Tổng hợp và khảo sát hoạt tính độc tế bào của các chất tương đồng curcumin từ các dẫn chất phenylhydrazin

Hiện nay, có nhiều dược chất được tiếp cận đểđiều trị căn bệnh này, cùng nhiều phương pháp và thuốc làm giảm các triệu chứngbệnh, ngăn cản sự di căn và giảm ảnh hưởng hay điều chỉnh các

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS TS TRƯƠNG NGỌC TUYỀN

.

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kếtquả nêu trong luận văn là trung thực và chưa được công bố trong các công trìnhnghiên cứu khác Nếu không đúng như đã nêu trên, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm

Người cam đoan

Trần Thiên Thi

.

Mở đầu và đặt vấn đề

Các nghiên cứu trước đây cho thấy hoạt tính tốt của curcumin trong tác động chống

oxy hóa, kháng khuẩn, và đặc biệt là kháng ung thư Dị vòng 1H-pyrazol có mặt trong

cấu trúc các dược chất như mepiprazol (giải lo âu), celecoxib, mepirizol (kháng

khung cấu trúc trên, thử độc tế bào và hoạt tính sinh học của chúng

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: Chất tương đồng curcumin kiểu monocarbonyl

(Monocarbonyl Analogues of Curcumin–MACs) chứa dị vòng 1H-pyrazol.

MACs có cấu trúc (A) dị vòng 1H-pyrazol gắn nhóm thế phenyl hoặc phenyl có nhóm

thế; (B) vòng phenyl gắn nhóm cho electron chứa oxy, hình thành liên kết hydro(hydroxy, methoxy, ethoxy); (C) dây nối mạch thẳng/ vòng thơm/ dị vòng thơm vớitính kỵ nước kiểu penta-1,4-dien-3-on

Hình 1: Khung cấu trúc MACs

Phương pháp nghiên cứu:

A (A.1–A.4) với các chất trung gian B (B.1–B.9) với tỉ lệ 1:1,05.

.

Phương pháp kiểm nghiệm: Nhiệt độ nóng chảy, sắc ký lớp mỏng, phổ IR, MS, 1H

Phương pháp thử hoạt tính độc tế bào: Đo độ hấp thu của sản phẩm khử MTT

(formazan) sinh ra từ phản ứng giữa tế bào sống và MTT ở bước sóng 540 nm

Kết quả và bàn luận

Tổng hợp

Đề tài đã tổng hợp và chứng minh cấu trúc của 36 MACs chứa dị vòng 1H-pyrazol

Hiệu suất tổng hợp các chất trung gian A từ trung bình: 40–60% Hiệu suất tổng hợp

MACs ở mức trung bình cao: 30–90%

Graduation thesis for degree of BS Pharm–Academic Year: 2019-2021

RESEARCH ON THE SYNTHESIS OF THE PYRAZOLE-INCORPORATED

MONOCARBONYL ANALOGS OF CURCUMIN FROM

PHENYLHYDRAZINE DERIVATIVES

Introduction: According to published studies, curcumin can exert a therapeutic

impact on oxidation, inflammation, alzheimer’s treatment and especially, cancer

treatment 1H-Pyrazole can be easily found in drug structure available in the market

such as mepiprazole-antidepressant, celecoxib and mepirizole-anti-inflammatory,betazole-receptor H2 agonist This research aims to synthesis new derivatives andevaluate their biological activity

Methods and Subjects: MACs derivatives are synthesized via aldol reaction of A

intermediate (from acetophenone and phenylhydrazine) and B intermediate (fromaromatic aldehyde and acetone) following the 4-step procedure Those synthesizedderivatives are purified and determined the structures by measuring melting point

Research object: Monocarbonyl curcumin analogues (Monocarbonyl Analogues of

Curcumin - MACs) contained a 1H-pyrazol heterocycle.

MACs had a structural (A) 1H-pyrazol heterocycle with a phenyl substituent or a

phenyl substituent; (B) the phenyl ring attached a group to the oxygen-containingelectron, forming a hydrogen bond (hydroxy, methoxy, ethoxy); (C)

hydrophobicity

MACs

Synthesis of asymmetric MACs: Aldol condensation reaction between A (A.1-A.4)

and B (B.1-B.9) with a ratio of 1:1.05

.

Identification: Melting point, thin layer chromatography, IR, MS, 1H NMR, 13CNMR

Cytotoxic activity test: Measure the absorbance of MTT reducing product (formazan)

generated from the reaction between living cells and MTT at the wavelength of 540nm

Results and discussion

Synthetic

This research synthesized and demonstrated the structure of 36 heterocyclic MACs

containing 1H-pyrazol.

Medium to high yields of synthesis intermediate A: 40-60%

Medium yields of synthesis of MACs: 30-90%

Bioactivity test: MCF-7

Conclusion: 36 derivatives are successfully synthesized MACs have trans

configuration with desired structure and are conducted biological activity tests withpositive results on the MCF-7 cell line

Keywords: hydrazon, MACs, monocarbonyl, 1H-pyrazol, phenylhydrazin.

.

DANH MỤC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT xi

DANH MỤC CÁC BẢNG xiii

DANH MỤC CÁC HÌNH xiv

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 Curcumin–Cấu trúc phân tử 2

1.2 Tác dụng curcumin 4

1.3 Chất tương đồng curcumin kiểu monocarbonyl 7

1.4 Dẫn chất vòng 1H-pyrazol 9

1.4.1 Giới thiệu chung về dị vòng 1H-pyrazol 9

1.4.2 Các phương pháp tổng hợp dị vòng 1H-pyrazol 9

ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11

2.1 Đối tượng nghiên cứu 11

2.1.1 Cấu trúc chất tương đồng curcumin kiểu monocarbonyl (MACs) 11

2.1.2 Nguyên liệu 11

2.1.3 Dụng cụ và trang thiết bị 13

2.2 Phương pháp nghiên cứu 14

2.2.1 Phương pháp tổng hợp 14

2.2.2 Phương pháp phân lập và tinh chế sản phẩm 21

2.3 Phương pháp kiểm nghiệm sản phẩm 22

2.3.1 Sắc ký lớp mỏng (SKLM) 22

2.3.2 Nhiệt độ nóng chảy (MP) 22

2.3.3 Quang phổ hấp thu hồng ngoại (IR) 22

2.3.4 Phổ khối (MS) 22

2.3.5 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 22

2.4 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính độc tế bào 23

2.4.1 Dòng tế bào 23

.

2.4.2 Thao tác 23

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 253.1 Tổng hợp các chất trung gian A (A.1–A.4) 25

3.2.1 Tổng hợp 3-phenyl-1H-pyrazol-4-yl) penta-1,4-dien-3-on (CUR1.1) 32 3.2.2 Tổng hợp (1E,4E)-1-(2,4-dimethoxyphenyl)-5-(1-(4-methoxyphenyl)- 3-phenyl-1H-pyrazol-4-yl) penta-1,4-dien-3-on (CUR1.2) 33

3.2.25 Tổng hợp

(1E,4E)-1-(1,3-bis(4-methoxyphenyl)-1H-pyrazol-4-yl)-5-(3,4,5-trimethoxyphenyl)penta-1,4-dien-3-on (CUR3.7) 58

3.2.26 Tổng hợp (1E,4E)-1-(1,3-bis(4-methoxyphenyl)-1H-pyrazol-4-yl)-5-(4-(dimethylamino)phenyl)penta-1,4-dien-3-on (CUR3.8) 59

3.2.27 Tổng hợp (1E,4E)-1-(1,3-bis(4-methoxyphenyl)-1H-pyrazol-4-yl)-5-(4-hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)penta-1,4-dien-3-on (CUR3.9) 60

3.2.28 Tổng hợp (1E,4E)-1-(3,4-dimethoxyphenyl)-5-(3-(4-florophenyl)-1-(4-methoxyphenyl)-1H-pyrazol-4-yl)penta-1,4-dien-3-on (CUR4.1) 61

3.2.29 Tổng hợp (1E,4E)-1-(2,4-dimethoxyphenyl)-5-(3-(4-florophenyl)-1-(4-methoxyphenyl)-1H-pyrazol-4-yl)penta-1,4-dien-3-on (CUR4.2) 62

3.2.30 Tổng hợp (1E,4E)-1-(3-(4-florophenyl)-1-(4-methoxyphenyl)-1H-pyrazol-4-yl)-5-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)penta-1,4-dien-3-on (CUR4.3) 63

3.2.31 Tổng hợp (1E,4E)-1-(3-(4-florophenyl)-1-(4-methoxyphenyl)-1H-pyrazol-4-yl)-5-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)penta-1,4-dien-3-on (CUR4.4) 64

3.2.32 Tổng hợp (1E,4E)-1-(3-ethoxy-4-hydroxyphenyl)-5-(3-(4-florophenyl)-1-(4-methoxyphenyl)-1H-pyrazol-4-yl)penta-1,4-dien-3-on (CUR4.5) 65

3.2.33 Tổng hợp (1E,4E)-1-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-5-(3-(4-florophenyl)-1-(4-methoxyphenyl)-1H-pyrazol-4-yl)penta-1,4-dien-3-on (CUR4.6) 66

3.2.34 Tổng hợp (1E,4E)-1-(3-(4-florophenyl)-1-(4-methoxyphenyl)-1H-pyrazol-4-yl)-5-(3,4,5-trimethoxyphenyl)penta-1,4-dien-3-on (CUR4.7) 67

3.2.35 Tổng hợp (1E,4E)-1-(4-(dimethylamino)phenyl)-5-(3-(4-florophenyl)-1-(4-methoxyphenyl)-1H-pyrazol-4-yl)penta-1,4-dien-3-on (CUR4.8) 68

3.2.36 Tổng hợp (1E,4E)-1-(3-(4-florophenyl)-1-(4-methoxyphenyl)-1H-pyrazol-4-yl)-5-(4-hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)penta-1,4-dien-3-on (CUR4.9) 69

3.3 Bàn luận về tổng hợp 70

3.4 Thử nghiệm hoạt tính độc tế bào 74

3.5 Bàn luận về hoạt tính độc tế bào 75

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 77

.

4.1 Kết luận 77

4.2 Đề nghị 77

.

DANH MỤC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ tắt Ý nghĩa tiếng Anh Ý nghĩa tiếng Việt

DNA Deoxyribonucleic acid Acid deoxyribonucleic

IC50

xii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số đặc tính về curcumin 4

Bảng 2.1 Nguyên liệu dùng trong đề tài 11

Bảng 2.2 Các hệ dung môi sắc kí dùng trong đề tài 22

.

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Mối liên quan cấu trúc và tác động của curcumin 2

Hình 1.2 Dạng keto và enol của curcumin 3

Hình 1.3 Cấu trúc các curcuminnoid 3

Hình 1.4 Liên quan cấu trúc–tác dụng của curcumin 5

Hình 1.5 Các mục tiêu tác động của curcumin 7

Hình 1.6 Tổng hợp MACs theo Kumar và cộng sự 8

Hình 1.7 Tổng hợp MACs theo Carapina da Silva và cộng sự 8

Hình 1.8 Tổng hợp MACs theo Nagargoje và cộng sự 8

Hình 1.9 Tổng hợp 1H-pyrazol-4-carbaldehyd từ hydrazon 9

Hình 1.10 Tổng hợp 1H-pyrazol-4-carbaldehyd từ semicarbazon 10

Hình 1.11 Tổng hợp 1H-pyrazol-4-carbaldehyd từ methyl keton và hydrazin 10

Hình 1.12 Tổng hợp 1H-pyrazol-4-carbaldehyd từ benzohydrazid hoặc isoniazid 10

Hình 2.1 Định hướng cấu trúc của MACs trong nghiên cứu 11

Hình 2.2 Tóm tắt giai đoạn tổng hợp các chất trung gian A (A.1–A.4) 14

Hình 2.3 Tóm tắt giai đoạn tổng hợp các chất trung gian B (B.1–B.9) 14

Hình 2.4 Tóm tắt giai đoạn tổng hợp MACs 15

Hình 2.5 Quy trình tổng hợp TG.1 15

Hình 2.6 Quy trình tổng hợp TG.2 16

Hình 2.7 Quy trình tổng hợp TG.3 16

Hình 2.8 Quy trình tổng hợp TG.4 17

Hình 2.9 Cơ chế phản ứng chung cho các TG 18

.

Thầy, Cô trong Hội Đồng đánh giá Khóa luận văn tốt nghiệp Thạc Sĩ cùng quý thầy

cô đã đóng góp ý kiến giúp luận văn của em hoàn chỉnh hơn

Gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Chị Lê Nguyễn Duyên Sa bộ môn Hóa Hữu Cơ, thầy

TS Vòng Bính Long, bạn DS Hà phòng thí nghiệm sinh học thử hoạt tính trường Đại Học Quốc Gia đã hết lòng giúp đỡ, tạo điều kiện để em có thể hoàn thành luận

văn này

Em xin chân thành cảm ơn Quý Thầy Cô đã tận tình dạy dỗ em trong suốt hơn 2 nămhọc qua, để em có được ngày hôm nay

Xin chân thành gửi lời cám ơn DS Đoàn Quốc Hoài Nam đã đặt những bước đi đầu

tiên cho nhóm nghiên cứu này Cám ơn em đã giúp đỡ chị rất nhiều về mặt chuyênmôn để thực hiện luận văn này

Xin gửi một lời cảm ơn sâu sắc đến các em monitor Tiến Dũng, Đăng Sơn, Tấn Tài, Trương Yến, Ái Hậu, Nguyễn Dung, Trung Lê, Huỳnh Được, Kiều Nhật vì đã

cống hiến thời gian, sức lực và tâm trí cho luận văn này được hoàn thành tốt đẹp nhất

có thể Đặc biệt cảm ơn Tiến Dũng vì em đã luôn cố gắng vì chị không quản thời

gian và công sức trong mọi việc, mong em tương lai cũng có một người monitor nhưvậy Mong các em sẽ luôn hết mình trong nghiên cứu với đề tài của mình trong tươnglai dù ở lab này hay lab khác, để sớm hái được những thành công từ những công sứcmình đã vất vả trong suốt bao năm qua đồng hành cùng lab Hóa hữu cơ Chúc chocác em trên con đường tương lai nhờ sự chăm chỉ và hiểu biết để luôn thành côngtrên đường đời

Cảm ơn bạn Tú Linh, Minh Tâm, Quốc Bảo, Bảo Ngọc, Hoàng Nhung, Phạm Cảnh anh: Quốc Vương, Phiên Vũ chị Phúc, Vân và em Nguyệt lớp CNDBC và các em: Quốc Anh, Hoàng Việt, Ngọc Kim, Tiểu Long, Hoàng Sơn, Chương Trịnh, Anh Tiến, Tiến Phát, Dương Vũ ,Tuyết Minh, Trần Hải, Khánh Ngân, Triệu Vĩ, Ngọc Vi, Hữu Nhân, đã tận tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất để

tôi có thể thực hiện luận văn này

Thành quả này xin gửi đến gia đình, những người luôn yêu thương, động viên, khích

lệ giúp tôi vượt qua khó khăn trong cuộc sống

.

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư là một trong những căn bệnh hàng đầu gây tổn thất nặng nề về sức khỏe, tàichính và gánh nặng cho ngành y tế Hiện nay, có nhiều dược chất được tiếp cận đểđiều trị căn bệnh này, cùng nhiều phương pháp và thuốc làm giảm các triệu chứngbệnh, ngăn cản sự di căn và giảm ảnh hưởng hay điều chỉnh các chức năng cơ thể.Bên cạnh việc áp dụng các phương pháp mới, sử dụng phù hợp dược chất hay cải tiếnphương pháp bào chế mới để đưa thuốc đến mục tiêu, thì việc tìm ra những dẫn chấtmới mở ra nhiều cơ hội để phát hiện và đưa vào nghiên cứu điều trị cho căn bệnh này.Curcumin là chất tự nhiên có hoạt tính được nghiên cứu, đưa vào sử dụng rất phổbiến từ xưa và ngày nay còn đang được nghiên cứu phát triển hơn nữa về các tínhnăng của nó đặc biệt là nghiên cứu trong điều trị ung thư Bên cạnh curcumin, vòngpyrazol có mặt trong nhiều cấu trúc của thuốc trên thị trường với tác dụng đa dạng

curcumin và pyrazol nghiên cứu này với sự thay đổi cấu trúc curcumin tạo nên cácdẫn chất mới để cải thiện nhược điểm của curcumin và mở ra nhiều hướng nghiêncứu mới khi kết hợp với các khung cấu trúc khác

Bằng phương pháp tổng hợp hóa học, phát triển từ đề tài tổng hợp các chất tương

thế với mong muốn có tác dụng kháng ung thư tốt hơn, từ đó hình thành nghiên cứu:

“Tổng hợp và khảo sát hoạt tính độc tế bào của các chất tương đồng curcumin

từ các dẫn chất phenylhydrazin” với mong muốn tạo ra các dẫn chất có tác dụng

tốt trên tế bào ung thư và có thể áp dụng trong trị liệu

Mục tiêu cụ thể

- Tổng hợp các chất tương đồng curcumin có vòng 1H-pyrazol từ các dẫn chất

phenylhydrazin (phenylhydrazin và 4-methoxyphenylhydrazin) Tinh khiết và xácđịnh cấu trúc các chất tổng hợp được

- Khảo sát hoạt tính độc tế bào của các chất in vitro trên dòng tế bào ung thư MCF-7.

.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Curcumin–Cấu trúc phân tử

Cấu trúc–chức năng

Curcumin là dẫn chất polyphenol, chiết xuất từ củ nghệ (Curcuma longa L.

Zingiberaceae) Curcumin được sử dụng như một loại gia vị, tinh thể màu vàng cam,thực tế không tan trong nước và ether, tan được trong ethanol, dimethyl sulfoxid, vàaceton [42], [64] Mối liên quan về cấu trúc tác dụng hình 1.1 [29]

Hình 1.1 Mối liên quan cấu trúc và tác động của curcumin

Khung vòng thơm kiểu catechol A: khung phenyl kỵ nước có khả năng tương tác với

protein tế bào thông qua liên kết van der Waals tại vị trí kỵ nước của tế bào Nhómmethoxy và hydroxy tạo liên kết hydro ở 2 đầu của phân tử, có tác dụng trung hòa

liên quan chặt chẽ với phenolic O-H và C-H Cơ chế chống oxy hóa của curcumindựa trên sự tách rời nguyên tử H từ nhóm phenolic, không dựa trên trung tâm nhóm

CH2 trong liên kết heptadien [56]

Khung 1,3-diketon B: nhóm carbonyl tồn tại dạng hỗ biến keto-enol có thể tạo thành

sáu vị trí liên kết hydro tạo điều kiện cho các tương tác liên kết hydro với các vị tríhoạt động của protein tế bào, do đó mở rộng số lượng tương tác với các vị trí gắnprotein [24], [29] Các kim loại như Cu (II), Fe (II) hoặc Pb (II) có khả năng tạo phứcchelat qua nhóm diketo [6]

.

Hình 1.2 Dạng keto và enol của curcumin

Khung liên kết olefin C: mạch carbon chưa bão hòa, nối các vòng thơm với khung

1,3-diketon liên kết cộng hóa trị là trung tâm tác động theo cơ chế Michael với tác

Tính chất

Các nghiên cứu trước đây cho thấy có sự khác biệt về hàm lượng curcumin giữa các

dòng khác nhau của loài C longa Curcumin chứa khoảng 70% diferuloylmethan,

Curcumin có nhiều tác động, cho phép tạo thành các tương tác đa dạng với protein tế

qua phân, 1/3 trong số đó ở dạng không chuyển hóa, do đó có sinh khả dụng thấp[50], [70]

1.2 Tác dụng curcumin

Củ nghệ có thành phần chính là curcumin được sử dụng từ hàng ngàn năm trước trongviệc điều trị các bệnh khác nhau [43] có hiệu quả, với nguyên liệu rẻ tiền và phổ biến

Đã có nhiều tài liệu cho thấy curcumin có khả năng kháng nấm, kháng virus, chất

đã chứng minh cơ chế mà stress oxy hóa kéo dài (oxidative stress) có thể dẫn đếnviêm mãn tính, do đó có thể gây ra nhiều bệnh mãn tính bao gồm cả bệnh tim mạch,

mới nhất cho thấy curcumin tác động phòng ngừa chống lại COVID-19 do làm tăngkhả năng miễn dịch tế bào bằng cách ức chế sự xâm nhập của mầm bệnh, ức chế sựgắn kết của virus với tế bào chủ, ức chế con đường nội bào trong tế bào chủ, … [17].Những kết quả dưới đây cho biết một số tác động điển hình của curcumin:

.

Tác dụng chống oxy hóa

oxy hóa nhờ vào kiểm soát tổn thương DNA và đảo ngược quá trình peroxy hóa lipid

động chống oxy hóa này mà các nghiên cứu được đề cập chứng minh rõ về tác độngchống ung thư của curcumin

Hình 1.4 Liên quan cấu trúc–tác dụng của curcumin

Hệ thống 1,3-diketon của curcumin như một chất chống oxy hóa mạnh có vai trò quantrọng trong việc loại bỏ oxid nitric Các đặc tính điều trị của curcumin trong các tìnhtrạng bệnh lý khác, có thể được giải thích một phần bởi khả năng loại bỏ oxid nitric[44]

Tác động chống viêm

Tình trạng căng thẳng kéo dài dẫn đến mất cân bằng các phản ứng oxy hóa gây tổn

Hiện nay con người đang hướng đến sử dụng các loại thuốc kháng viêm tự nhiên đểthay thế thuốc kháng viêm NSAIDs để tránh các tác dụng phụ của nhóm thuốc này.Đáng kể đến là nghiên cứu curcumin trên mô hình động vật, curcumin ức chế chuyểnhóa acid arachidonic và tình trạng viêm ở biểu bì da thông qua điều chỉnh các enzym

trọng trong việc ngăn chặn quá trình viêm, thông qua thay đổi hoặc ức chế các conđường phân tử khác nhau Curcumin cho thấy có tác dụng ức chế viêm cấp tính và

cytokin [58]

Tác động bảo vệ dạ dày

Đối với dạ dày, curcumin làm giảm tình trạng loét và các biến chứng liên quan như:cải thiện các yếu tố bảo vệ dạ dày, ngăn ngừa tình trạng viêm, chống lại các yếu tốgây kích thích dạ dày [33] Như ta đã biết nếu bụng đói sử dụng acid acetylsalicylic(aspirin) thì gây tổn thương đến lớp niêm mạc dạ dày, trong khi dùng chung với

.

phối hợp với omeprazol có vai trò ngăn ngừa sự phát triển tổn thương dạ dày tronggiai đoạn cấp tính của viêm loét dạ dày [3]

Tác dụng chống ung thư

Ngoài khả năng chống oxy hóa, curcumin còn hoạt động trên một số con đường truyềntín hiệu tế bào, các enzym khác nhau, hệ thống miễn dịch, quá trình xơ vữa động

tiềm năng với khả năng gây độc tế bào được nghiên cứu và chứng minh trong bệnhung thư ruột kết [15], tác dụng kháng khối u [49], kháng viêm [4], chống oxy hóa

hỗ trợ kết hợp với các dược chất khác để tăng cường hoạt động chống khối u, nhưphối hợp với gemcitabin để điều trị ung thư tuyến tụy cho thấy hiệu quả tích cực trongđiều trị và kiểm soát sự tiến triển của ung thư [59], [28] Cyclooxygenase vàlipoxygenase có tác dụng ức chế hệ thống miễn dịch Curcumin ức chế chuyển hóaphụ thuộc cyclooxygenase của acid arachidonic thành prostaglandin và chuyển hóaacid arachidonic bằng lipoxygenase Do đó, curcumin có thể giúp hệ thống miễn dịchtránh khỏi sự ức chế gây ra bởi các khối u hoặc chất kích thích khối u [27]

Curcumin có khả năng can thiệp vào một số con đường sinh hóa liên quan đến sựtăng sinh và sống sót của các tế bào ung thư thông qua các liên kết trực tiếp và giántiếp tới các mục tiêu khác nhau, bao gồm các yếu tố phiên mã, yếu tố tăng trưởng,acid nucleic và một số protein có liên quan đến quá trình dẫn truyền tín hiệu tế bào

năng ức chế sự tăng sinh mạch, ngăn chặn việc cung cấp máu đến các mô tân sinh và

do đó làm chậm sự phát triển của khối u và (ii) tăng cường sửa chữa DNA bị hỏnghoặc giải độc [38]

Cơ chế tác dụng của curcumin trong điều trị các loại ung thư khác nhau vẫn đangđược nghiên cứu Vai trò curcumin là trung gian thông qua sự ức chế một số conđường tín hiệu tế bào ở nhiều cấp độ Curcumin có khả năng ức chế sự phát triển tếbào ung thư thông qua kiểm soát chu kỳ tế bào bằng cách liên kết trực tiếp hay gián

và AP-1), các yếu tố tăng trưởng (EGF, PDGF và VEGF), enzym (COX-2, iNOS vàMMP), kinase (cyclin D1, CDKs, Akt, PKC và AMPK), các cytokin gây viêm (TNF,MCP, IL-1, và IL-6), điều chỉnh lại proapoptotic (Bax, Bad và Bak) và điều hòa giảm

.

Hình 1.5 Các mục tiêu tác động của curcumin

1.3 Chất tương đồng curcumin kiểu monocarbonyl

Vì những tác dụng sinh học có lợi của curcumin mà ngày nay y học sử dụng rất nhiềutrong điều trị và nghiên cứu Nhưng nhược điểm của curcumin lại ảnh hưởng rất nhiều

kém, chuyển hóa lần đầu qua gan và đào thải chủ yếu qua phân, 1/3 trong số đó ở

chưa thể phát triển thành thuốc Vì vậy, ngày nay các chất tương đồng curcumin đượctổng hợp dựa trên tính chất và công thức cấu tạo curcumin để tăng sinh khả dụng củacurcumin và mang tính đa dạng sinh học

Trên in vitro–in vivo cho thấy các nhóm phenolic và khung 1,3-diketon bị thủy phân

cấu trúc đã được chứng minh là cải thiện độ ổn định của curcuminoid và làm tăng

đồng curcumin kiểu monocarbonyl (MACs) để tăng sinh khả dụng và tác dụng sinhhọc Chất tương đồng MACs đã được thiết kế và tổng hợp bằng cách loại bỏ cácdiketon, do nhóm này giới hạn dược động học của curcumin như dễ bị thủy phân vàphân hủy [34]

Yếu tố tăng trưởng: EGF,

IL-8, MIP,

TNF-α

Các receptor:

ER-α, HER-2,EAR, Fas-R,EGFR

Các enzym:

ATPase, GST,COX-2Telomerase

Curcumin

.

Hình 1.6 Tổng hợp MACs theo Kumar và cộng sự

Trong nghiên cứu mới của Carapina da Silva và cộng sự cho thấy MACs ổn định tại

pH = 7,4 và có tính ổn định hơn curcumin tự nhiên cho thấy tiềm năng hoạt tính sinh

Hình 1.7 Tổng hợp MACs theo Carapina da Silva và cộng sự

Nagargoje và cộng sự tổng hợp MACs có chứa dị vòng 1H-pyrazol theo cấu trúc đối

Hình 1.8 Tổng hợp MACs theo Nagargoje và cộng sự

.

1.4 Dẫn chất vòng 1H-pyrazol

1.4.1 Giới thiệu chung về dị vòng 1H-pyrazol

Trong những thập kỷ gần đây các nhà nghiên cứu đã quan tâm đến các hoạt tính sinh

học nổi bật của vòng 1H-pyrazol Đặc biệt vòng 1H-pyrazol có trong cấu trúc của các

1H-pyrazol được điều chế đầu tiên vào năm 1937 là hợp chất poly(1H-1H-pyrazol-1-

sử dụng như thuốc hạ sốt, giảm đau và chống viêm [12], [55], chất chủ vậnglucocorticoid [14], thuốc chống sốt rét, kháng khuẩn [7], chống đông máu [65],

ức chế protein kinase [13], [22] và các hoạt động sinh học khác

Pyrazolin và 1H-pyrazol là cấu trúc quan trọng của nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học như đã đề cập ở trên Các dẫn chất pyrazolin và 1H-pyrazol liên quan đã được thử nghiệm in vitro trên các dòng tế bào ác tính ở người cho thấy hiệu quả tốt và có

tiềm năng phát triển thành thuốc đặc biệt là thuốc điều trị ung thư [40], [57]

1.4.2 Các phương pháp tổng hợp dị vòng 1H-pyrazol

Với mục đích tổng hợp chất tương đồng curcumin có khung 1H-pyrazol, thì các

khung này phải có nhóm aldehyd trên vòng Phản ứng Vilsmeier-Haack có thể giúp

tổng hợp các 1H-pyrazol có nhóm carbadehyd.

Phản ứng Vilsmeier-Haack

Từ hydrazon

3-Aryl(alkyl)-1-phenyl-1H-pyrazol-4-carbaldehyd được tổng hợp qua phản ứng

Hình 1.9 Tổng hợp 1H-pyrazol-4-carbaldehyd từ hydrazon.

.

Từ semicarbazon

Hình 1.10 Tổng hợp 1H-pyrazol-4-carbaldehyd từ semicarbazon.

Từ methyl keton và hydrazin

Trong phương pháp này hydrazon được hình thành do phản ứng của methyl keton và

Hình 1.11 Tổng hợp 1H-pyrazol-4-carbaldehyd từ methyl keton và hydrazin.

Dẫn chất benzohydrazid hoặc isoniazid phản ứng với methyl keton, sau đó

Hình 1.12 Tổng hợp 1H-pyrazol-4-carbaldehyd từ benzohydrazid hoặc isoniazid.

.

ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Cấu trúc chất tương đồng curcumin kiểu monocarbonyl (MACs)

Từ tổng quan về curcumin và dị vòng 1H-pyrazol, và các nghiên cứu trước đây Đề

tài định hướng tổng hợp MACs của nghiên cứu thể hiện qua hình 2.1

Hình 2.1 Định hướng cấu trúc của MACs trong nghiên cứu

(A) Khung dị vòng 1H-pyrazol gắn thêm các nhóm thế cồng kềnh.

(B) Khung phenyl gắn các nhóm đẩy electron chứa O và N, hình thành liên kết hydro

2.1.2 Nguyên liệu

Bảng 2.1 Nguyên liệu dùng trong đề tài

14 N,N-Dimethylformamid Merck, Đức ≥ 99,8%

Bộ môn Hóa Hữu cơ, Đại

22

(E)-4-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)but-3-en-2-on(B.4)

Bộ môn Hóa Hữu cơ, Đại

23

(E)-4-(4-hydroxy-3-ethoxyphenyl)but-3-en-2-on(B.5)

Bộ môn Hóa Hữu cơ, Đại

.

(dimethylamino)phenyl)but-3-Bộ môn Hóa Hữu cơ, Đại

 Nguyên liệu dùng trong kiểm nghiệm

- Các dung môi chạy sắc kí: ethyl acetat, hexan, aceton, …

- Bản mỏng tráng sẵn Silica gel 60 F254 của Merck

2.1.3 Dụng cụ và trang thiết bị

2.1.3.1 Trang thiết bị dùng trong tổng hợp

- Bình cầu một cổ, hai cổ, sinh hàn bầu, cốc có mỏ, bình nón, ống đong, phễu thủytinh, cột sắc kí, phễu lọc hút Buchner, nhiệt kế, cá từ, ống nhỏ giọt, đũa thủy tinh, đĩapetri, buồng soi UV, giấy lọc định tính, bình lắng gạn,

dày 0,2 mm Sắc ký cột sử dụng silica gel cỡ hạt 0,040–0,063 mm (Merck), …

- Máy khuấy từ gia nhiệt, nồi cách dầu hay cách thủy; cân điện tử kỹ thuật, cân điện

tử phân tích; máy cô quay chân không, hệ thống lọc áp suất giảm; tủ sấy, tủ sấy chânkhông, tủ hood, tủ lạnh, …

2.1.3.2 Trang thiết bị dùng trong kiểm nghiệm

- Bình khai triển sắc ký, mao quản

- Máy đo điểm chảy GALLENKAMP (Sanyo)

- Máy đo quang phổ hồng ngoại IR: IRAffinity-1S

.

- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker 500 MHz-600 MHz

- Máy khối phổ Bruker Compass DataAnalysis 4.0

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp tổng hợp

Quy trình tổng hợp MACs được tóm tắt như sau:

Tổng hợp các chất trung gian A.1–A.4 theo nghiên cứu PascalRathelot [46]

Hình 2.2 Tóm tắt giai đoạn tổng hợp các chất trung gian A (A.1–A.4)

Tổng hợp trung gian B

cứu tại bộ môn Hóa hữu cơ (từ B.7-B.9) [2]

Hình 2.3 Tóm tắt giai đoạn tổng hợp các chất trung gian B (B.1–B.9)

.

ứng bằng sắc kí lớp mỏng (SKLM).

Kiểm tra phản ứng bằng SKLM:

Hệ dung môi khai triển: n-hexan–EtOAc (3:1)

Vết so sánh: dung dịch 4-methoxyphenylhydrazin trong EtOH hoặc MeOH và

acetophenon trong DCM

Phương pháp phát hiện: soi UV ở bước sóng 254 nm hoặc 365 nm.

Kết thúc phản ứng, làm nguội bình phản ứng về nhiệt độ phòng, sau đó thêm nước

khoảng 700-800 mL nước, lọc lấy chất rắn thu được trung gian TG.1, sấy khô.

Do sản phẩm này kém bền nên sau khi sấy khô thì làm tiếp giai đoạn sau

.

Phản ứng tạo thành sản phẩm TG.2 Sản phẩm TG.2 được tổng hợp như sau:

Hình 2 6 Quy trình tổng hợp TG.2Thêm vào bình cầu 1 cổ phenylhydrazin (3,24 g; 0,03 mol), 4-cloroacetophenon (4,64

Tiến hành khuấy ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ Theo dõi phản ứng bằng SKLM.Kiểm tra phản ứng bằng SKLM:

Hệ dung môi khai triển: n-hexan–EtOAc (3:1)

Vết so sánh: dung dịch phenylhydrazin trong EtOH, DCM hoặc EtOAc và

4-cloroacetophenon trong EtOAc

Phương pháp phát hiện: soi UV ở bước sóng 254 nm.

Kết thúc phản ứng, lọc lấy chất rắn thu được trung gian TG.2, sấy khô.

Do sản phẩm này kém bền nên sau khi sấy khô thì làm tiếp giai đoạn sau

Kiểm tra phản ứng bằng SKLM:

Hệ dung môi khai triển: PE-EtOAc-Aceton (5:1:1)

Vết so sánh: dung dịch dung dịch 4-methoxyphenylhydrazin trong EtOH hoặc MeOH

và 4-methoxyacetophenon trong EtOAc hoặc MeOH

Phương pháp phát hiện: soi UV ở bước sóng 254 nm hoặc 365 nm.

Kết thúc phản ứng, làm nguội bình phản ứng về nhiệt độ phòng, sau đó thêm nước

khoảng 700-800 mL nước, lọc lấy chất rắn màu nâu nhạt thu được trung gian TG.3,

Kiểm tra phản ứng bằng SKLM:

Hệ dung môi khai triển: PE-EtOAc-Aceton (5:1:1)

Vết so sánh: dung dịch dung dịch 4-methoxyphenylhydrazin trong EtOH hoặc MeOH

và 4-floroacetophenon trong EtOAc hoặc DCM

Phương pháp phát hiện: soi UV ở bước sóng 254 nm hoặc 365 nm.

Kết thúc phản ứng, làm nguội bình phản ứng về nhiệt độ phòng, sau đó thêm nước

khoảng 700-800 mL nước, lọc lấy chất rắn màu nâu nhạt thu được trung gian TG.4,

sấy khô

.

Do sản phẩm này kém bền nên sau khi sấy khô thì làm tiếp giai đoạn sau

Cơ chế phản ứng chung cho TG.1, TG.2, TG.3, TG.4.

Hình 2 9 Cơ chế phản ứng chung cho các TG

2.2.1.4 Phản ứng tạo thành sản phẩm A.1 đến A.4 – Phản ứng Vilsmeier-Haack Sản phẩm A.1-A.4 được tổng hợp như sau:

mmol), với điều kiện nhiệt độ như phản ứng

Hình 2 10 Quy trình tổng hợp A.1-A.4 Tiến hành phản ứng

Chuẩn bị tác nhân Vilsmeier-Haack: N,N-dimethylformamid DMF (với DMF ≥

99,8%, có thể sử dụng làm phản ứng) Thêm DMF vào bình cầu 2 cổ và làm lạnh

.

Nguyên liệu (TG) tương ứng được chia thành các lượng nhỏ và thêm dần dần vào

toàn bộ lượng chất phản ứng, chuyển sang bếp cách dầu, lắp sinh hàn, nâng dần nhiệt

độ lên 70–80 oC đối với A.1 và A.2; nhiệt độ 60–70 oC đối với A.3 và A.4 và duy trì trong 1–7 giờ tùy thuộc vào phản ứng (A.1, A.3, A.4 khoảng 1–2 giờ; A.2 khoảng 5–

7 giờ)

Theo dõi phản ứng bằng SKLM

Kiểm tra phản ứng bằng SKLM:

 Vết so sánh: nguyên liệu tương ứng (TG.1; TG.2; TG.3 hoặc TG.4) trong

EtOAc

 Phương pháp phát hiện: soi UV ở bước sóng 365 nm hoặc 254 nm hoặc hiện

màu bằng thuốc thử 2,4-DNPH

Kết thúc phản ứng đối với A.2 làm nguội hệ phản ứng đến nhiệt độ phòng sau đó

ngâm lạnh trong chậu đá Thêm vào khoảng 25–30 mL đá nghiền, vừa thêm vừakhuấy đều cho đến khi đá được tan hết Trung hòa hệ phản ứng bằng các lượng nhỏ

phản ứng trung hòa xảy ra hoàn toàn, sản phẩm thô sẽ tủa Lọc, rửa tủa với nước cấtlạnh

Sản phẩm thô được tinh chế bằng kết tinh lại trong EtOH tuyệt đối

Kết thúc phản ứng đối với A.1; A.3; A.4 làm nguội hệ phản ứng đến nhiệt độ phòng

sau đó đổ hỗn hợp phản ứng sang cốc 1000 mL có chứa đá nhuyễn và tráng bình phảnứng bằng đá nhuyễn, sau khi hỗn hợp được chuyển sang cốc khuấy đều và thêm nước

khoảng 300–400 mL đến khi đá tan hết Lọc, rửa tủa với nhiều nước cất lạnh.

Sản phẩm thô A.2 có thể được tinh chế bằng kết tinh lại trong EtOH.

Sản phẩm thô A.1; A.3; A.4 được tinh chế bằng cách chạy cột sắc kí:

Cơ chế phản ứng chung cho sự tạo thành A.1; A.2; A.3 và A.4.

.

2.2.1.5 Phương pháp tổng hợp các MACs (CUR1.1–CUR4.9) Phản ứng ngưng

tụ aldol Các sản phẩm CUR1.1–CUR4.9 được tổng hợp như sau:

Tiến hành phản ứng

Thêm B (1,05 mmol) vào bình cầu 1 cổ, thêm tiếp 5 mL dung dịch KOH 4% trong

EtOH tuyệt đối, khuấy đều và ngâm lạnh bình cầu trong hỗn hợp đá–muối Thêm

các phản ứng có nguyên liệu là B.3, B.5, B.9) Theo dõi phản ứng bằng SKLM.

.

Kiểm tra phản ứng bằng SKLM:

Hệ dung môi khai triển: n-hexan–EtOAc (3:1), n-hexan–EtOAc (2:1) hoặc n-hexan–

EtOAc–Aceton (5:1:1)

Vết so sánh: dung dịch A trong EtOAc; dung dịch B trong EtOAc.

Phương pháp phát hiện: soi UV ở bước sóng 365 nm hoặc 254 nm

- Kết thúc phản ứng, thêm vào bình cầu 5–10 mL nước đá, khuấy đến khi tan hết.Trung hòa lượng KOH dư bằng HCl đặc đến pH 5–6, sản phẩm thô sẽ tủa Lọc, rửatủa với nước cất đun sôi, sau đó với EtOH tuyệt đối lạnh

Sản phẩm thô được tinh chế bằng kết tinh lại trong EtOH tuyệt đối, aceton hoặc kết

hợp cả hai (CUR 2.7 chạy cột sắc kí).

Cơ chế Aldol:

2.2.2 Phương pháp phân lập và tinh chế sản phẩm

2.2.2.1 Phương pháp kết tinh lại

Để tinh chế các chất rắn, có thể sử dụng phương pháp kết tinh lại Hòa tan các sảnphẩm vào lượng tối thiểu dung môi thích hợp, có thể đun nóng để bảo đảm hòa tanhoàn toàn Sau khi lọc, làm lạnh dung dịch, để yên cho chất hữu cơ kết tinh từ từ Khi

hạ nhiệt độ, độ tan của chất hữu cơ sẽ giảm nên tách ra dưới dạng tinh thể

2.2.2.2 Phương pháp sắc kí cột

Sắc ký cột là phương pháp cuối cùng được sử dụng để phân lập và tinh chế sản phẩm.Phương pháp này được sử dụng khi không thể tinh chế sản phẩm bằng các phươngpháp đơn giản khác như: kết tinh lại, thay đổi dung môi hay thay đổi tính tan Ưuđiểm của phương pháp này là có thể thu được sản phẩm tinh khiết cao nhưng lại có

hạn chế là tốn nhiều dung môi để thực hiện.

.

Bảng 2 2 Các hệ dung môi sắc kí dùng trong đề tài

Kí hiệu Hệ dung môi

2.3.3 Quang phổ hấp thu hồng ngoại (IR)

Máy quang phổ hồng ngoại IRAffinity-1S (Shimadzu), bộ môn Hóa Hữu Cơ–KhoaDược, ĐH Y Dược TP HCM

2.4.2 Thao tác

Vô trùng môi trường, dụng cụ và hóa chất

Tủ an toàn sinh học được chiếu UV trong 30 phút, quạt thổi trong 3 phút trước khitiến hành thao tác Các dụng cụ được gói trong giấy nhôm và hấp tiệt trùng ở nhiệt

sinh học đều phải xịt cồn Các hóa chất, thuốc thử sau khi chuẩn bị trong tủ an toànsinh học, được lọc vô trùng qua màng lọc 0,22 µm hoặc chiếu UV trong 60 phút

Nuôi cấy và xử lý tế bào

Tế bào được nuôi cấy trong môi trường DMEM (tế bào MCF-7) (Gibco, Mỹ), bổ

sung 10% FBS (Gibco, Mỹ), 4 mM L-glutamin, 100 IU/mL penicilin, 100 µM

bào sống với trypan blue (Sigma-Aldrich, Mỹ), chia vào đĩa nuôi cấy 96 giếng với

nồng độ khác nhau trong 72 giờ Mẫu đối chứng âm (xử lý với dung môi pha mẫu)được tiến hành đồng thời Sau 72 giờ, tiến hành thử nghiệm MTT để đánh giá tỉ lệ tếbào sống

Đánh giá tỉ lệ tế bào sống bằng phương pháp MTT

Nguyên tắc:

Tỷ lệ sống của tế bào được xác định nhờ hoạt tính enzym succinat dehydrogenase(SDH) của ty thể chỉ có trong tế bào sống SDH chuyển MTT (3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromid)) thành tinh thể formazan tan trongdung môi hữu cơ như isopropanol tạo dung dịch màu tím được đo mật độ quang ở

540 nm, kết quả phản ánh số lượng tế bào sống trong mẫu nuôi cấy

.