Đề tài : ảnh hưởng của chế độ ăn (giàu lipid) và nước cam ép lên sự hấp thụ của cyclosporin A trên người việt nam tình nguyện khoẻ mạnh

8- Về những đóng góp mới của để tài Trên cơ sở so sánh với những thông tin đã được công bố trên các ấn phẩm trong và ngoài nước đến thời điểm kết thúc để tài, để tài có những điểm mới s

BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ

ANH HUGNG CHE DO AN (GIAU LIPID) VA

THỨC UỐNG (NƯỚC CAM ÉP) LÊN SỰ HẤP

THU CYCLOSPORIN A TRÊN NGƯỜI VIỆT

NAM TÌNH NGUYỆN KHOẺ MẠNH

Chủ nhiệm đề tài : PGS.TS Lê Minh Trí

BAO CAO KET QUA NGHIEN CUU DE TAI CAP BO

ANH HUONG CHE DO AN (GIAU LIPID) VA THUC UONG (NUGC CAM EP) LEN SU HAP

THU CYCLOSPORIN A TREN NGUGI VIET

NAM TINH NGUYEN KHOE MANH

Chủ nhiệm để tài : PGS.TS Lê Minh Trí

TS Phan Thị Danh

Cơ quan chủ trì : Đại Học Y Dược TP HCM

Cấp quản lý : Bộ Y Tế

Thời gian thực hiện để tài : 10/2003-04/2007

Tổng kinh phí thực hiện đề tài : 74.000.000 đồng

Trong đó kinh phí SNKH : 74.000.000 đồng

Nguồn khác :

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

2008

BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ

3 Cơ quan chủ trì : Đại Học Y Dược Tp HCM

4- Cơ quan quản lý đề tài : Bộ Y Tế

5

6

Thư ký đề tài : TS Lê Ngọc Hùng

Phó chủ nhiệm đề tài hoặc ban chủ nhiệm để tài

7- Danh sách những người thực hiện chính

- PGS.TS Lê Minh Trí

- TS Phan Thi Danh

- TS Lé Ngoc Hing

8- Các để tài nhánh

9- Thời gian thực hiện :

- _ Để tài được ký duyệt ngày 26/09/2002

- _ Bắt đầu thực hiện : 10/2003

- Kết thúc : 04/2007

MỤC LỤC

PHẦN A : Báo cáo tóm tất kết quả nổi bật của đề tài

PHAN B : Báo cáo kết quả chỉ tiết

2.1.1.8- Các phương pháp định lượng CSA

2.2- Tình hình nghiên cứu trong nước

3- ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1- Nguyên vật liệu-máy móc-người tình nguyện nghiên cứu

3.1.1- Nguyên vật liệu, máy móc

3.1.2- Người tham gia thử nghiệm

3.1.3- Xử lí mẫu chuẩn bị định lượng

3.1.4- Thẩm định lại máy định lượng TDX

4.1.2- Độ đúng (độ phục hồi của phương pháp)

4.1.3- Độ nhạy (giới hạn phát hiện)

4.2- Các thông số sinh hoá của người tình nguyện

4.3- Kết quả đo nồng độ CSA trong máu 10 người tình nguyện

4.3.1- Kết quả đo nỗng độ CSA trong máu lần 1

4.3.2- Kết quả thử nghiệm lần 2 (với nước cam ép)

4.3.3- Kết quả thử nghiệm lần 3 (với chế độ ăn giàu lipid)

4.4- Xử lí thống kê

4.4.1- So sánh lần bình thường và lần uống thuốc có uống nước cam

4.4.2- So sánh lần bình thường và lần uống thuốc với chế độ ăn giàu

CAC CHU VIET TAT TRONG DE TAI

Area Under Curve (diện tích dưới đường cong)

Cyclosporin A

Cytochrom P 450

Automatic Fluorescence Polarisation Immuno-Analyser

(Máy phân tích tự động miễn dịch phân cực huỳnh quang)

High Density Lipoprotein (Lipoprotein ti trong cao)

High Perfomance Liquid Chromatography (SAc ky Iéng hiéu nang

cao)

Low density Lipoprotein (Lipoprotein ti trong thap)

(The National Committee for Clinical Laboratory Standards)

(Tiêu chuẩn quốc gia của phòng thí nghiệm lâm sàng Hoa Kỳ)

Radio Immuno-Assay (Định lượng bằng phương pháp miễn dịch

phóng xạ)

Ultra-Violet (Tử ngoại - Khả kiến)

Very Low Density Lipoprotein (Lipoprotein tỉ trọng rất thấp)

DANH MUC CAC BANG VA BIEU DO

Bảng 4.4 Các chỉ số sinh hoá của 10 người tình nguyện

Bảng 4.5 Nông độ CSA trong máu 10 người tình nguyện (lần 1)

Bang 4.6 AUC2.;2 VA Cymax (C¿) của 10 người tình nguyện lần 1

Bang 4.7 Néng độ CSA trong máu 10 người tình nguyện (lần 2)

Bảng 4.8 AUC;.¡; của 10 người tình nguyện (lân 2)

Bảng 4.9 Nông độ CSA trong máu 10 người nh nguyện (lần 3)

Bang 4.10 AUC; ;; của 10 người tình nguyện (lần 3)

Cơ quan chủ trì : Đại Học Y Dược Tp HCM

Thời gian thực hiện :

- _ Để tài được ký duyệt ngày 26/09/2002

- _ Bất đầu thực hiện : 10/2003

- _ Kết thúc : 04/2007

Tổng kinh phí thực hiện dé tài : 74.000.000 đ (bảy mươi tư triệu đông)

Trong đó kinh phí từ ngân sách nhà nước : 74.000.000 đ

Tình hình thực hiện đề tài so với đề cương :

7.1- Mức độ hoàn thành khối lượng công việc :

Đã hoàn thành tất cả mục tiêu để cương đặt ra (100%)

7.2- Các yêu cầu khoa học và chỉ tiêu cơ bản của các sản phẩm KHCN

Thẩm định lại phương pháp định lượng nông độ CSA trong máu bằng phương pháp

miễn dịch huỳnh quang

Đã khảo sát tất cả các điều kiện định lượng CSA trong máu người toàn phần bằng

máy TDX của công ty Abbott Máy đáp ứng các điều kiện định lượng như độ chính xác, độ đúng, độ lặp lại và giới hạn phát hiện CSA trong máu

Định lượng nông độ CSA trong máu của người tình nguyện Việt Nam

Đã định lượng nêng độ CSA trong máu của 10 người tình nguyện Việt Nam (6 nam

và 4 nữ) Kết quả là C „ = 1204,3 + 317,520 ng/mIl, AUC,, „ = 3928,926 + 1237,278 (00 ng/h.ml, AUC, „ = 4072,123 + 1237,278 ng/h.m], t„.„ max = 2,00 + 0,00 gid va t,) =

1,23 + 0,53 giờ

Khảo sát ảnh hưởng của chế độ ăn (giàu lipid) và thức uống (nước cam) lên sự hấp

thu CSA Ở người tình nguyện Việt Nam

Đã định lượng nồng độ CSA trong máu 10 người tình nguyện bình thường tham gia

thử nghiệm và có các kết quả như sau :

Với lần có uống thêm nước cam ép : C,,,, = 1189,1 + 294,237 ng/ml, AUC, =

max 3846.435 + 1101,469 ng/h.ml, AUC, „ = 3954,379 + 1101,469 ng/h.ml, t_,, = 2,00 +

0,00 giờ và t„ = 1,10 + 0,48 giờ

Với lần thử nghiệm 3, ăn chế độ ăn giàu Hpid : C„ = 943,44 + 231,617 ng/ml, AUC oy = 3424,714 + 805,440 ng/h.ml, AUC,, „ = 3520,575 + 805,440 ng/h.ml, t„.„

= 2,00 + 0,00 giờ và t,„ = 1,09 + 0,48 giờ

Các kết quả xử lí thống kê cho thấy :

- Nước cam ép có ảnh hưởng đến néng độ CSA trong máu người uống thuốc

(làm gidm ca AUC va C,,,x) với p = 0,05 Do vậy, nên khuyên bệnh nhân

không nên dùng nước cam trước và sau khi uống thuốc trong khoảng 3 giờ

- Chế độ ăn giàu Hpid có ảnh hưởng đến sự hấp thu của CSA trong máu Qua kết quả thử nghiệm cho thấy các thông số dược động học như C„„„, AUC, giá

trị Ty déu c6 gidm Theo thi nghiém nay, dé chdc chắn thuốc không bị ảnh

hưởng hấp thu trên bệnh nhân thì cũng không nên ăn chế độ ăn giàu lipid

trước và sau uống thuốc khoảng 3 giờ

- _ Theo đối nông độ tại thời điểm C¿ của 3 lần thử nghiệm cũng cho thấy nước

cam ép và chế độ ăn giàu lipd có ảnh hưởng đến nổng độ của CSA trong máu người uống Neoral® với p = 0,05 Nồng độ C; trên người ghép thận được dùng

để chỉnh liều chống thải ghép và giảm bớt độc tính trên thận của CSA Như

vậy, lời khuyên bệnh nhân tránh dùng nước am ép và ăn chế độ ăn giàu lipid

trong khoảng 3 giờ trước và sau khi uống thuốc là có cơ sở

7.3- Tiến độ thực hiện

Để tài được duyệt ngày 26/09/2002 và hoàn thành vào tháng 04/2007

Đề tài thực hiện và hoàn thành trễ hạn vì các lý do sau đây :

- _ Khó kiếm đủ 10 người tình nguyện tham gia thử nghiệm Trong lúc thực hiện

thử nghiệm có 1 số người tình nguyện có phần ứng với CSA nên phải ngưng

và thực hiện lại từ đầu

- Thuốc thử bị tăng giá do hết thời gian tài trợ của Cty Abbott đành cho người ghép thận ở Việt Nam Tuy vậy, để tài đã khắc phục kinh phí và cố gắng thực hiện theo đúng mục tiêu ban đâu

8- Về những đóng góp mới của để tài

Trên cơ sở so sánh với những thông tin đã được công bố trên các ấn phẩm trong và

ngoài nước đến thời điểm kết thúc để tài, để tài có những điểm mới sau đây :

8.1- Về giải pháp khoa học công nghệ : trước nay ở Việt Nam chỉ định lượng CSA trên người ghép thận thường thực hiện bằng phương pháp HPLC phức tạp và kém chính xác Phương pháp FPIA lần đầu được thực hiện ở Việt Nam Nghiên cứu nàu

áp dụng phương pháp này để định lượng và theo dõi nỗng độ CSA trong máu

Tóm tắt báo cáo

Mục đích nghiên cứu

Hiện nay ở Việt Nam đã ghép thận thành công cho hàng trăm trường hợp Tất cả bệnh nhân ghép thận đều phải dùng thuốc chống thải ghép cyclosporin A (CSA) Sự hấp thu của CSA còn bị ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác như thức ăn và đồ uống Chưa có nghiên cứu nào ở Việt Nam về vấn để này Do vậy, nghiên cứu “Ảnh hưởng của chế độ ăn (giàu lipid) và thuốc uống (nước ép hoa quả) lên sự hấp thu của CSA trên người Việt Nam tình nguyện khoẻ mạnh” là cần thiết

Phương pháp nghiên cứu và đối tượng nghiên cứu

10 người Việt Nam tình nguyện khoẻ mạnh (6 nam và 4 nữ) tuổi 23-33 đảm bảo đủ

điểu kiện tham gia thử nghiệm Người tham gia nghiên cứu được cho uống thuốc và

có 3 lẫn lấy máu cách nhau mỗi lần 60 ngày Máu được lấy vào các thời điểm 0, 2,

4,6, 8, 10, 12 giờ sau khi uống thuốc và định lượng nềng độ cyclosporin A trên máy TDx Xử li kết quả bing Excel 97 va phan mém Phasolpro BE (tinh tofn AUC, Cmax,

Tinax)-

Kết quả nghiên cứu

Kết quả định lượng lần ! (chế độ ăn uống bình thường) : AUC,„=3928,926+

Kết quả định lượng lần 3 (chế độ ăn giàu lipid) : C_,,,=943,44+231,617 ng/ml,

AUC,, „=3424,714+805,44 ng/h.ml, AUC,„ „=3529,575+805,44 ng/h.ml,

t„„„=2,00+0,00 giờ, t,„=1,09+0,48 giờ

Kết luận rút ra từ nghiên cứu

- _ Nước cam ép có ảnh hưởng đến nổng độ CSA trong máu (giảm AUC và C„ạ¿,

p=0.05) Do vậy, nên khuyên bệnh nhân không dùng nước cam trước và sau

khi uống thuốc trong khoảng 3 giờ

- _ Chế độ ăn giàu lipid có ảnh hưởng đến sự hấp thu của CSA trong máu (giảm

Cam AÚC, giá trị T¿) Bệnh nhân không nên ăn chế độ ăn giàu lipid trước

và sau uống thuốc khoảng 3 giờ

- Nồng độ CSA C¿ của thử nghiệm cũng cho thấy nước cam ép và chế độ ăn giàu lipd có ảnh hưởng đến hấp thu (p = 0,05) Cạ thường được dùng để chỉnh

Hểu chống thải ghép và giảm bớt độc tính của CSA Do vậy, tránh dùng nước

cam ép và ăn chế độ ăn giàu Hpid trong khoảng 3 giờ trước và sau khi uống

thuốc là có cơ sở và cần thiết

PHAN B

1- ĐẶT VẤN ĐỀ

1.1- Tóm lược các nghiên cứu trong và ngoài nước

Cùng với sự tiến bộ của y học thế giới, hiện nay ở Việt Nam cũng có nhiều thành tựu

y khoa đáng kể trong việc ghép và thay thế các cơ quan nội tạng nhất là ghép thận

Bệnh viện Chợ Rẩy đã ghép thành công cho hàng chục trường hợp Hàng chục ca ở

phía Bắc cũng đã được các thầy thuốc thực hiện Tổng số bệnh nhân được ghép thận hiện nay ở nước ta khoảng hơn 400 người, đa phần là ghép ở Singapor và Trung Quốc

Tất cả bệnh nhân ghép thận đều phải dùng thuốc chống thải ghép cyclosporin A (Neoral®, Sandimmum®) Ché phẩm này được dùng phối hợp với glucocorticoid để chống thải ghép do tính ức chế miễn dịch của thuốc Một trong những điểu bất lợi khi sử dụng cyclosoprin A (CSA) là bệnh nhân phải dùng suốt đời và phải định

lượng nồng độ trong máu thường qui suốt cuộc sống sau khi ghép thận Nồng độ của

thuốc trong máu mỗi bệnh nhân phải là một hằng số thích hợp với từng người để chống thải ghép, nếu nông độ thấp sẽ có nguy cơ thải ghép cao, nếu quá cao sẽ bị

ngộ độc thuốc vì cyclosporin A có nhiều tác dụng phụ và độc tính trên cả gan và

thận cũng như các cơ quan khác [4], [5], [7]

1.2- Giả thiết nghiên cứu

Trong thời gian qua, các thầy thuốc Việt Nam cũng đã xử dụng cyclosporin A để

điều trị hỗ trợ chống thải ghép cho tất cả các bệnh nhân Việt Nam ghép thận (kể cả ghép ở nước ngoài) Liễu đùng, các thông số được động học của thuốc đều căn cứ trên khuyến cáo của nhà sản xuất và các số liệu trên bệnh nhân nước ngoài (đa số là

Au, Mỹ) Chưa có nghiên cứu nào về dược động học cũng như liễu thích hợp cho thể

trạng của bệnh nhân Việt Nam được nghiên cứu Ngoài ra, sự hấp thu của CSA còn

bị ảnh hưởng của nhiễu yếu tố khác như thức ăn và đồ uống Các công trình nghiên

cứu trên thế giới chứng minh CSA tăng hấp thu khi bệnh nhân ăn thức ăn giàu lipid

va AUC cũng gia tăng đáng kể khi bệnh nhân uống nước bưởi

1.3- Mực tiêu nghiên cứu

Để tài “Ánh hưởng của chế độ ăn (giàu lipiđ) và thuốc uống (nước ép hoa quả) lên

sự hấp thu của CSA trên người Việt Nam tình nguyện khoẻ mạnh” được thực hiện

nhằm các mục tiêu sau :

- Thâm định phương pháp định lượng nồng độ CSA trong máu bằng phương

pháp miễn dịch huỳnh quang trên máy TDX Abbott

- _ Định lượng nồng độ CSA trong máu của người tình nguyện Việt Nam

- _ Khảo sát ảnh hưởng của chế độ ăn (giàu Hpid) và thức uống (nước cam) lên sự hấp thu CSA ở người tình nguyện Việt Nam

2- TONG QUAN

2.1- TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU NGOÀI NƯỚC

2.1.1- Tổng quan về cyclosporin A

2.1.1.1- Nguồn gốc-Cấu trúc-Tính chất

CSA có cấu trúc polypeptid vòng gồm 11 acid amin được phân lập từ 2 loại nấm là

Tolypocladium inflatum Gams va Cylindrocarpon lucidum Borth

Hình 2.1 Công thức phân tử của cyclosporin A

Tên khoa hoc : cyclo {{(E)-(2S,3R,4R)-3-hydroxy-4-methyl-2methylamino)oc-6- enoy]]-L-2-aminobutyryl-N-methylglycin-N-methyl-L-leucin-N-valyl-N-methyl-L- leucin-L-alanin-D-alanyl-N-methy]-L-leucin-N-methyl-L-valin}

(C=61,95%, H=9,24%, N12,82%, O=15,99%)

CSA rất sơ nước, phân tử chỉ có amino acid số 1 có 9 carbon (Wenger 1986) Tất cả

các N amid hoặc Hên kết với H hoặc methyl hoá Sinh khả dụng của CSA rất nhạy

khi cấu trúc có sự biến đổi không gian và thay đổi các nhóm khác tai vị trí 1, 2, 3, 10

và 11 CSA có một D-acid amin tại vị trí 8 và nhóm methyl amid giữa vị trí 9-10 có cấu hình c¿s, tất cả các nhóm methyl amid còn lại có cấu hình dạng /rans [16]

CSA ở đạng bột, tỉnh thể trắng, tái kết tình trong aceton ở -15 °C được tỉnh thể hình

kim trắng, chảy ở 148-151 °C, năng suất quay cực -240 độ [29]

CSA it tan trong nước, độ tan 14 0,04 mg/ml 6 25 °C, kém tan trong hydrocarbon no

Tan trong dầu và các dung môi hữu cơ (methanol, ethanol, aceton, ether, cloroform),

tan hon 80 mg/ml trong alcol 6 25 °C [14]

2.1.1.2- Dược lực học

CSA có tác dụng ức chế miễn dịch mạnh J.F Borel và cộng sự đã ngẫu nhiên phát

hiện tính chất này năm 1976 trong khi nghiên cứu các chế phẩm kháng nấm [17],

[18]

CSA không ảnh hưởng đến khả năng dé kháng viêm nhiễm mà chủ yếu tác dụng

vào khả năng miễn dịch của tế bào [20] Thử nghiệm trên súc vật, CSA kéo dài thời gian sống của các cơ quan dị ghép (da, tim, thận, tuy tạng, tuỷ xương )

Ngày nay, việc ghép cơ quan đặc và tuỷ xương đã được thực hiện thành công trên

người bằng cách đùng CSA (Sandimmum®, Neoral®, Sang 35”) để ngừa và chống thải ghép CSA đã cải thiện đáng kể sự tổn tại của mảnh ghép so với các thuốc ức chế miễn dịch khác thường dùng như corticosteroid và azathioprin [12]

CSA cũng được sử dựng trong nhiễu bệnh lý tự miễn khác : vảy nến, tiểu đướng týp

1, thấp khớp, viêm khớp, Lupus đồ toàn thân, viêm ruột và bệnh thận [3], [12], [14] CSA khá hữu ích cho các ca viêm sau phẫu thuật trong trường hợp viêm màng mạch

nho ở phụ nữ trẻ [19], hiệu quả và an toàn để điều trị các bệnh viêm rễ thần kinh

mạn do huỷ myelin [6]

10

Để phòng chống thải ghép (tim, phổi, gan, thận, tuy) CSA có thể dùng riêng hay kết

hợp corticosteroid liễu nhỏ (tác động hiệp lực) hay azathioprin

Điều trị chống thải ghép cho các bệnh nhân có nguy cơ hay đã thất bại với các phác

đỗ chống thải ghép bằng các chất ức chế miễn dịch khác [3]

2.1.1.3- Cơ chế tác động

'Thực nghiệm cho thấy CSA có tác dụng ức chế :

- _ Sự phát triển của các phần ứng miễn dịch qua trung gian tế bào

~ _ Sự tạo ra và phóng thích các Iymphokin nhất là interleukin-2

CSA tie chế sự tăng sinh các lympho bào và các chức năng của chúng Tác dụng ức

chế miễn dịch có được từ sự ức chế chuyên biệt và thuận nghịch các tế bào T trong pha Gy hay G¡ của chu kỳ tế bào CSA ức chế tổng hợp và/hoặc phóng thích các

lymphokin như interleukin-l (tác nhân hoạt hoá các lympho bào), interleukin-2 (tác

nhân tăng trưởng tế bào T) CSA ức chế sự phóng thích IL-2 từ tế bào T hoạt hoá và ngăn cần sự đáp ứng của IL-2 với receptor của nó trên tế bào T nghỉ nhưng T nghỉ vẫn được hoạt hoá bởi IL-2 ngoại sinh [14] CSA gắn với các chất cyclophilin A,B,

C va D cia nhóm immunophilin (prolin-isomerase) 1a loai protein c6 tác động

chuyển tín hiệu trung gian từ tế bào máu đến nhân làm bất hoạt protein và phức hợp

được hình thành ức chế men phosphatase 2B hay calcineurin Kết quả này làm

nghẽn sự sản xuất IL-2 phụ thuộc vào calcium, vào gen tạo ra tác động ức chế miễn

dịch [14], [18]

CSA có thể ức chế tế bào chặn T hay xúc tác chức năng của các tế bào ức chế nhờ

sự tăng sinh prostaglandin từ các tế bào đơn nhân CSA cũng có tác động ức chế sự phóng thích Y -interferon [14]

H

Một vài nghiên cứu cho thấy CSA ức chế trên Iympho B, ức chế đáp ứng của lympho

B đối với kháng nguyên từ đại thực bào và ngăn chặn trực tiếp tế bào B trong pha

sinh sản CSA không ức chế sự sản xuất kháng thể của lympho B [8], [17] Nghiên cứu cơ chế tác động cho thấy CSA làm mất cân bằng miễn dịch hơn là gây suy giảm miễn dịch [12]

CSA tác động trên tế bào lympho hoat hod, dac biét 14 trén lympho T CD4* CSA

hoàn toàn không làm suy giảm sự tạo máu và không ảnh hưởng đến chức năng của các đại thực bào (bài tiết enzym, sự di chuyển đại thực bào ) hay của các tế bào u bướu (tỉ lệ phát triển, sự di căn ) cũng như không làm thay đổi số lượng tế bào lympho T nhớ không phá huỷ tế bào lympho Tác dụng ức chế miễn địch nhanh

chóng chấm dứt khi ngưng thuốc [12], [14], [17], [18]

Dùng liễu cao CSA, số lượng tế bào tuỷ xương giảm không đáng kể, số lượng tế bào

nhánh tuỷ xương là bình thường hay hơi tăng [20]

CSA làm giảm đáng kể IL-4 trong huyết thanh làm ngăn cản sự hoạt hoá của tế bào Thạ được tìm thấy trong bệnh viêm da [9]

Liễu thấp CSA ảnh hưởng tạm thời đến nông độ glucose, insulin trong máu [1 1}

Hấp thu

CSA có thể dùng đường uống hay tiêm tĩnh mạch

Chế phẩm IV chứa 33% alcol và dầu xổ Có thể các chất này là nguyên nhân gây

các phản ứng mẫn cảm nặng trên bệnh nhân

Qua đường tiêu hoá, sự hấp thu của CSA khó đoán trước và không hoàn toàn từ 20-

80% Sự hấp thu thay đổi do nhiễu yếu tố : cá nhân, thời gian sau khi ghép, giai

12

đoạn ngay sau ghép thận, lưu lượng mật, tình trang tiéu hod (tiéu chay lam néng độ

CSA giám), liễu, dạng dùng, cách dùng, thức ăn, tương tác thuốc

Sinh khả dụng của CSA ting dan trong suốt quá trình sử dụng nên Hiểu dùng phải

giảm từ từ để duy trì nổng độ không đổi của CSA trong máu Sáu tháng sau khi

ghép, nông độ CSA trong máu thay đổi từ 80-200 ng/ml thành 100-250 ng/ml Nỗng

độ cao nhất của CSA đạt được sau I-6 giờ Sinh khả dụng tương đối của dạng uống

trung bình là 30% (thay đổi từ 2-89% tuỳ cá thể) [14] Với Hễểu 600 mg sinh khả

dụng từ 10-60%, nêng độ max trong huyết tương trung bình khoảng 540 ng/ml (240-

Ở bệnh nhân ghép thận ổn định 7-15 tuổi dùng CSA đạng nhũ tương với liễu 328 mg

(7,4 mg/kg) chia 2 lần/ngày thì C„„„ trong máu đạt 1827 ng/ml (pp FPIA) và AUC

sau 1 lần dùng là 6922 ng.h.ml” [14]

Sự thải ghép ít xẩy ra khi nổng độ thuốc trong máu > 100 ng/ml (pp HPLC) Theo

thông tin của nhà sản xuất, nổng độ trong huyết tương của CSA sau 24 giờ từ 50-300 ng/mlhay trong mau tif 250-800 ng/ml (pp RIA) thì hạn chế được tối đa sự thải ghép

và tác dụng phụ Nồng độ CSA trong huyết thanh > 500 ng/mIl sẽ độc đối với thận

[14] và 33% bệnh nhân ghép gan sử dụng CSA không có hiện tượng thải cấp [26] Phân phối

13

CSA được phân phối khắp cơ thể, qua được nhau thai và sữa mẹ

Phân phối thuốc và bạch cầu tùy thuộc vào nồng độ và nhiệt độ, do vậy nồng độ

CSA trong huyết tương khi lấy mẫu định lượng phụ thuộc vào nhiệt độ Có thể hạn

chế tối thiểu điểu này bằng cách để yên mẫu ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ trước khi

đem ly tâm

Trên người khoẻ mạnh, thể tích phân phối (Vp) là 13 Iíưkg liều uống 600 mg

Ở bệnh nhân ghép tạng đặc, Vọ ở thời điểm cân bằng (Ts) 1 3-5 lit/kg (IV) Tiêm

tính mạch ở bệnh nhân suy thận nặng (Clc, < 5 ml/phút) Vp ở Ts.s là 1,45-7,26 lít/kg [14]

Tỉ lệ phân phối thuốc trong máu là : huyết tương 33-47%, Iympho bào 4-9%, tế bào

hạt 4-12%, hỗng cầu 41-58% Trong huyết tương 90% CSA gắn với protein nhất là

các lipoprotein : HDL 43-57%, LDL 25% và VLDL 2% II, [12], [14]

CSA qua được hàng rào nhau thai, ở bệnh nhân ghép thận dùng 450 mg hàng ngày

trong thời gian mang thai thuốc không hiện diện trong nước ối, trong 36 tuân nồng

độ thuốc trong máu ở dây cuống rốn là 54 mg/1 và 86mg/1 trong máu sinh của mẹ

Chuyển hoá - Thải trừ

CSA chuyển hoá mạnh ở gan bởi hệ thống men cyt.P450 chủ yếu bởi isoenzym CYP 3A Các nghiên cứu cho thấy có khoảng 30 chất chuyển hoá của CSA trong mật,

14

phân, nước tiểu, máu Các chất chuyển hoá có độc tính và tác dụng kém hơn chất

ban dau CSA [14], [33]

CSA được hydroxyl hoá ở C Y của 2-leucin, oxy hoá ở C 4 va tao ether vong do oxy hoá dây nối đôi trong chuỗi amino acid 3-hydroxy-N-4-dimethyl-L-2-amino-6- octenoic acid va N-demethy] leucin [14]

Các sản phẩm chuyển hoá chính của CSA là AMI, AM9, AM4N AUC trung bình

của các chất này so với CSA trong máu bệnh nhân ghép thận lần lượt là 70%, 21%

và 7,5% Các chất chuyển hoá này có thể định lượng trong huyết tương được bằng

phương pháp HPLC hay RIA [12], [14]

6 người lớn có chức năng gan thận bình thường thời gian bán thải trong pha đầu

trung bình 1,2 giờ và pha cuối là 8,4-27 giờ (trung bình 4-50 giờ) Độ thanh thải CSA tiêm IV ở người lớn ghép gan hay thận là 5-7 ml/phútkg Trẻ sơ sinh cao hơn nhiều

lần và trẻ em cao gấp 2 lần người lớn Ở bệnh nhân sau 4 tuần sử dụng CSA nhũ

tương uống hệ số thanh thải là 593 mJ/phút (7,8 ml/phútkg, pp FPIA) Phần lớn

thuốc được thải trừ qua mật và phân, chỉ 6% liễu uống được thải qua nước tiểu và chỉ

có 0,1% chưa chuyển hoá [12], [14], [17]

2.1.1.5- Tương tác thuốc

" Néng độ của CSA trong máu bị ảnh hưởng bởi các thuốc ảnh hưởng đến hệ

enzym cyt.P450 đặc biệt là isoenzym CYP 3A

- _ Các thuốc ức chế men gan làm giảm chuyển hoá và tăng nồng độ CSA trong huyết tương hay trong máu toàn phần như : cimetidin, điHiazem, nicardipin,

verapamil, kháng nấm conazol (ở bệnh nhân ghép thận đùng fluconazol sinh

khả dụng sau 4 ngày tăng lên mức tối đa [28]

15

Các thuốc khác cạnh tranh thải trừ cũng làm tăng nồng độ CSA trong máu lên cao như các kháng sinh nhóm macrolid (erythromycin, clarythromycin ), các corticoid, allopurinol, bromocriptin, danazol, metoclopramid, estrogen,

fluoxetin .[12] , [14]

Các thuốc làm hoạt hoá men gan làm tăng chuyển hoá và giảm nỗng độ CSA

trong máu như : riampicin, nafcillin, carbamazepin, phenobarbital, phenytoin, ticlopidin

Do vậy, khi kết hợp thuốc phải theo dõi lai néng 46 CSA trong máu và cần chỉnh liều thích hợp cho mỗi trường hợp

Người ta khuyến khích nên phối hợp CSA và ketoconazol (hay itraconazol)

để giảm Hiểu CSA Ngưng kết hợp phải tăng liều CSA trở lại [14]

Sử dụng đông thời CSA và các thuốc ức chế miễn dịch khác tăng nguy cơ tăng

u bạch huyết và nhiễm trùng

Các thuốc lợi tiểu ít thải Kali như amilorid, spironolacton, triamteren sẽ gây

tăng Kali huyết

CSA lam giảm thanh thải của prednisolon và ngược lại dùng liễu cao methylprednisolon có thể làm tăng nổng độ CSA trong máu Do vậy, trong dự phòng chống thải ghép người ta nên dùng liễu nhỏ corticoid [3], [12], [14] Tuy vậy có 33% bệnh nhân ghép gan dùng CSA không có tương tác với các corticoid

CSA là tăng độc tính của lovastatin và colchicin [10] trên hệ thần kinh cơ,

nhất là ở người suy thận [25]

Misoprostol cải thiện được chức năng thận và giảm thải ghép cấp tính ở các

bệnh nhân ghép thận dùng CSA và prednisolon Cilastatin cũng làm giảm độc tính thận của CSA Tuy nhiên khi dùng chung CSA và cilastatin (có trong chế

16

phẩm chứa imipenem) sẽ có nguy cơ rối loạn hệ thân kinh trung ương (lẫn, run ray, kích động, động kinh ) có hổi phục [14]

s® Nước bưởi làm tăng sinh khả dụng của thuốc Do vậy, ở những bệnh nhân

dùng CSA ổn định nên tránh thay đổi lượng nước bưởi dùng hàng ngày [14], [221

2.1.1.6- Độc tính -Tác dụng phụ

Đệc tính

Trên thận

- LDa ở chuột khi tiêm IV là 107 mg/kg, 6 chudt nhdt 1a 25 mg/kg, trên thỏ là

> 10 mg/kg 6 đường uống LD:o trên các thú vật trên lần lượt là 2329 mg/kg,

1480 mg/kg va > 1000 mg/kg [28]

- _ Các thử nghiệm cho thấy độc tính thường gặp nhất ở bệnh nhân là trên thận chiếm tỉ lệ 20-30% Một biến chứng nặng và thường xẩy ra là tăng cấp tính

creatinin và urea huyết thanh Các độc tính này thường phụ thuộc vào liều và

có hổi phục, thường đáp ứng tốt khi giảm liễu Trong điều trị dài hạn, một số bệnh nhân có sự biến đổi trong cấu trúc của thận (tiểu cầu thận, ống thận,

động mạch thận, xơ hoá mô kế) [12], [14], [17]

- _ Tiến hành sinh thiết thận ở các bệnh nhân cấy ghép bị thải ghép cấp hay mạn thấy có sự biểu hiện khác nhau của các phân tử costimulatory, kiểm soạt tốt

hiện tượng này sẽ làm giảm độc tính thận do CSA [8]

- _ Anh hưởng của CSA trên chức năng thận của các bệnh nhân ghép thận muộn

còn phụ thuộc vào sắc tộc, mảnh ghép ở người da trắng thường có kết quả tốt

hơn [15]

7

- Déc tinh trén thin cba CSA liên quan đến chứng giảm oxy thận và tăng các

gốc tự do trong nước tiểu và không hên quan đến tác động ức chế miễn dich

của CSA [28], [35]

Trên gan

Xây ra khi dùng liéu cao CSA Sy tang bilirubin trong huyết thanh chiếm 20% trong tháng đầu ở các bệnh nhân ghép và đôi khi tăng cả men gan Độc tính trên gan ít có

ý nghĩa lâm sàng hơn độc tính thận

Trên tuyến tuy

CSA ảnh hưởng nghiêm trọng đến sự hồi phục của tuyến tuy CSA làm tổn hại chức năng miễn dịch của tế bào Langerhands và là l trong những tác nhân làm tăng

Nhịp tim không đều, chảy máu nướu răng, tăng sản lợi [13], [31], thiếu máu nhẹ,

trầm cảm, lẫn lộn, buồn chán, đau lưng đưới, đau bụng, tiêu chảy, đau đầu, sốt, ớn lạnh, biếng ăn, co giật, run (đặc biệt trên tré em)

Tăng cân, phù, mệt mỗi, rậm lông [32], di cảm đầu chỉ, rối loạn chức năng thận, hội chứng thiếu máu thận, tiêu ít, cầm giác muốn tiểu thường xuyên, viêm thận kẽ, tăng

Kali, urea mau, uric mầu

18

Rối loạn chức năng gan, viêm gan mãn tính dạng ứ mật, tăng enzym gan, tăng

cholesterol máu, tăng cân, phù, mệt mỏi

Co cứng cơ, yếu cơ, viêm cơ (hiếm)

Giảm tiểu câu, ting sinh lympho

2.1.1.7- Liều dùng

Thay đổi dựa vào nổng độ trong máu hay trong huyết thanh của CSA Nông độ trong

máu thay đổi tuỳ theo loại cấy ghép, thời gian sau ghép, thời gian làm mẫu Trong

dự phòng thải ghép thường phối hợp với corticoid

Đường uống

- Người lớn và trẻ em chuẩn bị cấy ghép : dùng liéu don 15 mg/kg 4-12 gid

_ trước khi thực hiện cấy ghép Có thể bắt đầu sử dụng liễu 9,3 mg/kg/ngày cho

hàng tuân đến khi còn 5-10 mg/kg/ngày Liễu có thể thấp hơn khi dùng

NeoralP, trong vài trường hợp ghép thận liễu dùng chỉ cần 4 mg/kg/ngày là đủ

[12]

Đường IV

- Người lớn và trẻ em chuẩn bị cấy ghép : liều đơn 5-6 mg/kg/ngày 4-12 giờ

trước khi thực hiện cấy ghép

19

- Người lớn và trẻ em sau khi cấy ghép : liều đơn 5-6 mg/kg/ngày cho đến khi

ổn định chuyển sang đường uống CSA có thể tiêm truyền liên tục trong suốt

giai đoạn hậu phẫu [12]

2.1.1.8- Các phương pháp định lượng CSA

CSA có thể được phát hiện và định lượng bằng các phương pháp HPLC, RIA, pp

FPIA [14], [18] Trong các nghiên cứu về CSA sau này, các tài liệu đều công bố kết

quả dựa vào pp FPIA nhờ tính chính xác, độ nhạy cao và đặc hiệu Phương pháp này hiện nay được chính thức khuyến cáo áp dụng rộng rãi trong nghiên cứu định lượng theo dõi nỗng độ CSA trong máu bệnh nhân ghép cơ quan

Nguyên tắc của phương pháp : tạo phức hợp giữa kháng nguyên và kháng thể (là các

chất phát huỳnh quang hoặc immunoglobulin Ig) Các chất phát huỳnh quang có thể

là isothiocyanat fluorescein (cho mau xanh), rhodamin hydroclorid (cho mau dé

cam, aminonaphtaly! sulfonyl clorid (cho mau vàng) Các phức hợp này sẽ được phát hiện bởi detector UV-VIS

2.2- TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC

Cho đến hiện nay, có rất ít công trình nghiên cứu về CSA ở Việt Nam Khoa Sinh

hoá lâm sàng bệnh viện Chợ Rẫy TP Hồ Chí Minh có nghiên cứu dược động học của CSA trên các bệnh nhân ghép thận Việt Nam và theo dõi nỗng độ trong máu

của tất cả các bệnh nhân ghép thận phía Nam Các tác giả đã nghiên cứu trên 130

bệnh nhân ghép thận trên l năm ở Việt Nam và có kết luận dược động học trên bệnh

nhân người Việt Nam có nông độ cao nhất ở thời điểm 2 giờ sau khi uống (C;¿) và thấp nhất là vào giờ thứ 12 (C¡;) sau khi uống thuốc [1] Ngoài ra, dạng bào chế vi

nhũ tương của cyclosporin (biệt được Neoral”) cũng được nghiên cứu dược động học trên người Việt Nam tình nguyện và so sánh với một số dân tộc ở các nước khác [2]

20

Néng d6 Cyax của CSA ở người Việt Nam 18 763 + 241 ng/ml (306-1501 ng/ml) cao hơn người tình nguyện gốc Jordan (245 + 45 ng/m]), cao hơn người Mỹ da trắng và

tương đông với người tình nguyện Mexico

Các nghiên cứu cũng chứng minh có sự khác biệt rất lớn giữa các cá thể Do vậy,

việc định lượng lại nổng độ CSA trong máu của từng bệnh nhân theo định kỳ là rất

cần thiết nhằm giầm thiểu độc tính và chống thải ghép cho bệnh nhân

21

3- BOL TUONG VA PHUONG PHAP NGHIEN CUU

3.1- Nguyên vật liệu - máy móc - người tình nguyện nghiên cứu

3.1.1- Nguyên vật liệu, máy móc

= May FPIA hiéu TDX (Automatic Fluorescence Polarisation Immuno-Analyser),

hang Abbott, My

" Bộ kit thử của hing Abbott bao gdm : ống đo (cuvette), giếng mẫu (sample cartridges), ống ly tâm (centrifuge tubes)

“ Thuốc thử của hãng Abbott gồm 3 lọ :

- LoS: kháng thể đơn dòng của chuột là dung dịch chứa < 25% kháng thể

trong hệ đệm có chất ổn định protein, bảo quản bằng Na azide

-_ LọT: dung dịch có chứa chất đánh dấu huỳnh quang là dd < 0,01% chất đánh dấu huỳnh quang trong hệ đệm chứa chất diện hoạt và chất ổn định protein

bảo quản trong Na azid

- LoP: dung dich tién xi li 14 chat dién hoạt trong dd đệm

» Bộ thuốc thử dùng kèm để xử li miu gdm:

- Thuốc thử gây tủa cho máu toàn phân, dd để rửa đầu đò (sulfat kẽm trong

methanol và ethylen glycolle)

- _ Thuốc thử để hoà tan : chất diện hoạt trong nước

- _ Thuốc thử pha loãng : dd đệm phosphat có chứa Y -globulin bò

» _ Bộ thuốc thử chuẩn hoá : gồm 6 lọ với nỗng độ CSA chính xác trong máu người

toàn phân (âm tính với AgHBs và kháng thể anti-HVC, anti-HIV-1, anti-HIV-

2)

22

Bảng 3.1 Nồng độ của CSA trong các lọ thuốc chuẩn

Ngoai ra con cé 3 Io thudc chudn hod néng d6 CSA trung gian 1a L, M, H véi néng

a6 CSA lần lượt là 150 ng/ml, 400 ng/m! và 800 ng/ml trong máu người toàn phần

âm tính với AgHBs và kháng thể anti-HVC, anti-HIV-1, anti-HIV-2

"_ Máy trộn mini: Vortex, Hettich, Rotolab, Phap

« Maéy siêu ly tâm : Mikro 12-24, Hettich, 2070, Diic

=® Micropipette 50-200 pl va 200-1000 1, Eppendorf

Nước cam ép : cam được sử dụng trong nghiên cứu này là cam sành (Citrus nobilis hay C reticulata, C sinensis) tươi mua ở chợ An Đông Cam được ép lấy nước trước thử nghiệm 1 giờ bằng máy sau khi đã bóc tách vỏ ngoài và vỏ quả giữa Sau khi lấy nước cam được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ khoảng 6 °C

Thịt bò : thăn bò nạc mua của đại lý công ty Vissan

Bơ : hiệu Brétel của Pháp

23

3.1.2- Người thử nghiệm

3.1.2.1- Tiêu chuẩn tham gia thử nghiệm

- _ Có 10 người tình nguyện tham gia đợt thử nghiệm (6 nam và 4 nữ ), tất cả đều được tư vấn và thông báo chi tiết của việc tham gia nghiên cứu Cả

10 người đều là nhân viên y tế công tác tại khoa sinh hoá lâm sàng bệnh

viện Chợ Rẫy

~_ Tất cả đều cam đoan tình nguyện tham gia nghiên cứu

- _ Độ tuổi 23-33 tuổi

- _ Được xét nghiệm tất cả các chỉ số sinh hoá trước khi tham gia thử nghiệm

3 ngày và 2 tuần sau khi tham gia thử nghiệm Các chỉ số sinh hoá phải

bình thường, không có dấu hiệu bệnh lý

3.1.2.2- Thời gian uống thuốc và lấy máu

Mỗi người tham gia thử nghiệm 3 lần cách nhau mỗi lần 2 tháng Mỗi lần thử

nghiệm phải thực hiện lại các xét nghiệm sinh hoá và người tham gia thử nghiệm

không được uống các thức uống có chứa cổn và dùng các thuốc khác có thể ảnh

hưởng đến men gan trước 15 ngày tham gia lấy máu

- Lan 1 (uống thuốc với chế độ ăn bình thường lúc 8 giờ sáng)

~_ Lần 2 (uống nước cam ép trước khi uống thuốc 1⁄2 giờ 250 ml, tổng cộng là I lít nước cam ép chia làm 4 lần 2 giờ, 4 giờ và 8 giờ sau khi uống thuốc, ăn chế

độ ăn bình thường)

- _ Lân 3 (trước uống thuốc 1⁄2 giờ ăn bánh mì + 100 g bơ + 20 g đường, buổi trưa

ăn thịt bò beefsteack 200 g chiên bơ + mỡ + khoai tây) Buổi chiều, các người

tham gia thử nghiệm được cung cấp thức ăn nhiễu dâu (cari gà nấu với dừa

nhiều dầu) Toàn bộ đều uống nước lọc

24

Uống thuốc : Neoral® tiéu trung binh 4 mg/kg

Lấy máu vào các thời điểm 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12 giờ sau khi uống thuốc

3.1.3.- Xử lí mẫu chuẩn bị định lượng

Mỗi lần lấy khoảng Í ml máu, cho vào ống có chứa sẵn chất chống đông EDTA Na

Lấy 150 u1 mẫu máu cho vào ống ly tâm Thêm chính xác 50 pl thuốc thử để hoà tan vào từng ống ly tâm (thật nhẹ nhàng bằng cách chạm đầu pipet vào thành ống) Thêm chính xác 300 pl thuéc thử tửa protein/ rửa đầu dò vào từng ống ly tâm Đậy nắp và lắc từng ống trên máy Vortex 10 giây để đảm bảo trộn đều Đặt các ống ly tâm vào máy siêu tốc trong 10 phút, tốc độ 12.000 vòng/phút hoặc cho đến khi có được lớp dung dịch trong suốt bên trên và có tủa protein biến tính cứng chắc bên

dưới

Chuyển hết phần dung dịch vào giếng mẫu (cẩn 150 pl dung dich dé thử nghiệm)

Đo ngay nông độ CSA trên máy TDX

Chú ý :

- _ Tất cả các thuốc thử, mẫu máu, chất chuẩn đều được đưa về ở nhiệt độ phòng

trước khi tiến hành thử nghiệm

- _ Đảo trộn các dung dịch thật nhẹ nhàng tránh tạo bọt có thể ảnh hưởng đến kết

quả Nếu có bọt phải để yên vài phút trước khi thao tác tiếp

3.1.4- Thẩm định lại máy định lượng TDX

Máy TDX được thẩm định lại dựa vào các thông số :

- _ Độ lệch chuẩn (độ chính xác) : thực hiện trên các lọ chuẩn CSA có nổng độ biết trước lần lượt là 150, 400 và 800 ng/ml thém vào máu người toàn phần có nông độ CSA biết trước là 400 ng/ml

25

- _ Độ đúng : thực hiện bằng phương pháp thêm chuẩn vào mẫu mầu với nỗng độ lần lượt là 150, 400 và 800 ng/ml Thực hiện trên mẫu máu người khơng cĩ CSA và mẫu máu cĩ nổng độ CSA biết trước là 400 ng/ml Độ đúng của

phương pháp là tỉ số nồng độ CSA giữa 2 mẫu máu trên sau khi trừ phần nơng

độ CSA cĩ sẵn

~ _ Độ nhạy của phương pháp : thực hiện bằng phương pháp pha lỗng

Tất cả các tiêu chuẩn tuân theo hướng dẫn của nhà sản xuất máy Abbott và tiêu chuẩn NCCLS

3.1.5- Xử lí kết quả

Các kết quả thực nghiệm được xử lý dựa vào phân tích lý thuyết thống kê với phần

mềm Excel 97 để phân tích số liệu Anova và phần mềm Phasolpro BE để tính tốn

các thơng số được động hoc (AUC, Cmax, Tmax) Cha bộ mơn vị tính dược Đại học Y Dược TP HCM

Thử nghiệm này được xem như thử nghiệm tương đương sinh học so sánh ảnh hưởng

của 2 yếu tố uống nước cam ép và chế độ ăn giàu lipid trên cùng một nhĩm người tình nguyện với cùng loại thuốc Neoral? Do vậy, các số liệu thống kê sẽ được xử lí trên kết quả AUC;.¡; và C„;„ của 10 người tình nguyện theo tài liệu hướng dẫn thử

nghiệm tương đương sinh học [27]

Khoảng tin cậy 90% được áp dụng cho các số liệu AUC;¡; và C„¿„ được tính theo phương trình :

2

CI = (~ =tg)# to os(yyX Sử

Trong đĩ :

kr : trung bình ÁC;.¡; (hay trung bình Cạ¿„) từ nhĩm dùng nước cam ép và chế độ

ăn giàu lipid (lần thử nghiệm 2 và 3)

26