Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắcxin cúm a h5n1 trên tế bào thận khỉ tiên phát ở quy mô phòng thí nghiệm

Danh mục các bảng trong báo cáo Bảng 1 Các đoạn ARN trong hệ gen virút Cúm A và các protein mã hóa 5 Bảng 2 Các vắcxin Cúm đã được đăng ký sử dụng trên thế giới 16 Bảng 3 Hiệu giá vir

Bộ khoa học công nghệ – Bộ y tế

Viện Vệ sinh Dịch tễ trung ương

1 Yersin, Hà Nội

báo cáo tổng kết khoa học và kỹ thuật đề tài

nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắcxin cúm a/h5n1 trên tế bào thận khỉ tiên

phát ở quy mô phòng thí nghiệm

m∙ số : ĐTĐL-2006/02G GS.TSKH.Nguyễn THU VÂN

6374

14/5/2007

Hà nội – 2007 Bản quyền 2007 thuộc Công ty vắcxin và sinh phẩm số 1,Viện VSDTTƯ

Đơn xin sao chép bản toàn bộ hoặc từng phần tài liệu này phải gửi đến Giám đốc Công ty vắcxin và sinh phẩm số 1 trừ trường hợp sử dụng với mục đích nghiên cứu

Bộ khoa học công nghệ – Bộ y tế

Viện Vệ sinh Dịch tễ trung ương

1 Yersin, Hà Nội

báo cáo tổng kết khoa học và kỹ thuật đề tài

nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắcxin cúm a/h5n1 trên tế bào thận khỉ tiên

đề tài nghiên cứu khoa học công nghệ nhà nước ĐTĐL-2006/02G

nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắcxin cúm a/h5n1 trên tế bào thận khỉ

tiên phát ở quy mô phòng thí nghiệm

Cố vấn khoa học : GS.TSKH.Hoàng Thủy Nguyên

Chủ nhiệm đề tài : GS.TSKH Nguyễn Thu Vân

Các cán bộ tham gia

Thạc sỹ Đinh Thúy Vân KS.Trịnh Tuấn Việt CNSH.Nguyễn Kim Dung Thạc sỹ Đoàn Văn Lưu TS.Đỗ Thủy Ngân Thạc sỹ Nguyễn Thu Hằng CNSH.Nguyễn Hoàng Mai Thạc sỹ Nguyễn Bích Thủy TS.Nguyễn Quế Anh

TS.Lê Quỳnh Mai Thạc sỹ Nguyễn Lê Khánh Hằng

Cơ quan thực hiện :

Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương

CCID 50 Cell Culture Infectious Dose 50

(Liều gây nhiễm 50% tế bào)

(Trung tâm kiểm soát bệnh tật và dự phòng- Mỹ)

tác động gây hủyhoại tế bào

Ngày sau gây nhiễm

(thử nghiệm miễn dịch gắn enzym)

(Liều gây miễn dịch 50%)

(Cơ quan quản lý thực phẩm và thuốc)

IVPI Intravenous Pathogenicity Index

Chỉ số độ lực tiêm tĩnh mạch

Môi trường cần thiết tối thiểu

RT- PCR Reverse transcription- Polymerase chain reaction

(phản ứng chuỗi polymeraza phiên mã ngược)

rpm round per minute

Virut gây suy giảm miễn dịch ở khỉ

Virut tạo bọt của khỉ

polyacrylamide gel electrophoresis

Khuyếch tán miễn dịch vòng tròn đơn

Không có các yếu tố gây bệnh đặc biệt

VABIOTECH Công ty vắcxin và sinh phẩm số 1

( Chủng sản xuất)

Tổ chức Y tế thế giới

mục lục

Đặt vấn đề 1

Phần 1 : tổng quan 3

1.1 Đặc điểm chung của virút cúm 3

1.2.Cấu trúc virion 3

1.3 Cấu trúc hệ gen virút Cúm và các protein mã hóa 4

1.4 Sự tái tổ hợp của virút Cúm 8

1.5 Sự phát triển của virút trên tế bào 9 1.6 Sinh bệnh học 9 1.7 Chẩn đoán virút Cúm 10

1.8 Đặc điểm dịch tễ học 10

1.9 Kỹ thuật di truyền ngược 13

1.10 Dự phòng 15

1.11 Một số quy trình sản xuất vắcxin Cúm 19

Phần 2: vật liệu và phương pháp 21

2.1 Vật liệu 21

2.1.1 Tế bào 21

2.1.2 Virút 21

2.1.3 Kháng nguyên chuẩn A/Vietnam/1203/2004 (H5N1) 22

2.1.4 ADN plasmit 22

2.1.5 Vật liệu và trang thiết bị khác 23

2.2 Phương pháp 23

2 2.1 Phương pháp tạo virut tái tổ hợp 23

2.2.2 Sản xuất chủng giống gôc và chủng sản xuất vắcxin H5N1 23

2.2.3 Thử nghiệm kiểm tra độc lực của WSV rgA/H5N1 24

2.2.4 Quy trình lựa chọn khỉ sạch 24

2.2.5 Quy trình sản xuất vắc xin Cúm H5N1 trên quy mô phòng thí

2.2.6 Phương pháp định lượng HA trong vắcxin 27

2.2.7 Phương pháp sản xuất kháng huyết thanh khỉ kháng H5N1 sử dụng

2.2.8 Các thử nghiệm huyết thanh học 28 2.2.9 Các thử nghiệm xác định hiệu giá virút 28 2.2.10 Các thử nghiệm kiểm tra chất lượng 29 2.2.11 Đánh giá sự nhân lên của virút trong quá trình nuôi cấy 34 2.2.12 Đánh giá tính an toàn và đáp ứng miễn dịch trong thử nghiệm tiền

3.6 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho vắcxin cúm A/H5N1 về các mặt 64

KÕt luËn 70 KiÕn nghÞ 72 Tµi liÖu tham kh¶o 73

Danh mục các bảng trong báo cáo

Bảng 1 Các đoạn ARN trong hệ gen virút Cúm A và các protein mã hóa 5

Bảng 2 Các vắcxin Cúm đã được đăng ký sử dụng trên thế giới 16

Bảng 3 Hiệu giá virút rg 15T qua các lần cấy truyền 37

Bảng 4 Kết quả thử nghiệm kiểm tra độc tính của các chủng virút

Bảng 9 Kết quả nghiên cứu xác định quy trình gây nhiễm 45

Tương quan giữa nồng độ huyết thanh khỉ và hàm lượng HA trong

vắcxin Cúm bằng thử nghiệm SRID

Danh mục các hình trong báo cáo

Hình 1 Quy trình sản xuất vắc xin Cúm A/H5N1 25

Hình 2 Trình tự nucleotit ở vị trí cắt liên quan đến độc tính của virút

trên đoạn gen HA của virút rgA/H5N1 trong mỗi loạt vắcxin so

với trình tự đó trên gen HA của chủng virut hoang dại

Hình 11 Hình ảnh SRID định l−ợng HA trong vắcxin Cúm H5N1 55

Hình 12 Hình ảnh tế bào PMKc và Vero sau khi gây nhiễm chủng

NIBRG-14 sau 48h

60

Hình 13 Kết quả PCR nhận dạng NIBRG -14 sau khi cấy truyền 62

H×nh 14 ChØ sè pH trong 15 lo¹t v¾c xin Cóm 66 H×nh 15 Hµm l−îng Protein toµn phÇn trong 15 lo¹t v¾cxin Cóm 67 H×nh 16 Hµm l−îng Formaldehyt (g%) trong 15 lo¹t v¾cxin Cóm 67 H×nh 17 Hµm l−îng Thimerosal (g%) trong 15 lo¹t v¾cxin Cóm 68 H×nh 18 hµm l−îng Al+++ (g%) trong 15 lo¹t v¾cxin Cóm 68

Bài tóm tắt

Đề tài: Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắcxin Cúm

A/H5N1 trên tế bào thận khỉ tiên phát ở quy mô phòng thí nghiệm

1 Mục tiêu chính của đề tài:

1.1 Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắcxin Cúm A/H5N1 trên

tế bào thận khỉ tiên phát ở quy mô phòng thí nghiệm

1.2 Đánh giá tính an toàn và đáp ứng miễn dịch của vắcxin sản xuất

được trên động vật thực nghiệm

2 Phương pháp nghiên cứu : Đề tài đã sử dụng phương pháp di truyền

ngược (revese genetics) để tạo ra chủng virut tái tổ hợp giảm độc lực

mà vẫn giữ nguyên tính kháng nguyên của chủng gốc A/VN/1194/2004, có hiệu giá cao Các phương pháp kiểm tra chất lượng chủng là các phương pháp chuẩn thức do TCYTTG quy định,

đảm bảo yêu cầu của chủng sản xuất vắcxin Các phương pháp tinh chế kháng nguyên hiện đại như: gặt virut, cô đặc, thẩm tích, tinh khiết, siêu lọc… cũng được áp dụng để sản xuất các loạt vắcxin ở quy mô phòng thí nghiệm Các phương pháp kiểm tra chất lượng vắcxin chuẩn thức theo quy định của TCYTTG cũng được áp dụng để đảm bảo chất lượng của vắcxin xuất xưởng

3 Các kết quả chính đạt được

3.1 Thiết lập hệ chủng gốc và chủng sản xuất vắcxin Cúm A/H5N1

với đầy đủ các chỉ tiêu kỹ thuật theo quy định

Tạo chủng virút mang gen HA và NA nguồn gốc từ chủng A/Vietnam/1194/2004 và 6 gen còn lại nguồn gốc từ chủng A/PR8/34 (PR8) bằng kỹ thuật di truyền ngược được thực hiện trên dòng tế bào PMKc, một dòng tế bào đã được sử dụng để sản xuất vắcxin Lần cấy truyền thứ 13 được lựa chọn làm chủng virút rgA/H5N1 gốc (MSV) và

đời thứ 14 làm chủng sản xuất vắcxin rgA/H5N1 (WSV) được cấy truyền 1 đời từ MSV Sau khi rgA/H5N1 được xác định là không còn khả năng gây độc và có tính kháng nguyên, chủng virút tái tổ hợp này

được sử dụng để sản xuất chủng giống gốc (MSV) và chủng sản xuất (WSV) Đề tài đã sản xuất được 460 ống chủng MSV và 555 ống chủng WSV Tất cả các ống chủng này đều được lưu trữ ở -80˚C

3.2 Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắcxin Cúm A/H5N1 trên

Bất hoạt formalin 1:2000, 37± 1 o C, 96h

3.3 Kết quả sản xuất thử nghiệm vắcxin Cúm ở quy mô phòng thí nghiệm

Sản xuất thử nghiệm vắcxin cúm bất hoạt H5N1 từ chủng dự tuyển này

ở quy mô phòng thí nghiệm được thực hiện với 26 loạt liên tiếp để đánh

giá tính ổn định của quy trình và chia làm 2 giai đoạn:

o Giai đoạn I: Nghiên cứu thăm dò các thông số kỹ thuật và tính

khả thi của qui trình sản xuất gồm 6 loạt (từ loạt 010305 đến loạt 050305B);

o Giai đoạn II: Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm ở qui mô phòng thí

nghiệm gồm 20 loạt (từ loạt 060405 đến loạt 091006)

3.4 Kiểm tra chất lượng và đánh giá đáp ứng miễn dịch của vắcxin

Cúm A/H5N1 trên động vật thực nghiệm

Các loạt vắcxin Cúm được kiểm tra chất lượng theo quy định của

TCYTTG đối với vắcxin Cúm bất hoạt Thử nghiệm công hiệu đối với

vắcxin Cúm được tiến hành trên cả động vật thực nghiệm và định lượng

HA bằng SRID sử dụng huyết thanh người và huyết thanh khỉ

Các kết quả kiểm tra hóa lý của vắcxin xuất xưởng cho thấy đều đạt yêu

cầu về các mặt pH, formaldehyt, thimerosal và nhôm Từ loạt 010506

trở đi, với quy trình công nghệ ổn định và pha vắcxin dựa vào hàm

lượng HA theo thử nghiệm SRID, hàm lượng protein toàn phần

<50àg/ml đối với các loạt vắcxin có hàm lượng HA là 15àg/ml Để

đánh giá an toàn chung của vắcxin dự tuyển, mỗi loạt được kiểm tra trên chuột lang, chuột nhắt trắng và thỏ giống như các vắcxin thông thường khác Kết quả cho thấy tất cả các loạt vắcxin đều đạt yêu cầu theo tiêu chuẩn quốc gia và của TCYTTG về an toàn chung Để đánh giá tính miễn dịch của vắcxin dự tuyển, vắcxin của mỗi loạt được tiêm cho 5 con gà Các kết quả HI cho thấy liều tiêm hiệu quả cho đáp ứng miễn dịch ở 50% số gà được tiêm dao động từ 8,0 – 9,66 àg và ở chuột nhắt trắng là 5,37 – 10,0 àg Từ loạt 010506 trở đi, do kết quả ổn định của quy trình sản xuất và áp dụng thử nghiệm SRID để pha vắcxin cùng một hàm lượng 15àg /ml nên kết quả công hiệu rất cao (ED50≤1,1àg) Thêm vào đó, các loạt vắcxin 010305 và 030305 đã được xác định khả năng gây miễn dịch trên khỉ Sau 3 mũi tiêm, mỗi mũi cách nhau 1 tháng, hiệu giá HI của nhóm tiêm vắcxin là 1:32 – 1:128 so với nhóm

an toàn của vắcxin thử nghiệm

3.5 Kết quả nghiên cứu thích ứng chủng NIBRG-14 trên dòng tế bào

PMKc, Vero và rgA/H5N1 trên Vero

Từ những kết quả thu được cho thấy chủng virút NIBRG-14 đã không thích ứng được trên tế bào Vero cũng như tế bào thận khỉ tiên phát sau

17 lần cấy truyền Ngược lại, kết quả cấy truyền chủng rgA/H5N1 qua

12 đời cho thấy chủng đã thích ứng và có hiệu giá ổn định HA

512-1024 và hiệu giá virút bằng 1011 PFU/ml Với kết quả trên cho thấy virút rgA/H5N1 bước đầu đã thích ứng và có khả năng nhân lên cũng như sản sinh ra kháng nguyên HA đặc hiệu trên dòng tế bào thường trực Vero và có thể khả thi để ứng dụng trong sản xuất vắcxin cúm A/H5N1 trên dòng tế bào thường trực Vero

3.6 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho vắcxin Cúm A/H5N1 về các mặt

Tiêu chuẩn đề nghị như sau :

đảm bảo tính ổn định và cho hiệu suất cao

2 Các loạt vắcxin Cúm A/H5N1 sản xuất quy mô phòng thí nghiệm

đã chứng minh được tính an toàn và hiệu quả gây miễn dịch trên thử nghiệm tiền lâm sàng Thử nghiệm tiêm các liều khác nhau trên khỉ cho thấy đáp ứng miễn dịch đạt yêu cầu sau 2 mũi tiêm với liều tiêm từ 7,5àg/ml trở lên với hiệu giá HAI ≥ 1/40

5 Những đóng góp mới của đề tài

Đề tài đã xây dựng quy trình công nghệ và sản xuất thành công vắc xin Cúm A/H5N1 trên tế bào ở quy mô phòng thí nghiệm Đây là một thành công có ý nghĩa to lớn đối với cả trong và ngoài nước Vắcxin Cúm A/H5N1 thử nghiệm thành công trên thực địa lâm sàng sẽ đem lại khả năng phòng chống đại dịch nếu xẩy ra

Đặt vấn đề

Dịch Cúm gia cầm độc lực cao týp A/H5N1 xuất hiện từ giữa tháng 12/2003 tại Hàn Quốc và lan rộng ra một số nước châu á hiện nay đang là mối quan tâm lo ngại hàng đầu Chủng virút týp A/H5N1 được xác định là có khả năng lan truyền sang người từ năm 1997 và xuất hiện ở Việt Nam từ tháng 1/2004 Sự lan truyền trong loài chim, gia cầm và thủy cầm làm tăng khả năng lây truyền trực tiếp sang người Nếu có càng nhiều ca bệnh trên người xẩy ra, càng nhiều nguy cơ nhiễm đồng thời chủng virút Cúm người và Cúm gia cầm trên người, dẫn đến nguy cơ tạo ra biến chủng mới có khă năng lây truyền dễ dàng từ người sang người

Chủng virút cúm týp A/H5N1 là mối nguy cơ đặc biệt đối với sức khỏe con người vì hai lý do Thứ nhất, virút cúm týp A/H5N1 là tác nhân gây bệnh trên gia cầm nhưng có khả năng truyền trực tiếp từ gia cầm sang người Thứ hai, virút cúm týp A/H5N1 gây bệnh với tỷ lệ tử vong rất cao trên người Tất cả những lý do đó làm cho virút cúm týp A/ H5N1 trở nên đặc biệt nguy hiểm với nguy cơ xẩy ra đại dịch nghiêm trọng

Số các trường hợp nhiễm Cúm gia cầm týp A/H5N1 trên người đã được xác định tính đến thời điểm 23/2/2007 là 274 theo số liệu của WHO, trong

số đó có 167 ca tử vong Số mắc/số chết tại Việt Nam cho đến thời điểm báo cáo là 93/42

Đặc điểm dịch tễ học nhiễm virút Cúm týp A/H5N1 tại Việt Nam

được thông báo với 3 đợt dịch:

(1) Đợt 1: Từ 26/12/2003 đến 10/3/ 2004, có 16 trường hợp tử vong trong 23 ca bệnh được xác định (Tỷ lệ tử vong/ ca bệnh (CFR) là 69,9%);

(2) Đợt 2: Từ 19/7/2004 đến 26/8/2004, có 4 ca bệnh và tất cả đều tử vong (CFR 100%); và

(3) Đợt 3: Từ 16/12/2004 đến 1/11/2005, 21 trường hợp tử vong trong 64

ca bệnh được xác định (CFR 32,8%)

Việc phát triển vắcxin phòng cúm A/H5N1 cho người là một yêu cầu cấp bách đặt ra Trong điều kiện xẩy ra đại dịch Cúm, việc sử dụng vắcxin và thuốc kháng virút là hai biện pháp hữu hiệu nhất có thể làm giảm tỷ lệ mắc

và tỷ lệ chết

Ngay sau khi virút cúm A/ H5N1 được phân lập ở các bệnh nhân tại Việt Nam, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu phát triển vắcxin cúm A/H5N1 tại Công ty Vắcxin và sinh phẩm số 1 (VABIOTECH), Viện Vệ Sinh Dịch Tễ

TW (NIHE), Hà Nội Kỹ thuật di truyền ngược đã được ứng dụng để tạo chủng cúm A/H5N1 giảm độc lực dùng cho sản xuất vắcxin từ chủng virút H5N1 có độc tính cao (A/Vietnam/1194/2004) với sự giúp đỡ và hợp tác của Khoa Virút- Viện Y khoa- Đại học Tokyo- Nhật Bản, dưới sự chỉ đạo của giáo sư Yoshihiro Kawaoka

Nghiên cứu này được tiến hành với 2 mục tiêu chính:

1 Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắcxin Cúm A/H5N1 trên tế bào thận khỉ tiên phát ở quy mô phòng thí nghiệm

2 Đánh giá tính an toàn và đáp ứng miễn dịch của vắcxin sản xuất

được trên động vật thực nghiệm

Phần 1 Tổng quan

1.1 Đặc điểm chung của virút cúm

Các virút cúm thuộc họ Orthomyxoviridae, là những chủng virút có hệ

gen dạng sợi đơn ARN (-) gồm 8 phân đoạn lần lượt mã hoá cho các protein

PA, PB1, PB2, NS, M, NP, HA, NA của virút (cúm A, B) Họ

Orthomyxoviridae gồm 4 giống: Virút cúm A, virút cúm B, virút cúm C, và

Thogovirus Virút Cúm B và C thường chỉ gây nhiễm cho người trong khi phần lớn virút Cúm A gây nhiễm trên gia cầm và chỉ có một vài phân týp gây nhiễm cho người và các động vật khác như lợn, ngựa Virút Cúm A, B và C khác nhau về tính kháng nguyên của nucleocapsit (NP) và protein Matrix (M) Trong đó virút cúm A lại được chia thành các phân týp dựa theo cấu trúc kháng nguyên của haemagglutinin (HA) và neuramidaza (NA) glycoprotein Chủng virút Cúm được đặt tên theo nguồn gốc phân lập, vùng

địa lý phân lập, số chủng, năm phân lập Đồng thời tên chủng virút cũng nói lên phân týp kháng nguyên haemagglutinin (HA) và neuraminidaza (NA) của chủng đó (ví dụ A/Vietnam/1194/2004 (H5N1) Có 16 phân týp HA và 9 phân týp NA; các phân týp khác nhau ít nhất 30% trình tự axít amin Từ năm

1983 đến nay, không có thêm phân týp mới nào được phát hiện, điều này cho thấy có một số giới hạn về sự biến chủng của virút cúm A [1]

1.2 Cấu trúc virion

Thành phần của các virút trong họ Orthomyxoviridae bao gồm 1%

ARN, 70% protein, 20% lipit và 5 đến 8% carbonhydrat [2] Lớp màng lipit của virỳt Cúm được tạo thành từ màng bào tương của tế bào chủ nơi virút

C có cấu trúc khác biệt với các gai glycoprotein sắp xếp theo hình 6 cạnh Virút Cúm A và B nuôi cấy trên tế bào hoặc trứng có hình dạng thông thường

đường kính 80-120 nm Ngược lại, virút Cúm phân lập từ người và động vật sau đó được cấy truyền một lần trên tế bào thường có hình thái khác biệt và

thuộc rất nhiều vào loại tế bào chủ khi virút nhân lên [4]

Đặc điểm hình thái nổi bật của virion Cúm A là lớp bao gồm 500 gai (10-14 nm) xòe ra phía ngoài lớp lipit Có 2 loại gai khác nhau: Gai hình gậy

là kháng nguyên HA và gai hình nấm là kháng nguyên NA Tỷ lệ HA:NA thường dao động nhưng thông thường từ 4:1 cho đến 5:1 Protein matrix M1

được cho là nằm dưới lớp lipit kép và liên kết với Ribonucleoprotein (RNP) lõi của virút M1 là protein có nhiều nhất trong virion

Bằng phương pháp cắt lớp mỏng tiêu bản có các hạt virút hoặc phá vỡ hạt, cấu trúc RNP có thể được chia thành nhiều lớp có kích thước khác

Các RNP có chứa 4 loại protein và ARN NP là protein tiểu đơn vị nổi trội của nucleocapsit và bao quanh ARN, có khoảng 20 nucleotit trong 1 tiểu

đơn vị NP Liên kết với RNP là phức hợp ARN polymeraza phụ thuộc – ARN bao gồm 3 polymeraza protein PB1, PB2, PA và chỉ có mặt từ 20-30

mối liên kết cần thiết trong chu trình sống của virỳt để giải phóng phức hợp

1.3 Cấu trúc hệ gen virút Cúm và các protein mã hóa

Hệ gen của virút Cúm A và B có 8 đoạn gen trong khi virút Cúm C có

7 đoạn gen (không có gen NA) Cấu trúc hệ gen của virút Cúm đã được tìm hiểu nhờ kỹ thuật phân tích điện di virion ARN virút trên gen polyacrylamit [14, 15, 16, 17, 18, 19, 20] Cấu trúc gen của virút Cúm như sau: Đoạn gen 1 mã hóa cho PB2, đoạn 2 cho PB1, đoạn 3 cho PA, đoạn 4 cho HA, đoạn 5 cho NP, đoạn 6 cho NA, đoạn 7 cho M1 và M2, đoạn 8 cho NS1 và NS2 Trình tự nucleotit của ARN virút Cúm PR8/34 và rất nhiều phân týp khác đã

Bảng 1 Các đoạn ARN trong hệ gen virút Cúm A và các protein mã hóa

(Trích dẫn từ Fields Virology, Ed David M Knipe et al, Volume 1, Fourth

edition, 2001, Lippincott William &Wilkins)

Đoạn gen Chiều dài

(nucleotit)

Polypeptit mã hóa

Chiều dài chuỗi polypeptit (axit amin)

Trọng lượng phân

tử ước tính (dalton)

Số phân tử trên 1 virion

Đoạn ARN đơn của virút Cúm C mã hóa cho protein liên kết haemaglutinin-esteraza (HEF) có chức năng gắn dính vào thụ thể (receptor), hoạt động hòa màng của HA và phá hủy thụ thể của NA, trong khi ở virút Cúm A và B những hoạt tính này do các đoạn gen riêng biệt mã hóa Chiều dài của các đoạn gen và các protein mã hóa được liệt kê trong bảng 1 Đoạn gen ngắn không mã hóa ở mỗi đầu bao gồm chuỗi 11-13 nucleotit tại đầu 5’

và 9-12 nucleotit tại đầu 3’ có tính ổn định cao hơn so với các đoạn gen khác

và giống nhau ở cả 3 loại virút Cúm A, B và C [22, 23, 24]

Ba gen lớn nhất mã hóa cho các thành phần của ARN polymeraza PB1, PB2 và PA của virút A [25] và virút Cúm B, C [26] Đoạn gen 1 và 2

đều dài 2.341 nucleotit mã hóa cho protein PB2 gồm 759 axit amin và PB1

757 axit amin Đoạn gen 3 dài 2.233 nucleotit mã hóa cho protein PA có 716 axit amin

NP là protein cấu trúc chính phối hợp với các đoạn ARN tạo thành RNP NP còn là kháng nguyên đặc hiệu týp, khác nhau giữa virút Cúm A, B

và C NP được đoạn ARN 5 dài 1.565 nucleotit mã hóa [27] NP chứa 498 axit amin và có trọng lượng phân tử 56.101 dalton NP của virút Cúm B chứa

560 axit amin và tương đồng 47% so với virút Cúm A trong khi NP của virút Cúm C có 565 axit amin và có một số vùng tương đồng với virút Cúm A và B [28]

Tên gọi của protein HA (haemagglutinin) xuất phát từ khả năng ngưng kết hồng cầu của virút bằng cách gắn với các thụ thể đặc biệt có chứa axit sialic HA có 3 vai trò quan trọng trong quá trình sao chép virút:

tạo thành sư gắn kết giữa virút và tế bào

bằng cách gián tiếp tạo nên sự hòa màng endocytosed của virút và màng nội bào làm cho nucleocapsit virút giải phóng vào trong bào tương

các vụ dịch Cúm đều liên quan đến sự thay đổi cấu trúc kháng nguyên

Đoạn ARN 4 có chiều dài từ 1.742 đến 1.778 nucleotit và mã hóa cho

562 đến 566 axit amin HA do đoạn ARN 4 mã hóa và được tổng hợp trên ribosom gắn màng và di chuyển vào lumen của lưới nội chất (ER) tế bào bị

thuộc vào phân týp virút, loại tế bào chủ và điều kiện nuôi cấy HA tồn tại cả

dalton) Qúa trình phân tách là điều kiện quyết định để virút có khả năng gây nhiễm và do vậy liên quan đến độc tính và khả năng lây truyền [29]

HA chính là đoạn gen đầu tiên của virút Cúm được xác định trình tự [30]

hoặc từ tế bào bị nhiễm bằng chất tẩy hòa tan màng, khi chất tẩy bị loại bỏ, vùng transmembrane kỵ nước kết hợp lại và tạo thành HA hình hoa thị Tuy nhiên, xử lý virút bằng promelin sẽ giải phóng ra HA bảo toàn tính kháng nguyên và cấu trúc 3 chiều, có khả năng hòa tan trong nước và chứa toàn bộ

32] Vị trí gắn thụ thể HA nằm ở vùng ngoại biên của các tiểu đơn vị phân

tử Cấu trúc vị trí đó có tính đồng dạng cao giữa các phân týp (Tyr -98, Trp -

153, His -183, Glu 190, Leu – 194) [33, 34, 35] Bởi vì tính đặc hiệu gắn thụ thể khác nhau giữa khí quản người (α 2, 6), hệ tiêu hóa gia cầm (α 2, 3) và khí quản lợn (α 2, 3 và α 2, 6), số lượng các phân tử HA có thể chuyển từ

tính gây nhiễm của virút [37, 38] Những HA đó đều chứa chuỗi R-X-K/R-

R ở cầu nối peptit và được phân tách trong tế bào bằng furin, một proteaza của mạng trans-Golgi [39, 40] Đoạn HA chỉ có arginine đơn ở cầu nối peptit không bị phân tách khi nuôi cấy trên tế bào (trừ chủng A/WSN/33) nhưng sẽ bị phân tách bởi trypsin ngoại sinh Khi nuôi cấy trên trứng gà có phôi, HA có arginine đơn ở cầu nối peptit sẽ bị phân tách có thể do yếu tố proteaza giống Xa [41] Nhiều nghiên cứu cho rằng vị trí phân tách có liên quan đến độc tính virút và chủng virút độc lực có chứa kiểu nhận biết furin trong khi chủng virút không độc lực chỉ chứa arginine đơn [42, 43, 44, 45] Tuy nhiên cũng có một số chủng cúm H5 không độc lực có vị trí nhận biết furin Những chủng không độc lực này có chuỗi oligosaccharit ở gần vị trí phân tách, điều này có thể ảnh hưởng tới hoạt tính của proteaza khi phân tách và chuỗi này không tìm thấy ở những chủng H5 độc lực [46, 47]

Trong các chủng virút Cúm người chỉ có A/WSN/33 có khả năng nuôi cấy trên nhiều loại tế bào mà không cần có trypsin và các nghiên cứu về hệ gen đã cho thấy NA của WSN cần thiết cho sự phân tách HA của WSN [48, 49]

NA là glycoprotein thứ hai đặc hiệu cho phân týp của virút Cúm A, B

NA do đoạn gen ARN thứ 6 mã hóa NA là một homotetramer NA quan trọng do cả hoạt tính sinh học loại bỏ axit sialic từ glycoprotein và là quyết

định nguyên chính ảnh hưởng đến sự thay đổi tính kháng nguyên NA có thể cho phép vận chuyển virút qua màng mucin ở trên đường hô hấp, giúp hỗ trợ virút tấn công tế bào biểu mô đích Đoạn gen ARN 6 của A/PR/8/34 đoạn gen ARN 6 có 1413 nucleotit mã hóa cho 453 axit amin

Đoạn ARN thứ bẩy mã hóa cho 2 protein M1 và M2 Đoạn có 1027 nucleotit mã hóa cho M1 có 252 axit amin, trọng lượng phân tử 27.801 dalton [50, 51, 52] M1 là kháng nguyên đặc hiệu týp của virút Cúm và có tính ổn định giữa các phân týp [53] Protein M2 có hoạt động kênh trao đổi ion nhờ hoạt hóa pH Kênh này được chặn đặc hiệu bởi thuốc kháng virút Cúm amantadin Hoạt động của kênh ion cần thiết cho việc bỏ lớp ngoài của virút trong khoang nội bào của tế bào bị nhiễm Đột biến của vùng M2 liên quan đến việc kháng amantadin [54]

Đoạn ARN 8 của virút Cúm A, B và đoạn ARN 7 của virút Cúm C mã hóa cho 2 loại protein NS1 và NS2 NS1 protein có trọng lượng phân tử 26.000 dalton NS1 là protein đa chức năng trong chu trình sống của virút Cúm NS2 protein có trọng lượng phân tử 11.000 tồn tại trong virion (130-

200 phân tử) và tạo thành phức hợp với M1

1.4 Sự tái tổ hợp của virút Cúm

Virút Cúm A, B, C có thể tái tổ hợp trong tự nhiên giữa các thành viên cùng týp nhưng không xẩy ra giữa các týp khác nhau Sự xuất hiện của chủng đại dịch là hậu quả của việc tái tổ hợp tạo ra chủng phân týp mới có

NA hoặc HA khác hẳn với chủng lưu hành trước đó Trong thế kỷ 20 có sự xuất hiện của Cúm “Tây Ban Nha” năm 1918-1919 có HA liên quan đến chủng virút của lợn và phân týp H1 Virút này lưu hành đến năm 1957 cho

đến khi được thay thế bởi phân týp H2N2 (chủng châu á) Chủng H2N2 lưu hành trong 11 năm và được thay thế bởi phân týp H3 mới (chủng Hồng Kông) trong đại dịch tiếp theo năm 1968 [55] Năm 1976 chủng H1N1 lưu hành trở lại và năm 1997-1998 đã xuất hiện chủng Cúm gia cầm độc lực H5 lây truyền từ chim sang người tại Hồng Kông Sự đột biến trong gen HA và

NA có thể gây ra các thay đổi nhỏ về đặc tính kháng nguyên

Virút Cúm B khác với virút Cúm A là không có ổ chứa động vật Mặc

dù virút Cúm B nguyên thủy thích ứng trên người dễ dàng hơn virút Cúm A nhưng tỷ lệ đột biến và thay đổi chỉ bằng một nửa virút Cúm A [56, 57, 58]

Có nhiều bằng chứng cho rằng virút Cúm trong loài thủy cầm lây truyền cho lợn, ngựa, gia cầm và động vật có vú ở biển; gây nên những vụ dịch nghiêm trọng [59] Năm 1989 đã có một vụ dịch lớn xẩy ra trên đàn ngựa của tỉnh Jilin và Heilongjiang, Trung Quốc do virút Cúm H3N8 có cấu trúc kháng nguyên giống virút H3 của gia cầm Có những bằng chứng cho rằng các vụ đại dịch Cúm trên người ở thế kỷ này có nguồn gốc từ gia cầm

và lây truyền qua lợn sang người sau khi tái tổ hợp với chủng Cúm người

đang lưu hành

Cả hai chủng đại dịch Asian/57 (H2N2) và Hong Kong/68 (H3N2)

đều được tạo thành do tái tổ hợp Chủng đại dịch 1957 có 3 gen (PB1, HA và NA) từ hỗn hợp gen Cúm gia cầm do tái tổ hợp tạo thành trên vịt trời và giữ nguyên 5 gen khác từ chủng Cúm người đang lưu hành [60] Sau khi chủng Asian xuất hiện, chủng H1N1 biến mất trên người Năm 1968 chủng đại dịch Hồng Kông có 2 gen (PB1 và HA) từ vịt do tái tổ hợp và giữ 6 gen từ chủng Cúm người đang lưu hành

Virút Cúm gia cầm không lan truyền trên quần thể người và ngược lại, virút của người không lây truyền sang quần thể chim, điều này cho thấy hàng rào loài giữa chim và người rất chặt chẽ Tuy nhiên, nhiều bằng chứng cho thấy loài lợn có thể cảm nhiễm dễ dàng với cả hai loại virút Cúm người hoặc gia cầm [61, 62] và hàng rào loài giữa lợn và gia cầm hoặc giữa lợn và người lỏng lẻo hơn nhiều, vì vậy, lợn có thể đóng vai trò như là vật chủ trung gian

để tạo ra giống virút Cúm mới trên người [63, 64, 65] Virút Cúm H3N2 đã

được phân lập trên lợn ở khắp thế giới Những virút này có đặc tính kháng nguyên và gen giống như những chủng đã lưu hành trên người trước khi phân lập ở lợn [66] Năm 1992, hai chủng H1N1 đã được phân lập từ lợn ở phía Bắc Nhật Bản có chứa gen glycoprotein liên quan đến chủng H1N1 của người lưu hành giữa năm 1990-1992 [67] Sự tái tổ hợp của đoạn ARN virút trong khi nhiễm trùng kép với hai chủng Cúm người và gia cầm là cơ chế để tạo ra chủng mới Quần thể người không có kháng thể trung hòa với kháng nguyên bề mặt của virút mới tạo ra do đó không được bảo vệ Virút mới có thể lan truyền dễ dàng gây đại dịch Yếu tố nguy cơ cao lợn sống gần người

ở những vùng như Đông Nam á và có thể chia sẻ nguồn nước là giả thuyết tại sao đại dịch thường bắt nguồn từ những vùng này trong thời gian gần đây

áp lực chọn lọc ảnh hưởng đến sự biến đổi của virút Cúm giống như các virút khác Để đảm bảo khả năng tồn tại lâu dài, bất cứ virút nào cũng phải giữ khả năng lan truyền sang vật chủ mới để cạnh tranh với các virút khác Cấu trúc độc đáo và khả năng thích ứng của virút Cúm là cơ chế để tạo nên khả năng sống sót lâu dài hoặc ngắn trên các vật chủ khác nhau cũng như các trạng thái bệnh, hình thái lan truyền khác nhau

1.5 Sự phát triển của virút trên tế bào

Virút cúm đầu tiên được nuôi trên trứng gà có phôi Sau này, các virút cúm có thể được nuôi cấy trên trứng gà có phôi hoặc trong một số hệ nuôi cấy tế bào tiên phát Việc nuôi cấy virút trên trứng gà có phôi vẫn được lựa chọn làm quy trình sản xuất vắcxin cúm trên thế giới Hiện nay, các hệ nuôi cấy tế bào như thận khỉ tiên phát hay thận chó Madin-Darby (MDCK) thường được dùng để phân lập virút cúm từ mẫu bệnh phẩm của người Tế bào MDCK có độ nhậy 100% trong phân lập virút Cúm A trong khi đó độ nhậy của Vero chỉ là 71,4% và MRC-5 là 57,1% [68]

Sự phát triển của virút trên nuôi cấy tế bào gây ra sự huỷ hoại tế bào

và tạo các đám hoại tử trong một số dòng tế bào tiên phát như tế bào thận khỉ, thận bê, thận chuột đồng, thận gà Ngoài ra, nếu sử dụng các dòng tế bào thường trực thì trypsin phải được bổ sung để hoạt hoá các phân tử protein HA trong quá trình xâm nhập vào tế bào chủ của virút

1.6 Sinh bệnh học

Các nghiên cứu đã đưa ra những bằng chứng chứng minh rằng sinh bệnh học của virút cúm là tính trạng đa gen Điều này có nghĩa là sản phẩm

của tất cả các gen của virút đều tham gia vào quá trình nhận dạng tế bào vật chủ và gây độc tính trong quá trình xâm nhập phá vỡ tế bào Trong đó gen

HA đóng vai trò trung tâm về tính độc của virút gồm 2 phân týp H5, H7 có

độc tính mạnh nên gây tỷ lệ chết cao Protein HA của các virút này khác các

HA của các phân týp khác là có một trình tự nhiều axit amin ở đầu carboxyl

của HA1 (multiple basic amino acid) Điều này cho phép các enzyme

proteaza của tế bào nhận biết trình tự đó để cắt HA thành HA1 và HA2, là giai đoạn cần thiết cho virút xâm nhập tế bào và phát triển lan ra Đây cũng

là cơ sở giải thích tính gây độc của virút cúm ở người

1.7 Chẩn đoán virút Cúm

Chẩn đoán Cúm có ý nghĩa rất quan trọng trong y tế cộng đồng để kiểm soát dịch bệnh Có rất nhiều các thử nghiệm chẩn đoán khác nhau: Phát hiện kháng nguyên virút, axit nucleic virút, tế bào bị nhiễm virút hoặc hạt virút gây nhiễm trong dịch tiết đường tiêu hóa Virút Cúm có khả năng nhân lên trên nhiều dòng tế bào khác nhau như tế bào tiên phát, lưỡng bội và dòng

tế bào thường trực Sự phát triển nhanh chóng của chủng Cúm ngựa và Cúm gia cầm trên trứng phôi gà khi so sánh với nuôi cấy tế bào cho thấy trứng gà

có phôi là hệ thống được lựa chọn cho việc chẩn đoán virut Với việc sử dụng kháng thể đơn dòng, sự phát hiện virút trong nuôi cấy tế bào bằng phương pháp miễn dịch 1-3 ngày sau khi gây nhiễm và trước khi có xuất hiện CPE có ứng dụng rất lớn trong chẩn đoán sớm

Kỹ thuật ngưng kết hồng cầu và hấp phụ hồng cầu được sử dụng trong chẩn đoán virút Cúm từ hơn 60 năm nay Hồng cầu gà, người hoặc chuột lang đã được sử dụng cho kỹ thuật này Thử nghiệm ức chế ngưng kết hồng cầu dược sử dụng để định týp virút Cúm nhờ sử dụng kháng huyết thanh đặc hiệu trên chồn sương, cừu hoặc gà Miễn dịch huỳnh quang và thử nghiệm miễn dịch gắn men đã được sử dụng để để xác định trực tiếp virút Cúm trên mẫu bệnh phẩm hô hấp Thử nghiệm RT-PCR đã được sử dụng để phát hiện ARN của virút và định týp

quan đến hệ thần kinh trung ương, và gây chết chỉ trong vòng một tuần Đó

là các chủng thuộc phân týp H5 và H7 như A/FPV/Dutch (H7N7) và A/Tern/South Africa/1/61 (H5N3) Những vấn đề nghiêm trọng nhất liên quan đến các phân týp khác (từ H1 đến H15) là gây viêm phổi mạn tính ở gà tây Các nhà nghiên cứu cho rằng sự nhiễm virỳt cúm ở gà tây bắt nguồn từ chủng virỳt ở vịt di cư Sở dĩ gà nuôi bị nhiễm với tần suất thấp hơn nhiều là

do chúng được nuôi trong nhà Tuy nhiên, năm 1997, virỳt cúm H5N1 ở Hồng Kông đã gây ra tỷ lệ tử vong cao lây lan sang cả gia cầm và người

ở vịt, các virỳt cúm chủ yếu nhân lên ở phổi và các tế bào thuộc hệ tiêu hóa Bản chất độc lực của virỳt cúm gây nhiễm cho vịt có thể là kết quả quá trình thích ứng của virỳt với vật chủ này qua nhiều thế kỷ, tạo nên một

sự ổn định đảm bảo cho sự tồn tại của virỳt

Ngoài ra, virỳt cúm A còn được phân lập từ nhiều loài khác như lợn, ngựa, chó biển, cá voi Các nhà nghiên cứu đã sử dụng chuột, chồn sương và linh trưởng để thực hiện các nghiên cứu về cúm Trong đó chồn sương được chứng minh là loài rất mẫn cảm với tất cả virỳt cúm A, B và chồn sương

được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu về virỳt cúm Virỳt cúm A ở người lần đầu tiên được phân lập trên loài chồn sương Những con chồn sương mắc bệnh viêm mũi và sốt sau khi bị gây nhiễm bởi dịch họng của người có triệu chứng cúm

Đặc điểm dịch tễ của Cúm A và B giống nhau là đều gây tỷ lệ mắc và chết cao mặc dù Cúm B không gây đại dịch vì tính ổn định kháng nguyên Cúm A/H1N1 có mức độ dễ dàng lân truyền trong cộng đồng nhất rồi đến Cúm A/H3N2 và cuối cùng là Cúm B Tại vùng khí hậu Bắc và Nam, bệnh Cúm có xu hướng phát triển theo mùa, thường xẩy ra vào mùa lạnh nhất trong năm Một số yếu tố ảnh hưởng đến tính cảm nhiễm cũng đã được xác

định như tình trạng miễn dịch, bệnh mạn tính, tuổi, hút thuốc lá…

Đại dịch được mô tả như là vụ dịch có phạm vi lớn khắp thế giới với tỷ

lệ mắc và chết cao, là hậu quả của sự biến đổi kháng nguyên – sự thay thế của kháng nguyên haemaglutinin mới (có hoặc không kèm sự thay đổi kháng nguyên neuramidaza) tại một quần thể không có miễn dịch trước đó Đại dịch và sự biến đổi kháng nguyên là điều không thể dự đoán và không xẩy ra thường xuyên Đã có ít nhất 3 đại dịch xẩy ra vào năm 1918 (A/H1N1), 1957 (Cúm châu á A/H2N2) và 1968 (Cúm Hồng Kông A/H3N2)

Virỳt Cúm gia cầm có một vai trò đặc biệt quan trọng đối với người Virỳt Cúm gia cầm đầu tiên được phân lập vào năm 1902 nhưng vẫn chưa

được xếp loại trong họ virỳt Cúm A cho đến năm 1955 Virỳt Cúm gia cầm

và Cúm lợn đều gây nên các triệu chứng bệnh trên người bằng lây truyền trực tiếp Virỳt gây đại dịch 1918 có liên quan đến virỳt Cúm lợn Đoạn gen từ

virỳt Cúm người cũng được tìm thấy ở virỳt Cúm gia cầm, lợn và ngựa Các nghiên cứu về cấu trúc gen đã cho thấy chủng châu á 1957 và chủng đại dịch Hồng Kông 1968 được tạo thành do sắp xếp gen giữa virỳt Cúm người

và Cúm gia cầm [69, 70] Virỳt Cúm gia cầm nhân lên trong đường tiêu hóa,

có thể không gây biểu hiện bệnh nhưng đào thải với nồng độ cao trong phân Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng virỳt giữ nguyên tính gây nhiễm trong bệnh phẩm phân sau 30 ngày ở 4˚C và 7 ngày ở 20˚C

Virỳt Cúm gia cầm H5N1 lây truyền sang người năm 1997 có tất cả 8

đoạn gen từ nguồn virỳt Cúm gia cầm và giữ nguyên đặc tính gắn với thụ thể

α (2, 3) axit sialic [71] Virỳt H5N1 hiện đang lưu hành ở Châu á có cấu trúc gen tương tự như genotype Z, genotype phổ biến tại Hồng Kông năm 2003 nhưng đã có một số thay đổi cấu trúc kháng nguyên Nhiều bằng chứng đã cho thấy những ca bệnh do nhiễm virỳt Cúm H5N1 độc lực cao thường có biểu hiện nặng và tử vong Năm 1997, tiếp theo những vụ dịch H5N1 tại 3 trang trại gia cầm ở Hồng Kông, virỳt này đã được phân lập trên trẻ trai 3 tuổi bị chết do viêm phổi nặng, suy hô hấp cấp tính và hội chứng Reye [72] Cũng trong năm đó, dịch tiếp tục lan rộng ra trong đàn gà ở chợ và trang trại Hồng Kông, 17 ca bệnh trong đó có 5 tử vong đã được xác nhận tại Hồng Kông Kết quả giám sát Cúm trong gia cầm trong năm 2001 và 2002 tiếp theo đó đã báo hiệu vụ dịch khác sẽ xẩy ra Không có một ca bệnh nào được ghi nhận tiếp cho đến tháng 2 năm 2003 với sự xuất hiện của 3 ca bệnh trong một gia đình [73]

Dịch Cúm gia cầm độc lực cao H5N1 xuất hiện từ giữa tháng 12/2003

và lan rộng ra một số nước châu á [74] hiện nay đang là mối quan tâm lo ngại hàng đầu Chủng virỳt H5N1 được xác định là có khả năng lan truyền sang người từ năm 1997 và xuất hiện ở Việt Nam từ tháng 1/2004 Sự lây truyền trong loài chim làm tăng khả năng lây nhiễm trực tiếp sang người Nếu có càng nhiều ca bệnh trên người xẩy ra thì càng có nhiều nguy cơ nhiễm đồng thời chủng virỳt Cúm người và Cúm gia cầm trên người, dẫn đến nguy cơ tạo ra biến chủng mới có khă năng lây truyền dễ dàng từ người sang người

hai lý do: Thứ nhất, H5N1 là tác nhân gây bệnh trên gia cầm nhưng có khả năng truyền trực tiếp từ gia cầm sang người; thứ hai, virỳt cúm A/H5N1 gây bệnh với tỷ lệ tử vong rất cao trên người Tất cả những lý do đó làm cho virỳt cúm A/H5N1 trở nên đặc biệt nguy hiểm với nguy cơ xẩy ra đại dịch nghiêm trọng

Số các trường hợp nhiễm Cúm gia cầm týp A/H5N1 trên người đã được xác định tính đến thời điểm 23/2/2007 là 274 theo số liệu của WHO, trong

số đó có 167 ca tử vong Số mắc/số chết tại Việt Nam cho đến thời điểm báo cáo là 93/42

Đặc điểm dịch tễ học nhiễm virỳt Cúm A/H5N1 tại Việt Nam được thông báo với 3 đợt dịch:

(1) Đợt 1: Từ 26/12/2003 đến 10/3/ 2004, có 16 trường hợp tử vong trong 23 ca bệnh được xác định (Tỷ lệ tử vong (CFR) là 69,9%) (2) Đợt 2: Từ 19/7/2004 đến 26/8/2004, có 4 ca bệnh và tất cả đều tử vong (CFR 100%)

(3) Đợt 3: Từ 16/12/2004 đến nay, 21 trường hợp tử vong trong 64 ca bệnh được xác định (CFR 32,8%)

1.9 Kỹ thuật di truyền ngược

Virỳt Cúm A là virỳt ARN sợi âm nên cần phải phiên mã thành mARN trước khi protein virỳt tổng hợp Qúa trình phiên mã này được thực hiện nhờ polymeraza của virỳt - enzym chịu trách nhiệm cho cả sự sao chép của các đoạn ARN của virỳt Các kỹ thuật về gen đối với virỳt Cúm trở thành hiện thực lần đầu tiên với sự xử lý virỳt bằng chất gây đột biến như 5-fluorouracil hoặc nitrosoguanidin [75] Một phát hiện quan trọng đối với việc phát triển kỹ thuật cho phép tạo đột biến ở điểm đặc biệt trên gen của virỳt Cúm là ARN trần của virỳt sợi âm không có khả năng gây nhiễm khi được chuyển nhiễm vào tế bào chủ Tất cả các virỳt đều phải sử dụng bộ máy phiên mã của tế bào chủ để tổng hợp protein Do đó, virỳt cần phải trình diện thông tin hệ gen của chúng cùng một lúc với mARN khi ở trong tế bào chủ

Hệ gen của ARN virút sợi dương được trực tiếp nhận biết như là mARN và ADN virút có thể sử dụng enzyme tế bào để tạo thành mARN virỳt Do vậy, ARN trần hoặc ADN của virỳt này có khả năng lây nhiễm Tuy nhiên, đối với ARN sợi âm của virút, tế bào không cung cấp được enzyme có khả năng phiên mã ARN virỳt thành mARN ARN virỳt sợi âm được phiên mã nhờ polymeraza phụ thuộc ARN cung cấp bởi các virỳt đang xâm nhập, hơn nữa, ARN phải được capsit hóa với NP tạo thành dạng phức hợp RNP để có thể nhận biết và phiên mã nhờ polymeraza virỳt

Năm 1989, Palese và cộng sự [76] thiết lập hệ thống đầu tiên cho việc biến đổi các virỳt có hệ gen là ARN sợi đơn (-), mở ra một kỷ nguyên mới của nghiên cứu virỳt tái tổ hợp sử dụng các virỳt mang vARN bắt nguồn từ cADN Năm 1994, Hobom và đồng nghiệp đã sử dụng enzym ARN polymeraza I để tổng hợp ARN virỳt cúm bên trong tế bào, thiết lập một hệ thống khác cho việc tạo ARN virỳt cúm [77] Nghiên cứu này đã thúc đẩy

việc ứng dụng kỹ thuật di truyền ngược trong các nghiên cứu virỳt cúm Trong kỹ thuật di truyền ngược, các phân đoạn ARN của virỳt được tạo dòng cADN trong các plasmit có khả năng tổng hợp vARN và protein Vì vậy, các gen của virỳt có thể được làm biến đổi theo ý muốn (ví dụ như có thể loại bỏ phần gen liên quan tới độc tính trên gen HA của virỳt H5N1) Các plasmit mang các cADN được chuyển nhiễm vào tế bào Bên trong tế bào, vARN và protein của virỳt được tổng hợp [78] Sự lắp ráp các vARN và các protein virỳt dẫn đến sự hình thành virỳt mới bên trong tế bào Virỳt mới tái tổ hợp này có khả năng nhân lên và phát triển bình thường như một chủng virỳt

được phân lập và là chủng virỳt giảm độc lực

Trong những năm gần đây, kỹ thuật di truyền ngược trên cơ sở các plasmit đã được sử dụng để phát triển một cách hợp lý các chủng virỳt cúm sắp xếp lại có khả năng nhân lên mạnh Trong từng trường hợp, chủng 6:2

đã được tạo ra trong đó đoạn HA và NA của nhiều chủng virỳt hoang dại khác nhau bao gồm các chủng virỳt người và gia cầm H1N1, H3N2, H5N1

và H5N3 với 6 đoạn còn lại từ PR8 [79, 80, 81] Qui trình kỹ thuật di truyền ngược có sự tham gia của các tế bào động vật và trong quá trình phát triển các kỹ thuật này các loại tế bào 293T, hỗn dịch tế bào 293T/MDCK và tế bào Vero cũng đã được sử dụng [82] Tuy nhiên, các tế bào động vật sử dụng trong kỹ thuật di truyền ngược yêu cầu phải tuân theo qui định khi virỳt được tạo ra sẽ được sử dụng để phát triển một vắcxin sử dụng cho người Để phát triển một vắcxin cúm cho người, TCYTTG khuyến cáo không sử dụng tế bào 293T trong kỹ thuật di truyền ngược [83]

Những chủng giảm độc lực được tạo bởi kỹ thuật di truyền ngược có thể được sử dụng như là vắcxin sống để tạo kháng thể bảo vệ kháng lại virỳt hoang dại Những đặc tính khác nhau của virỳt Cúm mang lại khả năng có thể sử dụng như là một vectơ vắcxin tiện lợi Kháng thể kháng lại các phân týp khác nhau không có hoặc rất ít miễn dịch chéo do vậy kháng thể có sẵn

đối với vectơ trong vật chủ có thể bị phá hỏng Tiêm chủng nhắc lại có hiệu quả với các phân týp virỳt Cúm khác nhau sản xuất ra cùng một loại kháng nguyên có thể thực hiện được Virỳt Cúm tạo miễn dịch dịch thể, đáp ứng miễn dịch niêm mạc và miễn dịch tế bào mạnh Hơn nữa, virỳt Cúm là virỳt không gây ung thư Một phương pháp để biểu thị trình tự lạ bằng cách chuyển nhiễm virỳt Cúm là dựa vào phương pháp ghép các quyết định nguyên tại nhiều vị trí trong protein của virỳt Một vị trí đã được tìm thấy dung hòa kháng nguyên ngoại lai là vị trí kháng nguyên B của phân tử HA Virỳt Cúm phân týp H1 và H3 đã được sử dụng để biểu thị trình tự kháng nguyên ELDKWAS của HIV [84] Virỳt Cúm cũng được sử dụng như là

vectơ biểu thị kháng nguyên sốt rét và Pseudomonas aeruginosa [85, 86]

Chủng virỳt Cúm được tạo bởi kỹ thuật di truyền ngược còn được sử dụng để nghiên cứu chức năng virỳt

đánh giá hiệu lực của các vắcxin đó Nhiều loại tá chất khác nhau cũng đã

được nghiên cứu đánh giá nhưng chỉ có hydroxyt nhôm là được phép sử dụng trên người Những tá chất khác như Freund’s, dầu lạc, dầu chuyển hóa như A65 và Drakeol, muramyl dipeptit (MDP), liposome, iscom đều không đạt yêu cầu hoặc phản ứng quá mạnh Vắcxin sử dụng bằng đường mũi cũng đã

được nghiên cứu phát triển với việc sử dụng các chất tăng cường khả năng trình diện kháng nguyên với bề mặt niêm mạc như : Iscom, liposome

Vắcxin Cúm có hiệu quả bảo vệ 70-90% trên người trẻ tuổi mạnh khỏe nếu kháng nguyên vắcxin phù hợp với chủng virỳt Cúm đang lưu hành Tuy nhiên, hiệu quả phòng bệnh của vắcxin không cao đối với trẻ em và người già Với những giới hạn của vắcxin hiện có, đã có nhiều nghiên cứu phát triển những tá chất tốt hơn để tăng cường đáp ứng miễn dịch của vắcxin Cúm cũng như phát triển vắcxin sống giảm độc lực Một trong những bước tiến hứa hẹn là phát triển vắcxin sống giảm độc lực bằng thích ứng nhiệt độ lạnh

Đáp ứng kháng thể tại chỗ với sự nhân lên của virỳt, đặc biệt là IgA tiết tại chỗ khi sử dụng loại vắcxin này chính là cơ chế làm tăng hoạt tính vắcxin Tuy nhiên, mặc dù vắcxin này có hiệu quả ở trẻ em và người trẻ tuổi thì lại quá giảm độc lực để kích thích sinh kháng thể bảo vệ ở người già [87, 88, 89] Sự phát triển của kỹ thuật di truyền ngược sử dụng hệ thống chuyển nhiễm ribonucleoprotein (RNP) cho phép thay thế các gen của virỳt Cúm và tạo thành phân tử ARN tái tổ hợp in vitro Một số tá chất khác nhau cũng đã

được sử dụng để tăng cường khả năng đáp ứng miễn dịch của vắcxin Cúm như DHEA (dehydroepiandrosteron) cho thấy rằng có khả năng làm tăng đáp ứng miễn dịch dịch thể trên chuột già khi sử dụng cùng với vắcxin Cúm bất hoạt [90] MF59 có khả năng làm tăng đáp ứng miễn dịch với thành phần H3N2 và B trong vắcxin nhưng không có tác dụng với H1N1 [91, 92] QS21 làm tăng đáp ứng miễn dịch với H3N2 ban đầu và sau khi tiêm nhắc lại có thể làm tăng đáp ứng miễn dịch với B [93]

Vắcxin Cúm bất hoạt bằng formaldehyt hoặc vắcxin chứa glycoprotein

bề mặt tinh khiết được sản xuất trên trứng gà có phôi phải thay đổi chủng sản xuất hàng năm để đáp ứng với tính đa dạng của virỳt Chủng virỳt là một trong những thành phần quan trọng nhất của sản xuất vắcxin Cúm Chủng virỳt phải không có các yếu tố ngoại lai, có chứa thành phần HA và NA phù hợp với chủng gây dịch trong năm và phải có khả năng nhân lên tốt Hàng năm vào tháng Hai, WHO quyết định chủng sản xuất cho vắcxin Cúm trong mùa đông tiếp theo Tổ chức Y Tế Thế Giới (TCYTTG) đã xem xét 2 lần trong một năm tình hình dịch tễ về cúm trên toàn Thế Giới, khuyến cáo sử dụng các chủng virỳt cúm mới Theo khuyến cáo của TCYTTG thì thường xuyên cần thiết phải phát triển các chủng virỳt vắcxin chuẩn có các tính chất kháng nguyên của loại chủng mà TCYTTG khuyến cáo, xong phải có được một chủng có khả năng nhân lên tốt hơn để việc sản xuất vắcxin có hiệu quả Trong hơn 20 năm qua các kiểu virỳt cúm được điều chế bằng cách sắp xếp lại các kiểu gien có khả năng nhân lên mạnh cũng đã được điều chế bằng cách gây nhiễm trứng gà có phôi với chủng cúm hoang dại A/PR/8/34, một phòng thí nghiệm đã thích ứng được một chủng virỳt có thể nhân lên với hiệu giá cao trên trứng Mục đích là để nhân lên các chủng virỳt sắp xếp lại

có chứa 6 đoạn gien từ chủng virỳt A/PR/8/34 cộng với đoạn gen haemagglutinin (HA) và gen neuramidaza (NA) của một chủng hoang dại mới được khuyến cáo (6:2)

Bảng 2 Các vắcxin Cúm đã được đăng ký sử dụng trên thế giới

Tên thương mại Nơi sản xuất Năm đang ký Nước đăng ký

Tây âu Inflexal V Berna (Solvay) 1997, 2000 Italy, phần còn lại của châu âuFluvirin

Agrippal

Begrivac

Fluad

Fluviral Shire 2001 Canada

Tuy nhiên, việc sản xuất vắcxin phải mất 6 tháng và quá chậm để có thể ngăn chặn một vụ dịch Cúm chủng mới có tốc độ lây truyền nhanh Mặt

khác, một số chủng phân lập như chủng Hồng Kông 1997 khó có thể sản xuất trên trứng gà có phôi vì độc lực qúa mạnh và giết chết phôi trước khi

đạt hiệu giá cao Vắcxin Cúm sản xuất trên trứng gà có phôi có thể là vắcxin toàn tế bào hoặc tiểu đơn vị Tất cả các vắcxin Cúm thông thường đều chứa 15àg HA/chủng sản xuất/liều Đặc điểm của vắcxin tiểu đơn vị là virỳt Cúm sau khi tinh khiết bằng siêu ly tâm được xử lý bằng chất tẩy để phá vỡ màng lipit của virỳt Nhiều nghiên cứu cũng đã tiến hành phát triển vắcxin Cúm trên tế bào sử dụng các dòng tế bào như Vero, BHK-21, MDCK MDCK là dòng tế bào thích hợp với virỳt Cúm có thể sử dụng để nhân virỳt lên với hiệu giá cao đến 2000 đơn vị HA trong một thời gian ngắn

Kháng nguyên HA cũng đã được sản xuất nhờ biểu thị bằng baculovirus tái tổ hợp trên tế bào côn trùng Phương pháp này có nhiều ưu

điểm giống như nuôi cấy trên tế bào là không phải sử dụng một số lượng lớn trứng gà Tuy nhiên, để sản xuất được protein HA và NA của 3 chủng Cúm phải cần tới 6 hệ thống biểu thị khác nhau

Vắcxin sống đã được sử dụng ở Cộng hòa liên bang Nga và đã được nghiên cứu thực nghiệm ở châu âu và Mỹ Tuy nhiên, vắcxin này không

được sử dụng rộng rãi như vắcxin bất hoạt

Trên người trưởng thành, virỳt toàn tế bào và tiểu đơn vị có hiệu quả gây miễn dịch như nhau Tuy nhiên, có một số nghiên cứu cho rằng vắcxin toàn tế bào có tính miễn dịch cao hơn vắcxin tiểu đơn vị Hàng triệu liều vắcxin Cúm được sử dụng hàng năm và có rất ít thông báo xuất hiện phản ứng phụ Phản ứng phụ thường gặp chỉ là những biểu hiện tại chỗ Nhiều nghiên cứu đã khẳng định rằng vắcxin bất hoạt tạo ra đáp ứng miễn dịch tại chỗ và toàn thân nhanh chóng với gần 90% hoặc cao hơn có kháng thể bảo

vệ (≥1/40) trong vòng 2 tuần sau tiêm Vắcxin Cúm thông thường đã có hiệu quả rõ ràng trong việc phòng chống bệnh Cúm cho quần thể cả người trẻ tuổi

và người già

Ngược lại, thuốc kháng virỳt có tác dụng nhanh hơn để ngăn chặn dịch Cúm vì virỳt có thể được xác định sớm bằng các thử nghiệm nhanh Amantadin và Rimantadin được sử dụng rộng rãi từ nhiều năm nay Amantadin chỉ có tác dụng với virỳt Cúm A vì vị trí tác động là protein M2 Tuy nhiên, một số chủng virỳt đột biến có khả năng kháng thuốc và tác dụng phụ của thuốc là hạn chế lớn nhất khi sử dụng thuốc kháng virỳt Một số thuốc kháng virỳt khác cũng được sử dụng để ức chế NA Amantadin không

độc với tế bào ở nồng độ tối đa 25 àg/ml trong khi độc tính có thể xuất hiện

ở nồng độ 100 àg/ml Rimantadin có thể gây độc nhẹ đối với tế bào ở nồng

độ 24 àg/ml Tất cả các chủng virỳt Cúm A nhậy cảm đều bị ức chế bởi một

lượng Rimantadin và Amantadin nhỏ hơn 1 àg/ml trong thử nghiệm giảm

đám hoại tử Amantadin và Rimantadin đều ức chế hoạt động của protein M2 Có giả thuyết cho rằng các thuốc này ức chế hoạt hóa axit của kênh trao

đổi ion M2 mà thông thường có tác dụng làm ly giải protein matrix M1 từ phức hợp ribonucleoprotein (cởi áo), do đó việc vận chuyển phức hợp đó tới nhân để phiên mã, dịch mã và lắp ráp không thể xẩy ra Trình tự chuỗi ARN của nhiều chủng kháng Amantadin và Rimantadin cho thấy có sự thay đổi axit amin ở protein tại các vị trí 26, 27, 30, 31 hoặc 34 [94] Có nghiên cứu cho rằng đó là kết quả của sự chuyển đoạn gen ARN 7 mã hóa cho protein M (M1 và M2) từ chủng kháng sang chủng nhậy cảm trong lúc nhiễm đồng thời dẫn đến kết quả chuyển dịch kiểu hình kháng thuốc [95]

Chủng virỳt cúm H5N1 có độc lực quá mạnh và gây nên tỷ lệ tử vong cao Do đó không thể sử dụng chủng H5N1 phân lập để làm chủng sản xuất vắcxin vì tính chất rất nguy hiểm Việc cần thiết là phải tạo được chủng virỳt H5N1 giảm độc lực để dùng làm chủng sản xuất vắcxin Sự ra đời của kỹ thuật di truyền ngược cho phép tạo chủng virỳt tái tổ hợp từ cADN tạo dòng của các vARN trong thời gian vài ngày Kỹ thuật này có thể được ứng dụng

để tạo chủng virỳt tái tổ hợp giảm độc lực (như chủng H5N1) trong thời gian ngắn, có hiệu quả và đáp ứng kịp thời cho vụ dịch cúm mới

Hiện nay trên thế giới cũng đã rất nhiều nước như Mỹ (Chiron), Pháp (Aventis), Nhật Bản ,Trung Quốc , Hungaria cũng đã có nhiều nỗ lực và sử dụng công nghệ di truyền ngược để nghiên cứu phát triển một vắcxin phòng cúm gia cầm H5N1 và cũng đang ở những giai đoạn khác nhau của quá trình nghiên cứu Các hướng công nghệ đang được các nhà sản xuất lựa chọn hiện nay bao gồm : 1/ Từ trứng gà có phôi SPF (Specific Pathogen Free) ; 2/ Trên

tế bào (MDCK); 3/ Sống giảm độc lực và 4/ Trên Vero (dùng chủng độc lực hoang dại)

` Hiện nay Mỹ, Hungari, Sanofi Pasteur đã tiến hành nghiên cứu thành công bước đầu trên thử nghiệm lâm sàng, Trung Quốc cũng đã bắt đầu Thử nghiệm lâm sàng vắcxin Cúm H5N1 (Sanofi –Pasteur) sản xuất trên trứng phôi gà sử dụng chủng di truyền ngược từ chủng hoang dại A/Vietnam/1203/04 cho thấy vắcxin đảm bảo an toàn nhưng đáp ứng miễn dịch chưa đạt yêu cầu Đáp ứng miễn dịch sau khi tiêm 2 liều hàm lượng 7,5àg; 15àg; 45àg; hoặc 90àg HA/ml chỉ đạt 11%; 4% ; 48% ; và 67% [96] Thử nghiệm lâm sàng giai đoạn I vắcxin Cúm H5N1 chủng NIBRG 14 sản xuất trên trứng phôi gà tại Pháp trên 300 người tình nguyện tuổi từ 18-40 cho thấy liều 30àg HA/ml có hấp phụ nhôm cho tỷ lệ đáp ứng miễn dịch cao nhất (67% đáp ứng sau 2 mũi tiêm) [97] Thử nghiệm lâm sàng vắcxin toàn

tế bào H5N1 hấp phụ nhôm ở Hungari cho thấy một liều đơn 30àg HA/ml có

thể tạo ra 90 % đáp ứng miễn dịch Các thử nghiệm vắcxin H5N1 chủng di truyền ngược có hấp phụ nhôm đang được tiến hành ở Australia Một thử nghiệm lâm sàng gần đây nhất của Sanofi Pasteur cho thấy với liều tiêm là 3,25àg HA/ml cũng đã cho đáp ứng miễn dịch đủ bảo vệ ở những đối tượng

được tiêm Tuy nhiên vẫn chưa có một vắcxin cúm H5N1 nào đã được cấp chứng chỉ lưu hành

1.11 Một số quy trình sản xuất vắcxin Cúm

Vắcxin virut toàn phần

Chủng sản xuất được nuôi cấy trên trứng gà có phôi với nhiệt độ dao động

từ 35-37˚C tùy từng chủng, sau đó được làm lạnh ở 4˚C và gặt nước niệu đệm

từ những phôi còn sống Nhiều nhà sản xuất bất hoạt virút sau khi ly tâm nhưng cũng có một số quy trình bất hoạt virút ở bước cuối cùng Hóa chất bất hoạt thường sử dụng là formaldehyt và β-propiolactone Tiếp theo virút

được tinh khiết bằng sắc ký cột hoặc siêu ly tâm phân vùng

Vắcxin phân tách (split vaccine)

Tiếp theo quá trình tinh khiết như trên, virút được xử lý bằng chất tẩy hoặc dung môi như diethyl ether, Tween 80, Triton X100 và ammonium deoxycholate để phá vỡ màng lipit Một số quy trình tiếp tục các bước loại

bỏ chất tẩy bằng cách siêu ly tâm, phân tách phase, thẩm tích…

Vắcxin tiểu đơn vị

Quy trình sản xuất sử dụng chất tẩy như SDS, Triton N101, enzym bromelain để phân tách hai thành phần kháng nguyên HA và NA Virút tinh khiết bằng siêu ly tâm phân vùng trong sucrose được tiếp tục chạy qua lớp gradient sucrose khác có chứa Triton N101 để phân tách HA và NA

Vắcxin bất hoạt sản xuất trên tế bào

Hầu hết các vắcxin Cúm thông thường đều sản xuất trên trứng gà có phôi Tuy nhiên, đã có một số nghiên cứu phát triển vắcxin trên các dòng tế bào Vero, BHK-21 và MDCK Các quy trình này đều cố gắng phát triển vắcxin tế bào sử dụng công nghệ nuôi cấy trên micro carrier

Vắcxin tái tổ hợp

HA của virút Cúm được biểu thị trên tế bào côn trùng bằng baculovirut tái

tổ hợp Toàn bộ clon cDNA của đoạn gen HA được cài đặt vào hệ thống đó

và HA tái tổ hợp được tinh khiết trong điều kiện không biến tính cho 95%

độ tinh khiết

Vắcxin sống giảm độc lực

Vắcxin sống cũng được sản xuất trên trứng gà có phôi giống như vắcxin bất hoạt Điểm khác biệt chủ yếu là vắcxin này không được bất hoạt do vậy cần đảm bảo không có các yếu tố ngoại lai Điều lưu ý là vắcxin này không cần phải có độ tinh khiết cao vì sử dụng theo đường mũi nhưng thử nghiệm

an toàn phải xác định không có các yếu tố ngoại lai Vắcxin này thường ở dạng đông khô để tăng tính ổn định Vắcxin giảm độc lực thích ứng lạnh cũng đã được FDA, Mỹ cho phép lưu hành Virút Cúm được giảm độc lực bằng cách cấy truyền trên tế bào (tế bào thận gà) và trên trứng gà có phôi ở nhiệt độ 25˚C

Vắcxin Cúm A/H5N1

Các nhà sản xuất cũng sử dụng hầu hết các công nghệ truyền thống như quy trinh sản xuất vắcxin Cúm thông thường để phát triển vắcxin Cúm A/H5N1 Tuy nhiên, một số quy trình nghiên cứu đã thêm chất hấp phụ như nhôm hydroxyt hoặc MF59, liposome, độc tố E.coli dễ bị phá hủy bởi nhiệt vào vắcxin để tăng đáp ứng miễn dịch

loạt vắcxin Tế bào PMKc được sản xuất từ nguồn khỉ Maccaca

mulatta không bị nhiễm virỳt ngoại lai: SIV, SV40, SFV, herpesvirus simiae (virỳt B), M tuberculosis Tế bào được nuôi cấy trong môi

trường LHE (Lactalbumin Hydrolysate Eagle) 10% huyết thanh bò

2.1.2 Virỳt

2.1.2.1 Virỳt gốc

Virỳt cúm A/H5N1 chủng A/Vietnam/1194/2004 đã được phân lập từ một trường hợp bệnh nhân nhiễm virỳt cúm ở Hà Nam, Việt Nam Việc phân lập virỳt mang độc tính cao đã được tiến hành tại phòng thí nghiệm

an toàn sinh học cấp độ 3, Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương, Hà Nội Hai

đoạn gen HA và NA của chủng virỳt gốc này được sử dụng trong việc tạo thành virỳt tái tổ hợp

2.1.2.2 Virỳt Cúm chuẩn NIBRG-14

Chủng virỳt Cúm NIBRG-14 do Viện mẫu chuẩn quốc gia, Anh NIBSC (National Institute for Biological Standards and Control) cung cấp Chủng này đã được phục hồi trên tế bào Vero và được cấy truyền hai lần

trên trứng gà có phôi Hiệu giá chủng là 109,3 EID50/ml, hiệu giá HA là

1280

2.1.3 Kháng nguyên chuẩn A/Vietnam/1203/2004 (H5N1)

Kháng nguyên chuẩn A/ Vietnam/1203/2004 của Sanofi Pasteur có hàm lượng HA 152 àg/ml được sử dụng cho thử nghiệm SRID

2.1.4 ADN plasmit

Các plasmit mang cADN của các virỳt cúm A/PR/8/34, A/WSN/33 và A/Vietnam/1194/2004 do GS Yoshihiro Kawaoka, Đại học Tổng hợp Tokyo, Nhật Bản cung cấp Trong đó 6 plasmit pPolI-PR8-PA, -PB1, -

A/PR/8/34/; 2 plasmit pPolI-VN-1194-HA, pPolI-VN-1194-NA tương ứng mang gen HA và NA của virỳt A/Vietnam/1194/2004; 7 plasmit trợ

gen của virỳt A/WSN/33 mã hoá các protein PA, PB1, PB2, NP, M1, M2, NS2 và 2 plasmit trợ giúp khác pCAGGS-VN-1194-HA, pCAGGS-VN-1194-NA mang các gen của A/Vietnam/1194/2004 mã hoá 2 protein haemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA)

Các ADN plasmit này được biến nạp vào tế bào vi khuẩn E coli DH5α

để khuếch đại và sau đó được tinh sạch bằng kit Marligen Midiprep (QIAGEN)

Để loại bỏ phần gen liên quan tới độc tính của virỳt tại vị trí cắt HA thành HA1 và HA2 trên gen HA của virỳt gốc, plasmit pPolI-VN-1194-

HA được tạo đột biến với cặp mồi chứa một trình tự ADN đã được biến

đổi tại vị trí cắt nói trên Trình tự các axit amin (polybasic amino acid) PQRERRRKKR/GL tại vị trí phân tách HA1-HA2 của virỳt gốc được biến đổi thành PQRETR/GL Cặp mồi này cũng mang các trình tự nhận

biết của enzym giới hạn BsmBI Vì vậy sản phẩm PCR sẽ được kết vòng

lại thành plasmit mang gen HA đột biến bằng kỹ thuật cắt và nối tại vị trí

đặc hiệu của 1 enzym giới hạn Sau đó plasmit mang gen H5-HA không

độc này cũng được biến nạp vào tế bào vi khuẩn E coli DH5α để khuếch

đại và được tinh sạch bằng kit Marligen Midiprep

2.1.5 Vật liệu và trang thiết bị khác

xuất Vắcxin và Sinh phẩm y tế cung cấp)

- Trypsin đã xử lý bằng TPCK (Sigma)

- Phiến nuôi tế bào 24, 96 giếng (Corning)

- Tủ ấm nuôi cấy tế bào (Memmert)

- Máy ly tâm lạnh Hitachi

- Hệ thống tinh khiết cô đặc Millipore, màng NMWL 10 000

- Hệ thống siêu lọc Millipore

2.2 Phương pháp

2.2.1 Phương pháp tạo virỳt tái tổ hợp

Kỹ thuật di truyền ngược (reverse genetics) được áp dụng để tạo chủng sản xuất giảm độc lực H5N1 Tổng số 17 plasmit được chuyển

(Mirus, Madison, WI) Sau 48 giờ virỳt tái tổ hợp hình thành được cấy chuyển sang chai tế bào PMKc khác Chủng virỳt này (rgA/H5N1) được kiểm tra độc lực nhằm xác định tính an toàn để sử dụng làm chủng nghiên cứu sản xuất vắcxin cúm A/H5N1 Chủng virỳt rgA/H5N1 được cấy chuyển trên PMKc với nồng độ 0,01 pfu/tế bào cho đến khi đạt được

rgA/H5N1 được dùng để sản xuất chủng giống gốc và chủng sản xuất vắcxin Cúm A/H5N1

2.2.2 Sản xuất chủng giống gốc và chủng sản xuất vắcxin Cúm A/H5N1

Để sản xuất chủng giống gốc MSV (Master Seed Virus), chủng virỳt rgA/H5N1 được gây nhiễm với liều 0,01 pfu/tế bào trên tế bào thận khỉ

Để sản xuất chủng sản xuất Working Seed Virus (WSV), chủng MSV

được gây nhiễm với liều 0,01 pfu/tế bào trên tế bào thận khỉ tiên phát Sau