Nghiên cứu sản xuất bộ sinh phẩm để chẩn đoán nhanh bệnh sốt dengue sốt xuất huyết dengue và bệnh viêm đường hô hấp cấp ( SARS ) ở việt nam

Bàn luận 1 Một phương pháp chẩn đoán sớm trong phòng thí nghiệm có hiệu quả 226 2 Trong giai đoạn đầu của dịch SARS, một số phương pháp ELISA được giới thiệu 234 3 Bộ sinh phẩm MA

Bộ Khoa học và Công nghệ

Chương trình KC- 04

Báo cáo tổng kết khoa học và kỹ thuật Đề tài cấp nhà nước

Đề tài: KC 04 - 32

Nghiên cứu sản xuất Bộ sinh phẩm để chẩn đoán nhanh bệnh sốt Dengue/ sốt xuất huyết Dengue và bệnh Viêm đường hô

hấp cấp (SARS) ở Việt Nam

Nh÷ng ch÷ viÕt t¾t trong b¸o c¸o

☯

Trung t©m c¸c bÖnh nhiÔm trïng

Trung t©m kiÓm so¸t bÖnh tËt

Thö nghiÖm miÔn dÞch men

Kü thuËt miÔn dÞch enzym ph¸t hiÖn IgG

Kü thuËt miÔn dÞch huúnh quang gi¸n tiÕp

Kü thuËt miÔn dÞch huúnh quang trùc tiÕp

Kü thuËt miÔn dÞch huúnh quang gi¸n tiÕp MAC -

ELISA

IgM Capture ELISA

Kü thuËt miÔn dÞch enzym ph¸t hiÖn IgM

Phản ứng dao chép ngược khuếch đại chuỗi

Hội chứng viêm đường hô hấp cấp tính

SARS-CoV Severe Acute Respiratory Syndrome associated Corona

virus Virus Corona gây bệnh SARS

Tæng quan tµi liÖu

A Nghiªn cøu virus Dengue g©y nªn bÖnh Sèt Dengue/ Sèt xuÊt huyÕt Dengue ë ViÖt Nam

1.1 BÖnh sèt Dengue vµ sèt xuÊt huyÕt Dengue 5 1.1.1 BiÓu hiÖn l©m sµng

1.2.1 §Æc ®iÓm h×nh th¸i vµ cÊu tróc 13

1.2.3 Chu tr×nh nh©n lªn vµ c¬ chÕ g©y bÖnh cña virus Dengue 15

B nghiªn cøu virus corona g©y bÖnh viªm ®−êng

h« hÊp cÊp SARS ë ViÖt Nam

1.1 T×nh h×nh nghiªn cøu trªn thÕ giíi 26

Ch−¬ng II

§èi t−îng vµ ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu

2.3.2 Phương pháp sản xuất kháng huyết thanh 58

2.3.4 Kỹ thuật trung hoà (Neutralization Test - NT) 59 2.3.5 Phương pháp miễn dịch hấp phụ liên kết men

phát hiện KT IgG (GAC- ELISA)

2.4.3 Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp

(Direct ImmunoFluorescent Antibody Assay – DFA)

64

2.4.4 Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang gián tiếp

(Indirect ImmunoFluorescent AntibodyAssay – IFA)

65

2.4.5 Kỹ thuật Trung hoà giảm đám hoại tử

( Plaque Reduction Neutralization Test - PRNT )

66

2.4.6 Phương pháp tổng hợp dây chuyền chuỗi nhờ polymerase

(RT-PCR - Polymerase Chain Reaction)

2.3.4 Phương pháp hấp phụ miễn dịch liên kết enzyme tóm bắt

kháng thể IgM (MAC- ELISA)

3.1 Nuôi cấy virus Dengue type I (D1), virus Dengue type II (D2), virus

Dengue type III (D3) và virus Dengue type IV (D4) trên tế bào muỗi

Aedes albopictus dòng C6/36

82

3.1.1 Nhân virus Dengue type I (D1), virus Dengue type II (D2), virus

Dengue type III (D3) và virus Dengue type IV (D4) vào tế bào muỗi

Aedes albopictus dòng C6/36 để tách chiết ARN

82

3.1.2 Quan sát sự nhân lên của virus Dengue trong tế bào muỗi Aedes

albopictus dòng C6/ 36 dưới kính hiển vi điện tử

100

3.2 Nghiên cứu qui trình công nghệ biểu hiện, tách chiết, tinh chế kháng

nguyên Dengue tái tổ hợp các type

106

3.2.3 Quy trình tách chiết và tinh chế kháng nguyên tái tổ hợp của virus

dengue từ chủng E coli cho cả bốn typ virus dengue

3.3.3 Biểu hiện kháng nguyên màng và vỏ của virus Dengue type 1, 2, 3, 4

trong hệ nấm men Pichia pastoris

148

3.3.4 Biểu hiện gen mã hoá kháng nguyên preM-E (gen preM-env) trong

Pichia pastoris

163

3.3.5 Kiểm tra phản ứng của kháng nguyên DxME tái tổ hợp với kháng thể

kháng virus Dengue tự nhiên bằng Western Blot

167

3.4 Thiết kế cặp mồi và xây dựng kế họach tách dòng gen mã hóa kháng

nguyên vỏ của virus Dengue các type I, II, III, IV

168

3.5 Chế tạo cộng hợp (Gold monoclonal antibodies) gắn kháng nguyên vào

giá thể (màng thấm Nitrocellulo membrane)

173

3.6 Nghiên cứu dung dịch đệm buffer tối ưu

dùng trong phản ứng

179

3.8 Thử nghiệm Bộ sinh phẩm trong phòng thí nghiệm 198 3.8.1 Thường qui sử dụng Bộ sinh phẩm chẩn đóan nhanh bệnh sốt Dengue/

sốt xuất huyết Dengue

200

3.8.2 So sánh kết quả thử nghiệm trong phòng thí nghiệm 204 3.9 ứng dụng Bộ sinh phẩm trong thực địa 210 3.9.1 Kết quả kiêm tra tại phòng thí nghiệm Sốt xuất huyêt Arbovirus, Viện

Vệ sinh Dịch tễ Trung ương

210

3.9.2 Giá thành và chất lượng Bộ sinh phẩm chẩn đóan nhanh bệnh sốt

Dengue/ sốt xuất huyết Dengue

211

3.9.3 Một số hình ảnh khi tiến hành thí nghiệm tại các điểm nghiên cứu 213

B Kết quả sản xuất Bộ sinh phẩm chẩn đoán nhanh

bệnh viêm đường hô hấp cấp (SARS)

3.1 Kháng nguyên tái tổ hợp protein N - SARS-CoV 217 3.2 Xác định các thông số cơ bản cho bộ sinh phẩm MAC-ELISA chẩn

đoán nhiễm virus SARS-CoV

viên y tế có tiếp xúc trực tiếp với bệnh nhân SARS

Bàn luận

1 Một phương pháp chẩn đoán sớm trong phòng thí nghiệm có hiệu quả 226

2 Trong giai đoạn đầu của dịch SARS, một số phương pháp ELISA được

giới thiệu

234

3 Bộ sinh phẩm MAC- ELISA phát hiện sớm nhiễm virus SARS 236

4 Toàn bộ bệnh nhân được xác định nhiễm virus SARS-CoV trên lâm

sàng đã được khẳng định lại khi phát hiện được kháng thể IgM kháng

đặc hiệu virus SARS –CoV thông qua phương pháp MAC-ELISA

239

5 Sự xuất hiện của KT kháng đặc hiệu virus SARS-CoV trên một số

người không có biểu hiện lâm sàng

239

Đặt vấn đề

Trong vòng 15 năm gần đây, nhiều dịch bệnh nguy hiểm ở qui mô khu vực cũng như toàn cầu đã xảy ra và lần đầu tiên gây ảnh hưởng lớn đến nền kinh tế thế giới Tất cả các bệnh dịch nguy hiểm này (như dịch hạnh ấn Độ vào năm 1994, dịch cúm gia cầm tại Hồng Kông 1997, dịch viêm não Nipah tại Malaysia, dịch SARS hay hội chứng hô hấp cấp tính ở Trung Quốc từ năm 2002 đến 2003, và cúm gia cầm ở vùng Đông Nam á từ năm 2003 đến2007)… đều có mầm bệnh

từ động vật và phát sinh tại á Châu và dần dà lây lan làm ảnh hưởng đến nền kinh tế thế giới Với tiến trình toàn cầu hoá hiện nay, chúng tôi thiết nghĩ trong tương lai sẽ xảy ra nhiều dịch bệnh ở tầm mức tương tự Hơn nữa, do các yếu tố xã hội, văn hoá và nhân khẩu ở Châu á… có lẽ vẫn là nơi tiếp tục xuất hiện các dịch bệnh bắt nguồn từ động vật… Việc phát hiện ổ dịch trong chương trình

“chiến lược dự phòng sớm” tại á châu sẽ giúp chúng ta chủ động phát hiện và ngăn chặn kịp thời các bệnh dịch đã biết đến cũng như các bệnh dịch mới phát sinh Trong các bệnh dịch mới gần đây, nổi lên có dịch SD/ SXHD và Viêm

đường hô hấp cấp SARS

Sốt Dengue/ sốt xuất huyết Dengue (SD/ SXHD) là một bệnh nhiễm trùng cấp tính do virus Dengue gây ra Bệnh không có vacxin và thuốc điều trị Biểu hiện lâm sàng của SD/ SXHD rất đa dạng từ sốt cao đột ngột kéo dài 2-7 ngày kèm theo triệu chứng đau đầu, đau cơ, đau xương, đau khớp, đau bụng cho tới buồn nôn, phát ban Sau đó có thể có biểu hiện xuất huyết dưới da, xuất huyết nội tạng (chảy máu cam, chảy máu lợi, nôn ra máu, đi ngoài ra máu ) Ngoài ra còn có thể có thêm các dấu hiệu khác như gan to, sốc, huyết áp hạ và có thể dẫn tới tử vong (Barnes W J S và Rosen L., 1974) Bệnh SD/ SXHD là bệnh do

muỗi (Aedes aegypti, Aedes albopictus) [33] truyền vì vậy bệnh thường dễ dàng

phát triển thành dịch Virus Dengue được Sabin phân lập đầu tiên ở Calcuta, ấn

độ, New-Guinea và Hawaii (Sabin A và cs, 1952) Sau này được xác định là virus Dengue type 1-Hawaii và virus Dengue type 2-New-Guinea Các type virus Dengue 3 và virus Dengue 4 được Hammon W.M và cs phân lập ở Philippines vào năm 1956 (Hammon W.M và cs 1960) Tiếp đó nhiều chủng virus Dengue

đã được phân lập từ nhiều vùng khác nhau trên thế giới nhưng đều được xác định

là thuộc 4 type huyết thanh nêu trên (Anonymous, 1986)

Tới năm 1997 bệnh SD/ SXHD đã lan rộng trên phạm vi toàn thế giới Theo Gubler, D.J (1997) thì hiện nay có tới hơn 2,5 tỷ người đang sống trong khu vực

có lưu hành SD/ SXHD và hàng năm có khoảng 100 triệu người mắc bệnh này

Để có thể phòng chống bệnh một cách hiệu quả thì việc chủ động giám sát huyết thanh học, dịch tễ học, côn trùng học virus Dengue gây nên bệnh sốt Dengue/sốt xuất huyết Dengue là hết sức cần thiết

Các phương pháp chủ yếu chẩn đoán huyết thanh học của virus Dengue bao gồm: Phản ứng Ngăn ngưng kết hồng cầu (HI), phản ứng kết hợp bổ thể (CF), phản ứng trung hòa giảm đám hoại tử (PRNT), phản ứng miễn dịch hấp phụ gắn enzym phát hiện kháng thể IgM (MAC-ELISA) và phản ứng miễn dịch hấp phụ gắn enzym phát hiện kháng thể IgG (GAC-ELISA), kỹ thuật RT- PCR

Ngoài bệnh SD/ SXHD, Hội chứng viêm đường hô hấp cấp tính nặng (SARS) là một bệnh dịch mới xuất hiện trên phạm vi toàn cầu SARS đã xuất hiện tại 23 Quốc gia: Trung Quốc, Hồng Kông, Singapore, Canada, Hoa Kỳ, Việt Nam, Malaysia, Thái Land… Tính đến tháng 04 năm 2004 trên toàn thế giới đã có tổng số mắc/ tổng số chết là: 3169/ 144 người (Theo Tổ chức Y tế Thế giới- WHO) [39]

Tác nhân gây bệnh SARS là một biến thể họ Corona (Coronaviridae); Một

cũng cần chú ý tới một số loại vi khuẩn, virus cơ hội thường xuyên có mặt ở

đường hô hấp của người; Có thể góp phần gây ra các bội nhiễm đường hô hấp dưới và viêm phổi không điển hình trên bệnh nhân SARS

Virus này có sức đề kháng yếu, tồn tại với động lực lớn trong không khí mát lạnh khoảng 2- 5 giờ Virus SARS nhạy cảm với nhiệt độ cao, tia cực tím, các hoá chất khử trùng…

Nguồn bệnh và ổ chứa virus SARS: Chưa biết rõ ràng Người có thể là nguồn bệnh chính trong chuỗi mắt xích lây truyền Người- Người Người bệnh SARS, nhất là bệnh nhân nặng đang trong giai đoạn khởi phát và toàn phát là nguồn truyền nhiễm nguy hiểm Theo qui luật chung của các bệnh do virus thì SARS

có thể thải mầm bệnh từ 5 đến 15 ngày sau khởi phát Thời gian ủ bệnh trung bình 7 ngày; Một số trường hợp có thể kéo dài tới 14- 15 ngày [32]

Triệu chứng: Hắt hơi, chảy nước mũi, ngạt mũi, ho, đau họng hoặc khó thở…Có thể dẫn đến biến chứng như: Nhiễm khuẩn huyết, viêm màng não do bội nhiễm

vi khuẩn…

Để chẩn đoán bệnh này, người ta thường:

Phát hiện trực tiếp virus hoặc kháng nguyên virus Có thể có kết quả trong vài giờ nếu bệnh phẩm lấy tốt; Rồi tiến hành các kỹ thuật:

- Miễn dịch huỳnh quang gián tiếp là phương pháp nhạy cảm để phát hiện virus trong mẫu bệnh phẩm lâm sàng và nuôi cấy tế bào Tỷ lệ dương tính là 30%

- Các phương pháp khác: Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) dùng trong nghiên cứu Kỹ thuật này khá chính xác nhưng đòi hỏi các trang bị kỹ thuật đắt tiền cũng như tay nghề của cán bộ kỹ thuật

Việc phát hiện nhanh virus Dengue gây bệnh SD/ SXHD hay bệnh Viêm đường hô hấp cấp SARS sẽ giúp cho các bác sỹ lâm sàng có hướng điều trị thích hợp và

Chương I

Tổng quan tài liệu

A Nghiên cứu virus dengue gây bệnh Sốt Dengue/ Sốt xuất huyết Dengue ở Việt Nam

1.1 Bệnh sốt Dengue và sốt xuất huyết Dengue

1.1.1 Biểu hiện lâm sàng

Sốt Dengue/ Sốt xuất huyết Dengue được chia thành nhiều cấp độ khác nhau tuỳ theo mức độ nặng của bệnh mà bệnh nhân có những biểu hiện như: sốt cao từ

38 0C đến 40 0C, thời gian kéo dài 2-7 ngày kèm theo các triệu chứng đau đầu,

đau cơ, buồn nôn, phát ban, có thể kèm theo rét tuy không thành cơn, choáng váng, chóng mặt, xuất huyết dưới da, xuất huyết niêm mạc, xuất huyết phủ tạng

ở thể nặng bệnh nhân có thể bị sốc hay còn gọi là hội chứng sốc Dengue

(HCSD) HCSD xảy ra với trẻ em nhiều hơn ở người lớn, phổ biến nhất vào ngày sốt thứ 4 đến thứ 6, ở bệnh nhân nặng có dấu hiệu suy tuần hoàn, đau bụng, bồn chồn, vật vã, nếu không được can thiệp sớm bệnh nhân có thể bị tử vong sau từ

12 đến 24 giờ [8]

Các triệu chứng của bệnh thường rất đa dạng nhưng lại không có tính chất đặc trưng Do đó, không thể phân biệt được sự khác biệt về lâm sàng giữa các bệnh

nhân nhiễm các type virus Dengue khác nhau Mặt khác, các triệu chứng này

cũng tương tự như các triệu chứng gặp phải khi bị nhiễm các loại virus gây bệnh khác như cúm, sởi, viêm não…

Căn cứ theo biểu hiện lâm sàng của bệnh SD/ SXHD có thể chia thành 3 cấp độ sau đây :

+ Sốt Dengue (SD): còn gọi là sốt Dengue cổ điển, thường có các triệu

chứng như các bệnh nhiễm virus khác là: sốt từ 38 0 C- 40 0 C, đau mỏi cơ và các khớp xương, đau đầu vùng trán và thái dương, rất ít gặp mảng xuất huyết dưới

da, tỉ lệ tử vong thấp (khoảng 0.018%) [21]

+ Sốt xuất huyết Dengue: Sốt cấp tính cao, kéo dài 2-7 ngày kèm theo nhức

đầu, đau khớp, đau cơ, xuất hiện mảng hoặc chấm xuất huyết dưới da, niêm mạc, xuất huyết nội tạng, hạ sốt do xuất huyết nhiều, xuất hiện các biểu hiện như chảy máu mũi, chảy máu chân răng nhiều và kéo dài [21]

+ Hội chứng sốc Dengue: có các biểu hiện tượng tự như SXHD nhưng còn

kèm theo hiện tượng mạch đập nhanh, huyết áp tụt, da lạnh và ướt Khi sốc sâu, kéo dài có thể dẫn tới suy thận cấp, rối loạn tiêu hoá, ngừng tim, xuất huyết nội tạng và tử vong sau 12-24 giờ [30]

ở người mắc sốt Dengue thường thấy các đặc điểm như: Hạch lympho sưng đau

toàn thân, lượng tiểu cầu ít giảm, giãn mạch ngoại vi, bạch cầu giảm, hematocrit tăng nhẹ Đối với trường hợp mắc SXHD thì có thêm các đặc điểm khác nữa như: gan to, tiểu cầu giảm, hematocrit tăng hơn 20% so với bình thường, có biểu hiện vàng da, xuất huyết phủ tạng hệ tiêu hoá và ngoài tiêu hoá như não, màng não nặng có thể chuyển sang các giai đoạn khác nghiêm trọng hơn như SXHD thể não (hội chứng não cấp), SXHD thể suy gan cấp

1.1.2 Tác nhân truyền bệnh

Bệnh SD và SXHD lây qua đường máu Các nghiên cứu về trung gian truyền

bệnh đã xác định muỗi vằn Aedes aegypti (A.aegypti) là vector chủ yếu, ngoài ra các loại muỗi khác như Aedes albopictus, Aedes polynesiens cũng có thể truyền bệnh SXHD Muỗi A.aegypti là loại muỗi sống ở trong nhà hoặc xung quanh

nhà Chỉ có muỗi cái đốt người vào ban ngày, chủ yếu vào sáng sớm và chiều tối [35] Muỗi cái có thể truyền bệnh sau thời kỳ ủ bệnh 3 đến 10 ngày hoặc có thể truyền bệnh ngay nếu đang hút máu bệnh nhân dở dang rồi đốt sang người khác

bàn, chỗ treo quần áo, chăn màn (80.5%) và những vật dụng khác Một điểm

đáng lưu ý là muỗi A.aegypti có khả năng truyền virus Dengue qua lăng quăng, nghĩa là virus Dengue có chu kỳ xuyên qua trứng Đây cũng là một yếu tố quan

trọng trong công tác phòng chống bệnh, diệt muỗi trưởng thành phải đi đôi với diệt lăng quăng trong các vật chứa nước Điều này chính là cơ sở của phương

pháp quản lý muỗi dựa và cộng đồng Vòng đời của muỗi A.aegypti được thể

hiện ở Hình 1.1

Sau khi bị nhiễm virus, muỗi sẽ bị nhiễm suốt đời Muỗi cái có thể truyền virus

Dengue cho trứng và trứng lại có khả năng tồn tại rất lâu trong điều kiện khô

hạn (có thể trên 1 năm) [24], đây là một yếu tố khó khăn cho việc diệt muỗi Muỗi sinh sản vào mùa mưa, ở những nơi chứa nước nhân tạo (vũng nước đọng, chum, vại v.v)

Thời gian virus nhân lên trong hạch nước bọt muỗi là từ 3 – 10 ngày tuỳ theo

nhiệt độ môi trường Muỗi cái có thể truyền dọc virus Dengue sang thế hệ sau

tuy nhiên đường truyền dọc này không có vai trò lớn trong cơ chế lây truyền

Dengue sang người, người vẫn là vật chủ chính nhân virus Dengue

nặng nếu có xuất huyết (Sốt xuất huyết Dengue- SXHD) Bệnh hay bùng nổ thành dịch lớn ở những vùng chưa từng bị nhiễm virus Dengue và có điều kiện thuận lợi cho sự phát triển lan tràn của vectơ truyền bệnh

Dịch Sốt Dengue lần đầu tiên được Y văn ghi nhận là vào mùa hè năm 1780 tại Philadenphia, Hoa Kỳ Sau đó bệnh được thấy ở nhiều nước nhiệt đới và cận nhiệt đới Tại châu A, năm 1953, SXHD xuất hiện lần đầu tiên ở Manila (philipin) Rồi Thái Lan, Indonexia, Singapore, India, Banglades ở vùng Tây Thái Bình Dương, có từ 28 đến 35 nước đã trải qua các vụ dịch SD/ SXHD Sốt Dengue và sốt xuất huyết Dengue đã được các nước trên thế giới công nhận là một vấn đề Y tế công cộng quan trọng [34]

Tại Việt Nam, SXHD được phát hiện lần đầu tiên ở miền Bắc vào năm 1958; Còn miền Nam là năm 1960 Sau đó dịch lan rộng tới hầu hết các tỉnh trong cả nước Những năm có dịch lớn là: 1969,1977,1978,1979,1980,1983,1987,1991,

1994, 1998 Hiện nay bệnh SD/ SXHD không chỉ lưu hành ở thành thị, khu vực

đông dân cư mà còn lan tràn cả các vùng nông thôn đồng bằng, trung du và miền núi [26]

Theo thống kê cuả TCYTTG thì ở Việt Nam từ năm 1963 đến năm 1988 có số bệnh nhân mắc trên số bệnh nhân chết về SD/ SXHD là 1.111.734/ 10.415; đây

là số lượng bệnh nhân mắc và chết lớn nhất so với các nước trong khu vực Đông Nam A và Tây Thái Bình Dương, tính trung bình hàng năm có 50.000 - 100.000 người mắc SD/ SXHD

Bệnh cảnh lâm sàng của sốt Dengue kèm theo xuất huyết được Hamon và CS mô tả năm 1953 ở Manila (Philippine) Đến năm 1956, cũng tại Manila, virus Dengue đã được Sabin phân lập từ máu bệnh nhân và muỗi

ở châu Mỹ, sau vụ dịch đầu tiên tại Philadenphia năm 1780 thì mãi đến năm 1826-1828, người ta lại ghi nhận có những trận dịch tương tự xảy ra tại vùng biển Caribe (Nam Mỹ) Trong thập kỷ từ 1950 đến 1960, tại vùng này có những chiến dịch lớn nhằm loại trừ muỗi truyền bệnh đã được tiến hành ở Mexico, Panama Nhưng sau đó muỗi lại xuất hiện ở hầu hết các nước trong vùng Từ

đó tần số các vụ dịch SXHD lại tăng lên với đầy đủ cả 4 type virus Dengue Trong 15 năm gần đây do sự giao lưu thuận tiện nên chỉ từ tháng 1 đến tháng 10/1995 đã có 200.000 bệnh nhân sốt Dengue và 5.500 bệnh nhân sốt xuất huyết Dengue được báo cáo từ các nước: Brazin, Hondurat, Nicaragoa, Venezuela

Nhìn vào Hình 1.2 Bản đồ dịch tễ về tình hình mắc SD/ SXHD trên thế giới có thể nhận thấy rằng dịch SD/SXHD có xu hướng lan rộng không những trong mỗi nước mà còn ra nhiều nước khác; Năm 1970- 1980 SD/ SXHD lan ra các nước trong khu vựv Đông Nam A; Tiếp theo 1980- 1997, dịch SD/ SXHD lan sang Ân

Độ….Từ đó hàng năm có sự gia tăng số nước báo có dịch và số trường hợp mắc bệnh Rồi tiếp đến các nước vùng Tây Thái Bình Dương và Trung Mỹ đang là

vùng hoạt động mạnh của virus Dengue gây nên bệnh SD/ SXHD Theo thống

kê của WHO từ năm 1995 đến nay, mỗi năm có khoảng 50 triệu người bị nhiễm

virus Dengue với khoảng 500.000 trường hợp phải nhập viện do mắc SXHD,

trong đó có khoảng 12.000 trường hợp tử vong hoặc cao hơn nữa nếu như bệnh nhân không được chẩn đoán và điều trị kịp thời Đặc biệt vào những tháng đầu năm 2004, tại Inđônêxia dịch SD/SXHD đã bùng phát mạnh với tổng số trường hợp bị nhiễm hơn 80.000, số tử vong là hơn 1000 trường hợp [17]

Hình 1.2 Bản đồ dịch tễ về tình hình mắc SD/ SXHD trên thế giới

Nhìn vào Hình 1.3, ta thấy bệnh SD/ SXHD hiện đang lưu hành tại vùng Trung, Nam Mỹ và vùng Đông Nam A

ra ở miền Nam Việt nam vào năm 1927

Miền Bắc Việt Nam, vụ dịch SXHD đâu tiên được Mirosky J, F Vymola, Hoang Thuc Thuy ghi nhận vào mùa hè năm 1958 [19] Nhiều tác giả đã mô tả các đặc điểm lâm sàng của 68 bệnh nhân nằm viện giống hệt như các nét lâm sàng của những trường hợp mắc SXHD ở các nước khác trong vùng đã được xác minh về mặt virus học Tiếp đó, năm 1969, đã có dịch lớn xảy ra ở 19 tỉnh, thành phố miền Bắc [23] Theo Trương Uyên Ninh và CS [27]: Năm 1976 có 11 tỉnh thì đến 1987 lên đến 17 tỉnh thành miền Bắc có SD/ SXHD

Miền Nam Việt Nam, dịch SXHD được mô tả đầu tiên vào năm 1960 với 60 bệnh nhân tử vong Tiếp theo, từ tháng 6 đến tháng 10 năm 1963, có 331 bệnh nhân nhập Viện và tử vong 116 trường hợp do virus Dengue type 2 đã được Halstead ghi nhận Sau đó, liên tục năm nào cũng có bệnh nhân thường xảy ra hàng năm ở các tỉnh, thành phố đông người, miền đồng bằng châu thổ và các vùng ven biển Bệnh đã lan rộng đến các thị xã, thị trấn, huyện lỵ miền núi, trên các trục đường giao thông chính liên tỉnh Số mắc trung bình hàng năm từ 50.000 - 100.000 người Trong giai đoạn 1980-1989, SD/ SXHD có tỷ lệ chết

đứng đầu: 0,84/100.000 dân Từ 1985-1989 tỷ lệ mắc cao thứ ba trong các bệnh truyền nhiễm: 201,5/ 100.000 dân, sau hội chứng cúm và ỉa chảy [9] Theo Lê Hồng Hinh và CS [10] thì SD/ SXHD là một trong 10 bệnh truyền nhiễm có tỷ

lệ mắc và chết cao nhất ở Việt Nam (1994)

Vựng cấu

trỳc

Vựng khụng cấu trỳc

Hình 1.4 Hình thái cấu trúc của virus Dengue

Vùng NS1 NS5: Khu vực có cấu trúc giống các virus thuộc họ Flaviviridae

(Chiếm >50% số lượng nucleotid trong chuỗi ARN) Vùng C-prM-E: Khu vực có cấu trúc riêng biệt (Khu vực mở)

1.2.1 Đặc điểm hình thái và cấu trúc

Virus Dengue thuộc họ Flaviridae, giống Flavivirus bao gồm 4 type huyết thanh là Dengue1, Dengue2, Dengue3, Dengue4 Virus Dengue hình khối cầu có

đường kính khoảng 40-50 nm, chứa một sợi ARN đơn-dương (khoảng 10200

(envelope) bản chất là glycoprotein-lipit bao quanh màng protein, lớp vỏ này bắt nguồn từ màng tế bào vật chủ (Hình 1.4) Ngoài ra nucleocapsid có cấu trúc đối xứng 20 mặt Hạt virus có hệ số lắng khoảng 175S đến 215S Tỷ trọng xác định bằng ly tâm gradien sacarosa khoảng 1.19 g/cm3 Tỷ lệ này có thể thay đổi đôi chút do các kỹ thuật tinh chế [25]

1.2.2 Genome của virus

Virus Dengue có hệ gen của Flavivirus điển hình Genome là một sợi ARN đơn,

dương có chiều dài xấp xỉ 10200 ribonucleotit Hệ gen chứa một khung đọc mở mã hoá thành một chuỗi polyprotein duy nhất Chuỗi này, sau đó sẽ được phân cắt bởi các enzyme của tế bào vật chủ và các enzyme của virus thành 10 phân tử protein chức năng, bao gồm 3 protein cấu trúc và 7 protein phi cấu trúc Genome của virus Dengue có cấu trúc phân bố của các gen theo thứ tự như sau: 5’-C-preM-E-NS1-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5-3’ (Hình 1.5)

- Đầu 5’ không mã hoá dài khoảng 100 nucleotit

- Đầu 5’ không mã hoá dài khoảng 100 nucleotit, được metyl hoá đảm bảo sự bền vững cho vật liệu di truyền Đầu 3’ (không được polyadenin hoá) không mã hoá dài khoảng 400 nucleotit

Hình 1.5 Cấu trúc bộ gen của virus Dengue

- Khoảng một phần tư chiều dài của genome tính từ đầu 5’ mã cho các protein cấu trúc: protein lõi (C), protein màng (M), protein vỏ (E) Đoạn gen này

đã được hiểu rõ và đã được giải trình tự Đoạn này chứa nhiều vùng đặc hiệu loài

và đặc hiệu type Người ta dựa vào các vùng đặc biệt này để phân biệt cấu trúc gen của các virus trong nhóm và các type virus trong loài

-Phần còn lại của genome mã hoá cho 7 protein phi cấu trúc thực hiện các chức năng sinh học xác định vòng đời của virus Chức năng của các protein này

đến nay vẫn chưa được biết đầy đủ

Khoảng 1/ 4 chiều dài của genome tính từ đầu 5’ (khoảng hơn 2000 nucleotid) mã hoá cho các protein cấu trúc Đoạn gen này chứa nhiều vùng quyết định kháng nguyên quan trọng góp phần đánh giá đặc hiệu type Tính chất

đặc trưng của vùng này cho phép phân biệt cấu trúc gen của các virus trong nhóm và trong cùng type huyết thanh Hiện nay đã phân biệt được 4 type huyết

thanh của virus Dengue gây bệnh là: virus Dengue type I (D1), virus Dengue type II (D2), virus Dengue type III (D3) và virus Dengue type IV (D4) Về phương diện kháng nguyên , cả 4 type huyết thanh này đều có liên quan chặt chẽ với nhau và có phản ứng chéo nhau [6] Khi cơ thể nhiễm một trong bốn type virus Dengue, cơ thể sẽ sinh miễn dịch đối với type virus đó trong một thời gian dài nhưng không có tác dụng miễn dịch đối với các type còn lại Điều này giải thích tại sao một người có thể nhiễm cả bốn type virus trong suốt cuộc đời [12, 25]

• Protein cấu trúc

Bao gồm protein lõi (C), protein vỏ (E), protein màng (M)

+ Protein lõi (C) là protein có kích thước nhỏ và là thành phần cơ bản tạo nên lõi nucleocapsit của virus

+ Protein vỏ (E) có nguồn gốc từ màng tế bào chủ, được glycosyl hoá ở pH thấp, mang các kháng nguyên trung hoà, kháng nguyên gây ngưng kết

+ Protein màng (M) Có hai dạng phụ thuộc vào độ sinh trưởng của virus bao gồm M có khối lượng phân tử 8 kDa và pre_M có khối lượng phân tử

19 – 23 kDa

• Protein phi cấu trúc

Chức năng của nhóm protein này chưa được biết một cách đầy đủ Các chức năng sinh học này xác định vòng đời của virus Cấu trúc đoạn gen này khá

giống nhau ở các type virus Dengue khác nhau, đây chính là nguyên nhân gây

lên các phản ứng chéo nhau trong chẩn đoán huyết thanh học

+ NS1 là glycoprotein ở dạng chất tiết hoặc không tiết, có thể giữ vai trò sao chép ban đầu

+ NS2 có thành phần là các enzyme quan trọng trong việc sao chép ARN, helicase và ARN triphotphatase tạo thành cấu trúc đầu 5’, protease để phân cắt polyprotein và liên kết với màng

+ NS5 thành phần là các enzyme polymerase phụ thuộc ARN có chức năng phiên mã DNA và enzyme methyltransferase metyl hoá đầu 5’

+ Ngoài ra còn có các vị trí của NS2A, NS2B, NS4A, NS4B Các protein này cùng phối hợp thực hiện các chức năng sinh học trong vòng đời của virus [12]

1.2.3 Chu trình nhân lên và cơ chế gây bệnh của virus Dengue

dạng sao chộp

Bộ mỏy Golgi

Flaviviri on

Hình 1.6 Cơ chế gây bệnh của virus Dengue

Sau khi bám vào tế bào chủ, nhờ liên kết với các thụ thể đặc hiệu trên bề mặt tế bào chủ thích hợp là Fc và C3, virus Dengue xâm nhập ngay vào tế bào theo cơ chế thực bào Tại vùng có pH thấp, hình dạng của virus bị biến đổi, xảy ra quá trình dung giải vỏ protein E, ARN virus được giải phóng vào trong bào tương ARN virus hoạt động như một mARN nhờ enzyme polymerase của tế bào chủ trực tiếp dịch mã thành polyprotein Hoạt động này diễn ra trong tế bào chất vùng gần nhân và được sự hỗ trợ của mạng lưới nội chất Để sao chép genome của mình, virus phải tạo một sợi ARN âm bổ sung với sợi đơn dương của mình Quá trình này được xúc tác bởi một protein là replicase và enzyme ARN polymerase của tế bào chủ, sau đó ARN sợi đơn âm này sẽ được sử dụng như một sợi khuôn để tổng hợp ra một bản sao mới của sợi dương Khi các protein

Các nucleocapsit này di chuyển đến màng tế bào chất nhờ bộ máy Golgi, sau đó chúng di chuyển đến mặt trong của màng và được bao bọc bởi màng Các hạt virus trong một tế bào được hình thành và giải phóng ra ngoài do tế bào chủ bị huỷ hoại Các nucleocapsit có màng bao chính là màng sinh chất của tế bào chủ

cũ và các virion mới có thể sử dụng các bao màng này để hoà nhập với màng của tế bào chủ mới (Hình 1.6)

ở trong cơ thể, virus Dengue tăng sinh trong các đại thực bào Khi cơ thể bị nhiễm virus Dengue type khác thì những kháng thể có sẵn trong cơ thể không có khả năng phản ứng đặc hiệu với kháng nguyên nên không trung hoà được kháng nguyên của virus Virus xâm nhập vào bạch cầu đơn nhân, số lượng bạch cầu

đơn nhân to tăng lên Hoạt hoá các CD4, CD8, lympho độc tế bào Các lympho

T hoạt hoá giải phóng ra nhiều cytokinin, các bạch cầu đơn nhân to nhiễm virus

bị ly giải do đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào Xuất hiện thoát huyết tương và xuất huyết [15] Theo thống kê có được từ Tổ Chức Y Tế Thế Giới thì cả bốn type virus đều có thể gây SD, SXHD và shock Dengue

1.2.4 Đặc điểm kháng nguyên

Virus Dengue mang các kháng nguyên trung hoà, kháng nguyên gây ngưng kết hồng cầu, kháng nguyên kết hợp bổ thể trên protein màng (E) [15] Virus Dengue có nhiều kháng nguyên, trong đó có kháng nguyên đặc hiệu type, kháng nguyên chung của phân nhóm và của nhóm, dựa vào sự khác biệt giữa các đặc

điểm quyết định kháng nguyên người ta phân chia virus Dengue thành 4 type khác nhau từ virus Dengue type I (D1) đến virus Dengue type IV (D4) Cả 4 type huyết thanh của virus Dengue rất gần nhau về phương diện kháng nguyên nhưng khác nhau ở chỗ có một phần miễn dịch chéo Virus Dengue còn có

chung một số đặc điểm kháng nguyên với một số Flavivirus khác Kháng

nguyên của virus Dengue khu trú ở đại thực bào phổi, lách, gan, tuyến ức, các tổ chức da và bạch cầu đơn nhân Khi xâm nhập vào cơ thể các kháng nguyên của virus là kháng nguyên trung hoà, kháng nguyên ngưng kết hồng cầu và kháng

nguyên kết hợp bổ thể sẽ kích thích cơ thể hình thành các kháng thể đặc hiệu tương ứng [17]

Để phát hiện kháng thể kháng virus Dengue trong huyết thanh bệnh nhân hoặc xác định sự có mặt của virus Dengue trong các tổ chức cơ quan nghi nhiễm virus phải sử dụng một trong các kỹ thuật của hai nhóm phương pháp sau đây

1.2.4.1 Phát hiện kháng thể

Với thể điển hình dựa vào các yếu tố sau:

- Yếu tố Dịch tễ: Bệnh nhân ở mùa dịch, vừa ở nơi có dịch trở về

- Lâm sàng: Bệnh nhân sốt, dấu hiệu Tourniquet dương tính, xuất huyết, gan to

- Xét nghiệm: Tiểu cầu dưới 100.000/ mm3 Hematocrite tăng thêm trên 20%, bạch cầu, lympho bào giảm hoặc bình thường

Nhưng chỉ có các xét nghiệm huyết thanh học, virus học mới cho kết luận chính xác vụ dịch căn nguyên vụ dịch SD/ SXHD

Như chúng ta đã biết tiếp theo sau các nhiễm trùng, các kháng thể ngăn ngưng kết hồng cầu, kháng thể trung hoà xuất hiện sau 7 ngày khởi bệnh; Các kháng thể kết hợp bổ thể hình thành từ 7 đến 14 ngày sau Kháng thể IgM thường xuất hiện sớm sau 2, 3 ngày đầu mắc bệnh; Kháng thể này tồn tại trong vòng 90 ngày sau Trong khi đó kháng thể IgG thường xuất hiện muộn sau 5, 6 ngày và tồn tại lâu dài Dựa vào tính chất này mà người ta đã sáng tạo ra nhiều kỹ thuật chẩn đoán nhanh, sớm và khá chính xác bệnh SD/ SXHD

- Phản ứng ngưng kết hồng cầu thụ động: là phản ứng trong đó dùng một kháng nguyên hoà tan để phát hiện một kháng thể tương ứng

- Phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu: Theo Clarke và Casals (1958) [5] dùng hồng cầu đã gắn kháng nguyên hoà tan để phát hiện và đo lường kháng thể tương ứng Để thực hiện kỹ thuật này phải mất trên 15 ngày sau khi khởi bệnh Bởi vì kháng thể IgG thường hình thành chậm

- Kỹ thuật ELISA phát hiện IgM (IgM antibody capture ELISA) hay còn gọi là MAC-ELISA [22]: Là một kỹ thuật mới được phát hiện nhưng đã nhanh chóng được sử dụng rộng rãi Kỹ thuật đơn giản, nhanh và đòi hỏi ít trang bị

kỹ thuật cao Kỹ thuật MAC-ELISA dựa trên nguyên tắc phát hiện kháng thể IgM đặc hiệu của Dengue có trong máu bệnh nhân bằng kháng thể kháng IgM đã gắn trước vào bản nhựa Nếu IgM trong huyết thanh bệnh nhân có kháng thể kháng Dengue, nó sẽ gắn với kháng nguyên Dengue được thêm vào sau và được phát hiện bằng một kháng thể kháng Dengue gắn enzym cho thêm vào sau nữa Kháng thể gắn enzym này có thể là kháng thể người kháng Dengue hoặc là kháng thể đơn dòng Khi cho cơ chất vào, nếu phản ứng dương tính, sẽ xuất hiện màu

Kháng thể IgM kháng virus Dengue thường xuất hiện sớm hơn kháng thể IgG ở ngày thứ 5 sau khi khởi phát, hầu hết các trường hợp dương tính với xét nghiệm NNKHC thì đều phát hiện được kháng thể IgM kháng virus Dengue Kỹ thuật MAC-ELISA còn có thể phát hiện ở giai đoạn sớm từ ngày thứ hai sau khi bệnh khởi phát; Trong khi đó kỹ thuật NNKHC không

có khả năng này Tuy nhiên sự xuất hiện kháng thể IgM còn tuỳ thuộc vào từng cơ thể bệnh nhân và vì thể tỷ lệ dương tính thường xê dịch từ 75%

đến 82% Kỹ thuật MAC-ELISA đã trở nên có gía trị đặc biệt trong việc giám sát SD/ SXHD Nó có thể dùng điều tra sàng lọc một lượng lớn huyết thanh vì kỹ thuẩt đơn giản, thời gian nhanh, sớm (chỉ cần lấy máu đơn), với

số lượng huyết thanh lớn Nhờ kết quả của kỹ thuật MAC-ELISA mà các nhà dịch tế có thể phát hiện sớm để có hướng dập dịch; Các bác sĩ lâm sàng

có hướng điều trị kịp thời

- Kỹ thuật chẩn đoán nhanh IgM và IgG ở bệnh nhân mắc SD/ SXHD bằng phương pháp Sắc ký miễn dịch (Panbio Dengue Fever Rapid Test) Theo Chew Theng Sang (Bệnh viên đa khoa Singapore) và BS David Vaughn cùng

CS (Viện nghiên cứu Y học Quân đội Hoa kỳ, Bangkok, Thai Lan) thì thấy

đây là một kỹ thuật sắc ký miễn dịch để phát hiện kháng thể IgM và IgG ở bệnh nhân mắc SD/ SXHD Tất cả các thành phần bao gồm kháng nguyên Dengue lẫn các hoá chất của quá trình phản ứng được tẩm sẵn trên tấm card giấy; Sau khi nhỏ thêm dung dịch đệm và huyết thanh bệnh nhân; 07 phút sau đọc kết quả

1.2.4.2 Phân lập virus

Có 4 hệ thống phân lập có thể sử dụng để phân lập virus Dengue:

-Cấy truyền trên não chuột ổ (1-3 ngày tuổi)

- Cấy truyền trên tế bào của động vật có vú (LLC-MK2)

- Cấy truyền vào ngực muỗi trưởng thành

- Cấy truyền trên tế bào muỗi (A.albopictus dòng C6/36)

∗ Cấy truyền trên não chuột ổ (1-3 ngày tuổi)

Tất cả 4 type virus Dengue đều có thể phân lập được từ huyết thanh người khi gây nhiễm trên não chuột ổ Phương pháp này đòi hỏi nhiều thời gian, cho kết quả chậm và không kinh tế Hơn thế nữa do sự kém nhạy nên có rất nhiều virus hoang dại không thể phân lập được ở trên chuột Phân lập virus trên chuột ổ phải qua nhiều lần gây nhiễm để thúc đẩy sự nhân lên của virus trên não chuột, vì vậy rất tốn tiền và thời gian Ưu điểm của phương pháp này là một số arbovirus khác có triệu chứng giống SD/SXHD cũng có thể phát hiện được nhờ phương pháp này Ngày nay hầu hết các phòng thí nghiệm trên thế giới không sử dụng phương pháp này để phân lập virus [18]

∗ Cấy truyền trên tế bào động vật có vú

Phân lập virus trên tế bào động vật có vú (LLC-MK2) có những nhược điểm giống như phân lập trên chuột ổ đó là: không kinh tế, chậm và kém nhạy cảm Phương pháp này cũng đòi hỏi phải cấy truyền nhiều lần trước khi nhìn thấy sự huỷ hoại của tế bào Phương pháp này hiện nay cũng chỉ thực hiện trong một số

∗ Cấy truyền vào ngực muỗi trưởng thành

Đây là một phương pháp nhạy nhất trong phân lập virus Dengue Tuy không đạt tới tỷ lệ 100% nhưng đủ độ nhạy để thành công trong việc xác định virus Dengue trong các trường hợp tử vong của SD/ SXHD Trong rất nhiều vụ dịch virus Dengue đã được xác nhận hồi cứu thông qua phương pháp này Có 4 loài

muỗi được sử dụng để phân lập virus đó là: Ae.aegypti, Ae.albopictus, Toxorhynchities amboinensis và T.splendens [42] Sự nhân lên của virus

Dengue trong muỗi rất nhanh (106-107 MID 50) trong 4-5 ngày và phụ thuộc vào nhiệt độ trong quá trình gây nhiễm Virus Dengue nhân lên trong tất cả các tổ chức tế bào của muỗi kể cả não Gần đây phương pháp này còn được áp dụng trên não bọ gậy và muỗi Toxorhynchities Tuy nhiên việc cải tiến trên cũng không làm tăng tính nhậy cảm hơn so với gây nhiễm vào ngực muỗi Phương pháp này đòi hỏi phải có phòng thí nghiệm chuyên dụng và khả năng duy trì một lượng muỗi lớn, hơn nữa là sự an toàn trong công việc sử dụng muỗi cái

Ae.aegypti hoặc Toxorhynchities, bởi vì chính đó là vectơ truyền bệnh và là

nguyên nhân gây nhiễm virus cho nhân viên làm việc tại phòng thí nghiệm đó

∗Cấy truyền trên hệ thống tế bào muỗi

Đây là phương pháp được sử dụng rộng rãi hiện nay Có 3 dòng tế bào muỗi nhạy cảm hiện nay được sử dụng rộng rãi đó là:

+ Tế bào muỗi Ae.albopictus dòng C6/36 được dùng rộng rãi nhất

Sử dụng dòng tế bào này làm cho phương pháp phân lập virus Dengue trở nên nhanh, nhậy và kinh tế nhất đồng thời cũng là phương pháp lý tưởng

để giám sát virus So với phân lập trên ngực muỗi, phương pháp này kém nhạy hơn khoảng 15% tuy nhiên nó vẫn được sử dụng rộng rãi vì có khả năng giải quyết được một số lượng mẫu lớn dễ dàng trong thời gian ngắn

+ Tế bào muỗi A pseudocutellaris dòng 61(AP-61) Độ nhậy của

dòng tế bào này kém hơn so với C6/36 Vì vậy nếu chỉ dùng dòng tế bào này sẽ bỏ sót nhiều trường hợp nhiễm virus Dengue Tuy nhiên nhiều nhà

nghiên cứu vẫn thích sử dụng loại tế bào này bởi vì có thể quan sát được

sự đáp ứng của tế bào với virus Dengue thông qua việc tạo CPE (Cytopathogenic effect) Ngày nay người ta thường sử dụng dòng tế bào này đi kèm với C6/36 để phân lập virus Dengue

+ Tế bào muỗi Tx.amboinensis (TRA-dòng 284) Đây là dòng tế

bào nhậy cảm nhất đối với virus Dengue nhưng khả năng duy trì và phát triển của dòng tế bào này khó vì vậy không được sử dụng rộng rãi như dòng C6/36 hiện nay

Các phương pháp xác định type virus [18]

∗ Phương pháp thông dụng

Phương pháp thông dụng để xác định type huyết thanh của virus Dengue hiện nay đó là phương pháp miễn dịch huỳnh quang (Immuno Fluorescent Assay – IFA) luôn được thực hiện cùng với các phương pháp phân lập virus Phương pháp này sử dụng kháng thể đơn dòng đặc hiệu type được tạo ra trên tế bào nuôi cấy hoặc dịch báng miễn dịch chuột kết hợp với kháng thể kháng IgG chuột gắn huỳnh quang Phương pháp này dễ dàng thực hiện trên tế bào đã gây nhiễm, não muỗi hoặc tiêu bản mô, tiêu bản tổ chức não chuột được cố định bằng Formalin hoặc parafin

Đây là phương pháp đơn giản, đáng tin cậy và rất nhanh, thêm nữa nó có thể phát hiện được nhiều loại virus trên cùng một bệnh nhân trong trường hợp bệnh nhân bị nhiễm nhiều type của virus Dengue

Phương pháp này muốn thành công phụ thuộc vào nhiều yếu tố:

- Tổ chức và bảo quản mẫu: Đây là yếu tố quan trọng vì virus có thể bị bất hoạt bởi nhiệt độ, pH và một số hoá chất Yếu tố này thường là nguyên nhân gây ra thất bại của trong quá trình phân lập và xác định

- Nồng độ virus có trong máu trong giai đoạn đầu của bệnh Thông thường virus nhân lên trong máu đạt tới đỉnh cao trong một thời gian rất ngắn ở giai đoạn đầu của bệnh Khó có thể phát hiện virus sau 4-5 ngày mắc bệnh

- Hệ thống phân lập virus được cho cũng là một yếu tố quan trọng quyết định sự thành công của phương pháp này

∗ Một số phương pháp khác

Trong những năm gần đây có một số phương pháp mới đã được phát triển góp phần vào việc hoàn thiện các phương pháp chẩn đoán nhiễm virus Dengue Những phương pháp tiêu biểu có thể kể đến đó là: phản ứng khuyếch đại chuỗi (Polymerase chain reaction - PCR), phương pháp mảnh lai ghép (Hybridization probes), hoá miễn dịch mô (Immunohistochemistry)

- Phản ứng khuyếch đại chuỗi

(Reverse Transcriptase - PCR)

Phương pháp tổng hợp ngược RT-PCR (Reverse Transcriptase - PCR) đã được phát triển và áp dụng cho phần lớn các virus có vật liệu di truyền là ARN trong những năm gần đây đã là cuộc cách mạng lớn trong lĩnh vực sinh học phân tử Phương pháp này đã bổ xung thêm vào các phương pháp chẩn đoán của virus Dengue và là một phương pháp chẩn đoán nhanh, đặc hiêụ, nhạy, đơn giản và cho kết quả chính xác, nếu như được kiểm soát tốt Phương pháp này có khả năng phát hiện đoạn ARN đặc hiệu của virus trong mẫu huyết thanh của người, trên mô của tử thi hoặc từ muỗi Khác với các phương pháp phân lập virus khác, các yếu tố như điều kiện bảo quản, kỹ năng thực hiện, sự xuất hiện của KT trong mẫu cũng không ảnh hưởng tới kết quả của RT-PCR Tuy vậy trong các phòng thí nghiệm, phương pháp này cũng không sử dụng rộng rãi do giá thành quá cao, trang thiết bị yêu cầu cao và nguyên nhân chủ yếu là do độ nhạy của RT-PCR quá cao nên nếu không kiểm soát được sự tạp nhiễm của các tác nhân ngoại lai thì việc tạo ra các kết quả sai lệch là không tránh khỏi

đơn giản có thể sử dụng cho các mẫu thu thập trên lâm sàng cũng như trên tử thi

Độ nhạy của phương pháp này kém hơn RT- PCR và cũng đòi hỏi trang thiết bị cao, đắt tiền vì vậy cũng không sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm

- Phương pháp hoá miễn dịch mô

(Immunohistochemistry)

Một vấn đề còn vướng mắc trong các phòng thí nghiệm chẩn đoán virus là xác

định nguyên nhân của các trường hợp tử vong Trong một thời gian ngắn nếu chỉ dựa vào một huyết thanh thu nhập được và kết quả của các phương pháp chẩn

đoán huyết thanh học thì việc nhận định kết quả rất hạn chế, đặc biệt là một số trường hợp tử vong sớm hoặc chỉ sốt nhẹ khi đó việc phân lập virus rất khó khăn Với kỹ thuật hoá miễn dịch mô này có thể giải quyết vấn đề đó bằng cách phát hiện kháng nguyên của virus trên các tổ chức khác nhau

Cũng như phương pháp IFA, phương pháp này sử dụng các kháng thể gắn enzym (cộng hợp) như peroxidase, photphatase gắn với các kháng thể đa dòng hoặc đơn dòng khác nhau Phương pháp này có thể áp dụng cho các mẫu mới hoặc mẫu đã

được cố định trong các trường hợp tử vong vì SXHD/SD Hiện tại phương pháp này cũng không được sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán mà chỉ áp dụng cho nghiên cứu hồi cứu

+ Nhóm phương pháp phân lập virus gây bệnh và định type virus có thể sử

Trong hai phương pháp nêu trên thì RT-PCR là phương pháp cho kết quả nhanh, nhạy và đặc hiệu nhưng tiến hành khá phức tạp, đòi hỏi kỹ thuật cao, đầu tư tài chính lớn nên khó đáp ứng và phổ biến rộng rãi trong các phòng thí nghiệm chẩn đoán SD/SXHD ở nước ta

+ Nhóm phương pháp chẩn đoán huyết thanh học Đây là nhóm phương pháp đơn giản, giúp phát hiện bệnh và nghiên cứu dịch tễ, bao gồm các phương pháp sau:

- Dựa vào phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu (HI)

- Dựa vào phản ứng kết hợp bổ thể (CF)

- Dựa vào phản ứng trung hoà giảm đám hoại tử (PRNT)

- Dựa vào phản ứng Dot blot, ELISA Phản ứng này nhằm phát hiện những kháng thể IgG và IgM dựa trên hai kiểu đáp ứng miễn dịch của cơ thể là

đáp ứng miễn dịch tiên phát đối với người chưa bị nhiễm virus Dengue và một

virus khác trong loài Flavivirus hay chưa dùng vaccin Flavivirus, IgM hiệu giá

cao hơn hẳn IgG hoặc là đáp ứng miễn dịch thứ phát đối với người có tiền sử

nhiễm virus Dengue hay đã dùng vaccin Vì vậy phản ứng Dot blot, ELISA rất

có ý nghĩa trong việc đánh giá nhiễm trùng hiện tại của virus

B nghiên cứu virus corona gây bệnh viêm đường hô hấp cấp SARS ở Việt Nam

1.1.Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Bệnh dịch SARS hay Hội chứng viêm đường hô hấp cấp tính nặng là một bệnh dịch mới xuất hiện và cho đến nay được xác định là đã xuất hiện lần đầu tiên tại Quảng Đông -Trung Quốc vào tháng 11 năm 2002 (trường hợp mắc bệnh đầu tiên vào ngày 16/11/2002 tại thành phố Foshan)

Tiếp theo đó trong tháng 2 và 3 năm 2003 các ca bệnh viêm đường hô hấp cấp tính gây nguy hiểm đến tính mạng nhiều người và không rõ nguyên nhân đã

được thông báo từ Việt Nam, Hồng Kông, Canada Các trường hợp viêm

đường hô hấp cấp tính nặng mới xuất hiện có khả năng lây lan nhanh đặc biệt là cho người nhà và nhân viên y tế với tỉ lệ tử vong cao Hội chứng này sau đó

được Tổ chức Y tế Thế giới (TCYTTG) định nghĩa là Hội chứng viêm đường hô hấp cấp tính nặng (SARS: Severe Acute Respiratory Syndrome) Đến ngày 28/4/2003 trên thế giới đã có 26 nước báo cáo có bệnh nhân SARS với tổng số mắc là 5050 người và 321 trường hợp tử vong Số bệnh nhân mắc và chết do SARS tăng lên hàng ngày đã gây ảnh hưởng nghiêm trọng tới đời sống và sự phát triển kinh tế xã hội của nhiều nước, theo ước tính ban đầu dịch SARS đã làm thiệt hại tới hàng trăm tỷ USD Sau khiHội chứng SARS bùng phát ở Hồng Kông, Việt Nam, Singapore, Trung Quốc, Đài Loan, Canada và một số nước khác trên thế giới, Tổ chức kiểm soát bệnh tật Hoa Kỳ CDC đã tìm và xác định căn nguyên gây bệnh là một vi rút mới họ corona (nhưng không giống vi rút corona cổ điển)

Rất nhiều trường hợp mắc bệnh có thể sắp xếp trong chuỗi mắt xích lây nhiễm

từ 1 Bác sỹ ở Quảng Đông đã ghé qua Hồng Kông, bị phát bệnh tại đây và đã tử

có 30 nhân viên y tế và 10 bệnh nhân đang điều trị tại thời điểm này đã bị lây bệnh phổi bởi Johnny, cũng với các triệu chứng viêm đường hô hấp cấp nặng Một ngày sau khi Johnny Chen chết, y tá Nguyễn Thị Lượng, người chăm sóc trực tiếp cho Johnny cũng tử vong 17/3/2003, bác sĩ người Pháp Dorosier, người đặt nội khí quản cho bệnh nhân Johnny Chen, cũng đã tử vong tại BVVP

đồng thời rất nhiều bệnh nhân khác với các biểu hiện lâm sàng tương tự cũng trong tình trạng nhiễm bệnh rất nặng Liên tiếp những ngày sau đó thêm 3 ca bệnh đều là các nhân viên y tế của BVVP đã bị lây nhiễm và không qua khỏi Tính đến ngày 8/4/2003 Việt Nam có 63 trường hợp mắc hội chứng SARS, với

5 trường hợp tử vong đều là các nhân viên y tế của BVViệt Pháp

Trước nguy cơ bùng phát của bệnh dịch SARS , Ban Chỉ đạo quốc gia phòng chống dịch SARS của Việt nam được thành lập và đã phối hợp với TCYTTG bước đầu tiến hành một số nghiên cứu để xác định tác nhân gây bệnh, các yếu tố

có liên quan đến quá trình lan truyền dịch và triển khai các biện pháp phòng chống Kết quả là đến ngày 28/4/2003, Việt nam đã trở thành quốc gia đầu tiên trên thế giới thành công trong khống chế dịch SARS

Về căn nguyên bệnh SARS:

Ngay từ cuối tháng 11/2002 (khi dịch bệnh bắt đầu tại Quảng Đông –Trung Quốc) hàng loạt các nghiên cứu về căn nguyên của bệnh lạ đã được tiến hành

[21] Các nhà khoa học Trung Quốc cho rằng Chlamydia pneumonia là thủ

phạm gây ra bệnh dịch này, tuy nhiên những đặc tính sinh học của vi sinh vật này, cùng với các diễn biến lâm sàng nặng nề của bệnh không đủ khả năng thuyết phục giả thuyết trên là đúng Đến giữa tháng 3 năm 2003, dựa trên

nghiên cứu về hiển vi điện tử các nhà khoa học Hồng Kông tìm ra virus human pneumonia (hMPV) thuộc họ Paramyxoviridae trong dịch tiết của bệnh nhân

nhiễm SARS, kết quả này cũng được sự đồng tình của các nhà khoa học Canada khi tìm thấy ARN của hMPV trong dịch tiết của bệnh nhân thông qua phương pháp RT-PCR Giả thuyết này một lần nữa lại bị loại bỏ khi các nhà khoa học

Mỹ (CDC-Attlanta) ngày 16 tháng 4 năm 2003 đưa ra những hình ảnh cụ thể của một loại virus phân lập được từ những bệnh nhân SARS với kích thước từ 100- 120 nm có các gai (spike) trên bề mặt giống với 1 loài virus gây bệnh

cho người đã từng biết đó là virus Corona Tuy nhiên sự khác biệt lớn nhất giữa virus Corona mới này so với các virus Corona cùng loại là độc lực mạnh gây chết người và khả năng lan truyền mạnh Virus mới này được gọi là SARS- CoV ( Severe Acute Respiratory Syndrome associated Corona virus) và được

khẳng định chính là nguyên nhân gây ra bệnh SARS Từ đó, các phương pháp chẩn đoán trong phòng thí nghiệm được tiến hành nghiên cứu một cách khẩn trương với mục đích đưa ra một phương pháp có khả năng xác định sớm sự nhiễm virus SARS đồng thời tìm hiểu được đặc điểm sinh học của tác nhân gây bệnh này

Phương pháp di truyền phân tử (RT-PCR) được hầu hết các nhà khoa học trên thế giới quan tâm do khả năng cho kết quả sớm với độ nhạy và đặc hiệu cao Hiệu quả của phương pháp này phụ thuộc rất nhiều vào trình tự của các cặp mồi Đây là phương pháp chính được các phòng thí nghiệm trên thế giới cũng như tại Việt Nam áp dụng để chẩn đoán sớm nhiễm virus SARS –CoV hiện nay

pháp này có độ nhạy cao hơn từ 10 đến 20 % so với các phương pháp PCR thông thường, tuy nhiên về giá thành của phương pháp này cao hơn rất nhiều so với phương pháp RT-PCR truyền thống

Vào tháng 7 năm 2003 các nhà khoa học của công ty hoá học Eiken- và Trường đại học Nagasaki Nhật bản đã đưa ra một phương pháp mới được phát triển dựa trên nguyên lý về di truyền phân tử đó là RT-LAMP (Reverse Transcriptase Loop Mediated Isothemal Amplification) Độ nhanh, nhạy, đặc hiệu của phương pháp này được đánh giá thông qua một số lượng lớn mẫu thu thâp ở các bệnh nhân SARS Việt Nam Hiện tại, phương pháp này đang được phát triển để chẩn đoán nhanh một số bệnh truyền nhiễm do virus khác như sốt xuất huyết dengue, viêm não Nhật bản B …

Một số lớn các phương pháp khác áp dụng để xác định sự nhiễm virus SARS thông qua kháng thể kháng đặc hiệu virus SARS-CoV trong huyết thanh bệnh nhân cũng đã được phát triển : Miễn dịch hấp phụ liên kết men gián tiếp (ELISA gián tiếp), miễn dịch huỳnh quang (IFA), trung hoà giảm đám hoại tử ( PRNT) Các phương pháp này đều đáp ứng yêu cầu chẩn đoán xác định nhiễm virus SARS-CoV với độ nhạy, và đặc hiệu cao ( >90%) tuy nhiên hiệu quả tốt chỉ thể hiện ở giai đoạn hồi phục của bệnh hoặc trong các nghiên cứu hồi cứu

Phân lập virus SARS-CoV nhằm hiểu rõ hình thể, cấu trúc phân tử cũng như sự nhân lên của virus trong tế bào chủ cũng được một số phòng thí nghiệm trên thế giới áp dụng, tuy nhiên đây là một virus đặc biệt nguy hiểm vì vậy yêu cầu về an toàn sinh học được đặt ra hết sức nghiêm ngặt trong điều kiện làm việc đặc biệt phải được kiểm soát một cách chặt chẽ

Phản ứng của cơ thể người khi virus SARS-CoV thâm nhập gây nên một số biểu hiện toàn thân như : Sốt cao, mệt mỏi ,ho khan,khó thở… ngoài ra một số triệu

chứng nhiễm virus nói chung cũng biểu hiện trên một số chỉ số tế bào và sinh hoá trong máu ngoại vi như: tiểu cầu giảm, bạch cầu giảm, các men chuyển hoá alanine, aspartate tăng … Cũng như nhiễm các loại virus nói chung, đáp ứng miễn dịch cơ thể thông qua 2 hệ thống miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào, các kháng thể đặc hiệu kháng virus SARS –CoV như IgA, IgM và IgG cũng xuất hiện trong máu sau khi virus thâm nhập từ 5-10 ngày Thời gian tồn lưu và khả năng bảo vệ của các loại KT này cũng như ảnh hưởng của interferon đến khả năng nhân lân của virus SARS-CoV hiện nay vẫn tiếp tục được nghiên cứu

Hình ảnh của virus SARS-CoV đã quan sát rõ trên tế bào cảm nhiễm Vero –E6 Đó là virus có hình dạng giống các virus thuộc họ Coronaviridae với đường kính trung bình là 78 nm Hạt virus hình tròn nhân sáng màu màng nhân ( nucleocapsid) có dạng xoắn, gai (Spike) xuất hiện trên bề mặt của hạt virus Vật liệu di truyền của virus là một sợi RNA dương, có chiều dài khoảng 27 kb bao gồm 5 gen mã hóa cho 4 protein cấu trúc : S (gai),E (vỏ), M (màng), N (màng nhân) và 1 protein không cấu trúc đó là Polymerase bao gồm rất nhiều các enzym chức năng khác nhau Thứ tự sắp xếp của các gen như sau : 5’- Pol-S-E-M-N-3’ Kích thước ARN của virus SARS-CoV ngắn hơn các virus khác cùng

họ Corona khoảng 5kb, sự thiếu hụt của một lượng nucleotid mã hoá cho một

số enzym chức năng trong vật liệu di truyền có thể là nguyên nhân làm cho độc tính của virus SARS-CoV biến đổi Protein N có kích thước khoảng 46 kDa là yếu tố miễn dịch chính, được sử dụng trong nghiên cứu các phương pháp chẩn

đoán sớm bằng huyết thanh học Protein S có kích thước khoảng 139 kDa, bản chất là một glycoprotein, sự hiện diện của protein này trong huyết thanh bệnh nhân nhiều tác giả cho rằng đó là kết quả của những sự can thiệp có tính chất bảo vệ của cơ thể với virus SASR- CoV

Tại Việt Nam: ngay từ trường hợp nhiễm SARS đầu tiên được phát hiện, với

Mỹ, NIID –Nhật bản, Viện Jacques Monod –Pháp, các nghiên cứu tiếp theo đã

được tiến hành nhằm tìm hiểu rõ căn nguyên của bệnh SARS Sự nhân lên của virus SARS- CoV tại tế bào niêm mạc đường hô hấp trên đặc biệt là niêm mạc mũi đã chỉ ra vị trí lý tưởng để thu thập bệnh phẩm lâm sàng dùng cho chẩn

đoán sớm trong phòng thí nghiệm có hiệu quả Các phương pháp sử dụng để nghiên cứu về virus học cũng đã được áp dụng như phân lập virus, di truyền phân tử… và đã chẩn đoán xác định được các trường hợp nhiễm virus SARS tại Ninh bình đầu tháng 4 năm 2003 Hình ảnh virus SARS-CoV do Viện VSDTTƯ phân lập lại bệnh nhân K (Ninh Bình) đã được công bố, trùng hợp với hình ảnh virus SARS-CoV đang gây dịch trên thế giới

Vê lâm sàng và bệnh học SARS :

Cả TCYTTG (WHO) và Trung tâm kiểm soát và phòng chống bệnh Hoa Kỳ (Center for Disease Control and Prevention) đều đưa ra định nghĩa ca bệnh cho các trường hợp nghi ngờ, có khả năng và khẳng định nhiễm SARS Trường hợp nghi ngờ là những bệnh nhân sốt cao và có một hoặc nhiều biểu hiện của nhiễm khuẩn hô hấp (như ho, thở nhanh nặng hoặc khó thở) và có tiền sử tiếp xúc trực tiếp với người bệnh đó được chẩn đoán SARS trước đó Trường hợp có khả năng nhiễm SARS là những bệnh nhân có đầy đủ tiêu chuẩn nghi ngờ nhiễm SARS, kèm theo có thay đổi ở phổi trên hình ảnh X quang Định nghĩa ca bệnh SARS rất có lợi trong công tác thống kê giám sát và có thể áp dụng trên lâm sàng với những bệnh nhân đến muộn hoặc được chẩn đoán sau khi nhập viện Tuy nhiên nếu những định nghĩa này được bổ sung thêm các tiêu chuẩn để phát hiện sớm người bệnh ngay trong tuần đầu hoặc trước khi đến bệnh viện, thì độ nhạy của

nó chỉ còn đạt mức 25% Sở dĩ độ nhạy của tiêu chuẩn đạt thấp là do trong định

nghĩa này, tất cả các tiêu chuẩn đều phải được đánh giá đầy đủ trong khi đó các biểu hiện hô hấp thường lại xuất hiện từ tuần thứ 2 trở đi, và nhiều bệnh nhân mặc dù cảm thấy sốt nhưng khi cặp nhiệt độ lại không đạt mức 38 oC

Tiêu chuẩn xét nghiệm để chẩn đoán SARS có thể được dùng để khẳng định ca bệnh, xác nhận các trường hợp huyết thanh âm tính hoặc không xác định SARS

có thể được khẳng định hoặc bằng phản ứng chuỗi men PCR dương tính với virus gây SARS, hoặc chuyển đảo huyết thanh trên phản ứng ELISA, hoặc phân lập virus Các trường hợp âm tính về mặt huyết thanh học được định nghĩa là các trường hợp không có kháng thể kháng SARS-CoV trong huyết thanh sau 21 ngày kể từ khi có biểu hiện lâm sàng Định nghĩa huyết thanh không xác định

được áp dụng cho các bệnh nhân không có hoặc có kết quả huyết thanh không hoàn chỉnh

Biểu hiện lâm sàng:

Biểu hiện lâm sàng của SARS rất đa dạng SARS điển hình đặc trưng thường bắt đầu bằng các biểu hiện giống cúm, gồm sốt (94 - 100%), rét run (43 - 56%), mệt mỏi (43 - 56%), đau cơ (51 - 68%), ra mồ hôi vào ban đêm (28%) và chán

ăn (10 - 54%) Trong 2 đợt bệnh lớn ở Hồng Kông, biểu hiện lâm sàng của bệnh nhân là rất khác nhau cho thấy SARS có thể được lây lan qua đường hô hấp, hoặc đường phân - miệng Sau đó vài ngày, các biểu hiện đường hô hấp hoặc đường dạ dày - ruột thường tiến triển ngày càng rầm rộ (có thể tuỳ theo con đường lây bệnh), như ho khan (29 - 62%), đờm (28%), chảy mũi (24%),

đau họng (20 - 23%), thở nhanh nặng (4 - 30%), buồn nôn (22%) và nôn (14%), đau bụng (13%) và ỉa chảy (1 - 70%) Đau đầu (15 - 50%) và chóng mặt (3 - 30%) cũng thường xảy ra Mặc dù viêm phổi thường tiến triển ở hầu hết bệnh nhân SARS nhưng chỉ có dưới 1% có biểu hiện đau ngực Theo một số tác giả, ỉa chảy gặp ở phần lớn bệnh nhân vào viện (73%), nhưng cho tới nay người