX, ngành hoá học trong bảo vệ thực vật ñã phát triển với tốc ñộ nhanh, nhất là sau ñại chiến thế giới lần thứ hai, toàn thế giới ñã sản xuất ra hơn 15 triệu tấn thuốc hoá học ñể phun trên diện tích hơn 4

tỷ ha cây trồng nông – lâm nghiệp Thực tế cho thấy, trên ñồng ruộng việc sử dụng hoá chất (BVTV) ñã giảm hẳn số lượng sâu hại và năng suất, sản lượng nông nghiệp tăng lên xấp xỉ hai lần Kết quả này cho thấy chỉ cần có thuốc hoá học, con người có thể giải quyết ñược vấn ñề phòng trừ sâu, bệnh hại cây trồng và thời gian ñó biện pháp hoá học giữ vị trí khá quan trọng, gần như là ñộc tôn trong phòng trừ dịch hại bảo vệ cây trồng

Từ giữa những năm 1950 trở ñi, việc sử dụng các loại thuốc trừ sâu hoá học ñã không ngừng ñược tăng nhanh và phát triển rộng trên mọi ñối tượng cây trồng, ở khắp nơi trên thế giới với số lượng ngày càng lớn Vì vậy, việc sử dụng thuốc hoá học phòng trừ sâu, bệnh hại ở nhiều nước ñã trở nên lạm dụng, có khi còn quá tuỳ tiện, rất nhiều nơi chỉ trong một vụ họ ñã phun 10 –

12 lần, thậm chí có khi 20 – 24 lần Sau nhiều năm sử dụng ñơn thuần hoá chất (BVTV) năng suất cây trồng không thể tăng lên ñược nữa mà bị chững lại và kết quả ngược lại là sâu hại, bênh hại có chiều hướng gia tăng bởi vì chúng ñã quen dần với thuốc hoá học, thực tế là sâu, bệnh hại cây trồng phát sinh, phát triển ngày một nhiều hơn chúng ñã phá hai cây trồng nhanh hơn và gây thiệt hại ñáng kể, có vài loài sâu hại trước ñây chỉ là thứ yếu thì nay lại thành chủ yếu là do chúng ñã phát sinh với số lượng lớn, rộng khắp với toàn

diện tích trồng trọt và phá hại rất mạnh ðiều ñã gây ra những tổn thất và làm mùa màng thiệt hại nghiêm trọng, ảnh hưởng rất lớn ñến năng suất và phẩm chất của nông sản.( Trích dẫn theo Phạm Thị Thuỳ, 2010)

1.1.2 Hạn chế của thuốc hoá học và vai trò của biện pháp sinh học trong BVTV vào thập kỷ 80 – 90 thế kỷ XX

Do phun thuốc trừ sâu ñinh kỳ với liều nồng ñộ cao nên môi trường sinh thái chung bị ô nhiễm trầm trọng, các nông sản phẩm bị nhiễm ñộc và ít nhiều cũng ñể lại dư lượng hoá chất trong nông sản thực phẩm

ðiều tra trên các cây trồng nông - ngư nghiệp, các nhà khoa học ñã phát hiện thấy trên 500 loài sâu, nhện hại mang tính kháng thuốc, các quần thể con trùng kí sinh, thiên ñịch có ích như các loài ăn thịt và bắt mồi tự nhiên ñã bị giảm hẳn số lượng Ong bướm thụ phấn hoa ñã bị tiêu diệt khá nhiều, ñiều này ñã gây ảnh hưởng lớn ñến năng suất cây trồng, ñặt biệt là các loài con trùng thụ phấn chéo, các loài giun và côn trùng trong lớp ñất cũng ngày một ít

ñi rõ rệt, các loài chim thú ăn sâu cũng dần dần biến mất, có khi bị cạn kiệt Chính vì vậy, vai trò của các biện pháp sinh học trong ñấu tranh sinh học

ñã ñược các nhà khoa học trong những năm 80 – 90 của thế kỷ XX ñánh giá cao khi mà biện pháp hoa học ñã bộc lộ những hạn chế chính như sau :

- Thuốc hoá học ñã tác ñộng lên hệ côn trùng ký sinh và ăn thịt manh hơn nhiều so với ñối tượng sâu hại cần phòng trừ

- Thuốc tích tụ trong các cơ thể ñộng vật, thực vật thông qua chuỗi mắt xích thức ăn, thuốc còn ñọng lại cả trên ñất, nước mà cá, tôm ñã ăn phải con người lại ăn cả những loài cá, tôm trên

Liều lượng thuốc trừ sâu cứ tăng dần nên dẫn ñến môi trường sinh thái ảnh hưởng, sức khoẻ con người bị giảm sút

- Việc sử dụng liên tục một loại thuốc ñã gây cho những cá thể bị biến

1.2 ðấu tranh sinh học trong tự nhiên là cơ sở, nền tảng của công nghệ sinh học trong BVTV

1.2.1 Khái niệm về ñấu tranh sinh học

Theo tài liệu của Hoàng ðức Nhuận thì có rất nhiều ñịnh nghĩa về ñấu tranh sinh học, nhưng ñịnh nghĩa ñơn giản và dễ hiểu hơn cả là :« ñấu tranh sinh học là biện pháp sử dụng sinh vật hoặc các sản phẩm của chúng nhằm ngăn chặn, hoặc làm giảm bớt những thiệt hại do các sinh vật hai gây ra »

Sử dụng biện pháp (ðTSH) là vận dụng sự hài hoà những nguyên tắc và biện pháp sinh học phòng trừ sâu, bệnh hại Trong bảo vệ thực vật nếu biết ứng dụng ðTSH thì hiệu quả phòng trừ cao và hiệu quả ñược diễn ra liên tục trong thời gian dài, các nhà khoa học thường coi ñấu tranh sinh học là sinh thái học ứng dụng

1.2.2 Cơ sở khoa học của ñấu tranh sinh học trong bảo vệ thực vật

- Tạo ra mối quan hệ mới không thuận lợi cho ñối tượng gây hại trên cơ

sở vận dụng sáng tạo, nghĩa là ñưa vào môi trường sống của sâu hại một một yếu tố sinh học mới là kẻ thù tự nhiên ñể phá vỡ ñiều kiện không thuận lợi cho sự phát triển của quần thể sâu hại Yếu tố sinh học mới ñó là các loài ăn thịt, bắt mồi hay ký sinh ong, ruồi và các vi sinh vật gây bệnh con trùng như

Bt, Virus Vi nấm…

- Tạo nên hiện tượng nhiều ký sinh cả trong ñiều kiện tự nhiên cũng như trong nghiên cứu thí nghiệm, dựa trên cơ sở côn trùng gây hại thường có các loài sinh vật có ích ký sinh Bình thường thì chỉ có một loài ký sinh nhung trong thực tế cũng có những loài côn trùng có từ 2 loài ký sinh trở lên, hiện tượng này ñược các nhà khoa học gọi nhiều ký sinh ðiều này dẫn tới sự cạnh

tranh thưc ăn trực tiếp giữa các loài ký sinh, ví dụ như ong Opius sp ký sinh

lên ruồi ñục quả trong cùng thời gian dẫn ñến sự cạnh tranh quyết liệt Theo (Howard, năm 1911), việc nghiên cứu tác ñộng của hiện tượng nhiều ký sinh

ñể tiêu diệt sâu Róm ñã dẫn ñến nhiều lý thuyết tuần tự trong ñấu trong sinh học nghĩa là tạo cho mỗi loài ký sinh tác ñộng vào một giai ñoạn phát triển của sâu hại Hiện nay, hiện tượng nhiều ký sinh tác ñộng có hiêu quả cũng ñủ kìm chế khă năng phát triển của sâu hại

- Vai trò của ký sinh và bắt mồi, ăn thịt trong ñấu tranh sinh học: Tuỳ ñiều kiện cụ thể, người ta thường căn cứ vào quan hệ ñặc thù giữa sâu hại với

kẻ thù tự nhiên mà quyết ñịnh sử dụng loài ký sinh hoặc loài bắt mồi ăn thịt

ñể phòng trừ trên cơ sở công nghệ sinh học

1.2.3 Các nhóm vi sinh vật có ích trong ðTSH

- Nhóm bắt mồi ăn thịt như bọ rùa, bọ mắt vàng, kiến vàng, bọ ñuôi kìm,

- Nhóm côn trùng và nhện ký sinh: ong mắt ñỏ, ong ký sinh…

- Nhóm vi sinh vật bao gồm vi khuẩn Bt, Virus (NPV, GV, CPV, )vì

nấm Beauveria, Metarhizum, Nomuraea,tuyến trùng…

Ở mỗi nhóm sinh vật có ích ñều phát huy vai trò và tác dụng to lớn trong ñấu tranh sinh học, ñặc biệt là trong việc phòng trừ các loài thiên ñịch hại nguy hiểm trên các cây trồng nôn, lâm nghiệp (Trích dẫn theo Phạm Thị Thuỳ, 2010)

CHƯƠNG 2: NHỮNG THÀNH TỰU CƠ BẢN CỦA BIỆN PHÁP ðẤU

TRANH SINH HỌC

2.1 Các hướng chính của ñấu tranh sinh học:

Theo Phạm Thị Thùy (2010, biện pháp ñấu tranh sinh học có những hướng chính sau):

2.1.1 Nâng cao khả năng hoạt ñộng của các sinh vật có ích ngoài tự nhiên bao gồm

- Xác ñịnh thành phần và hiêu quả các loài côn trùng ký sinh, ăn thịt có ích và các tác nhân gây bệnh trên cơ thể sinh vật có hại sẵn ngoài tự nhiên, nhằm mục ñích duy trì sự xuất hiện của chúng trên ñồng ruộng ñể làm giảm một phần hoặc tiến tới giảm hẳn sự phát triển của thuốc trừ sâu

- Xây dựng cơ cấu cây trồng thích hợp ñể tạo ra nguồn thức ăn có cơ chế không thích hợp với loài sâu, bệnh hại như gieo trồng các loại cây có khả năng chuyển gen ñộc, các cây có khả năng miễn dịch, các giống mới có khả năng kháng ñược sâu hại…

- Xác lập các biện pháp canh tác thích hợp ñể nâng cao hoạt tính của các sinh vật có ích

- Sử dụng các loài thuốc trừ sâu hoá học có ảnh hưởng thấp ñối với các quần thể côn trùng ký sinh, ăn thịt và bắt mồi, cũng như không ảnh hưởng tới môi trường sống cộng ñồng

2.2.2 Nghiên cứu tạo ra các chế phẩm sinh học và các vũ khí sinh học khác ñể ứng dụng trong phòng trừ các vi sinh vật gây hại bao gồm

- Sản xuất và sử dụng rộng rãi các loài thuốc trừ sâu vi sinh vật: vi khuẩn, virus, vi nấm và các thuốc kháng sinh

- Sử dụng các chất có hoạt tính sinh học như các pheromon sinh dục, các hormon sinh trưởng, các chất dẫn dụ ăn uống, các chất gây ngán và các chất xua ñuổi côn trùng…

- Sản xuất trên quy mô công nghiệp ñể phóng thả các côn trùng và nhện

ký sinh – ăn thịt có ích trên ñồng ruộng nhằm hạn chế ñược quần thể sâu hại

- Phóng thả các côn trùng có hại ñược gây vô sinh nhằm tạo ra sự cạnh tranh sinh dục với quần thể sâu hại ngoài tự nhiên

- Sử dụng côn trùng, tuyến trùng và các tác nhân gây bệnh chuyển tính hẹp ñã qua kiểm dịch ñể diệt trừ các loài cỏ cây hại cho cây trồng

Trong hai hướng trên, hiện nay các nhà khoa học ñặc biệc chú ý ñến hướng thứ hai, bởi hướng này hầu hết phải dựa trên nền tảng của công nghệ sinh học mới có thể phát triển sản xuất ra các loại thuốc trừ sâu sinh học ñạt chất lượng cao, mang tính ổn ñịnh ñể sử dụng rộng rãi trong phòng trử dịch hại cây nông, lâm nghiệp

ðến nay, trên thế giới ñã có rất nhiều công trình khoa học nghiên cứu về CNSH trong bảo vệ thực vật, nhiều nước ñã thu ñược những kết quả tốt trong quá trình triển khai ứng dụng các chế phẩm sinh học phòng trừ sâu hại, ,bệnh hại cỏ dại và chuột hai bảo vệ cây trồng

2.3 Nhóm chế phẩm sinh học ứng dụng cho phòng trừ sâu bệnh tại Việt Nam

Theo Bộ Nông nghiệp và PTNT, trong danh mục các loại thuốc BVTV

có nguồn gốc sinh học, từ năm 2000 chỉ có 2 sản phẩm trừ sâu sinh học ñược công nhận cho ñăng ký ðến năm 2005 ñã có 57 sản phẩm các lọai, ñến 6 tháng ñầu năm 2007 có 193 sản phẩm ñược cấp giấy phép ñăng ký Nâng tổng

số có 479 sản phẩm sinh học ñược phép lưu hành, trong ñó có 300 lọai thuốc trừ sâu và 98 sản phẩm thuốc trừ bệnh Các sản phẩm này ñã góp phần không

cơ ñộc hại do sử dụng thuốc BVTV nguồn gốc hóa học ảnh hưởng ñến sức khỏe con người và gây ô nhiễm môi trường Một số sản phẩm tiêu biểu:

+ Nguồn gốc thảo mộc:

- Các sản phẩm chế biến từ cây Neem hiện nay ñã ñược ñưa vào ứng dụng rộng rãi trong công tác bảo vệ thực vật, ñược chiết xuất từ nhân hạt

Neem ( Azadirachta indica A Juss ) có chứa hoạt chất Azadirachtin, có hiệu

lực phòng trừ nhiều loài sâu hại trên cây trồng như lúa, rau màu, cây công nghiệp, cây ăn trái, hoa kiểng Loại thuốc có nguồn gốc thảo mộc này không tạo nên tính kháng của dịch hại, không ảnh hưởng ñến thiên ñịch và không ñể lại dư lượng trên cây trồng Thuốc tác ñộng ñến côn trùng gây hại bằng cách gây sự ngán ăn, xua ñuổi, ngăn sự lột xác của côn trùng cũng như ngăn cản sự

ñẻ trứng là giảm khả năng sinh sản Các sản phẩm thương mại tương tự từ cây Neem như: Vineem, Neemaza, Neemcide 3000 SP, Neem Cake

- Hoạt chất Rotenone ñược chiết xuất từ hai loài cây họ ñậu là Derris

elliptica Benth và Derris trifoliate, có thể sử dụng như một loại thuốc trừ sâu

thảo mộc có tác dụng diệt trừ sâu rầy trên lúa, ốc bươu vàng cũng như các loại

cá dữ, cá tạp trong ruộng nuôi tôm Chế phẩm ðầu trâu Bihopper (hoạt chất Rotenone) ñóng vai trò diệt tuyến trùng và chế phẩm Olicide (Oligo – Sacarit ) ñóng vai trò tăng sức ñề kháng bệnh của cây trồng

+ Nguồn gốc vi sinh vật

- Thuốc trừ sâu có nguồn gốc vi khuẩn BT (Bacilus thuringiensis): phổ

diệt sâu rộng và hữu hiệu ñối với các lọai sâu như sâu cuốn lá, sâu tơ, sâu xanh, sâu khoang, sâu ăn tạp… Sâu khi ăn phải thuốc sẽ ngừng ăn sau vài giờ

và chết sau 1 – 3 ngày Ở Việt Nam, chế phẩm Bt (Bacillus thuringiensis) ñã

ñược nghiên cứu từ năm 1971 Hơn 20 chế phẩm Bt nhập khẩu và nội ñịa ñã cho kết quả tốt trong phòng thí nghiệm và ngoài ñồng ñối với một số sâu hại chính trên ñồng ruộng như sâu xanh bướm trắng, sâu xám, sâu tơ, sâu hại

bông, sâu ño Các lọai sản phẩm thương mại có trên thị trường khá nhiều như Vi-BT 32000WP, 16000WP; BT Xentary 35WDG, Firibiotox P dạng bột; Firibiotox C dạng dịch cô ñặc

Khoa Nông nghiệp và sinh học ứng dụng ( ðại học Cần Thơ ) cũng ñã nghiên cứu và ñưa ra 2 chế phẩm sinh học Biobac và Biosar có khả năng phòng trừ 2 bệnh thường gặp trên lúa là ñốm vằn và cháy lá Chế phẩm Biobac ñược sản xuất từ một chủng vi khuẩn có sẵn ở ñịa phương, có khả năng tiêu diệt và ức chế sự phát triển của sợi nấm gây bệnh ñốm vằn Còn chế phẩm Biosar là sản phẩm ñược chiết xuất từ một số loài thực vật, có khả năng

kích thích tính kháng bệnh cháy lá lúa (ñạo ôn) do nấm Pyricularia gây ra

+ Nguồn gốc nấm: ðiều chế từ nấm có sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học VIBAMEC với hoạt chất Abamectin ñược phân lập từ quá trình lên men nấm

Steptomyces avermitilis Diệt trừ ñược các lọai sâu như sâu vẽ bùa, nhện, sâu

tơ, sâu xanh, bọ trĩ, bọ phấn; Ngòai ra cũng trong nhóm này Vivadamy, Vanicide, Vali… có họat chất là Validamycin A, ñược chiết xuất từ nấm men

Streptomyces hygroscopius var jingangiesis ðây là nhóm thuốc trừ bệnh có

nguồn gốc kháng sinh ñặc trị các bệnh ñốm vằn trên lúa, bệnh nấm hồng trên cao su, bệnh chết rạp cây con trên cà chua, khoai tây, thuốc lá, bông vải…

- Hai chế phẩm nấm trừ côn trùng Metarhizium anisopliae và Beauveria

bassiana là sản phẩm của ñề tài do Viện Lúa ñồng bằng sông Cửu Long thực

hiện: Ometar - Metarhizium anisopliae (nấm xanh); Biovip = Beauveria

bassiana (nấm trắng)

+ Nguồn gốc virus: Tiêu biểu là nhóm sản phẩm chiết xuất từ virus Nucleopolyhedrosisvirus (NPV) ðây là lọai virus có tính rất chuyên biệt, chỉ

lây nhiễm và tiêu diệt sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) rất hiệu quả trên

một số cây trồng như bông, ñậu ñỗ, ngô, hành, nho …

+ Pheromone: Là một nhóm chế phẩm sinh học có tác dụng dẫn dụ giới tính, ñược sử dụng rộng rãi trong hệ thống bảo vệ thực vật cây trồng Với ñặc ñiểm chuyên tính cao với từng lọai sâu hại nên rất an tòan với sản phẩm, sinh vật có ích và môi trường Pheromone ñược dùng như một công cụ có hiệu quả

Ở Việt nam hiện nay, việc ứng dụng pheromone ñược tập trung ñối với một

số côn trùng sau ñây:

- Côn trùng hại rau: Các lọai sâu ăn lá: sâu tơ ( Plutella xylostella) , sâu xanh ( Helicoverpa armigera ), sâu khoang ( Spodoptera litura ) và sâu xanh

da láng ( Spodoptera exigua )

- Côn trùng hại cây ăn trái: tập trung là chất dẫn dụ ruồi vàng ñục

trái (Bactrocera dorsalis ) Sản phẩm tiêu biểu là Vizubon – D với họat chất

Methyl Eugenol dẫn dụ ñối với ruồi ñực rất mạnh Trong sản phẩm có pha

trộn thêm chất diệt ruồi Naled ðối với sâu ñục vỏ trái cam quýt (Prays citri)

cũng ñã ñược sử dụng pheromone có hoạt chất Z(7)- Tetradecenal

+ Nguồn gốc tuyến trùng: Trong các giải pháp sinh học, tuyến trùng

EPN (viết tắt tên tiếng Anh Entomopathogenic nematodes của nhóm tuyến

trùng ký sinh và gây bệnh cho côn trùng) ñược coi là tác nhân có nhiều triển vọng bởi có khả năng diệt sâu nhanh, phổ diệt sâu rộng, an toàn cho người, ñộng vật và không gây khả năng "kháng thuốc" ở sâu hại Nhóm các nhà khoa học ở Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Khoa học và Công nghệ

VN ñã ñiều tra, phân lập nhóm tuyến trùng EPN - 2 giống Steinernema và Heterorhabditis ñược coi là Entomopathogenic nematodes (EPN), ñưa vào sản xuất thuốc sinh học tuyến trùng

CHƯƠNG 3: SINH HỌC CỦA TUYẾN TRÙNG

3.1 Giới thiệu về tuyến trùng kí sinh côn trùng

3.1.1.khái niệm

Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (Entomopathogenic nematodes, viết tắt EPN) ñã ñược nhiều nước trên thế giới nghiên cứu và phát triển công nghệ ñể sản xuất chế phẩm sinh học phòng trừ sâu hại cây trồng

Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng EPN thuộc hai giống

Steinernema và Heterohabtidis chúng cộng sinh với vi khuẩn Xenorhadus: Ở

heterorhabtidis chúng cộng sinh với Potorhabdus và chuyên ký sinh côn trùng hại sống trong ñất, hoặc những côn trùng phải qua một phần vòng ñời hay một vùng sinh thái trên ñất

Khi tiếp cận vật chủ, tuyến trùng thường sâm nhập qua miệng, hậu môn,

lổ thở, tuyến tơ, hoặc nơi có lớp kitin mỏng

Xâm nhập vào vật chủ tuyến trùng giải phóng ra vi khuẩn cộng sinh, những vi khuẩn này ñược nhân lên nhanh chóng và chính những chất ñộc của chúng là nguyên nhân gây chết côn trùng trong vòng 48 giờ.(Trích dẫn theo Phạm Thị Thuỳ, )

3.1.2 Phân loại

Trong tự nhiên, nhiều loài tuyến trùng có mối quan hệ với các loài côn trùng ở những mức ñộ khác nhau Trong số tuyến trùng ký sinh côn trùng, nhiều loài tuyến trùng có thể gây hại cho côn trùng và trở thành thiên ñịch của nhiều loài côn trùng sâu hại Nhóm tuyến trùng ký sinh côn trùng bao gồm ký sinh tạm thời (facultative) và ký sinh bắt buộc (obligate) Trong số các nhóm

tuyến trùng ký sinh này thì các loài thuộc giống Heterorhabditis vừa có khả

năng ký sinh lại vừa có khả năng gây bệnh và giết chết côn trùng nên chúng

ñược gọi chung là nhóm tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (Entomopathogenic Nematodes – EPN)

Trong tổng số gần 70 loài EPN thì có 14 loài thuộc giống

Heterorhabditis ñược phát hiện và mô tả thì có 3 loài có diện phân bố tương

ñối rộng là H.bacteriophora, H.indica, H.megidis Các loài này ñược tìm thấy

ở nhiều vùng khí hậu ôn ñới, nhiệt ñới và cận nhiệt ñới của Châu Á, Châu Âu

và Châu Mỹ Như vậy phần lớn các loài EPN có diện phân bố rất hẹp

Dựa trên cơ sở phân tích mối quan hệ họ hang và tiến hoá của nhiều ñại diện tuyến trùng, De Ley & Blaxter, 2002 ñã xây dựng hệ thống phân loại tuyến trùng mới, trong ñó tuyến ký sinh trùng gây bệnh côn trùng ñược sắp xếp như sau:

Ngành : Nematoda

Lớp : Chromadorea Inglis, 1983

Phân lớp : Chromadoria Pearse, 1942

Bộ : Rhabditida Chitwood, 1949

Phân bộ : Rhabditina Chitwood, 1933

Dưới phân bộ : Rhabditomorpha De Ley Blaxter, 2002

Liên họ : Strongyloidea Orley, 1880

Họ : Heterorhabditidae Poinar, 1975

Giống : Heterorhabditis Poinar, 1976

Loài chuẩn : Heterorhabditis bacteriophora Poinar, 1976

3.1.3 Phổ ký chủ

Hoạt ñộng ký sinh gây bệnh của các loài tuyến trùng thuộc giống

Steinernematid và Heterorhabditis ñã ñược chứng minh gây bất lợi cho phổ

rộng côn trùng gây hại trong môi trường khác nhau Hỗn hợp tuyến trùng – vi khuẩn giết chết con trùng nhanh chóng mà không cần hình thành mối quan hệ mật thiết, thích nghi cao, mối quan hệ kí chủ - kí sinh ñặc trưng cho sự liên

kết tuyến trùng – côn trùng Tỷ lệ tử vong nhanh cho phép tuyến trùng mở rộng phổ kí chủ hầu như ở tất cả các bộ côn trùng, một phổ hoạt ñộng tốt vượt

xa bất kỳ tác nhân nấm gây bệnh côn trùng nào Nhưng kiểm tra trong phòng

thí nghiệm, S Carpocapsaae ñã tân công hơn 250 loài của hơn 75 họ trong bộ

con trùng (Divya và sankar, 2009) Theo Lacey và ctv, (2001) Phổ ký chủ của tuyến trùng EPN gồm: bọ hung , bọ hung ñen, sâu ñục trái táo, sâu hại rễ mía, sâu xanh, ấu trùng ñục gốc nho, sâu dục thân chuối, sâu ñục cành và thân cây café , sâu ñục thân ngô, sâu ñục thân và cành khoai lang sâu ăn lá, ấu trùng muỗi sốt xuất huyết loài ve bét (theo Phạm Thị Mến, 2009)

Trong phòng thí nghiệm, hầu hết EPN có thể xâm nhiễm với tất cả các loài côn trùng khác nhau, ñiều kiện môi trường tối ưu, và không bị ngăn cản bởi tác ñộng môi trường bên ngoài ñến quá trình xâm nhiễm Tuy nhiên ở ngoài ñồng ruộng EPN tấn công vào phổ kí chủ hẹp hơn so với trong phòng thí nghiệm Bởi vì tuyến trùng này thích sống trên ñất, kí chủ chính là con trùng sống trong ñất và hoạt ñộng mạnh trên các loài thuộc bộ cánh vẩy (dẫn theo Phạm Thị Mến, 2009) Việc phân phân lập loài giống tuyến trùng thường

dựa vào ấu trùng bướm sáp lớn, Galleria mellonella, và do ñó, phổ kí chủ

ñược biết ñến của tuyến trùng ñều thiên về những côn trùng thuộc bộ cách vẩy Tuy nhiên, nhiều loài tuyến trùng ñược phân lập từ xác chết ngoài ñồng

ruộng thì có phổ kí chủ giới hạn như S kushidai và S carabaei thích nghi với

ấu trùng bọ hung S Scapterosci thích nghi với dế dũi và tấn công kèm với

những côn trùng khác, nhưng (Bonifassi và cs 1999) ñã chứng minh sự kết

hợp của Xenorhabdus dòng UY61 và S scapterisci dễ dàng tấn công G

mellonella (Hazir và cs,2004)

3.2 Cơ chế xâm nhập, ký sinh và gây bệnh của tuyến trùng EPN

3.2.1 ðặc tính sinh học của tuyến trùng EPN

Mặc dù các tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng thuộc giống

Steinernema và Heterorhabdits là những loài ký sinh bắt buộc ở côn trùng,

nhưng chúng lại có một pha chuyên hoá tồn tại bên ngoài vật chủ côn trùng, thường là môi trường ñất, ñó là IJs ấu trùng tuổi 3, còn gọi là ấu trùng xâm

nhiễm (infective junveniles), là giai ñoạn ñặc biệt trong vòng ñời phát triển

của nhóm tuyến trùng này Ở giai ñoạn này, chúng không cần dinh dưỡng nhưng vẫn có khả năng tồn tại lâu dài trong môi trường ñất khi chưa gặp vật chủ Thực chất ñây là giai ñoạn ấu trùng nằm chờ trong ñất và sẵn sàng xâm nhập vào vật chủ thích hợp ñể ký sinh gây bệnh

Mỗi giai ñoạn ấu trùng mang trong ruột của chúng một loài vi khuẩn

cộng sinh (VKCS) chuyên hoá ðối với các loài tuyến trùng Sternernema thì

vi khuẩn cộng thuộc giống Xennohabdus, ở IJs phần trước của ruột, phía sau thực quản Còn ở IJs của loài tuyến trùng heterohabditis spp, thì vi khuẩn này

không tập trung ở phần vỏ bọc của ruột mà chúng nằm rải rác theo chiều dày của ruột Các VKCS này thường dạng que hoặc dạng ovan dài trong như cái lạp xường kích thước rộng 1-2µm và dài từ 3-5 µm, vì vậy có thể quan sát chúng khá rỏ dưới kính hiển vi quang học dưới ñộ phóng ñại 1500 lần Bình thường ở lổ miệng và hậu môn của IJs ở dạng ñóng kính ðây là hiện tượng cộng sinh bắt buộc cả tuyến trùng và vi khuẩn không có khả năng sống ñộc lập với nhau trong tự nhiên

Môt chu kỳ xâm nhập của côn trùng vào vật chủ và phát triển của tuyến trùng EPN trong xác chết côn trùng vật chủ bắt ñầu từ pha IJs ñến pha phát triển ký sinh bên trong cơ thể côn trùng vật chủ và sau khi kết thúc pha ký sinh lại trở về pha IJs bên ngoài côn trùng vật chủ

Ấu trùng xâm nhập vào hai tập tính ñể tiếp cận với côn trùng: Hầu hết

IJs của của các loài tuyến trùng Heterohabditis và một số loài của giống

sternernema có tập tính săn lùng tìm vật chủ nhờ chúng chúng ñịnh hướng và

tìm mục tiêu nhanh về phía vất chủ ñể xâm nhập Nhóm còn lại hầu hết IJs

của giống sternernema thì có tập tính phục kích tức là ngồi một chổ trong ñất

ñể phục kích , chờ côn trùng vật chủ ñi qua sẻ tiếp nhận và xâm nhập

Khi tìm ñược vật chủ thích hợp, IJs xâm nhập vào cơ thể côn trùng qua các lỗ tụ nhiên như miệng, hậu môn hoặc lổ hở của hậu môn, môt số dạng IJs ñược trang bị mấu bằng kitin có thể ñục thủng thành cơ thể côn trùng tại một nơi xung yếu nào ñó là ranh giới của các ñốt cơ thể ñể xâm nhập Sau khi vào

cơ thể, IJs nhanh chóng xâm nhập vào xoang máu, trong 5 giây VKCS ñược giải phóng khỏi tuyến trùng qua miệng hoặc qua hậu môn

Tại ñây nhờ môi trường thích hợp là huyết tương vi khuẩn cộng sinh trong vòng 48h Giai ñoạn ñầu trong cơ thể côn trùng IJs cũng ñược phát triển nhanh chóng ñạt ñến giai ñoạn trưởng thành thê hệ 1

Tuyến trùng Steinernema sinh sản theo kiểu phân tính nhờ giao phối

giữa ñực và cái, trứng con cái ñược thụ tinh với tinh trùng của con ñực ðiều này cũng có nghĩa là ñể sinh sản ñược trong cơ thể côn trùng vật chủ tuyến trùng cần xâm nhập cả IJs ñực và IJs cái, ñể chúng thâm nhập cả ñực và cái trưởng thành cho phép chúng có ñiều kiện ghép ñôi trong vật chủ Một số

nghiên cứu của Gfinfinet at (2001) cho biết có chủng Steinernema ñược phân

lập ở Indonesea khi nhiễm vào côn trùng vật chủ có khả năng phát triển thành

con cái lưỡng tính tự thụ tinh có kích thước lớn Trong quần thể thế hệ 1 của chúng cũng có con ñực nhưng số lượng con ñực rất ít

Hình 3.2: Chu trình xâm nhập và phát triển của EPN bên trong cơ thể

của côn trùng vật chủ

Ở giai ñoạn ñầu con cái ñẻ trứng vào cơ thể côn trùng và trứng nở thành

ấu trùng tuổi hai, tuy nhiên khi già hơn các con cái này không ñẻ trứng mà trứng ñược giữ lại và nở ra ở ấu trùng tuổi hai ngay bên trong cơ thể con cái Mỗi con cái như thế chứa tới hàng trăm ấu trùng bên trong

Các ấu trùng của thể hệ 1 không phát tán ra ngoài mà ở lại bên trong các xác chết cơ thể vật chủ ñể sử dụng các chất dinh dưỡng chính bằng các mô của côn trùng vật chủ ñể phát triển và ñạt ñến nhanh chóng giai ñoạn trưởng thành giai ñoạn hai Trong trường hợp xác chết vật chủ vẩn còn nguồn thức ăn thì chúng vẩn tiếp tục giao phối và phát triển qua thế hệ ba thậm chí thế hệ bốn bên trong cơ thể vật chủ Cuối cùng chúng dừng lại ở thế hệ hai khi xác chết ñã cạn nguồn dinh dưỡng và chúng bắt ñầu chui ra bên ngoài và trở thành

IJs tuổi ba và từ ñây chúng bắt ñầu cuộc phát triển mới với một côn trùng vật chủ mới

Theo dõi sự phát triển của tuyến trùng ở Việt Nam steinernema sanggi

cho thấy: Một chu kì phát triển của tuyến trùng này ấu trùng BSL là 8-9 ngày, tương ñương ñến thời gian phát triển của sâu khoang

Không giống với steinerma, ở các loài tuyến trùng Herteroabdits IJs khi

xâm nhập vào cơ thể côn trùng phát triển thành con cái lưỡng tính Con cái này có khả năng sinh sản ra tinh trùng với trứng và thụ tinh ñể sinh sản Từ thế hệ 2 trở về sau IJs mới phát triển thành con trưởng thành phân tích ñực cái và sinh sản bằng hình thức giao phối, giai ñoạn ñầu của con cái cả lưởng tính và phân tính chúng ñể trứng nhưng ở giai ñoạn sau khi con cái về già chúng ñẻ trứng thai, lúc này ấu trùng nở ra bên trong cơ thể con mẹ làm nguồn thức ăn ñể phát triển thành ấu trùng tuổi hai, biến con cái trở thành cái bọc chứa ấu trùng tuổi 2 khi phá vở thành cơ thể con mẹ chui ra ngoài trở thành ấu trùng nhiễm tuổi 3 nhưng chúng vẫn giữ ấu cái võ của ấu trùng tuổi hai

Một chu kì phát triển của tuyến trùng EPN trong cơ thể côn trùng vật chủ

ñối với các loài tuyến trùng giống Steinernema spp, dao ñộng từ 7-10 ngày, còn ñối với các loài tuyến trùng giống Heterorhabditis spp, từ 12-15 ngày

Như vậy, một chu ky phát triển của tuyến trùng EPN bên trong cơ thể côn trùng là hoàn toàn khác so với một chu kỳ hay một vòng ñời phát triển của tuyến trùng Một vòng ñời phát triển của tuyến trùng là chu kỳ khép kìn một thế hệ, còn một chu kỳ phát triển của EPN bên trong vật chủ côn trùng có thể gồm một vài thế hệ Qua mỗi chu kỳ xâm nhập và phát triển như vậy, từ một

vài IJs các loài tuyến trùng Heterorhabditis spp Và Steinernema spp, có thể

sinh sản qua một số thế hệ bên trong xác chết côn trùng và nhân số lượng

EPN trong PTSH sâu hại Khả năng sinh sản tạo ra số lượng lớn IJs cũng là thế ñể nhân nuôi sản xuất tuyến trùng, sư dụng côn trùng làm môi trường

nhân nuôi ( in vivo), sử dụng môi trường nhân tạo ñể nhân nuôi (in vitro) sản

xuất tuyến trùng ở quy mô công nghiệp

Với cơ chế ký sinh gây bệnh như trên, tuyến trùng không những có khả năng tiêu diệt nhanh côn trùng mà còn có khả năng sinh sản ñể nhân nhanh số lượng của chúng sau khi giết chết sâu hại vật chủ và trở thành nguồn thiên ñịch trên ñồng ruộng Thực tế trong tự nhiên ở ñâu có tồn tại EPN thì ở ñó sâu hại khó có khả năng phát triển thành dịch hại ñược Sự tồn tại của EPN trong

tự nhiên có mối quan hệ chặt chẽ với côn trùng và các ñiều kiện môi trường Nếu phun nhiều thuốc trừ sâu làm cho sâu hại chết hết thì cũng làm chi nguông thiên ñịch tự nhiên EPN của sâu hại không có khả năng tồn tại nữa Nhờ thành công trong công nghệ nhân nuôi EPN, người ta không những chủ ñộng phòng trừ sâu hại mà cồn bổ sung nguồn thiên ñịch EPN cho ñồng ruộng

3.2.2 Sự xâm nhập vào côn trùng vật chủ của tuyên trùng

Về mặt lý thuyết thì chỉ cần 1 IJs của tuyến trùng xâm nhập vào côn trùng cũng có thể làm chết vật chủ, mặc dù vậy trong thực tế số lượng IJs vào côn trùng vật chủ thường nhiều hơn Do ñó tỷ lệ xâm nhập cao của IJs vào côn trùng vật chủ vẫn là yếu tố quan trọng nhất ñể ñánh giá khả năng tấn công của một chủng tuyến trùng ñối với 1 loài sâu hại Mặt khác, ñây cũng là chỉ tiêu ñể ñánh giá sự mẫn cảm của một loài sâu hại ñối với một chủng tuyến trùng Một trong những nguyên nhân có thể cản trở sự xâm nhập của tuyến trùng vào cơ thể vật chủ là cơ chế bảo vệ của côn trùng Một số loại côn trùng có khả năng kháng lại một lượng nhỏ tuyến trùng xâm nhập bằng cơ chế miễn dịch, hoặc bằng cơ chế cơ học với màng lưới bao bọc các lỗ thở Các cơ chế trên ñây có thể ngăn cản tuyến trùng hoặc làm cho tuyến trùng có thể thất

bại trong nỗ lực xâm nhập và giết chết vật chủ Mặt khác số chất tiết của côn trùng vật chủ cũng có khả năng hấp dẫn một số tuyến trùng tìm kiếm, xâm nhập vào cơ thể vật chủ Khả năng xâm nhập của tuyến trùng càng cao cũng

có nghĩa là vật chủ càng mẫn cảm với tuyến trùng và trong trường hợp này côn trùng vật chủ bị nhiễm ñộc càng nhanh và bị chết nhanh hơn so với côn trùng ít mẫn cảm hơn Ngoài sự, xâm nhập của tuyến trùng vào các phần khác nhau của côn trùng vật chủ cũng khác nhau phụ thuộc vào chủng tuyến trùng

và côn trùng vật chủ Vì vậy, ngoài việc ñánh giá về số lượng tuyến trùng xâm nhập, tỷ lệ xâm nhập vào các phần khác nhau của côn trùng cần ñược xem xét ñể hiểu rõ ràng về cơ chế và ñặc trưng xâm nhập của tuyến trùng ñối với côn trùng ñối với côn trùng vật chủ

Về mặt lý thuyết, IJs có khả năng xâm nhập vào cơ thể côn trùng vật chủ qua lỗ miệng, hậu môn, lỗ thở hoặc xuyên qua thành cơ thể tại khớp nối giữa các ñốt Tuy nhiên, tỷ lệ xâm nhập vào các phần cơ thể khác nhau của côn trùng vật chủ là phân ñầu ngực, phần bụng và phần cuối bụng lại khá khác nhau, phụ thuộc vào loài côn trùng vật chủ và chủng tuyến trùng ký sinh So sánh tỷ lệ tuyến trùng xâm nhập vào các phần khác nhau của côn trùng vật chủ là ấu trùng BSL cho thấy: Trong tổng số IJs có mặt bên trong cơ thể ấu trùng BSL thì chủng tuyến trùng S-TK10 có tỷ lệ IJs xâm nhiễm vào phần ñầu ngực nhiều nhất (46,3%), sau ñó ñến phần bụng (41,5%) và phần cuối bụng

có tỷ lệ thấp nhất (12,2%) Trong thí nghiệm với chủng S-TX1, cũng cho kết quả tương tự với chủng S-TK10: tỷ lệ 43,2% ở phần ñầu + ngực, 41,6% ở phần bụng và 15,2% ở phần cuối bụng

3.2.3 Thời gian sinh trưởng và phát triển của tuyến trùng

Việc nghiên cứu xác ñinh thời gian sinh trưởng và phát triển của một chủng tuyến trùng có ý nghĩa quan trọng trong việc xác ñịnh thời gian nhân ủ

tối ưu trong công nghệ nhân nuôi in vivo và in vitro ñể sản xuất sinh khối tuyến trùng

Thời gian sinh trưởng và phát triển của các chuyển tuyến trùng ñược tác giả Nguyễn Ngọc Châu (2010) cho biết như sau:

Bảng.3.1: Thời gian sinh trưởng và phát triển của 4 chủng EPN

Ấu trùng xâm nhiễm mới

3.3 Quan hệ tương tác giữa tuyến trùng và vi khuẩn cộng sinh

Do bản chất tự nhiên của các loài tuyến trùng ký sinh gây bệnh là những

tổ hợp cộng sinh giữa tuyến trùng và vi khuẩn, trong ñó các loài tuyến trùng

giống Steinernema tổ hợp với các loài vi khuẩn giống Xenorhabdus, còn các loài tuyến trùng Heterorhabditis thì tổ hợp với các loài vi khuẩn giống

Photorhabus Các tổ hợp tuyến trùng của vi khuẩn này có tính chuyển hoá

khá cao: Mỗi loài tuyến trùng có thể tổ hợp với một số loài vi khuẩn, nhưng mỗi loại vi khuẩn chỉ tổ hợp với các loài tuyến trùng nhất ñịnh

3.3.1.Vai trò của tuyến trùng trong tổ hợp

Trong tổ hợp cộng sinh tuyến trùng - vi khuẩn, tuyến trùng EPN có vai trò như sau:

- Vector vận chuyển VKCS: một khi ñã xâm nhập vào trong cơ thể côn trùng, tuyến trùng di chuyển thẳng vào xoang máu côn trùng, tại ñó vi

khuẩn cộng sinh trong cơ thể IJs trở nên hoạt ñộng nhanh chóng ñược giải phóng qua hậu môn tuyến trùng ra xoang máu côn trùng, vi khuẩn sinh sôi nảy nở một cách nhanh chóng, ñồng thời tiết ra chất ñộc gây nhiễm xoang máu và giết chết côn trùng trong vòng 24-48h

- Tuyến trùng bảo vệ vi khuẩn ở 2 mặt :

Bảo vệ VKCS ở môi trường ngoài côn trùng vật chủ bằng cách ñể VKCS trong bọc chứa nằm trong ruột chúng do VKCS không thể tồn tại trong môi trường ñất, nước

Bảo vệ VKCS ở trong cơ thể côn trùng Khi VKCS ñược giải phóng từ

cơ thể tuyến trùng vào xoang máu côn trùng, theo phản ứng tự nhiên côn trùng thường tiết ra một số chất kháng thể (dạng protein) ñể hạn chế hoặc loại

bỏ VKCS Trong khi ñó nhờ tuyến trùng có khả năng tiết ra một số chất làm trung hoà và làm mất tác dụng của chất kháng thể Nhờ vậy, tuyến trùng bảo

vệ cho VKCS phát triển bình thường trong cơ thể côn trùng

Bảng.3.2: Danh sách các loài vi khuẩn cộng sinh với EPN

Các loài vi khuẩn cộng sinh Các loài tuyến trùng EPN

1 X nematophila S carpocapsae

2 X bovienlii S affine, S Feltiae, S krausei

3 X poinarii S cubanum, S glaseri

4 X beddingii Steinernema sp

5 X japonica S kushudai

6 Xenorhabdus sp S arenarium, S Rarum, S risteri

7 Photorhabus luminescens H bacteriophora H brevicaudis

8 P temperata H bacteriophora, H megidis

9 P asymbiotica Loài này phân lập từ người

10 Photorhabdus sp H dawnesi, H Ponari

3.3.2.Vai trò của vi khuẩn cộng sinh trong tổ hợp

Trong tổ hợp cộng sinh vi khuẩn có vai trò rất lớn ñối với tuyến trùng, thể hiện qua các mặt sau:

- Sản sinh ñộc tố giết chết côn trùng bị nhiễm : ðộc tố do VKCS tiết ra một số protein ñộc có khả năng nhiễm xoang máu côn trùng vật chủ và làm côn trùng vật chủ chết một cách nhanh chóng trong vòng 24 – 48 giờ Như vậy, thời gian chết côn trùng vật chủ khác nhau tuỳ loại tổ hợp tuyến trùng vi khuẩn và cũng phụ thuộc vào loại côn trùng vật chủ nhưng thường không chậm hơn 48 giờ

- Cung cấp nguồn thức ăn cho tuyến trùng: tuyến trùng sử dụng VKCS vừa ñược giải phóng từ cơ thể chúng và sinh sôi trong xoang máu côn trùng như nguồn dinh dưỡng của chúng Nhờ ñó mà IJs cũng nhanh chóng phát triển sang tuổi 4 và ñạt ñến tuổi trưởng thành Từ thế hệ 2 tuyến trùng chuyển sang dinh dưỡng hoạt hoá xác chết côn trùng: Nhờ các enzyme do vi khuẩn sinh ra mà các mô cơ thể côn trùng trở thành nguồn thức ăn thích hợp cho tuyến trùng Từ ñó thế hệ 2 tuyến trùng tiếp tục phát triển, sinh sôi các thế hệ tiếp theo Thông thường trong cơ thể côn trùng, tuyến trùng có thể phát triển 2 ñến 4 thế hệ, phụ thuộc vào sinh khối côn trùng làm nguồn thức ăn cho chúng Ngăn cản các vi khuẩn khác xâm nhập vào xác chết côn trùng: VKCS có khả năng sinh ra các hoạt chất kháng sinh ñể ngăn cản tác nhân sinh học khác như nấm, vi khuẩn xâm nhập và phát triển trên xác côn trùng Nhờ vậy mà chúng bảo vệ nguyên vẹn nguồn thức ăn giành cho tuyến trùng cộng sinh của chúng Như vậy có thể nói ñây là một trong những mô hình cộng sinh tuyệt vời và hoàn hảo giữa hai loài vi sinh vật trong tự nhiên Mô hình cộng sinh này vừa chuyển hoá cao ñến mức sự tồn tại của loài này bắt buộc phải có sự hiện diện

và cộng sinh của loài kia và ngược lại

3.3.3 Vai trò của tổ hợp chống lại hệ thống bảo vệ của côn trùng

ðể phá huỷ cấu trúc ngăn trở các tác nhân gây bệnh hiệu quả cần phải chống lại cơ chế miễn dịch của côn trùng vật chủ Một vài cách thức ñối phó với hệ miễn dịch ñó là: Sự kháng chịu với cơ chế bảo vệ của vật chủ, phá huỷ

hệ thống nhận biết và phản ứng của vật chủ.( Akhurst & Dunphy, 1993)

Trong trường hợp một số loài tuyến trùng và vi khuẩn không phải là cộng sinh của nhau thì chúng thường mẫn cảm với các cơ chế bảo vệ của côn trùng Một trong những cơ chế của một số côn trùng hai cách có giai ñoạn ấu trùng sống trong môi trường nước là tao ra thể dịch tức thời bao bọc tuyến trùng trong một nang bọc polyphenol/protein (Dunphy & thurston, 1990) Tuy nhiên phản ứng nang bọc này cũng không bảo vệ ñược sự chết của Aedis spp

Và Culex restuans ngay cả khi tuyến trùng bị mang bọc do VKCS X

nematophilus ñược nhanh chóng giải phóng từ tuyến trùng trước khi bị mang

bọc và vi khuẩn ñã kịp thời phát triển mà không ảnh hưởng bởi phản ứng bảo

vệ - chúng ñã kịp sản sinh và giết chết vật chủ muỗi này (Welch & Bronkill,1962)

Vi khuẩn cộng sinh tạo ra các ñộc tố giết côn trùng

Mỗi tổ hợp tuyến trùng vi khuẩn có thể tiêu diệt một phổ khá lớn các loài côn trùng vật chủ do chúng có khả năng vượt qua các hệ thống bảo vệ của côn trùng và sản xuất các chất ñộc tố (toxin) ñể giết côn trùng bị nhiễm

Cũng giống như các vi khuẩn gram âm khác các loài Xenorhabdus spp

Và Photorhabdus spp có khả năng sản sinh ra nội ñộc tố Nội ñộc tố do X

poinarii sinh ra là các hợp chất lipopolisacharide của thành tế bào các chất

này gây ñộc ñối với huyết cầu (haemocytes) của côn trùng (Dunphy

&Webster, 1988) Tuy nhiên hiện tại vẫn chưa rõ ràng là chỉ một mình nội ñộc tố có hiệu lực giết chết côn trùng vật chủ hay còn nhiều yếu tố nào khác

nữa Sự gây nhiễm huyết cầu vật chủ cho phép Xenorhabdus nhân nhanh số

minh trong P Luminescens (Bowen et,al,.1988,) X Nematiphilus và X

Bovienii bằng cách tiêm các chất vào phù nổi của dịch nuôi cấy vi khuẩn vảo

cơ thể côn trùng thì côn trùng chết nhanh chóng Mặc dù các vi khuẩn này sản sinh ra các enzyme ngoài tế bào, các chất này ñược xem như proteases, phospholipase và lipases ở các vi khuẩn khác, các enzyme này chưa ñược

chứng minh nhưng có tác nhân hoạt hoá trong việc gây ñộc của Xenorhabdus

ñối với côn trùng Tuy nhiên, Eisign et al.(1990) ñã ghi nhận ñược một

protein ngoại bào ở X Luminescens là hoạt ñôc tố cao khi tiêm vào ấu trùng

tuổi 5 của Manduca sexta ñã giết chết trong 24 giờ Bản chất và cơ chế tác dụng của ñộc tố này còn chưa ñược xác ñịnh rõ, nhưng chắc chắn ñộc tố này không phải là proteases cũng không phải là phospholipase

Vi khuẩn cộng sinh kích hoạt sự sinh sản của tuyến trùng

Mặc dù các loài Steinernema spp, có thể ñược nhân nuôi ñơn giá thể (axenic - chỉ một mình tuyến trùng) bằng môi trường nhân tạo (in vitro),

nhưng chắc chắn chúng không thể sinh sản trong cơ thể côn trùng mà không cần sự có mặt của vi khuẩn cộng sinh Các thí nghiệm của Ponar & Thomas

(1966) và Boemare et al (1983) ñã cho thấy khi cho nhiễm tuyến trùng S

carpocapsae sinh ra bằng sinh sản ñơn giản (axenic) vào cơ thể côn trùng vật

chủ BSL thì tuyến trùng vẫn ñạt ñến tuổi trưởng thành nhưng không sinh sản ñược Tuy nhiên, cũng tuyến trùng này nhưng cho nhiễm vào cơ thể côn trùng

vật chủ BSL kết hợp cùng với một số loài vi khuẩn như Enterobacter

aglomerans, Serratia liquefaciens, pseudomonas jlurescens hoặc VKCS của

chúng, X nematophilus thì tuyến trùng có thể sinh sản Kết quả tương tự cũng ñạt ñược ñối với loài Steinernema khác như S glaseri và S feltiae Mặt dù, về

thực chất, VKCS không phải là yếu tố cần thiết cho sự sinh sản của tuyến trùng, nhưng nhìn chung chúng rất cần thiết ñối với các loài khác trong sinh

sản in vivo và in vitro.(boemare et al., 1983: Akhurst, 1983; Dunphy et al

1985; Han et al., 1990)

3.3.4 Cơ chế chống lại các vi sinh vật gây bệnh khác

Có một cơ chế bảo vệ khác chống lại vi sinh vật ngoại ña góp phần làm cho hệ huyết tương của vật chủ sẽ không bị nhiễm các vi khuẩn gây bệnh khác khi tuyến trùng xâm nhập vào côn trùng vật chủ và giải phóng VKCS của chúng ðiều này cũng có nghĩa là các huyết cầu của côn trùng vật chủ sẵn sàng phá huỷ các vi khuẩn nhiễm bệnh khác, trong ñó có các vi khuẩn bám trên bề mặt của tuyến trùng và theo tuyến trùng xâm nhập vào xoang máu hoặc chúng cũng có thể xâm nhậm khi tuyến trùng ñâm thủng ruột côn trùng

Một khi huyết cầu bị phá huỷ bằng Xenorhabdus một cơ thể khác chống

lại sự nhiễm thứ cấp của vi sinh vật từ ruột hoặc từ môi trường ñất vào xác

chết côn trùng Các loài Xenorhabdus spp Có 2 cơ chế ñối với hoàn cảnh

này: Các chất kháng sinh ngăn cản sự phát triển trên một phổ rộng của vi khuẩn và nấm ngoại biên xâm nhập (Dutky, 1974; Akhurst, 1982) và các chất baterioxin và các thực khuẩn bào (bacteriophages) ngăn cản các loài

Xenorhabdus khác Một số hợp chất kháng khuẩn ñược xác ñịnh từ Xenorhabdus spp (Paul et al.,1981; Mclnerney et al, 1990a,b) Mỗi một

chủng VKCS sản xuất môt vài thành phần của một nhóm và ít nhất một chủng sản xuất hai nhóm kháng khuẩn này không duy trì trong ñiều kiện monoxenic trong xác chết côn trùng một cách vô hạn ñịnh, nhưng chúng thường giữ ñược hiệu lực trong pha giới hạn của sự sinh sản Một số tác giả ñưa ra giả thuyết rằng hiện tượng hình quan sinh học do VKCS của tuyến trùng

Heterorhabditis spp tạo ra ñã giúp xác chết côn trùng ñược bảo vệ trong môi

trường ñất Phản ứng tạo hình quang sinh học ñạt tới ñỉnh ñiểm trong khi tuyến trùng ñang sinh sản và có thể chống chọi với sự phá vỡ xác chết Các