Khóa luận tốt nghiệp : Công nghệ cố định enzyme và ứng dụng

Theo phương pháp cố định enzym của các tác giả người Nhật, enzym aminoacylase của nấm sợi đã được gắn vào DEAE-sephadex thông qua liên kết ion và sử dụng chúng cho các quá trình thủy phâ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

Tp Hồ Chí Minh, tháng 6 năm 2011

Chữ ký của giáo viên

Xin cảm ơn tất cả bạn bè, những người đã quan tâm, giúp đỡ tôi hoàn thành đồ án này

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 6/2011

Nguyễn Bảo Dư

MỤC LỤC

TRANG BÌA i

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN ii

LỜI CẢM ƠN iii

MỤC LỤC iv

DANH MỤC HÌNH vi

DANH MỤC BẢNG vi

Chương 1: TỔNG QUAN 1

1.1 Lịch sử phát triển của enzym cố định 1

1.2 Sơ lược về enzym cố định 2

1.2.1 Định nghĩa 2

1.2.2 Đặc điểm của enzym cố định 2

1.2.3 Ưu nhược điểm của enzym cố định 3

1.2.4 Các phương pháp cố định enzym 3

1.2.5 Vật liệu cố định 5

1.2.6 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự cố định enzyme 7

Chương 2: ỨNG DỤNG CỦA ENZYM CỐ ĐỊNH 9

2.1 Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm 9

2.1.1 Enzym β-galactosidase 9

2.1.1.1 Giới thiệu về enzym β-galactosidase 9

2.1.1.2 Nguồn thu nhận enzym β-galactosidase 9

2.1.1.3 Các phương pháp cố định enzym β-galactosidase 10

2.1.1.4 Ứng dụng của enzym β-galactosidase cố định 13

2.1.1.4.1 Thủy phân lactose trong sữa và lactoserum 13

2.1.1.4.2 Tổng hợp Galacto-Oligosaccharides (GOSs) 16

2.1.2 Enzym lipase 17

2.1.2.1 Giới thiệu về enzym lipase 17

2.1.2.2 Nguồn thu nhận enzym lipase 17

2.1.2.3 Các phương pháp cố định enzym lipase 18

2.1.2.4 Ứng dụng enzym lipase cố định trong công nghệ thực phẩm 20

2.1.2.4.1 Ứng dụng lipase cố định tổng hợp các ester có hương trái cây 20

2.1.2.4.2 Ứng dụng enzyme lipase cố định để sản xuất liên tục monoacylglycerol từ olein dầu cọ 21

2.1.3 Enzym α-galactosidase (raffinase) 23

Đồ án môn học

2.1.3.1 Giới thiệu về enzym α-galactosidase 23

2.1.3.2 Nguồn thu nhận enzym α-galactosidase 23

2.1.3.3 Cách phương pháp cố định enzym α-galactosidase 23

2.1.3.4 Ứng dụng của enzym riffinase cố định 26

2.2 Ứng dụng trong phân tích 27

2.2.1 Tổng quan về cảm biến sinh học (biosensor) 27

2.2.1.1 Giới thiệu về cảm biến sinh học 27

2.2.1.2 Lịch sử phát triển cảm biến sinh học 27

2.2.1.3 Phân loại 28

2.2.1.4 Các yếu tố sinh học 29

2.2.1.4.1 Enzym 29

2.2.1.4.2 Kháng thể 29

2.2.1.4.3 Vi sinh vật 30

2.2.1.5 Bộ chuyển đổi (transducer) 30

2.2.1.5.1 Chuyển đổi điện hóa 30

2.2.1.5.2 Chuyển đổi quang 30

2.2.1.5.3 Chuyển đổi nhiệt 30

2.2.1.5.4 Chuyển đổi bằng tinh thể áp điện (piezoelectric) 30

2.2.2 Cảm biến sinh học sử dụng L-glutamate oxidase và L-glutamate dehydrogenase cố định dùng để phân tích monosodium glutamate trong thực phẩm 31

2.2.2.1 Giới thiệu 31

2.2.2.2 Phương pháp thí nghiệm 31

2.2.2.2.1 Các hóa chất sử dụng 31

2.2.2.2.2 Sự cố định enzym 31

2.2.2.2.3 Điện cực 32

2.2.2.2.4 Thử nghiệm 32

2.2.2.2.5 Quá trình phản ứng 33

2.2.2.2.6 Cấu hình nhiệt độ và pH 33

2.2.2.2.7 Xác định giá trị Km và V max 34

2.2.2.2.8 Sự ổn định của màng cố định 35

TÀI LIỆU THAM KHẢO 36

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1: Mô hình biosensor 27

Hình 2.2: Mô hình cảm biến sinh học phân tích MSG dùng L-GLOD–L-GLDH cố định 32

Hình 2.3: Đường hiệu chỉnh vận tốc tiêu thụ Oxy theo nồng độ MSG của cặp L-GLOD–L-GLDH cố định trong cảm biến sinh học 33

Hình 2.4: pH ở nhiệt độ 25 ± 2 ◦C có mặt 2mM NADPH và 10mM ammonium với nồng độ MSG 1.2mg/L 34

Hình 2.5: Nhiệt độ ở pH 7.0 với nồng độ MSG 12mg/dL 34

Hình 2.6: Hoạt tính của enzym cố định trên cảm biến sinh học trong thời gian 60 ngày: L-GLOD 25U–L-GLDH 143.2U; L-L-GLOD 25U–L-GLDH 35U; L-L-GLOD 25U 35

DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Ưu – Nhược điểm của các phương pháp cố định enzyme 4

Bảng 2.1: Tóm tắt các phương pháp cố định enzym β-galactosidase 13

Bảng 2.2: Thủy phân lactose sử dụng các kỹ thuật cố định khác nhau 15

Bảng 2.3: Nguồn VSV thu nhận enzym lipase và tính chất enzyme lipase 18

Chương 1: Tổng quan Đồ án môn học

Chương 1: TỔNG QUAN

1.1 Lịch sử phát triển của enzym cố định [1]

- Năm 1916, Nelson và Griffin quan sát và cho thấy rằng enzym invertase của nấm men (EC.3.2.1.2.6) khi hấp thụ vào than có khả năng thủy phân đường saccharose Sau đó trên thế giới xuất hiện nhiều báo cáo về khả năng cố định enzym bằng liên kết đồng hóa trị trên chất mang Trước năm 1953 chưa có một nghiên cứu nào về enzym không hòa tan được ứng dụng vào thực tế

- Năm 1953, Grubhofer và Schleith đã cố định được một số enzym như carboxy peptidase, diastase, pepsin và ribonuclease trên polyaminostyrene bằng liên kết đồng hóa trị

và các nghiên cứu trên mới bắt đầu thử nghiệm ứng dụng qui mô pilot

- Năm 1954, Chang đã tạo ra được các vi tiểu cầu bán thấm có gắn enzym để chống lại

dị ứng khi đưa enzym vào cơ thể

- Năm 1963, Bernfeld và Wan đã thí nghiệm thành công việc nhốt các enzym như amylase, trypsin, papain, ribonuclease vào gel polyacrylamide

- Năm 1964, Quiociio và Richards đã mô tả phương pháp liên kết chéo cố định carboxy peptidase A với glutaraldehyde Cũng trong năm này Chang đã triển khai phương pháp tạo vi nang để nhốt enzym carbonic anhydrase

- Năm 1969, Wilson đã xây dựng thành công xưởng thực nghiệm để sản xuất glucose bằng glucoamylase cố định

- Năm 1969, Chibata và những người cộng tác ở công ty Tanabe Seiyaku – Nhật đã là những người đầu tiên thực hiện thành công việc áp dụng enzym cố định vào sản xuất công nghiệp Theo phương pháp cố định enzym của các tác giả người Nhật, enzym aminoacylase của nấm sợi đã được gắn vào DEAE-sephadex thông qua liên kết ion và sử dụng chúng cho các quá trình thủy phân

- Năm 1970, Mosbach đã tiến hành cố định ba loại enzym: -galactosidase, hexokinase, glucophosphatase bằng liên kết cộng hóa trị với các hạt sephadex

- Năm 1971, Gregoriadis đã triển khai liposome có chứa amyloglucosidase

- Năm 1973, Chibata và các cộng tác viên cũng là những người đầu tiên thành công trong việc cố định tế bào vi sinh vật để sản xuất L-aspartate từ ammonium fumarate bằng gel

acrylamid Tế bào E.coli chứa trong gel có hoạt tính aspartate rất cao

- Đến năm 1987, bằng công nghệ ứng dụng enzym glucoisomerase cố định, đã tiến hành sản xuất siro fructose từ glucose theo qui mô công nghiệp Cho đến nay có khoảng 4,5 triệu tấn siro fructose được sản xuất theo phương pháp enzym cố định

- Ngoài sản phẩm trên, enzym cố định còn được ứng dụng nhiều trong công nghệ lên men, chống ô nhiễm môi trường và cả trong y học

1.2 Sơ lược về enzym cố định

1.2.1 Định nghĩa [1]

Enzym cố định có thể hiểu theo 2 nghĩa:

- Nghĩa hẹp: enzym không hòa tan là enzym được đưa vào những pha riêng rẽ, pha này

có thể tách riêng với môi trường dung dịch phản ứng Pha enzym không hòa tan trong nước

và được gắn với các polymer ưa nước có trọng lượng phân tử lớn

- Nghĩa rộng: các chất xúc tác cố định là các enzym, tế bào, cơ thể sống ở trạng thái

cho phép sử dụng lại Như vậy, theo nghĩa rộng, enzym không hòa tan bao gồm cả enzym được cố định vào một chất mang, cả enzym có trong tế bào sống, chúng được cố định trong các bình phản ứng sinh học có sự gắn kết vào một chất mang cho phép ta sử dụng nhiều lần

- Enzym không hòa tan hay enzym cố định thường là những enzym hòa tan được gắn vào một chất mang bằng nhiều kỹ thuật khác nhau Nhờ quá trình gắn này mà enzym từ trạng thái hòa tan chuyển sang không hòa tan

1.2.2 Đặc điểm của enzym cố định [1]

Enzym cố định có đặc điểm như sau:

- Hoạt tính của enzym cố định thường nhỏ hơn hoạt tính của enzym tự do cùng loại Sở

dĩ có sự thay đổi hoạt tính riêng của enzym cố định là do những nguyên nhân sau:

 Do ảnh hưởng điện tích của chất mang: khi điện tích của chất mang có sự khác biệt với điện tích của enzym thì khi gắn enzym vào chất mang, cấu trúc không gian của enzym có sự thay đổi ở mức độ nhất định Chính vì sự thay đổi cấu trúc này mà sự kết hợp giữa enzym và cơ chất sẽ kém đi, dẫn đến hoạt tính của chúng cùng giảm

 Do enzym bị nhốt vào mạng lưới hoặc bị liên kết bởi chất mang khiến cho sự tiếp xúc giữa enzym và cơ chất bị kém đi

- Enzym cố định hoàn toàn tuân theo định luật Michaelis – Menten nhưng có một số sai khác nhất định:

 Có thể xảy ra sự cạnh tranh cơ chất với enzym và chất mang

Chương 1: Tổng quan Đồ án môn học

 Xảy ra hiện tượng cản trở khuếch tán của cơ chất và sản phẩm làm giảm tốc độ phản ứng

- Enzym cố định thường có tính bền nhiệt hơn enzym tự do nhờ có tác dụng che chở của chất mang

- Enzym cố định thường có pH tối ưu không trùng với enzym tự do cùng loại

- Enzym cố định do có chất mang che chắn nên được bảo vệ tốt hơn enzym tự do

- Enzym cố định có thể tái sử dụng nhiều lần và dễ dàng tách ra khỏi cơ chất một cách

dễ dàng sau phản ứng và độ bền của enzym cố định cao hơn enzym tự do

1.2.3 Ưu nhược điểm của enzym cố định [1]

Ưu điểm:

- Enzym cố định có thể tái sử dụng nhiều lần trong thời gian dài

- Enzym cố định không lẫn vào trong sản phẩm cuối của phản ứng enzym, do đó nó không gây ảnh hưởng xấu đến chất lượng sản phẩm, hay nói cách khác chúng ta không tốn chi phí cho việc tách enzym ra khỏi sản phẩm

- Có thể ngừng phản ứng khi cần thiết bằng cách tách hệ chất mang – enzym ra khỏi dung dịch cơ chất

- Enzym cố định tương đối bền với các tác nhân vật lý và hóa học hơn enzym tự do

- Dễ dàng tiến hành quá trình sản xuất theo phương pháp liên tục

Nhược điểm:

- Sự có mặt của chất mang có thể làm giảm hoạt tính của enzym

- Trong đa số trường hợp, enzym có thể bị giảm hoạt mất hoạt tính sau quá trình cố định

- Tuy nhiên, những hạn chế trên là không đáng kể so với những lợi ích mà enzym cố định mang lại Do vậy, ngày càng có nhiều nghiên cứu về cố định enzym cũng như ứng dụng enzym cố định vào sản xuất công nghiệp

1.2.4 Các phương pháp cố định enzym [1]

Các phương pháp cố định enzym được chia thành 2 nhóm: hóa học và vật lý

Bảng 1.1: Ưu – Nhược điểm của các phương pháp cố định enzyme [1]

Hoạt tính enzym có thể bị giảm do những biến đổi về cấu trúc của enzym trong quá trình cố định

Thường được dùng phối hợp với các phương pháp khác

Chi phí cao, thao tác thực hiên tương đối phức tạp

Hoạt tính enzym có thể bị giảm do những biến đổi về cấu trúc của enzym trong quá trình cố định

Thao tác thực hiện đơn giản

Điều kiện tiến hành cố định enzym ôn hòa nên không làm mất hoạt tính của enzym trong quá trình cố định

Có khả năng tái sử dụng chất mang

Do lực tương tác giữa enzym

và chất mang yếu nên dễ xảy

ra hiện tượng nhả hấp phụ trong quá trình sử dụng enzym cố định do khuấy trộn hay do thay đổi nhiệt độ, pH của môi trường

Phương pháp nhốt enzym Thao tác đơn giản

Không đòi hỏi phải có các nhóm tạo liên kết nên phù hợp với nhiều loại enzym

Hiệu quả cố định enzym cao

Có thể cố định đồng thời nhiều enzym

Chỉ thích hợp cho phản ứng với cơ chất có khối lượng phân tử nhỏ

Chương 1: Tổng quan Đồ án môn học Phương pháp hóa học:

- Gắn enzym lên chất mang bằng liên kết cộng hóa trị

- Gắn các phân tử enzym lại với nhau bằng liên kết cộng hóa trị

Vật liệu cố định enzym và tế bào có thể chia làm hai loại: vật liệu vô cơ và vật liệu hữu

cơ

Vật liệu vô cơ:

- Đặc điểm: chất mang vô cơ bền với các tác động bên ngoài, không bị vi sinh vật ăn mòn, phân hủy, nhưng việc gắn với enzym thường khó khăn hơn

- Một số chất mang vô cơ thông dụng như: thủy tinh xốp, các oxid kim loại như oxid

nhôm, oxid mangan, oxid magie, silicagel…

Vật liệu hữu cơ:

- Đặc điểm: chất mang hữu cơ thường có các nhóm hoạt động hóa học như: -NH2, COOH, -OH, -SH,… nên dễ kết gắn với enzym nhưng độ bền với tác động của môi trường không cao, đặc biệt các polymer sinh học rất dễ bị vi sinh vật xâm nhập và tấn công

- Các polymer tự nhiên:

- Tinh bột là vật liệu phong phú rẻ tiền Tinh bột dùng để đóng mạch, diethanolamin tinh bột đã được dùng làm chất mang cố định enzym như lipase, glucoisomerase, trypsin, amylase Nhược điểm của tinh bột là độ trương kém, thiếu các nhóm chức năng nên khả năng

cố định và hoạt tính enzym còn thấp Tinh bột thường được ghép copolymer với các vinyl monomer ưa nước như acrylamide, acrylic acid để cải thiện tính chất cơ lý, độ trương nở và tạo các nhóm chức năng trên bề mặt

- Cellulose và dẫn xuất của cellulose là CM-cellulose, DEAE-cellulose, nitrocellulose… là những vật liệu rẻ hơn so với agarose nhưng lại không đồng nhất, thường chỉ sử dụng ở dạng sợi, và dạng tinh thể (microcrystalline) Cellulose là vật liệu được nghiên cứu cố định enzym đầu tiên, các quy trình cố định trên vật liệu này được nghiên cứu khá hoàn chỉnh Cellulose thường được dùng để hấp thụ, liên kết ion, liên kết cộng hóa trị với enzym hoặc nhốt trong gel

- Chitin là hợp chất được Braconnot phân lập từ năm 1811 và Odier đặt tên là chitin từ năm 1823 Chitin là một polymer sinh học có nhiều triển vọng trong nghiên cứu và ứng dụng làm vật liệu cố định enzym và tế bào Chitin là một polymer sinh học rất phổ biến trong tự nhiên, chỉ đứng sau cellulose

- Chitin có cấu trúc tương tự cellulose, là một polymer của các gốc deoxy-β-D-glucoza, liên kết với nhau bởi liên kết β-1,4-glycoside Chitin có trong thành phần cấu trúc vỏ của côn trùng, vỏ tôm cua, sò, vách tế bào sinh vật,…Chitin là một vật liệu có chứa nhóm chức –OH và cho liên kết với enzym, có cấu trúc siêu lỗ, có khả năng hấp thụ tốt,

2-acetoamide-2-dễ tạo màng Chitin có cấu trúc mạng tinh thể chặt chẽ, không chỉ có các liên kết hydro hình thành trong chuỗi mà còn có giữa các lớp với nhau trong mạng tinh thể Chitin là một polymer kỵ nước, độ trương thấp, diện tích bề mặt tiếp xúc nhỏ và bền về mặt hóa học Gần đây có rất nhiều nghiên cứu cố định enzym trên chitin, chủ yếu bằng phương pháp hấp thụ và liên kết công hóa trị qua cầu nối glutaraldehyde Chitin được tìm thấy trong thành tế bào của nấm sợi Nó là chất hữu cơ chiếm lượng lớn để hình thành nên lớp vỏ ngoài của động vật không xương sống (côn trùng, giáp xác…) Về mặt cấu trúc, chitin có cấu trúc tương tự như cellulose, điểm khác biệt hóa học duy nhất là nhóm acetamido ở vị trí số 2 trên khung carbon của chitin được thay thế cho nhóm hydroxyl (-OH) ở cellulose

- Chitosan là dẫn xuất của chitin khi được deacetyl hóa trong kiềm mạnh Chitosan dễ tạo màng, tạo hạt, có cấu trúc siêu lỗ, có nhóm - NH2 Chitosan có thể cố định enzym bằng phương pháp hấp phụ, phương pháp cộng hóa trị, hoặc nhốt enzym trong gel chitosan Chitosan không tan trong nước, tan trong dung môi hữu cơ như acid formic, acid dipic, acid acetic Chitosan là một polymer sinh học có trọng lượng phân tử cao, có các nhóm amin hoạt động, các nhóm hydroxyl có thể tham gia phản ứng hóa học

- Anginate, carrageenan, cả hai vật liệu này tạo gel trong dung dịch CaCl2 dùng để nhốt

tế bào, enzym

- Chất mang protein thường là gelatin, keratin, albumin,… thường có khả năng dễ tạo màng, tạo hạt, nhốt enzym trong khuôn gel với tác nhân đóng mạch là glutaraldehyde; nhược điểm của nhóm này là thường kém bền, dễ bị nhiễm khuẩn

Chương 1: Tổng quan Đồ án môn học

 Các polymer tổng hợp:

- Các polymer tổng hợp được sử dụng làm chất mang cố định enzym như polyacrylamide, polyester, polyvinylalcohol, polyvinylacetate, polyacrylic, polyhydroxyethylacrylate, polystyrene,…

- Ưu điểm chung của các polymer tổng hợp này là bền, tính chất cơ lý tốt, hoàn toàn trơ với sự tấn công của vi khuẩn, độ trương tốt, một số polymer có thể điều chỉnh kích thước siêu

lỗ

- Nhược điểm là một số polymer có giá thành cao, khả năng tương hợp sinh học kém, không thể phân hủy trong môi trường tự nhiên nên gây ô nhiễm môi trường

1.2.6 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự cố định enzyme [1]

Ảnh hưởng của chất mang

- Các tính chất lý học của chất mang như tính hòa tan, tính bền cơ hóa, diện tích, tính háo nước và kỵ nước,…đều có ảnh hưởng nhất định đến lượng enzym được liên kết, đến tính bền và hoạt tính sinh học của các chất dẫn xuất enzym không tan

- Bản chất hóa học của chất mang cũng ảnh hưởng đến khả năng tạo thành dẫn xuất enzym và tới khả năng chất mang hấp phụ không đặc trưng các chất từ môi trường phản ứng

- Sự định vị enzym giúp cho dẫn xuất enzym không tan có tính bền nhiệt cao hơn enzym tan

- Chất mang có tác dụng hạn chế sự biến tính của enzym trong các dung môi, làm đứt nối liên kết hydro và liên kết kỵ nước

Ảnh hưởng của pH

- Khi lực ion thấp thì nồng độ H+ gần chất mang tích điện âm cao hơn, còn gần chất mang tích điện dương cao hơn trong dung dịch Kết quả là pH tối ưu của enzym liên kết đồng hóa trị với chất mang tích điện âm sẽ chuyển dịch sang pH kiềm so với enzym hòa tan, trái lại nếu enzym liên kết đồng hóa trị với chất mang tích điện dương thì pH tối ưu sẽ chuyển dịch sang phía pH acid

- Khi lực ion lớn thì điện tích của chất mang được trung hòa bởi các ion trái dấu và pH tối ưu của enzym cố định gần giống enzym hòa tan

Ảnh hưởng của enzyme

- Theo Poltorak, một trong những nguyên nhân làm giảm hoạt độ của enzym cố định là

sự tương tác protein-protein giữa các phân tử enzym đã được liên kết

- Trong mọi trường hợp đều thấy hoạt độ riêng của chế phẩm bị giảm đi cùng với sự tăng lượng enzym được kết hợp trên một đơn vị diện tích chất mang

Ảnh hưởng của phương pháp cố định

- Khi cố định bằng phương pháp hấp phụ vật lí, các enzym ít bị thay đổi cấu trúc không gian do đó ít ảnh hưởng đến hoạt tính Nhưng do phương pháp này sử dụng các liên kết yếu như liên kết kị nước, liên kết hydro,… nên enzym dễ bị giải hấp phụ

- Khi cố định bằng phương pháp liên kết cộng hóa trị sẽ có độ ổn định cao khi sử dụng dưới các điều kiện như nhiệt độ, pH, có khả năng chống chịu cao đối với sự ảnh hưởng của các dung môi hữu cơ và các tác nhân vật lí khác Tuy nhiên, liên kết cộng hóa trị sẽ làm thay đổi mạnh mẽ cấu trúc không gian của enzym nên hoạt tính của enzym cố định thường bị giảm

Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học

Chương 2: ỨNG DỤNG CỦA ENZYM CỐ ĐỊNH

2.1 Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm

2.1.1 Enzym β-galactosidase

2.1.1.1 Giới thiệu về enzym β-galactosidase [2]

Enzym β-galactosidase (EC.3.2.1.23) là một lactase thủy phân đường lactose thành các monomer là glucose và galactose Việc sử dụng β-galactosidase để thủy phân lactose trong sữa và whey là một trong những ứng dụng tiềm năng trong công nghiệp chế biến thực phẩm và các sản phẩm từ sữa Enzym này có thể được sử dụng dưới dạng hòa tan hoặc dạng

cố định nhưng dạng hòa tan chỉ có thể sử dụng trong qui trình sản xuất gián đoạn, còn dạng

cố định có lợi thế hơn là có thể sử dụng tốt cho cả hai qui trình sản xuất gián đoạn và liên tục

Mặc dù hầu hết các ngành công nghiệp vẫn thủy phân lactose với enzym tự do, nhưng việc sử dụng enzym β-galactosidase cố định là một lĩnh vực đáng quan tâm vì những tiềm năng của nó

2.1.1.2 Nguồn thu nhận enzym β-galactosidase [2]

Enzym β-galactosidase có thể được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như vi sinh vật, thực vật, và động vật Tuy nhiên, tính chất của enzym được thu nhận từ các nguồn khác nhau có sự khác nhau rõ rệt Enzym thu nhận từ nguồn thực vật và động vật có giá trị kinh tế thấp, nhưng thu nhận từ nguồn vi sinh vật lại có nhiều ưu thế như dễ dàng xử lí thu nhận, tốc

độ nhân giống vi sinh vật cao, năng suất thu nhận sản phẩm cao Một số vi sinh vật được xem

là nguồn thu nhận tiềm năng của loại enzym này

Bacteria: Alicyclobacillus acidocaldarius subsp, Rittmannii Arthrobacter sp, Bacillus

acidocaldarius, B circulans, B coagulans, B subtilis, B megaterum, B stearothermophilus, Bacteriodes polypragmatus, Bifidobacterium bifidum, B.infantis, Clostridium acetobutylicum, C.thermosulfurogens, Corynebacterium murisepticum, Enterobacter agglomerans,E cloaceae, Escherichia coli, Klebsiella pneumonia, Lactobacillus acidophilus, L bulgaricus,L helviticus, L kefiranofaciens, L lactis, L sporogenes, L themophilus, L delbrueckii, Leuconostoc citrovorum, Pediococcus acidilacti, P pento, Propioionibacterium shermanii, Pseudomonas fluorescens, Pseudoalteromonas haloplanktis

Streptococcus cremoris, S lactis, S thermophius, Sulfolobus solfatarius, Thermoanaerobacter sp.,Thermus rubus, T aquaticus, Trichoderma reesei, Vibrio cholera, Xanthomonas campestris

Fungi: Alternaria alternate, A palmi, Aspergillus foelidis, A fonsecaeus, A

fonsecaeus, A Carbonarius, A Oryzae, Auerobasidium pullulans, Curvularia inaequalis, Fusarium monilliforme, F oxysporum, Mucor meihei, M pusillus, Neurospora crassa, Penicillum canescens, P chrysogenum, P expansum, Saccharopolyspora rectivergula, Scopulariapsis sp, Streptomyces violaceus

Yeast: Bullera singularis, Candida pseudotropicalis, Saccharomyces anamensis, S

lactis, S fragilis, Kluyveromyces bulgaricus, K fragilis, K lactis, K.marxianus

2.1.1.3 Các phương pháp cố định enzym β-galactosidase [2]

Phương pháp hấp phụ vật lý

Các chất vô cơ như nhôm, silic, thủy tinh xốp, đất sét, bentonite,… chất hữu cơ như cellulose, tinh bột, than hoạt tính, nhựa trao đổi ion,… được sử dụng làm chất mang hấp phụ trong cố định enzym Hơn nữa có thể xử lí thêm với glutaraldehyde để tăng sự ổn định

Enzym β-galactosidase từ K fragilis và K lactis được cố định trên chitosan có hoạt

độ riêng 0.9–2.2 U/mg trọng lượng khô của tế bào Hoạt tính của enzym được cố định từ K

fragilis thì cao hơn nhưng độ ổn định của enzym cố định từ A oryzae thì cao hơn 5-14 lần tùy

thuộc vào phương pháp cố định Khi dùng phương pháp hấp phụ người ta nhận thấy hoạt tính cao nhất thu được khi dùng enzym từ nấm men với chất mang là Ostsorb-DEAE Hơn nữa, sự

cố định tối đa đạt được ở pH 5.5 và kết quả tối ưu thu được khi có mặt dung dịch đệm

citrate/phosphate trong suốt quá trình cố định β-galactosidase từ E coli bằng phương pháp hấp phụ vật lí trên chromosorb-W Một thiết bị phản ứng mới chứa β-galactosidase từ B

circulans được cố định trên màng có gờ làm từ PVC và silica được sử dụng để thủy phân

lactose trong sữa gầy Việc cố định β-galactosidase từ Bullera singularis trên hạt Chitopearl

BCW 3510 (970 GU/g nhựa) bằng phương pháp hấp phụ đơn giản cũng được thực hiện

Các nghiên cứu về động học của enzym β-galactosidase từ Kluyveromces marxianus (Saccharomyces) lactis được cố định trên những chất mang khác nhau như nhôm và silica đã

cho thấy rằng hoạt tính của enzym cố định phụ vào bản chất hóa học tự nhiên và cấu trúc vật

lí của chất mang Khi kích thước lỗ của các hạt chất mang tăng thì hoạt tính của enzym giảm

mạnh Sự cố định β- galactosidase từ Thermus sp diễn ra rất nhanh trên PEI-Sepabeads và

DEAE-Agarose Tuy nhiên, độ mạnh hấp phụ thì cao hơn trong trường hợp của Sepabeads

PEI-Enzym β-galactosidase từ B stearothermophilus chịu nhiệt được cố định trên chitosan

sử dụng Tris (hydroxymethyl) phosphine (THP) và glutaraldehyde dùng để thủy phân đường lactose trong sữa Khả năng chịu nhiệt và hoạt tính của enzym β-galactosidase được cố định

Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học

trên THP thì vượt trội hơn so với enzym tự do và enzym được cố định bằng glutaraldehyde Enzym β-galactosidase được cố định trên THP cho thấy hoạt tính cao hơn enzym tự do khi có mặt ion Ca2+ và ổn định trong suốt thời gian bảo quản ở 4oC trong 6 tuần, trong khi enzym tự

do bị mất 31% hoạt tính trong cùng điều kiện Hai phương pháp quy hoạch thực nghiệm là phương pháp “Response surfacemethodology” (RSM) và “Centre composite design” (CCD)

được dùng để tối ưu sự cố định enzym β-galactosidase từ Pisum sativum trên hai vật liệu

khung mạng: Sephadex G-75 và hạt chitosan Hiệu suất cố định đạt được 75.66% và 75.19% tương ứng với Sephadex G-75 và chitosan

Enzym β-galactosidase từ A oryzae được cố định trên một chất mang rẻ tiền

concanavalin A-cellulose Chế phẩm β-galactosidase được hấp phụ và liên kết chéo bằng Concanavalin A-cellulose, giúp giữ lại 78% hoạt tính ban đầu Nhiệt độ tối ưu của enzym cố định tăng từ 50o

C lên 60oC Enzym cố định bằng phương pháp hấp phụ và liên kết chéo giữ được 93% hoạt tính sau 1 tháng bảo quản trong khi enzym tự nhiên chỉ giữ được 63% hoạt tính

Phương pháp bao gói

Khung mạng sử dụng để cố định thường được làm từ các nguyên liệu như Ca-alginate, agar, k-carragenin, polyacrylamide và collagen Tuy nhiên, một vài khung mạng rắn như than hoạt tính, ceramic,… cũng có thể dùng để cố định Các loại màng dùng để nhốt enzym được

sử dụng phổ biến là nylon, cellulose, polysulfone, và polyacrylmide

Enzym β-galactosidase từ nấm sợi được cố định trong gel polyvinyl alcohol có tính chịu nhiệt cao hơn enzym tự do, giữ được 70% hoạt tính sau 24h ở 50oC Các tế bào K

bulgaricus có chứa enzym β-galactosidase được xử lí với glutaraldehyde được nhốt trong

alginate sử dụng dung dịch BaCl2 Các hạt alginate thu được sau khi xử lí tiếp theo với

polyethyleneimine thì đạt được độ ổn định cao Enzym β-galactosidase của E coli cũng được

cố định trong gel polyacrylamide thông qua việc chuẩn bị các dẫn xuất liên kết chéo của enzym với bisimidoesters

Tế bào K marxianus có chứa lactase hoạt động được nhốt trong gel calcium pectate

(CPG) và trong gel calcium alginate (CAG) được làm cứng bằng polyethyleneimine và glutaraldehyde Các tế bào được cố định trong CPG đã thủy phân hơn 80% lactose trong quá trình liên tục và bán liên tục

So sánh các phương pháp cố định enzym β-galactosidase từ Thermus aquaticus cho

thấy rằng việc cố định bằng liên kết chéo sau đó nhốt enzym trong hạt agarose có thể cho

hiệu suất hoạt động tốt hơn Việc nhốt enzym β-galactosidase từ A oryzae trong gel

polyvinyl alcohol lạnh xốp sẽ tăng cường độ ổn định với nhiệt độ, pH, lực ion hơn so với

enzym tự do Khung dạng sợi được làm từ alginate và gelatin được bổ sung chất làm cứng là glutaraldehyde có thể giữ được 56% hoạt tính của enzym trong 35 ngày mà không có bất kì

sự giảm hoạt tính

Người ta nhận thấy rằng chế phẩm β-galactosidase được liên kết chéo bằng canavalin

A có thể thủy phân lactose vượt trội trong hàng loạt quá trình so với các chế phẩm khác vì chúng vẫn giữ được hoạt tính cao, cụ thể là giữ được 95% hoạt tính sau 7 lần sử dụng, và giữ được 93% hoạt tính sau 2 ngày bảo quản ở 4o

C

Phương pháp liên kết cộng hóa trị

Các phân tử enzym liên kết với chất mang thông qua các nhóm chức năng không nằm trong trung tâm hoạt động của enzym như amino, carboxyl, hydroxyl, và sulfydryl Các nhóm chức năng trên chất mang thường được hoạt hóa bằng cách sử dụng các chất hóa học như cyanogen bromide, carbodimide, và glutaraldehyde

Enzym từ A oryzae được cố định trên bột nylon-6 và zeolite Zeolite thì không lý

tưởng vì lượng liên kết tạo thành ít trong khi đó nylon-6 tạo ra được khung mạng ổn định Các dẫn xuất thu được hoạt hóa bằng diazo hoặc bằng carbodiimide cho thấy hoạt tính cao nhất trong suốt quá trình cố định enzym trên thủy tinh xốp có phủ lớp glycophase

Enzym β-galactosidase từ E coli được cố định trên gelatin sử dụng chất hoạt hóa là

chromium (III) acetate và glutaraldehyde vẫn giữ được tương ứng 25% và 22% hoạt tính Enzym được cố định trên silica-alumina ổn định hơn enzym tự do ở pH acid

Các dẫn xuất β-galactosidase cố định cho thấy nhiều sự cải thiện nhưng hoạt tính khác nhau sau khi được tạo điều kiện cho liên kết cộng hóa trị đa điểm bằng cách ủ trong dung dịch kiềm một thời gian dài, enzym được cố định trên Sepabeads-epoxy-boronic được xem là

ổn định nhất Dẫn xuất tốt nhất rất hoạt động trong việc thủy phân lactose thậm chí ở 70o

C Gần đây sự liên kết ngang của β-galactosidase trên các hạt từ tính có nguồn gốc khác nhau được thực hiện với sự có mặt của glutaraldehyde Kết quả là hoạt tính của enzym cố định được tăng lên

Khi cố định β-galactosidase chịu nhiệt trên Sepabeads để thủy phân lactose người ta nhận thấy sự ức chế enzym do sản phẩm tạo ra giảm, điều này hữu dụng trong việc cải thiện hiệu suất hoạt động của enzym trong công nghiệp

Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học

Bảng 2.1: Tóm tắt các phương pháp cố định enzym β-galactosidase

Phương pháp cố định Nguồn β-galactosidase Tác nhân cố định

Polyvinyl chloride, Silica gel Chitosan

Porous ceramic monolith Chitosan beads

K lactis

Alginate using BaCl3 Polyacrylamide gel Nylon-6 and zeolite Agarose bead Calcium alginate Poly(vinylalcohol) hydrogel

2.1.1.4 Ứng dụng của enzym β-galactosidase cố định

2.1.1.4.1 Thủy phân lactose trong sữa và lactoserum [2]

Sữa được thủy phân lactose được sử dụng cho việc chế biến hương liệu sữa, phô mai, và sữa chua Sự thủy phân lactose trong sữa và dùng sữa chế biến thực phẩm cũng ngăn ngừa sự kết tinh lactose khi đông lạnh sữa và sản phẩm sữa cô đặc Hơn nữa việc sử dụng sữa

đã thủy phân trong sản xuất sữa chua và pho mát sẽ làm tăng quá trình acid hóa, bởi vì thủy phân lactose thường là bước làm chậm tốc độ của quá trình, làm giảm thời gian đông đặc của sữa chua và tăng tốc độ phát triển cấu trúc và hương vị cho phó mat Chất lượng của sữa đông lạnh và kem làm từ sữa cũng được cải thiện đáng kể khi thêm enzym lactase Nó chống

lại sự kết tinh đường lactose bằng cách thủy phân thành glucose và galactose và làm giảm cấu trúc cát sạn

Thủy phân lactose trong whey là một ứng dụng quan trọng khác của β-galactosidase trong ngành công nghiệp chế biến sữa Whey thủy phân và cô đặc hay whey thu được qua lọc màng có thể được sử dụng như chất tạo ngọt trong sản xuất siro rau quả đóng hợp và nước giải khát

β-galactosidase từ nấm (Miles Chemie) được cố định trong gel polyvinyl alcohol

được nhận thấy là bền nhiệt hơn so với enzym tự do, giữ được 70% hoạt tính sau 24h ở 50o

C

và 5% hoạt tính ở 60 oC Thủy phân được 75% lactose trong 5-6h và mức độ chuyển đổi giảm 50% sau 30 lần sử dụng Các nghiên cứu về thủy phân lactose sử dụng enzym cố định β-galactosidase (Aspergillus niger) trên nhựa phenol formaldehyde cho thấy nhiệt độ tối ưu phụ thuộc vào thời gian thực hiện quá trình nhưng không phụ thuộc vào nồng độ và sự chuyển đổi

lactose Enzym β-galactosidase từ A niger thủy phân được 70% lactose trong sữa gầy ở 40oC

trong 10 phút Enzym β-galactosidase có nguồn gốc từ nấm cố định trên hydrogel được dùng

để thủy phân whey, sau 7h thủy phân được 70-75% whey Sự cố định enzym β-galactosidase

từ A niger trên silica gel đã được kích hoạt, kết quả là hầu hết các chế phẩm enzym cố định

sử dụng silica gel được kích hoạt bằng TiCl3 và FeCl3 sẽ thủy phân được 81% đến 84% trong dung dịch chứa 4% lactose

Enzym β-galactosidase từ K lactis được cố định trên CPC-silica (đã được silan hóa

và kích hoạt với glutaraldehyde) và agarose (được kích hoạt bằng tác nhân cyanua) chuyển

đổi được 90% lactose trong thiết bị phản ứng “packed bed minireactor” β-galactosidase được nhốt trong gel đồng polymer hóa N-isopropylacrylamide và acrylamide có hiệu quả trong quá

trình thủy phân lactose ở 5oC cho quá trình sản xuất sửa nghèo lactose Mô hình động học sử

dụng cho enzym β-galactosidase từ K lactis cũng được khảo sát Enzym cố định có thể hoạt

động ở nhiệt độ thấp và áp dụng được cho sản xuất các sản phẩm sữa đông lạnh, ngăn chặn

sự kết tinh của lactose, tăng khả năng tiêu hóa và tạo hương vi cho sản phẩm sữa Enzym galactosidase từ K lactis cố định trên vải cotton sử dụng glutaraldehyde làm tác nhân liên kết

β-chéo được dùng để thủy phân lactose trong sữa nguyên kem và chuyển đổi được 95% lactose trong 2h trong thiết bị phản ứng gián đoạn, và khi được cố định bằng liên kết cộng hóa trị với polysiloxane-polyvinyl alcohol, sử dụng glutaraldehyde như là tác nhân liên kết chéo cho thấy độ hoạt động cao hơn và độ ổn định nhiệt cao hơn so với enzym hòa tan Vì thế enzym

này được sử dụng có hiệu quả trong thủy phân lactose từ sữa β-galactosidases từ K lactis

cũng được cố định trên viên nang LentiKats polyvinylalcohol hydrogel dạng thấu kính được

Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học

dụng để sản xuất D-galactose từ lactose (200 g L−1) trong một quá trình gián đoạn vừa đường hóa vừa lên men đồng thời

β-galactosidase từ A oryzae cố định trên chất mang concanavalin A-cellulose được

sử dụng để thủy phân liên tục lactose từ whey và sữa Người ta nhận thấy rằng pH tối ưu của enzym hòa tan và enzym cố định là 4.8 nhưng nhiệt độ tối ưu tăng từ 50oC lên 60oC đối với enzym cố định Enzym cố định có sự ổn định nhiệt cao hơn ở 60oC Gần đây thiết bị phản ứng packed bed cùng với tế bào có tính thấm được nhốt trong alginate được sử dụng để thủy

phân lactose trong sữa trong hệ thống liên tục, đạt hiệu suất 87.2% β- galactosidase từ A

oryzae được cố định bằng 3 kĩ thuật khác nhau: hấp phụ trên celite, liên kết cộng hóa trị với

chitosan, hoặc kết hợp lại với nhau bằng liên kết chéo Các chế phẩm enzym cũng được so sánh với nhau về hiệu suất cố định, đặc tính của enzym, độ ổn định, và hiệu quả tổng hợp oligosaccharide Các enzym β-galactosidase được kết hợp lại với nhau bằng liên kết chéo được cho là có hiệu quả trong việc thủy phân lactose, đạt hiệu suất 78% trong 12h β-

galactosidase từ A oryzae được cố định trên silica, hoạt tính cũng như độ ổn định của enzym

đã được thẩm định, và kết quả cố định tốt nhất thu được bằng cách sử dụng glutaraldehyde như chất hỗ trợ hoạt hóa và ổn định cho enzym Trong các phương pháp xử lí whey khác nhau (vi lọc, siêu lọc, xử lí nhiệt), siêu lọc được xem là phương pháp tốt nhất đối với dung dịch cơ chất để cho vào thiết bị phản ứng

Bảng 2.2: Thủy phân lactose sử dụng các kỹ thuật cố định khác nhau

Cotton fabric Hydrogels Calcium alginate Concanavalin A layered calcium alginate-starch hybrid

5 h

2 h

7 h 2.5 h

3 h

2 h