bào, trong nhân và cả tế bào chất qua việc ứng dụng nhiều kháng thể đơn dòng mớicũng như sự cải thiện các chiến lược phân tích đã góp phần hoàn thiện sự hiểu biếtvề quá trình hình thành
TỔNG QUAN Y VĂN
Lịch sử phát triển của kĩ thuật tế bào dòng chảy
Kĩ thuật tế bào dòng chảy (TBDC) có nguồn gốc dựa trên nguyên lý điện trở tế bào – một hệ thống đếm tế bào dựa trên kích thước của Wallace H Coulter được giới thiệu vào năm 1953 Đến năm 1968, Wolfgang Gửhde đó phỏt triển kĩ thuật TBDC dựa trên việc sử dụng các chất phát huỳnh quang với nhiều lợi điểm hơn so với nguyên lý Coulter.
Từ năm 1976, việc chẩn đoán và phân loại bệnh bạch cấu cấp (BCC) hoàn toàn dựa trên hình thái thái học và hóa học tế bào theo tiêu chuẩn phân loại của FAB (French-American-British) [12] Tuy nhiên, với những tiến bộ trong miễn dịch học và việc ứng dụng các kháng thể đơn dòng có khả năng phát hiện các kháng nguyên bề mặt, quá trình biệt hóa – trưởng thành của các dòng tế bào máu cũng như nguồn gốc tế bào của bệnh BCC đã dần được sáng tỏ Đến năm 1986, Foon và Todd đã chính thức công bố trên tạp chí Blood bài báo “Immunologic classification of leukemia and lymphoma” [34] Khoảng 10 năm sau, năm 1995, EAHP (European Association of Pathologists) và SH (Society for Hematopathology) đã phát triển một bảng phân loại mới các bệnh lý huyết học ác tính; trong đó, dấu ấn miễn dịch (DAMD) đã được công nhận là một trong những tiêu chuẩn chẩn đoán bắt buộc và đã góp phần quan trọng vào việc phân loại chính xác các bệnh lý ác tính hệ tạo máu nói chung và bệnh BCC nói riêng [41]. Đến năm 1997, Foon và Jenning tiếp tục giới thiệu một ứng dụng mới và rất quan trọng của kĩ thuật TBDC là việc theo dõi và đánh giá tồn lưu tế bào ác tính Như vậy, qua hơn 30 năm phát triển, kĩ thuật TBDC từ một kĩ thuật mới triển vọng đã dần tự khẳng định vai trò để trở thành một công cụ không thể thiếu trong việc chẩn đoán và theo dõi các bệnh lý huyết học ác tính [45].
Sự cải tiến không ngừng của kĩ thuật TBDC từ một phương pháp phân tích đơn thuần một thông số đến phương pháp có khả năng đánh giá đồng thời cùng lúc lên tới
13 thông số; cùng với sự phát hiện ngày càng nhiều các kháng nguyên trên màng tế bào, trong nhân và cả tế bào chất qua việc ứng dụng nhiều kháng thể đơn dòng mới cũng như sự cải thiện các chiến lược phân tích đã góp phần hoàn thiện sự hiểu biết về quá trình hình thành và phát triển của các DAMD bình thường trên các tế bào tạo máu, làm nền tảng vững chắc không những cho việc chẩn đoán và phân loại dưới nhóm bệnh BCC mà còn giúp chẩn đoán phân biệt các bệnh lý khác như: lymphoma, đa u tủy, tăng sinh bạch cầu mạn tính…Bên cạnh đó, kĩ thuật TBDC đã và đang trở thành một công cụ quan trọng và có tính ứng dụng cao trong việc đánh giá TLTBAT trên các bệnh lý ác tính; góp phần giúp tiên lượng chính xác hơn và sớm hơn khả năng tái phát bệnh [27].
Đại cương về kĩ thuật tế bào dòng chảy
Ngày nay, việc xác định kiểu hình miễn dịch bằng kĩ thuật TBDC giữ vai trò quan trọng trong việc chẩn đoán các bệnh lý huyết học Kĩ thuật TBDC có thể thực hiện trên mẫu máu ngoại biên (khi số lượng tế bào ác tính đủ lớn), mẫu máu tủy hoặc dịch tế bào của các cơ quan bị thâm nhiễm nghi ngờ có chứa tế bào ác tính [68] Về mặt nguyên tắc, các kháng thể đặc trưng cho từng kháng nguyên quan tâm (một protein nhất định, có thể là một dấu ấn nằm trên màng tế bào, nằm trong tế bào chất hoặc trong nhân) được gắn với chất huỳnh quang để tạo ra những phổ màu mà máy flow cytometry có thể nhận diện được; từ đó, cho phép khảo sát được sự biểu hiện và mức độ biểu hiện của các kháng nguyên cần quan tâm ở tế bào bình thường và tế bào ác tính Kĩ thuật này được thực hiện trên nhiều kênh, cho phép khảo sát đồng thời thông số về kích thước tế bào (FSC - forward scatter), thông số về hạt – tính phức tạp của tế bào (SSC - side scatter) và sự biểu hiện của lên đến 10 kháng nguyên bề mặt màng tế bào trong một ống phân tích Bên cạnh đó, việc bổ sung thêm bước làm tăng tính thấm màng tế bào (permeabilization) đã giúp khảo sát thêm các kháng nguyên nằm trong nhân và tế bào chất [40].
Những khái niệm cơ bản về phân tích dấu ấn miễn dịch (DAMD) tế bào:
- Tỉ lệ phần trăm tế bào dương tính với kháng nguyên (mật độ dương tính) là số lượng tế bào có mang kháng nguyên quan tâm so với số tế bào trong quần thể khảo sát.
- Nồng độ kháng nguyên là số lượng kháng nguyên trên từng tế bào, được phản ánh gián tiếp thông qua mật độ huỳnh quang; thường được mô tả định tính với 4 mức độ: âm tính (neg – negative), yếu (dim – diminished), trung bình (inter – intermediate) hoặc mạnh (bright).
- FSC và SSC: Các đặc điểm về FSC và SSC cung cấp những thông tin về đặc tính nội tại của tế bào mà không cần nhuộm với các kháng thể có gắn chất huỳnh quang Thông số FSC tỉ lệ thuận với kích thước tế bào; trong khi đó, SSC phản ánh các cấu trúc bên trong tế bào (ví dụ như hạt) và tính phức tạp trong nội bào [52] FSC và SSC được sử dụng để thiết lập ngưỡng phân biệt mảnh vỡ tế bào, hồng cầu và tiểu cầu với các tế bào có nhân còn sống [68].
- Kiểu hình dấu ấn miễn dịch: Mỗi quần thể tế bào có một kiều hình DAMD nhất định Trong khi dòng tế bào bình thường có kiểu hình DAMD đặc trưng thì các tế bào ác tính thường biểu hiện kiểu hình miễn dịch bất thường (aberrant phenotype);đây chính là đặc điểm cho phép xác định được sự hiện diện cũng như số lượng các tế bào ác tính cùng tồn tại với quần thể tế bào bình thường.
Kĩ thuật tế bào dòng chảy trong chẩn đoán bệnh bạch cầu cấp dòng lympho B và xác định kiểu hình LAIPs
B và xác định kiểu hình LAIPs 1.3.1 Quá trình phát triển dấu ấn miễn dịch của dòng lympho B
Các tế bào tiền thân của dòng lympho B bắt nguồn từ các tế bào gốc tạo máu và biệt hóa trong tủy xương trước khi di chuyển đến các mô lympho ngoại biên dưới dạng các tế bào lympho B trưởng thành Quá trình biệt hóa của dòng lympho B là một chuỗi các giai đoạn liên tiếp, với sự xuất hiện hoặc mất đi dần dần các kháng nguyên liên quan đến dòng theo từng giai đoạn phát triển [56] Sự phát triển và biệt hóa của dòng lympho B (hình 1.1) có thể được chia thành các giai đoạn cơ bản sau, bao gồm: (1) Pro-B; (2) Pre-B; (3) Immature-B; (4) Mature-B và (5) tương bào.
Tế bào thuộc dòng lympho B hầu như luôn hiện diện CD19 và/hoặc CD22 trên màng tế bào [56] Giai đoạn Pro-B có sự hiện diện của các dấu ấn non như CD34,TdT (Terminal deoxynucleotidyl transferase) và CD10 Tế bào càng trưởng thành các dấu ấn này sẽ càng giảm dần, cụ thể từ giai đoạn Pre-B trở đi sẽ không còn thấy CD34 xuất hiện và đa phần không có TdT hoặc biểu hiện rất yếu Trong giai đoạn Pre-B, CD79a được biểu hiện; CD20 bắt đầu xuất hiện với nồng độ còn yếu và tăng dần khi tế bào trưởng thành hơn; ngược lại, CD10 vẫn còn dương tính nhưng có khuynh hướng giảm dần [21] Đến giai đoạn lympho trưởng thành, các tế bào B biểu hiện CD19, CD20, CD79a, smIg (surface membrane) và dương tính rất mạnh với CD20; không biểu hiện CD10 và các dấu ấn non của tế bào đầu dòng [51] Tương bào là một giai đoạn đặc biệt của dòng B: không có CD22 và CD20, có CD19 và CD45 thấp, thường đặc trưng bởi nồng độ CD38 rất cao và dương tính với CD138 [69].
Nói chung, trong quá trình biệt hóa của dòng lympho B, các DAMD xuất hiện sớm và có nồng độ ổn định từ đầu dòng cho đến cuối dòng là cyCD79a (cytoplasmic), cyCD22, smCD22, CD19, HLA-DR (Human leukocyte antigen) Các dấu ấn trưởng thành hơn là CD20, cyIgà, smIgà, Igκ hoặc Igλ Sự thay đổi biểu hiện cỏc DAMD trong quá trình biệt hóa của dòng lympho B theo từng giai đoạn có thể tóm tắt như sau [13] ,[69]:
- Pro-B: CD34 + CD19 + CD10 + TdT + CD38 ++ cyIgà - CD20 -
- Pre-B: CD34 - CD19 + CD10 + CD38 ++ cyIgà + CD20 +/-
- Immature-B: CD34 - CD19 + CD10 dim/- CD38 ++ smIgà dim/- CD20 +
- Mature nạve B: CD10 - CD19 + CD38 +/- smIgà + smIg + CD20 +
- Tương bào: CD10 - CD19 dim CD38 ++ CD138 +/++ CD20 - CD45 dim smIg - cy + /cy +
Hình 1.1 Các giai đoạn phát triển bình thường của dòng lympho B [91]
1.3.2.1 Đặc điểm hình thái học của hematogones
Hematogones là một quần thể tế bào không đồng nhất hiện diện bình thường trong tủy xương, gồm các tế bào tiền thân dòng lympho B ở nhiều giai đoạn biệt hóa khác nhau [65] Về mặt hình thái, HGs có nhiều hình dạng và kích thước khác nhau tương ứng với các giai đoạn phát triển khác nhau của tế bào B (Hình 1.2) Điều này khác với quần thể tế bào ác tính trong bệnh lý BCCDL-B, các tế bào blast thường đồng dạng hơn Tuy nhiên, đặc điểm này rất khó nhận ra hoặc dễ gây nhầm lẫn [23].
Hình 1.2 Đặc điểm hình thái học trên lame tủy của trường hợp A với các tế bào HGs (mũi tên) và trường hợp B với các tế bào ác tính B-lymphoblast [65]
1.3.2.2 Đặc điểm kiểu hình miễn dịch của hematogones
Ngày nay, kĩ thuật TBDC là công cụ hữu ích nhất trong việc nhận diện quần thể tế bào HGs HGs có kiểu hình miễn dịch của các tế bào tiền thân dòng lympho B và có sự thay đổi các DAMD tùy thuộc vào giai đoạn trưởng thành và biệt hóa của tế bào Nhiều nghiên cứu đã dựa vào đặc điểm kiểu hình miễn dịch để phân chia quần thể các tế bào HGs thành 3 giai đoạn (I, II và III) HGs I là giai đoạn chưa trưởng thành nhất trong quá trình phát triển của HGs với sự biểu hiện đồng thời của TdT và CD34, có CD38 + CD19 + CD10 bright CD22 dim và CD20 - Đến giai đoạn II, HGs trở nên âm tính với các dấu ấn non (TdT và CD34) và giảm dần nồng độ CD10; tiếp tục có
CD38 + CD19 + và tăng nhẹ CD22; CD20 bắt đầu xuất hiện và tăng dần mức độ biểu hiện HGs III tiếp tục tăng CD20 và CD22 đồng thời giảm thấp CD10 để cuối cùng trở thành những tế bào lympho B trưởng thành với CD10 - CD20 + CD22 + [6], [23],
[46] Sự biểu hiện của chuỗi nặng à và cỏc chuỗi nhẹ / cũng xuất hiện và thay đổi đặc trưng cho từng giai đoạn phát triển của HGs (hình 1.3).
Hình 1.3 Sự biểu hiện của các DAMD trong quá trình phát triển của HGs [23]
1.3.2.3 Sự phân bố và tăng sinh của hematogones
Hematogones hiện diện với lượng ít trong hầu hết các mẫu tủy xương bình thường (chiếm khoảng 1% tế bào có nhân ở người trưởng thành hoặc khoảng 7,15% tế bào có nhân ở trẻ em) và một lượng rất nhỏ ở các vị trí ngoài tủy (máu ngoại biên,hạch lympho) [23], [56] Trong tủy xương bình thường, mỗi giai đoạn của HGs chiếm một tỉ lệ khác nhau với khoảng 2/3 là giai đoạn II; phần còn lại gồm giai đoạn I và III chiếm tỉ lệ tương đối bằng nhau [51] HGs có khoảng dao động khá lớn theo lứa tuổi, cao nhất ở tủy xương trẻ em và có xu hướng giảm dần đáng kể số lượng theo tuổi [30].
HGs có thể tăng phản ứng trong nhiều loại bệnh lý khác nhau Tỉ lệ cao HGs có thể được quan sát trong các bệnh lý không ác tính như một số các trường hợp viêm nhiễm, suy giảm miễn dịch ở trẻ em Ở người lớn, HGs có thể tăng đi kèm với nhiễm siêu vi hoặc vi khuẩn, viêm nhiễm mạn tính (mà chủ yếu có liên quan đến EBV, CMV và HIV/AIDS); bệnh xuất huyết giảm tiểu cầu miễn dịch; các bệnh lý giảm sinh các dòng tế bào máu Trong các bệnh lý tăng sinh cũng có thể thấy HGs tăng, thường gặp trong nhóm bệnh tăng sinh mạn tính lympho hoặc lymphoma Ngoài ra, ở những bệnh nhân sau hóa trị liệu liều cao hoặc sau ghép tế bào gốc cũng thấy rất nhiều HGs ở tủy do quá trình tái hoạt hóa, kéo dài nhiều tháng hoặc nhiều năm [23], [51], [59].
1.3.3 Đặc điểm dấu ấn miễn dịch của BCCDL-B
Như đã trình bày, quá trình biệt hóa bình thường của dòng lympho B được đặc trưng bởi sự tăng hoặc giảm dần dần các DAMD với sự biểu hiện từ thấp đến cao hoặc ngược lại Điều này tương phản với sự biểu hiện đồng nhất hơn, nồng độ kháng nguyên bất thường (quá mạnh hoặc quá yếu) trong các bệnh lý ác tính dòng lympho
[51] Chính những hiểu biết về kiểu biểu hiện và mức độ biểu hiện của các DAMD trong quá trình phát triển và biệt hóa của dòng lympho B theo từng giai đoạn khác nhau đã cung cấp một khung tham chiếu cho việc nhận diện các kiểu hình miễn dịch bất thường ở các tế bào ác tính trong bệnh BCCDL-B, cũng như hữu ích trong việc đánh giá TLTBAT sau điều trị [56].
Trong hơn 95% các trường hợp BCCDL-B, các tế bào ác tính luôn biểu hiện các kiểu hình miễn dịch bất thường, cho phép phân biệt chúng với các tế bào tiền thân dòng lympho B bình thường [55] BCCDL-B được đặc trưng bởi sự biểu hiện củaCD19, HLA-DR và TdT cùng với một số dấu ấn của dòng B như smCD22 và/hoặc cyCD22, cyCD79a [68]; trong đó, gần như tất cả các trường hợp đều biểu hiện CD19,CD22, cyCD79a [50] Về các dấu ấn non, CD34 + trong khoảng 70% các trường hợp,TdT + trong hơn 90% trường hợp TdT và CD34 thường âm tính ở các giai đoạn sau;nhưng nhìn chung, chỉ có khoảng 4% các trường hợp không biểu hiện cả CD34 vàTdT CD10, trước đây được gọi là cALLa – common ALL antigen, được biểu hiện trong khoảng 80-90% các trường hợp BCCDL-B ở trẻ em và người trưởng thành [50].
CD20, một dấu ấn của tế bào B trưởng thành, có thể biểu hiện yếu hoặc âm tính ở các tế bào ác tính B-lymphoblast [67] Hầu hết các trường hợp thường không xuất hiện các chuỗi nhẹ Ig ở bề mặt tế bào Biểu hiện dấu ấn dòng tủy trên bệnh BCCDL-B có tỉ lệ thay đổi ở các nghiên cứu Một nghiên cứu lớn với các bệnh nhi BCCDL-B ghi nhận khoảng 31,9% các trường hợp có biểu hiện ≥1 dấu ấn dòng tủy, thường gặp nhất là CD11b, CD13, CD33 và CD66c Sự biểu hiện các dấu ấn dòng tủy không có ý nghĩa trong tiên lượng cũng như ảnh hưởng đến điều trị; nhưng nó có giá trị trong đánh giá TLTBAT bằng kĩ thuật TBDC [25], [50].
Có rất nhiều tiêu chuẩn phân loại dưới nhóm đối với bệnh BCCDL-B bằng DAMD Hiện nay, phân loại thường được sử dụng rộng rãi là phân loại BCCDL-B thành 5 dưới nhóm (chủ yếu dựa vào sự xuất hiện hoặc vắng mặt của CD10 và chuỗi nặng à), gồm cú: Pro B-ALL, Common B-ALL, Pre B-ALL, Transitional Pre-B- ALL, Mature B-ALL Trong đó, nhóm bạch cầu cấp dòng lympho B trưởng thành (Mature B-ALL) hiện nay được xếp vào nhóm Burkitt’s lymphoma theo phân loại của Tổ chức y tế thế giới.
Bảng 1.1 Phân loại dưới nhóm theo DAMD của BCCDL-B [57], [86]
Kĩ thuật tế bào dòng chảy trong đánh giá tồn lưu tế bào ác tính
1.4.1 Vai trò của tồn lưu tế bào ác tính trong bạch cầu cấp dòng lympho Đánh giá chính xác tiên lượng có vai trò trung tâm trong chăm sóc và điều trị bệnh lý BCCDL Việc phân nhóm nguy cơ cho phép xác định liệu pháp điều trị khởi đầu phù hợp nhất trên từng bệnh nhân nhằm hạn chế tái phát do điều trị dưới mức cần thiết cũng như giảm tác dụng phụ của các thuốc chống ung thư hoặc cân nhắc thời
Phân loại dưới nhóm Kiểu hình miễn dịch
Pro-B-ALL (B-I) CD10 - cyIgà - smIg - Ig - Ig - Common B-ALL (B-II) CD10 + cyIgà - smIg - Ig - Ig - Pre-B-ALL (B-III) CD10 + cyIgà + smIg - Ig - Ig - Transitional Pre-B-ALL CD10 + cyIgà + smIg + Ig - Ig - Mature B-ALL (B-IV) CD10 +/- cyIgà - smIg + Ig + /Ig + điểm dị ghép tủy xương [88] Gần đây, đánh giá TLTBAT đã trở thành một bước thực hành lâm sàng thường quy trong việc điều trị ở hầu như tất cả các trường hợp BCCDL-B ở trẻ em và nhiều trường hợp ở người lớn TLTBAT là sự tồn tại một lượng rất nhỏ tế bào ác tính ở bệnh nhân đang trong quá trình điều trị hoặc sau điều trị và đã được xác định lui bệnh hoàn toàn (CR – complete remission) với tế bào blast trong tủy xương