Nghiên cứu mức độ kháng thể dịch thể kháng mycobacterium tuberculosis ở cộng đồng người việt nam và một số yếu tố liên quan

tuberculosis trong huyết thanh các nhóm cộng đồng nghiên cứu 3.1.3 Mức độ kháng thể IgG và IgM huyết thanh đặc hiệu với M.tuberculosis của bệnh nhân lao phổi mới... 3.2 Mối liên quan gi

Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài Cấp bộ

Tên đề tài:

Nghiên cứu mức độ kháng thể dịch thể kháng

Mycobacterium tuberculosis ở cộng đồng

người việt nam và một số yếu tố liên quan

Chủ nhiệm đề tài: PGS TS Hồ Minh Lý Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương

6686

04/12/2007

Hà nội, 2005

người việt nam và một số yếu tố liên quan

Chủ nhiệm đề tài: PGS TS Hồ Minh Lý

Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương

Cấp quản lý: Bộ Y tế

Mã số đề tài (nếu có) :

Thời gian thực hiện : từ tháng 1/2002 đến tháng 12/2004

Tổng kinh phí thực hiện đề tài: 141 triệu đồng

Trong đó, kinh phí SNKH : 141 triệu đồng

Hà nội, 2005

Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp bộ

1 Tên đề tài: “Nghiên cứu mức độ kháng thể dịch thể kháng

yếu tố liên quan”

2 Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS Hồ Minh Lý

3 Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương

4 Cơ quan quản lý đề tài: Bộ Y tế

Viện Vệ sinh Dịch tễ TW Viện Vệ sinh Dịch tễ TW Viện Vệ sinh Dịch tễ TW

Viện Vệ sinh Dịch tễ TW Viện Vệ sinh Dịch tễ TW

6 Khương Anh Tuấn Ths.BS Viện CL & CS, Bộ Y tế

7 Nguyễn Vân Anh Ths.CN Viện Vệ sinh Dịch tễ TW

8 Nguyễn Kim Trinh KTV Viện Vệ sinh Dịch tễ TW

9 Trần Thanh Hoa CN Viện Vệ sinh Dịch tễ TW

Viện Vệ sinh Dịch tễ TW Phòng QY, Bộ TLBF Cục Quân Y

TT Lao PNT, TP HCM Viện Vệ sinh Dịch tễ TW

8 Thời gian thực hiện đề tài : từ tháng 1/2002 đến 12/2004

Bảng chữ cáI viết tắt

AFB Acid Fast Bacillus (Trực khuẩn kháng cồn, axit)

AIDS Acquired Immunodeficiency Syndrome (Hội chứng

thiếu hụt miễn dịch mắc phải) BNLP Bệnh nhân lao phổi

CDC Centre for Disease Control (Trung tâm kiểm soát bệnh) DOTS Direct Observe Treatments (Điều trị có giám sát trực

tiếp) ELISA Enzyme Linked Immuno- Sorbent Assay (Kỹ thuật miễn

dịch gắn men) HIV Human Immunodeficiency Virus (Virut gây thiếu hụt

OD Optical Density (Mật độ quang học)

PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi

polymeraza) PPD Purified Derivative Protein (Protein chiết xuất tinh khiết) TCYTTG Tổ chức Y tế Thế giới

XQ X – quang

Mục lục

Trang

1 phần A Tóm tắt các kết quả nổi bật của đề tài

Phần B Nội dung báo cáo chi tiết kết quả nghiên cứu đề

1.2 Yếu tố nguy cơ và tình hình nhiễm, mắc bệnh lao 11

1.4.3 Kỹ thuật huyết thanh học chẩn đoán bệnh lao 17

1.5 Kháng nguyên M tuberculosis siêu nghiền sử dụng trong chẩn

đoán huyết thanh học sàng lọc bệnh lao

19

1.6 Chuẩn hoá kỹ thuật ELISA sử dụng kháng nguyên M tuberculosis

siêu nghiền trong chẩn đoán bệnh lao

21

1.6.3 Tính ổn định của ELISA sử dụng kháng nguyên siêu nghiền 22

2.3.1 Phương pháp chế kháng nguyên siêu nghiền từ M.tuberculosis 25

2.3.2 Quy trình thực hiện ELISA sử dụng kháng nguyên M.tuberculosis

3.1 Mức độ kháng thể dịch thể kháng đặc hiệu M tuberculosis trong

huyết thanh các nhóm cộng đồng nghiên cứu

3.1.3 Mức độ kháng thể IgG và IgM huyết thanh đặc hiệu với

M.tuberculosis của bệnh nhân lao phổi mới

3.2 Mối liên quan giữa mức độ kháng thể IgG và IgM đặc hiệu

M.tuberculosis với một số yếu tố dịch tễ học

38

3.2.2 Yếu tố tuổi: Mức độ kháng thể IgG và IgM huyết thanh đặc hiệu

của đối tượng nghiên cứu theo tuổi

41

3.2.3 Điều kiện sinh hoạt xã hội và mức độ kháng thể IgG và IgM huyết

thanh đặc hiệu của các nhóm cộng đồng

42

3.2.4 Phân tích mức độ kháng thể IgG và IgM huyết thanh đặc hiệu ở

nhóm bộ đội học viên theo kết quả phản ứng Mantoux 44

3.3 Bước đầu xác định và theo dõi nhóm đối tượng khoẻ mạnh có đáp

ứng ELISA dương tính với IgG hoặc IgM

46

4.1 Mức độ lưu hành của IgG, IgM và IgA kháng M.tuberculosis

trong huyết thanh các nhóm cộng đồng nghiên cứu

50

4.2 Mối liên quan giữa mức độ kháng thể IgG, IgM huyết thanh đặc

hiệu kháng M.tuberculosis siêu nghiền với một số yếu tố dịch tễ

học

56

4.3 Bước đầu xác định và theo dõi nhóm đối tượng khoẻ mạnh có đáp

ứng ELISA dương tính với IgG và/hoặc IgM nhằm phát hiện sớm

và quản lý nguồn lây

60

phần a

tóm tắt các kết quả nổi bật của đề tài

1 Kết quả nổi bật của đề tài

1.1 Đóng góp mới của đề tài :

- Đề tài nghiên cứu là công trình đầu tiên đánh giá mức độ kháng thể IgG, IgM

và IgA huyết thanh kháng đặc hiệu kháng nguyên M.tuberculosis của một số

nhóm cộng đồng người khoẻ mạnh và bệnh nhân lao phổi mới bằng phương pháp miễn dịch gắn men (ELISA) sử dụng kháng nguyên siêu nghiền chiết xuất từ

M.tuberculosis và bước đầu xác định được mối liên quan của một số yếu tố dịch

tễ học đối với mức độ kháng thể IgG huyết thanh đặc hiệu M.tuberculosis của

cộng đồng

- Thông qua kết quả thu được, đề tài đã đề xuất phương pháp có tính khả thi, góp phần đánh giá tình hình nhiễm lao trong cộng đồng dân cư bằng các chỉ số globulin miễn dịch đặc hiệu với kháng nguyên lao và chẩn đoán sàng lọc bệnh nhân lao

a Hiệu quả và đào tạo:

- Đề tài nghiên cứu cung cấp tài liệu và số liệu có thể dùng để tham khảo trong

đào tạo và nghiên cứu về tình hình mắc, nhiễm lao ở cộng đồng, các yếu tố nguy cơ liên quan đến mức độ nhiễm lao ở cộng đồng

- Đề tài nghiên cứu và kết quả đạt được là nội dung của 01 luận văn tốt nghiệp

đại học đã bảo vệ thành công và sẽ là nội dung cơ bản cho 01 luận án tiến sỹ

b Hiệu quả về kinh tế và xã hội:

- Đề tài đã đánh giá được mức độ kháng thể IgG, IgM và IgA huyết thanh đặc

hiệu M.tuberculosis ở cộng đồng người khoẻ mạnh bình thường và bệnh nhân

lao, xác định được mối liên quan với một số yếu tố dịch tễ học, đóng góp cho việc hoạch định chiến lược phòng ngừa và kiểm soát tình hình nhiễm, mắc lao trong cộng đồng, trong đó có phát hiện sớm, kiểm soát hiệu quả trường hợp bệnh

1.2 Kết quả cụ thể

- 90% cộng đồng người khoẻ mạnh bình thường có mức độ kháng thể dịch thể ở ngưỡng bình thường (giá trị OD trung bình < 0,45, là giá trị ngưỡng được xác

định cho cộng đồng Việt nam khi sử dụng hệ thống ELISA và kháng nguyên siêu

nghiền chiết xuất từ M.tuberculosis), thấp hơn có ý nghĩa thống kê (p<0,001)so

với của nhóm bệnh nhân lao phổi

- Trong số các nhóm cộng đồng người khoẻ mạnh bình thường được nghiên cứu, nhóm bộ đội biên phòng có mức độ IgG và/ hoặc IgM huyết thanh kháng đặc

hiệu M.tuberculosis cao hơn có ý nghĩa thống kê cả về giá trị OD trung bình và

c Một phần nội dung nghiên cứu đã được đăng tải trong tạp chí Y học Thực hành năm 2003; Kết quả nghiên cứu đã được báo cáo tại Hội nghị Khoa học Miễn dịch học năm 2005 do Bộ Y tế kết hợp Viện Y học quân sự 103 tổ chức

d Tổng kinh phí cần thiết thực hiện đề tài : 300 triệu; được cấp 141 triệu đồng Tất cả thuộc kinh phí sự nghiệp khoa học do Bộ Y tế cấp Kinh phí được sử dụng

đúng mục đích và đã được thanh quyết toán đầy đủ, đúng thời hạn Do khuôn khổ kinh phí cấp cho đề tài, không có trang thiết bị nào có giá trị trên 3000 USD

được mua từ nguồn kinh phí đề tài

phần b

nội dung báo cáo chi tiết kết quả nghiên cứu đề tài cấp bộ

Đặt vấn đề

Mycobacterium tuberculosis là một trong những tác nhân gây bệnh nhiễm khuẩn có

tính đặc thù cao ước tính hiện có khoảng một phần ba dân số thế giới bị nhiễm lao Hàng năm có khoảng từ 8 đến 12 triệu trường hợp nhiễm lao tiến triển thành bị mắc lao hoạt động Số tử vong trung bình hàng năm do lao là 3 triệu người, chiếm khoảng 7% tổng số tử vong do tất cả các nguyên nhân và chiếm 26% tổng số tử vong gây ra bởi các bệnh có thể phòng được trên toàn cầu (50, 63)

Theo đánh giá của Tổ chức Y tế thế giới (TCYTTG), Việt nam là một trong 10 nước

có số bệnh nhân lao cao nhất ở Châu á và đứng thứ 11 trong 22 nước có số bệnh nhân lao cao nhất trên thế giới (3) Chương trình phòng chống lao quốc gia đã có nhiều cố gắng để kiểm soát và hạn chế bệnh lao bằng nhiều biện pháp khác nhau như tuyên truyền, giáo dục cộng đồng nhằm làm tăng nhận thức của ngưòi dân với việc phát hiện sớm khả năng mắc lao, điều trị lao miễn phí, giám sát theo dõi điều trị trực tiếp, v.v… ở tuyến trung ương chúng ta đã phát triển được các kỹ thuật chẩn

đoán hiện đại như nuôi cấy sử dụng hệ thống đo phóng xạ BACTEC, kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) phát hiện vi khuẩn lao trực tiếp trong bệnh phẩm bằng khuyếch đại trình tự axit nucleic đặc hiệu của chúng Tuy vậy ở tuyến dưới, việc xác định bệnh vẫn phụ thuộc chủ yếu vào các triệu chứng lâm sàng và soi kính tìm

vi khuẩn kháng cồn kháng toan (AFB) trực tiếp từ bệnh phẩm của bệnh nhân Hơn nữa, việc chẩn đoán sàng lọc ở cộng đồng vẫn chỉ dựa trên phản ứng Mantoux và chụp X-quang (XQ) phim nhỏ, các phương pháp này đều có độ chính xác không cao, dẫn đến việc xác định nguồn lây muộn, nguy cơ lây nhiễm trong cộng đồng tăng và tỷ lệ mắc bệnh tăng

Để làm giảm tỷ lệ mắc cũng như tỷ lệ tử vong do bệnh lao, một trong những biện pháp mà TCYTTG ưu tiên hàng đầu là đẩy mạnh việc phát hiện sớm các trường hợp mắc lao nhằm điều trị kịp thời để loại bỏ nguồn lây, hạn chế tối đa sự lây lan trong cộng đồng cùng với việc sử dụng phác đồ điều trị ngắn ngày có giám sát trực tiếp

(DOTS) Nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới đang cố gắng phát triển các kỹ thuật phát hiện, chẩn đoán sớm bệnh lao dựa trên các kỹ thuật sinh học phân tử để khuyếch đại về mặt số lượng cấu trúc di truyền đặc hiệu Song đối với cộng đồng, để sàng lọc, khảo sát để phát hiện sớm các nguồn lây tiềm tàng chưa được phát hiện hoặc các đối tượng nhiễm lao và có nguy cơ mắc lao cao, kỹ thuật có thể áp dụng phải là kỹ thuật có thể triển khai đại trà, thao tác đơn giản, giá thành rẻ mà kết quả

có thể tin cậy, một kỹ thuật như vậy cho đến nay vẫn chưa được thống nhất

Đối với bệnh lao, miễn dịch qua trung gian tế bào có vai trò quan trọng trong phòng

vệ, còn miễn dịch dịch thể chỉ có ý nghĩa liên quan đến tiến triển bệnh lý (3) Nhiều nghiên cứu đã cho thấy việc xác định mức độ kháng thể kháng đặc hiệu kháng nguyên vi khuẩn lao có thể đóng vai trò quan trọng trong chẩn đoán sàng lọc bệnh lao đồng thời cung cấp thông tin có giá trị về tình trạng đáp ứng miễn dịch dịch thể

đặc hiệu của vật chủ đối với tác nhân gây bệnh lao (16,39,52-53)

Trong hơn một thập kỷ qua nhiều loại kháng nguyên từ vi khuẩn thuộc nhóm M

tuberculosis đã được tách chiết và nghiên cứu sử dụng Đại đa số đều gây phản ứng

chéo với kháng nguyên của Mycobacterium khác hoặc các vi khuẩn khác ở mức độ

nào đó (39) Tuy nhiên người ta đã nhận ra có mối tương quan trực tiếp giữa nồng

độ kháng thể kháng các kháng nguyên này trong cơ thể bệnh nhân với mức độ biểu hiện bệnh về lâm sàng, hình ảnh XQ và mức độ phát tán vi khuẩn ở bệnh nhân lao phổi Đồng thời người ta cũng tìm thấy sự khác nhau ý nghĩa giữa nồng độ kháng thể đặc hiệu trong cơ thể bệnh nhân với nồng độ kháng thể đặc hiệu trong cơ thể người khoẻ mạnh (4,5,7,16,39,52)

Tuy nhiên nhu cầu đòi hỏi cần có một nghiên cứu thực hiện trên một cộng đồng lớn

để nghiên cứu tình trạng nhiễm lao của cộng đồng thông qua các chỉ số miễn dịch

dịch thể ở nước ngoài cũng như trong nước Đề tài:” Nghiên cứu tình trạng đáp ứng

miễn dịch dịch thể kháng Mycobacterium tuberculosis ở một số nhóm cộng đồng người việt nam và một số yếu tố nguy cơ liên quan” sử dụng kháng nguyên M.tuberculosis siêu nghiền, là một tập hợp các kháng nguyên của tế bào vi khuẩn,

được sản xuất bằng cách nghiền tế bào vi khuẩn bằng siêu âm để nghiên cứu mức độ lưu hành globulin miễn dịch IgG, IgM, trong huyết thanh một số nhóm cộng đồng

người Việt nam và bước đầu đánh giá sự liên quan giữa mức độ đáp ứng miễn dịch dịch thể với các yếu tố nguy cơ liên quan dịch tễ học nhằm góp phần kiểm soát các trường hợp nhiễm bệnh, phát hiện sớm trường hợp mắc bệnh, hạn chế sự lan truyền của các chủng lao khác nhau, đặc biệt là các chủng vi khuẩn kháng thuốc giữa các khu vực địa lý khác nhau

Mục tiêu của đề tài:

1 Đánh giá mức độ lưu hành kháng thể IgG, IgM kháng đặc hiệu M tuberculosis

trong huyết thanh của một số nhóm cộng đồng

2 Xác định mối liên quan giữa mức độ đáp ứng miễn dịch dịch thể với một số yếu

tố dịch tễ học

3 Bước đầu xác định và theo dõi nhóm nguy cơ mắc lao cao nhằm gia tăng khả năng phát hiện sớm và quản lý nguồn lây

đến năm 1882 khi Robert Koch tìm ra trực khuẩn lao và một loạt thuốc chống lao

được bắt đầu đưa vào sử dụng từ thập niên 40 của thế kỷ 20, mới làm cho bệnh lao giảm đi ở nhiều nước

Cùng với sự phát triển của kinh tế xã hội, điều kiện vệ sinh phòng bệnh ngày càng tốt hơn cũng như những tiến bộ trong điều trị đã làm cho người ta hy vọng rằng bệnh lao có thể phòng và điều trị được như các bệnh nhiễm khuẩn thông thường khác Chính vì vậy vào những năm 70, 80 người ta đã bàn đến vấn đề thanh toán bệnh lao vào cuối thế kỷ 20 Nhưng đến những năm đầu thập kỷ 90, cùng với quá trình phát triển của đại dịch HIV/AIDS, bệnh lao không những không thuyên giảm mà còn gia tăng ở nhiều nước kể cả các nước phát triển Theo thống kê của TCYTTG vào năm

1994, trong số 18 triệu người bị nhiễm HIV trên toàn thế giới thì có tới 5,6 triệu người bị lao Đến năm 1997, TCYTTG thông báo toàn thế giới có khoảng 1.87 tỷ người nhiễm lao, chiếm 32% dân số thế giới, trong số đó có tới 16,2 triệu trường hợp mắc lao (26) Mỗi năm có 8 triệu người mắc lao mới Hơn 95% số trường hợp mắc lao nằm ở các nước có thu nhập thấp và 80% ở 22 nước có tỉ lệ mắc lao cao nhất bao gồm 10 nước thuộc châu á: ấn độ, Indonexia, Bănglades, Thái lan, Myanma, Trung quốc, Việt nam, Philipin và Camphuchia Đến năm 1998, TCYTTG đã phải cảnh báo: “Bệnh lao đang đe dọa toàn cầu” (45)

Từ khi HIV/AIDS trở thành đại dịch lan tràn khắp thế giới thì tình hình bệnh lao trở nên càng trầm trọng Theo TCYTTG năm 1996, ước tính có tới 9,6 triệu người đồng nhiễm lao/ HIV trên toàn cầu trong đó vùng cận sa mạc Sahara chiếm 6,6 triệu, Nam

á 2,2 triệu người (64) Lao đã trở thành một bệnh nhiễm trùng cơ hội phổ biến nhất

đối với những người nhiễm HIV ở các nước đang phát triển ở ấn độ bệnh lao gặp ở

68.4% người nhiễm HIV, ở Thái lan 52%, Myanma 82% (26) Và từ năm 1993 tất cả các thể lao đã được coi là một trong các tiêu chuẩn chẩn đoán quan trọng trong bảng phân loại chẩn đoán AIDS của trung tâm kiểm soát bệnh dịch Mỹ (CDC) và TCYTTG (64)

1.1.2 Tình hình bệnh lao ở Việt nam

Nhiều đợt điều tra, giám sát qui mô đã được Viện lao và Bệnh phổi phối hợp với địa phương thực hiện liên tục trong gần 20 năm (1957- 75) cho thấy tỉ lệ nhiễm lao chung là 40,3%, tỉ lệ mắc lao trên X-quang là 2,5% (3) Cho tới những năm 80 của thế kỷ 20 công tác phòng chống lao Việt nam đã đạt được những kết quả to lớn Năm 1995, trong bối cảnh chung toàn cầu, tình hình dịch tễ bệnh lao có những biến

động xấu đi, bệnh lao trở lại là một trong những bệnh nguy hiểm hàng đầu đối với thế giới và Việt nam trở thành một nước có tỷ lệ bệnh lao ở mức trung bình cao trong khu vực và ở mức trung bình trên thế giới (26)

Theo số liệu thống kê của TCYTTG năm 1999, thì nguy cơ nhiễm lao của nước ta hàng năm là 1,7% (26) Theo ước tính của Viện lao và Bệnh phổi trung ương phối hợp với TCYTTG năm 2000, bệnh nhân lao mới ở mọi thể là 145.000 (tỷ lệ là 189/100.000 dân), trong đó 65.000 bệnh nhân lao phổi soi AFB dương tính (tỷ lệ 85/100.000 dân), tăng 10% so với năm 1999 (3)

Trong giai đoạn 1997-2002, chương trình Chống lao quốc gia đã phát hiện được 532.703 bệnh nhân lao các thể, đạt tỷ lệ 82% số bệnh nhân ước tính Số bệnh nhân lao Việt nam chiếm 12% tổng số bệnh nhân lao các thể và 15% số bệnh nhân lao phổi mới AFB dương tính của Khu vực Tây Thái bình dương (50) Số liệu ước tính năm 2004 của chương trình chống lao quốc gia cho thấy hàng năm trong cả nước xuất hiện khoảng 154.000 bệnh nhân lao các thể, trong đó có 69.000 trường hợp lao phổi AFB dương tính và tổng số bệnh nhân lao hiện mắc tại một thời điểm là 232.000 trường hợp với tỷ lệ tử vong 25,1/100.000 Tỷ lệ lao trẻ em khoảng 60-61/100.000 trẻ (8)

Tình hình bệnh lao ở những người nhiễm HIV/ AIDS cũng đang tăng nhanh hàng năm Từ khi ca nhiễm HIV/AIDS đầu tiên được phát hiện vào tháng 12/1990 đến tháng 6/1999 đã phát hiện được 2.165 người đồng nhiễm HIV/ lao trong số 18.713

ca HIV dương tính trên toàn quốc (1) Tỷ lệ HIV dương tính trong số bệnh nhân lao năm 2002 trên cả nước được xác định khoảng 3,2%, trong đó có 10 tỉnh lớn hơn 3% (thành phố Hồ Chí Minh:9,4%, Hải phòng là 11,8%, Bình dương là 14% và An giang: 4,8%) (8)

Tình hình bệnh lao kháng thuốc cũng là vấn đề cần quan tâm do là một trong những yếu tố gây gia tăng tỷ lệ mắc lao trong cộng đồng Năm 1996, điều tra kháng thuốc toàn quốc lần thứ nhất cho thấy tỷ lệ kháng thuốc chung của Việt nam là 32,5%, tỷ

lệ kháng đa thuốc là 2,3% Số liệu điều tra tình hình kháng thuốc toàn quốc lần thứ hai năm 2002 cho thấy 3% bệnh nhân mới và 23,5% bệnh nhân cũ đã kháng đa thuốc Tại đồng bằng sông Hồng, tỷ lệ bệnh nhân lao mới kháng đa thuốc bước đầu xác định lên đến 5,5% (8)

1.2 Yếu tố nguy cơ và tình hình nhiễm, mắc bệnh lao

ở những nước công nghiệp phát triển, tỷ lệ mắc bệnh lao giảm đáng kể trong khoảng thời gian từ 1700 đến 1940, trước khi phát triển thuốc chống lao Yếu tố có vai trò liên quan trực tiếp nhất bao gồm chế độ dinh dưỡng và sinh hoạt được cải thiện, sữa được vô trùng và sự cách ly với nguồn gây nhiễm là bệnh nhân lao trong các cơ sở điều dưỡng Sau khi thuốc chống lao được phát hiện và đưa vào sử dụng, tỷ

lệ mắc và chết do lao giảm nhanh hơn ở Mỹ, năm 1953-1983, tỷ lệ mắc hàng năm

giảm khoảng 8% Từ năm 1985 đến 1992, tỷ lệ này lại tăng trở lại 20% Hình ảnh tương tự cũng được nhân thấy ở nhiều nước phát triển khác Yếu tố liên quan lúc này

là sự gia tăng dịch tễ học nhiễm HIV, gia tăng cộng đồng nhập cư từ các nước trong vùng dịch, gia tăng cộng đồng sống lang thang, nghiện hút và đặc biệt nhất là sự giảm sút hiệu quả hoạt động của hệ thống y tế cộng đồng trong phòng chống lao ở những nước này

Dịch tễ học bệnh lao bị ảnh hưởng bởi hai yếu tố quan trọng Yếu tố thứ nhất là sự tiếp xúc với nguồn vi khuẩn lao trong môi trường Yếu tố nguy cơ đối với nhiễm lao thường liên quan đến sự tiếp xúc với bệnh nhân ở Mỹ, yếu tố nguy cơ quan trọng trong nhiễm lao là sống chung cùng với bệnh nhân trong một nhà, dân nhập cư từ vùng dịch (châu á, châu Mỹ La-tinh), tiếp xúc với bệnh nhân chưa điều trị trong các cơ sở công cộng

Yếu tố nguy cơ thứ hai liên quan đến tính nhạy cảm đối với bệnh của cá thể sau khi

bị nhiễm Có nhiều tình trạng liên quan đến miễn dịch tế bào vật chủ gây gia tăng nguy cơ phát triển bệnh Đó là tình trạng nhiễm HIV, độ tuổi nhạy cảm, điều trị ức chế miễn dịch, ung thư, bệnh thận giai đoạn cuối, đái tháo đường, suy dinh dưỡng cấp và can thiệp giải phẫu đường tiêu hoá trên Bên cạnh đó, tiêm chích thuốc cũng liên quan đến gia tăng nguy cơ mắc bệnh Như vậy, cộng đồng có tỷ lệ mắc lao cao bao gồm cả nhóm có nguy cơ nhiễm cao và nhóm có nguy cơ phát triển bệnh cao (32)

Nguy cơ nhiễm lao gia tăng theo tần xuất tiếp xúc với bệnh nhân, với điều kiện sinh sống và chế độ dinh dưỡng nghèo nàn Hiện nay, không chỉ ở các nước đang phát triển, tỷ lệ mắc bệnh lao tăng ở nhiều quốc gia trên thế giới, kể cả những nước phát triển như Mỹ Các yếu tố có khả năng liên quan nhiều đến sự gia tăng nhiễm lao ở những nước này là:

Để xác định các yếu tố nguy cơ đối với bệnh lao, Barr và cộng sự (Neighberhood poverty and the resurgence of tuberculosis in New York city 1984-1992) đã đưa ra một nhóm các yếu tố liên quan trực tiếp đến tình hình cấp thiết trở lại của bệnh lao ở New York Những yếu tố này là bệnh AIDS, cộng đồng di cư từ các vùng đang có dịch, tiêm chích thuốc, đa kháng thuốc và tình trạng sống lang thang không nhà cửa cùng với sự sao nhãng của hệ thống y tế cộng đồng trong lĩnh vực này (12) Kết quả nghiên cứu của Munor và CS (2000) cũng cho thấy đói nghèo từng được coi là yếu

tố nguy cơ kinh điển, tuy nhiên ở vùng có tỷ lệ AIDS và dân nhập cư cao, yếu tố này hiện nay vẫn có vai trò quan trọng đối với bệnh lao: tỷ lệ mắc lao năm 1992 ở 5.482

đối tượng láng giềng là 46,5/100.000 dân và tỷ lệ đói nghèo trung bình là 19,3% Tác giả cũng cho thấy từ năm 1908-1990, tỷ lệ mắc lao tăng khi thu nhập của cộng

đồng này giảm và kết luận thu nhập của nhóm láng giềng có ảnh hưởng trực tiếp nhất lên nguy cơ nhiễm lao và đói nghèo là yếu tố liên quan chặt chẽ với nguy cơ nhiễm lao hơn so với tình trạng nhiễm HIV, chủng tộc hoặc tôn giáo (44)

Đối với sơ nhiễm lao ở trẻ em, yếu tố nguy cơ đáng kể nhất là tiếp xúc với bố mẹ mắc lao hoạt tính đang có các triệu chứng điển hình như ho, soi kính đờm có AFB dương tính hoặc có hình ảnh X-quang đặc trưng Tuy nhiên những yếu tố nguy cơ này ở mức độ khác nhau sẽ đặc trưng cho tình trạng nhiễm hoặc phát bệnh và có thể

đóng vai trò là yếu tố nguy cơ đặc hiệu cho tình trạng nhiễm hoặc bị bệnh của cơ thể (32)

Trẻ em tiếp xúc với bệnh nhân lao có nguy cơ phát triển bệnh cao (44) Mặc dù được tiêm phòng BCG, đáp ứng Mantoux dương tính ở trẻ tiếp xúc trực tiếp với bệnh nhân

lao thiên về chỉ thị sự nhiễm M.tuberculosis của cơ thể, đòi hỏi dược điều trị dự

phòng, đặc biệt cho trẻ dưới 5 tuổi (41-42) Điều này quan trọng trong bối cảnh tỷ lệ mắc lao đang gia tăng ở vùng Châu Phi cận Sahara, nơi có trẻ được tiêm phòng BCG

đang sống tiếp xúc với người lớn mắc lao hoạt tính

ắ ảnh hưởng của tuổi và giới

Một nhận định chung là trong số người mắc lao, số lượng bệnh nhân nam nhiều hơn nữ Về tuổi, thanh niên mới lớn và người già thường mắc bệnh nhiều hơn Tuy nhiên, tình hình này còn phụ thuộc vào giai đoạn của tiến triển, tình hình mắc lao

trong cộng đồng

Tổng hợp số liệu của nhiều nước, Sutherland (1976) đã nêu nguy cơ nhiễm lao tăng theo tuổi, từ trẻ nhỏ đến thanh niên, tuy khác nhau theo mỗi nước nhưng trung bình mỗi năm nguy cơ tăng 5-6%

Về tình hình nhiễm lao ở nam và nữ tại các nước Châu Âu, nhiều tác giả cho thấy từ

30 tuổi trở lên, số mới mắc lao ở nữ thấp hơn so với nam Đối với các lứa tuổi, nhiều thống kê nêu rõ trong vòng 2 thập kỷ (1951-70), ở Châu Âu, bệnh lao trong trẻ em

và người ít tuổi giảm đi rõ (có nơi trên 90% ở lứa tuổi dưới 30) Mức giảm ít hơn nhiều ở người trung và cao niên Đối với lớp người trên 80 tỷ lệ này hầu như không thay đổi (4)

Theo số liệu của Trung tâm kiểm soát bệnh (CDC) Atlanta (57), bệnh lao ảnh hưởng không đồng đều đến nam giới và nữ giới : năm 2000, 62% trường hợp lao xảy ra ở nam giới và 38% - ở nữ giới, như vậy tỷ lệ mắc lao ở nam giới gần gấp đôi so với ở nữ giới (7,4/100.000 và 4,3/100.000) CDC cũng thông báo tỷ lệ mắc lao xẩy ra cao hơn nhiều trong nhóm phạm nhân nhóm tuổi từ 25-44, và trong nhóm cộng đồng sinh sống chật chội

ắ Dân tộc

Có một số dân tộc dễ bị mắc lao, ví dụ những người ở vùng núi xứ Xcôtlen ở Anh trước kia, ở một số nước Trung Phi hoặc sống trên các triền núi Himalaya (Crofton, 1988) Lí do được giải thích là vì những người này sống trong khu vực có điều kiện tiếp xúc vi khuẩn ít, nên sức đề kháng yếu, khi gặp nguồn lây, hoặc khi chuyển sang sống nơi đô thị hoặc các nước công nghiệp, họ dễ mắc lao hơn (3)

ắ Di truyền

Theo Verschner (1952), ở 52 trẻ sinh đôi cùng trứng, 65% phản ứng như nhau đối với bệnh lao trong khi ở 125 cặp khác trứng tỉ lệ đó chỉ là 25% Theo Kallman và Reichner (1943), khi 1 trong 2 trẻ sinh đôi mắc lao, bệnh sẽ xấy ra nhiều gấp 3 lần ở trẻ kia nếu cùng trứng so với khác trứng (3)

I.2.2 Tình hình nhiễm và mắc lao

Mycobacterium tuberculosis là loại vi khuẩn có thành phần cấu tạo khá đặc biệt, khi

xâm nhập vào trong cơ thể người, trong đa số trường hợp, vi khuẩn không bị tiêu diệt mà có thể tồn tại lâu dài ở nội bào, tạo nên trạng thái nhiễm lao thường không

có triệu chứng lâm sàng Chỉ một số người nhiễm lao sẽ trở thành bệnh nhân lao, trong một điều kiện nhất định (47)

Theo nghiên cứu của Sutherland (1968), trong 12.867 trẻ từ 14 dến 15 tuổi, tuberculin âm tính, XQ phổi bình thường, không tiếp xúc với bệnh nhân tại nhà, trong 10 năm, có 10,4% (1335 trẻ) bị nhiễm bệnh và 8.1% (108 trẻ) mắc bệnh Theo dõi 15 năm với tổng số 243 trường hợp nhiễm lao, các tác giả lại thấy 54% mắc bệnh trong vòng 1 năm, và khoảng 80% trong vòng 2 năm sau khi bị nhiễm (3) Tại Saskatchewan (Canada), theo kết luận của Barnet (1997) 6,4% trường hợp bị nhiễm sau đó đã bị mắc một thể lao lâm sàng Một nghiên cứu dịch tễ của Hà lan đã

ước tính sau khi bị sơ nhiễm, nguy cơ mắc bệnh hàng năm ở thể soi AFB dương tính

là 1,2% Theo Stylo (1990), để lập các mô hình về dịch tễ học, có thể đặt định đề là trong 6-8 trường hợp nhiễm lao mới sẽ có thể thấy xuất hiện một trường hợp mắc lao lâm sàng sau này (3)

1.3 Vi khuẩn Mycobacterium

Mycobacterium là tên được gọi do vi khuẩn có hình thái phát triển trong môi trường

lỏng như sợi nấm Giống Mycobacterium thuộc họ Mycobacteriaceae, bộ

Actinomycetes

Vi khuẩn Mycobacterium gồm hơn 54 loài khác nhau Đa số sống ở khắp nơi trong

tự nhiên (đất, nước, cây cối, thức ăn…), một số ít có khả năng gây bệnh ở động vật

và người Đây là nhóm vi khuẩn kháng cồn, kháng axit nhưng tính chất kháng nguyên lại cực kỳ mảnh mai, mờ ảo

Dựa vào tính chất gây bệnh: Mycobacterium được phân thành 3 loại:

• Nhóm Mycobacterium điển hình (M tuberculosis)

• Nhóm Mycobacterium không điển hình (Mycobacterium atypic)

• Nhóm Mycobacterium gây bệnh phong (M leprae, M lepraemurium)

Dựa vào khả năng sinh sắc tố và tốc độ phát triển, Runyon (1959)(48) chia

• Phân nhóm không sinh sắc tố (M tuberculosis, M avium, )

• Phân nhóm mọc nhanh (3-5 ngày, M fortuitum, M chelonei)

Dựa vào khả năng phát triển của vi khuẩn, có thể chia 2 nhóm:

• Mycobacterium mọc chậm (> 7 ngày)

• Mycobacterium mọc nhanh (< 7 ngày)

Mycobacteria có 4 nhóm kháng nguyên chủ yếu: Nhóm kháng nguyên chung (nhóm I) gồm các protein hoặc polysaccharide, arabinogalactan, có nhiều trên bề mặt tế

bào, ribosome (16S); Nhóm kháng nguyên đặc hiệu cho Mycobacteria mọc chậm (nhóm II) gồm protein ∝, gây đáp ứng qua trung gian tế bào; Nhóm kháng nguyên

đại diện cho Mycobacteria mọc nhanh (nhóm III) không có vai trò trong thử nghiệm nội bì và Nhóm các kháng nguyên đặc hiệu chủng (nhóm IV) có vai trò quan trọng

trong thử nghiệm nội bì gồm protein, lipid polysaccharide, và glycolipid (30)

Một số kháng nguyên đang đ−ợc sử dụng trong nghiên cứu và chẩn đoán là nhóm

kháng nguyên hỗn hợp A60 chế từ M bovis, kháng nguyên toàn phần vỏ, kháng

nguyên thành phần vỏ tế bào lipoarabinomannan (LAM), glycolipid, tuberculin, PPD, v.v

1.4 Miễn dịch học bệnh lao

1.4.1 Miễn dịch qua trung gian tế bào

Miễn dịch phòng vệ trong bệnh lao là miễn dịch qua trung gian tế bào Các tế bào có vai trò trong miễn dịch chống lao là các tế bào đơn nhân, đại thực bào, lympho bào

mà chủ yếu là các tế bào thuộc quần thể lympho bào T Miễn dịch chống lao là miễn

dịch đồng tồn, tức là chỉ tồn tại chừng nào còn có sự hiện diện của kháng nguyên vi khuẩn lao ở trong cơ thể Miễn dịch chống lao cũng chỉ là miễn dịch tương đối Một

cơ thể đã có miễn dịch vẫn có thể mắc bệnh lao Sự hiện diện của vi khuẩn trước đó không thể hoàn toàn ngăn cản được sự lan tràn của vi khuẩn mới thâm nhập sau này Người đã được tiêm phòng lao vẫn có khả năng mắc bệnh, tuy có thấp hơn nhiều so với chưa tiêm phòng

1.4.2 Miễn dịch dịch thể trong bệnh lao

Trong mối tương tác giữa vi khuẩn và tế bào, bên cạnh các quần thể lympho bào T còn có sự tham gia của các lympho bào B qua sự kích thích của các lympho bào T

hỗ trợ và do đó sản sinh ra các kháng thể dịch thể Từ đầu những năm 70 người ta đã nhận thấy có sự tăng gamaglobulin huyết thanh và các globulin miễn dịch IgA, IgG trong lao phổi Đặc biệt, người ta thấy các kháng thể thuộc nhóm IgG có liên quan nhiều nhất tới sự phát triển của bệnh lao (3)

Bên cạnh đó, các nghiên cứu đáp ứng miễn dịch dịch thể trên người cho thấy có sự xuất hiện sớm kháng thể IgM đặc hiệu sau đó là IgG đặc hiệu ở giai đoạn muộn hơn của quá trình nhiễm khuẩn Quá trình chuyển đổi từ IgM sang IgG được phát hiện ở hầu hết bệnh nhân lao.Tuy nhiên, trong giai đoạn nhiễm vi khuẩn lao, miễn dịch dịch thể không có khả năng ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn và giúp đỡ cơ thể chống lại bệnh lao

Sự hiển diện của kháng thể dịch thể đựơc sử dụng chủ yếu ngày nay trong huyết thanh học chẩn đoán bệnh lao Việc xác định mức độ kháng thể kháng đặc hiệu kháng nguyên vi khuẩn lao có thể đóng vai trò quan trọng trong chẩn đoán sàng lọc bệnh lao đồng thời cung cấp thông tin có giá trị về tình trạng đáp ứng miễn dịch dịch thể của vật chủ đối với nhiễm khuẩn (18, 39, 52, 53)

1.4.3 Kỹ thuật huyết thanh học trong chẩn đoán bệnh lao

Các kỹ thuật sử dụng chỉ số miễn dịch dịch thể đã được sử dụng trong chẩn đoán lao

từ sau khi Koch tìm ra và mô tả trực khuẩn lao Đây là phương pháp chẩn đoán sàng lọc đơn giản và có thể áp dụng trong nghiên cứu cộng đồng do giá thành không cao

và có thể làm nhiều mẫu cùng một thời điểm

Từ đầu thế kỷ, Vidal (1901) đã tìm cách chẩn đoán huyết thanh học bệnh lao bằng phản ứng gắn bổ thể nhưng do mức độ thiếu chính xác quá cao nên không được ứng dụng Đến năm 1950, phương hướng này lại được phục hồi với kỹ thuật ngưng kết hồng cầu của Middlebrook - Dubos Kết quả đã đạt được mức độ khả quan hơn nhưng sai số còn khá nhiều Theo một theo dõi tại Viện Lao và bệnh phổi trung

ương trên 120 bệnh nhân lao và nhóm đối tượng đối chứng đã có tới 33% dương tính giả và 41% âm tính giả (3) Năm 1959, với kỹ thuật khuyếch tán trên thạch, Parlett

và Youmams thấy có 84% dương tính ở bệnh nhân nặng, 73% ở bệnh nhân trung bình và 57% ở bệnh nhân nhẹ (3) Năm 1962, Takahaki đo kháng thể kháng Phosphat trong huyết thanh và nhận thấy 95% dương tính ở bệnh nhân lao, 12% ở người lành bị nhiễm, xác định bằng phản ứng tuberculin dương tính (3)

Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang được sử dụng từ những năm 60, theo Nassau và Merrick (1970) có tới 96% dương tính ở bệnh nhân lao đang điều trị và 97% âm tính

ở người khoẻ mạnh Tiếp theo, miễn dịch phóng xạ cũng được coi là kỹ thuật cho những kết quả đáng tin cậy Hewitt và Coates (1982), sử dụng các kháng thể đơn dòng đặc hiệu đã phát hiện 72% dương tính ở bệnh nhân và không có dương tính giả

ở người lành (3)

Phương pháp miễn dịch gắn men - ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)

là phương pháp được phát triển và sử dụng nhiều trong những năm gần đây Nghiên cứu của Sieminska (1999) đã chứng minh rằng các trường hợp lao phổi có căn nguyên vi khuẩn được khẳng định có mức độ kháng thể IgG kháng kháng nguyên A60 cao hơn so với các trường hợp lao phổi mà căn nguyên vi khuẩn không được xác định Trong số các trường hợp lao có căn nguyên xác định, mức độ kháng thể kháng kháng nguyên A60 cao hơn ở nhóm bệnh nhân nặng có hang lao Điều này cho thấy mức độ đáp ứng miễn dịch dịch thể tỷ lệ thuận với mức độ kháng nguyên vi khuẩn được trình diện (53)

Kháng nguyên toàn phần màng tế bào (IMAs) của Mycobacterium habana TMC

5135 cũng được sử dụng để phát hiện kháng thể kháng lao trong huyết thanh và dịch tiết của bệnh nhân lao chủ yếu là bệnh nhân lao ngoài phổi và được đánh giá là một

trong những kháng nguyên hứa hẹn trong chẩn đoán bệnh lao Việc sử dụng IMAs

đã làm tăng tỷ lệ dương tính từ 26% với nuôi cấy và 10% với soi kính lên 86% Tất cả các trường hợp dương tính với nuôi cấy đều dương tính với IMAs Ngoài ra người

ta còn thấy có sự tương đồng giữa mức độ đáp ứng kháng thể với nồng độ kháng nguyên vi khuẩn lao trong bệnh phẩm (20)

Kiểm tra bằng kỹ thuật ELISA, Torres M và cộng sự cũng nhận thấy mức độ đáp

ứng kháng thể kháng kháng nguyên 30 KD của Mycobacteria ở nhóm bệnh nhân lao phổi cao hơn nhiều so với nhóm tiếp xúc (58) Kháng nguyên tiết của M

tuberculosis như ESAS-7, EST-DE1, v.v cũng là đối tượng được quan tâm sử dụng

trong chẩn đoán lao phổi và lao ngoài phổi Độ nhạy và độ đặc hiệu của ELISA sử dụng các kháng nguyên trên để phát hiện kháng thể dao động từ 50%-90% và 86%-93% (11)

1.5 Kháng nguyên M tuberculosis siêu nghiền sử dụng trong chẩn đoán huyết

thanh học sàng lọc bệnh lao

Mặc dù trong hơn một thập kỷ qua nhiều kháng nguyên từ M tuberculosis đã được

tách chiết và sử dụng Việc lựa chọn kháng nguyên có thể ảnh hưởng tới kết quả của

kỹ thuật Mức dộ đáp ứng miễn dịch dịch thể của mỗi bệnh nhân lao với các kháng nguyên khác nhau của vi khuẩn lao là khác nhau Cho đến nay vẫn chưa có một kháng nguyên nào được công nhận là có khả năng được nhận biết và gây đáp ứng như nhau ở tất cả các bệnh nhân lao Trên thực tế kháng nguyên tinh khiết thường cho độ đặc hiệu cao, song độ nhạy thấp và nếu kết hợp kết quả khi sử dụng nhiều kháng nguyên khác nhau thì độ nhạy của thử nghiệm gia tăng (7, 33, 60)

Kháng nguyên siêu nghiền là một kháng nguyên dễ sản suất, đặc biệt đối với các nước đang phát triển không có điều kiện để sản xuất kháng nguyên tinh khiết hoặc mua từ bên ngoài với giá thành cao Đây là dạng kháng nguyên tổng hợp, bao gồm toàn bộ các thành phần có mặt trong tế bào của trực khuẩn lao So sánh độ nhạy và

độ đặc hiệu của ELISA xác định kháng thể kháng M tuberculosis khi sử dụng các

loại kháng nguyên khác nhau, người ta đã nhận thấy độ nhạy và độ đặc hiệu của ELISA khi sử dụng kháng nguyên siêu nghiền hầu như tương đương với ELISA sử dụng các kháng nguyên tinh chế, mặc dù các kháng nguyên tinh chế là các kháng

nguyên có tính kính thích miễn dịch cao như kháng nguyên tiết, kháng nguyên tiết tách LAM, kháng nguyên toàn phần vỏ, kháng nguyên A60 và có độ nhạy cao hơn nhiều so với kháng nguyên tinh khiết khác như kháng nguyên lõi vỏ tế bào v.v (58)

Để nghiên cứu hiệu quả chẩn đoán của kháng nguyên siêu nghiền M tuberculosis,

chúng tôi đã sử dụng kháng nguyên này để phát hiện IgG đặc hiệu ở bệnh nhân tràn dịch màng tim do lao Nồng độ IgG kháng lao ở bệnh nhân lao cao hơn có ý nghĩa

so với bệnh nhân nhóm chứng có tràn dịch màng tim do các căn nguyên khác Cụ thể khi đo kết quả ELISA ở bước sóng 450 nm, nồng độ pha loãng huyết thanh và dịch màng tim là 400 lần, IgG dịch màng tim và huyết thanh của bệnh nhân lao TDMT là 0,616 ± 0,098 và 0,586 ± 0,095 so với của bệnh nhân TDMT do nguyên nhân khác là 0,326 ± 0,024 và 0,359 ± 0,026 (P<0.01) Độ nhạy và độ đặc hiệu của ELISA trong nghiên cứu này đạt 84% và 89% (4)

Độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng huyết thanh với các kháng nguyên khác nhau chiết xuất từ M tuberculosis

Kháng nguyên Độ nhạy

(%)

Độ đặc hiệu (%)

64% trường hợp (giá trị OD 450nm trung bình là 0,73 ± 0,23), và không có trường hợp dương tính giả nào trong số 13 bệnh nhân tràn dịch màng phổi do ung thư (giá trị OD 450nm trung bình là 0,24 ± 0,1), đạt độ đặc hiệu 100% Trong số các trường hợp dương tính với ELISA, 75% có kết quả PCR dương tính (43)

Giá trị của ELISA sử dụng kháng nguyên siêu nghiền phát hiện kháng thể IgG đặc

hiệu kháng M tuberculosis trong chẩn đoán lao phổi thể thâm nhiễm người lớn cũng

được đánh giá OD 450 nm trung bình của nhóm bệnh nhân lao so với bệnh nhân bị bệnh phổi khác không do lao là 0,863 ± 0,395 so với 0,252 ± 0,19 (P<0,001) Đạt độ nhạy và độ đặc hiệu là 81% và 95%, giá trị dự báo dương tính và âm tính là 96% và 79% Giá trị OD trung bình cũng tỷ lệ thuận với mức độ tổn thương của lao phổi trên phim XQ trong đó OD trung bình là 0,547 ± 0,261 đối với tổn thương hẹp, 0,785 ± 0,304 đối với tổn thương vừa và 0,976 ± 0,435 đối với tổn thương rộng (P<0,01) (2)

Đối với lao màng não, ELISA sử dụng kháng nguyên siêu nghiền cho độ nhạy 73%,

độ đặc hiệu 100% (3)

1.6 Chuẩn hoá kỹ thuật ELISA sử dụng kháng nguyên M tuberculosis siêu

nghiền trong chẩn đoán sàng lọc bệnh lao

1.6.1 Nồng độ kháng nguyên tối ưu

Qua nhiều nghiên cứu nồng độ kháng nguyên sử dụng trong ELISA phát hiện kháng thể đặc hiệu của các nhóm nghiên cứu trong và ngoài nước, 10àg/ml được xác định

là nồng độ kháng nguyên M.tuberculosis siêu nghiền tối thiểu tối ưu được xác định

phù hợp cho phép phân biệt được bệnh phẩm âm tính và dương tính với điểm ngưỡng là giá trị OD trung bình người Việt nam khoẻ mạnh cộng trừ hai lần độ lệch chuẩn, tương đương với giá trị OD là 0,450 đo ở bước sóng 450 nm (7, 43)

1.6.2 Độ pha lo∙ng huyết thanh tối ưu

Độ pha loãng huyết thanh được khuyến cáo là tuỳ thuộc vào tình hình dịch tễ của từng khu vực Do đặc điểm môi trường ngoại cảnh và điều kiện sống khác nhau, mật

độ phân bố vi khuẩn thuộc nhóm Mycobacteria trong môi trường tự nhiên trên thế

giới khác nhau nên có thể ảnh hưởng đến nồng độ IgG kháng các kháng nguyên

Mycobacteria ở huyết thanh cộng đồng Với điều kiện môi trường nhiệt đới và tỷ lệ

mắc lao cao như ở nước ta, việc đánh giá xác định nồng độ huyết thanh tối ưu trong thử nghiệm miễn dịch gắn men nhằm xác định lượng IgG đặc hiệu là điều cần thiết

để giảm trường hợp dương tính giả cũng như âm tính giả Qua nhiều nghiên cứu

đánh giá mức độ IgG kháng đặc hiệu kháng nguyên lao ở cộng đồng người khoẻ mạnh và bệnh nhân lao Việt nam, chúng tôi đã xác định được nồng độ pha loãng huyết thanh tối ưu đối với cộng đồng người lớn Việt nam là 1/400 Đối với trẻ em, nồng độ pha loãng huyết thanh tối ưu là 1/200 Đây là nồng độ cho phép phân biệt cơ thể nhiễm lao và người khoẻ mạnh (2, 4,7) Đối với một số cộng đồng châu Âu, nồng độ pha loãng huyết thanh 1/100 thường được khuyến cáo sử dụng trong xét nghiệm kháng thể đặc hiệu đối với kháng nguyên lao (39, 58-60)

1.6.3 Tính ổn định của ELISA sử dụng kháng nguyên siêu nghiền

Tính ổn định của ELISA sử dụng kháng nguyên siêu nghiền đã được xác định qua việc thực hiện thử nghiệm trong các ngày khác nhau trên cùng một loạt các mẫu huyết thanh cho thấy thử nghiệm có tính ổn định cao Giá trị OD 450nm của cùng một mẫu huyết thanh dao động không đáng kể trong các thử nghiệm thực hiện ở các thời điểm khác nhau (7)

2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Nhóm cộng đồng khoẻ mạnh

Nhóm cộng đồng khoẻ mạnh với tổng số 3.703 người, gồm:

- Bộ đội biên phòng: 1.458 người bao gồm 265 chiến sĩ thuộc các đơn vị đóng quân ở khu vực phía Bắc (Hải phòng), 433 chiến sĩ thuộc khu vực miền Trung (Nghệ An – Hà tĩnh) và 760 chiến sĩ thuộc khu vực phía Nam (Tây ninh: 238, Biên hoà và Đồng nai: 522)

- Bộ đội học viên tại các trường quân đội (Sơn tây, Vĩnh phúc): 1343

- Nhóm dân cư khỏe mạnh bình thường sống tại vùng nông thôn (Thanh hoá): 141

- Nhóm dân cư, cán bộ, sinh viên sống/làm việc/học tập tại thành phố (Hà nội):

484

- Nhóm trẻ em dưới 10 tuổi đã được tiêm vacxin BCG (Hải phòng) : 277

2.1.2 Nhóm bệnh nhân lao

Bệnh nhân lao trong nghiên cứu này có 580 trường hợp, gồm:

- 357 bệnh nhân lao phổi tiến triển đã được chẩn đoán xác định, thu thập trong hai năm 2001 và 2002 tại Trung tâm lao Phạm Ngọc Thạch, thành phố Hồ Chí Minh

- 223 bệnh nhân lao phổi mới được chẩn đoán phát hiện tại các trung tâm Lao cấp

quận/huyện thuộc Hà nội và Hà tây

2.2 Vật liệu nghiên cứu

- Huyết thanh: lấy khoảng 2ml máu của đối tượng nghiên cứu, chắt huyết thanh và

bảo quản ở –200 C cho đến khi xét nghiệm

- Mẫu đờm được thu thập sau 6 tháng ở các đối tượng có kết quả ELISA duơng tính

để thực hiện phản ứng PCR tìm M.tuberculosis

- Kháng nguyên siêu nghiền của vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis

- Bộ Kit của hãng Lionex (Anh)

- Cộng hợp kháng thể thỏ kháng IgM, IgG người có gắn men Peroxydaza (Sanofi Diagnostic, Pasteur, Pháp)

- Tuberculin PPD tiêm trong da (Viện Văcxin Nha trang)

- Máy đọc ELISA có bước sóng 450nm

- Máy khuyếch đại nhiệt PCR

- Bản nhựa 96 giếng đáy phẳng (của hãng NUNC, Denmark )

- Pipetman loại 20, 200, 1000 microlit và đầu côn tương ứng

- Dung dịch đệm: PBS pH 7,2

- Dung dịch đệm rửa bản: PBS -Tween 0,05 %

Thành phần của PBS:

Na2HPO4 12 H2O 1,72 g Hoặc Na2HPO42 H2O 0,85 g

KH2PO4 0,254 g NaCl 8,5 g

H2O2 5àl

- Dung dịch ngừng phản ứng : H2SO4 1N

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp chế kháng nguyên siêu nghiền từ M.tuberculosis

- Chủng vi khuẩn M.tuberculosis được nuôi cấy trong môi trường Sauton lỏng

(Sauton, 1912) ( 2mM Mg2SO4 , 10mM axit xitric, 2,5mM K2HPO4 , 30mM asparagine, 0,1 ferriamonium xitrat, 830mM glycerol, pH=7,4) trong 8 tuần ở 370C với điều kiện lắc ở tốc độ 100 vòng/phút Thu hoạch vi khuẩn, bất hoạt ở 800C trong vòng 20 phút; ly tâm lấy cặn vi khuẩn, rửa với dung dịch nước muối sinh lý hoặc nước cất vô trùng

- Nghiền hỗn dịch vi khuẩn bằng siêu âm 20 kHz (SME ultrasonicator) trong vòng

10 phút Xác định nồng độ protein trong hỗn dịch vi khuẩn đã nghiền bằng siêu âm Bảo quản ở dạng đông khô hoặc dung dịch ở – 200C trong PBS

2.3.2 Quy trình thực hiện ELISA sử dụng kháng nguyên M.tuberculosis siêu nghiền

1 Phủ bản 96 giếng với kháng nguyên M tuberculosis siêu nghiền: 50 àl kháng nguyên M tuberculosis siêu nghiền (10àg/1ml)/ giếng, ủ ở 370C trong 1 giờ hoặc qua đêm có đậy nắp

2 ủ với huyết thanh: 50 àl huyết thanh đã pha loãng ở nồng độ tối ưu (từ

1:200 đến 1:400) trong PBS-Tween-BSA 1% vào mỗi giếng, ủ ở 370C trong 1giờ, rửa bản 3 lần với PBS-Tween 0,05%

3 ủ với cộng hợp: 50 àl cộng hợp (Kháng thể dê kháng IgG hoặc IgM người

gắn men peroxydasa, hãng Sigma) pha loãng 1/5000 trong PBS-Tween-BSA 1% cho mỗi giếng, ủ ở 370C trong 1giờ, rửa bản 3 lần với PBS-Tween 0,05%

4 ủ với cơ chất: 100àl cơ chất TMB vào mỗi giếng, ủ 370C trong 15 phút

5 Dừng phản ứng bằng H2SO4 1N (100 àl/ giếng)

6 Đọc kết quả: Đọc trên máy đọc ELISA ở bước sóng 450 nm (giá trị

ngưỡng được tính bằng giá trị OD trung bình của người Việt nam khoẻ

mạnh + 2 lần độ lệch chuẩn, đã được tính ở các nghiên cứu trước là 0.45 (3)

2.3.3 Quy trình thực hiện ELISA sử dụng KIT của h∙ng Lionex (Anh):

1 Huyết thanh chuẩn đã đuợc pha loãng sẵn: 100ul/giếng (đối với IgM: chứng

âm, chứng dương yếu và chứng dương; đối với các IgG, IgA: mẫu chuẩn từ 1-4)

2 Pha loãng bệnh phẩm bằng dung dịch pha loãng theo nồng độ tối ưu đã xác

định tuỳ thuộc cộng đồng và nhỏ 100ul/giếng ; ủ 370C X 45 phút

3 Rửa 4 lần bằng dung dịch đệm pha loãng 1/10 với nước cất

4 Nhỏ cộng hợp đã pha sẵn: 100ul/giếng; ủ ở 370C X 30 phút

5 Rửa như bước 4

6 Nhỏ 100ul cơ chất TMB pha sẵn ; ủ trong bóng tối ở 370C X 10 phút

7 Nhỏ 100ul /giếng dung dịch ngừng phản ứng và đo ở bước sóng 450nm

2.3.4 Phương pháp tiêm trong da (Phản ứng Mantoux):

- Dùng syringe 1ml, lấy đúng 0.1 àl dung dịch PPD (Viện Vacxin Nha trang)

và tiêm trong da ở vị trí 1/3 mặt trước cẳng tay

- Sau 72 giờ đo kết quả phản ứng: Sử dụng một thước nhựa dẻo đo đường kính nốt phản ứng (chỉ đo nốt sần xác định được ranh giới cần đo bằng sờ ngón tay, không tính quầng đỏ)

(29,4gr Na-citrat.2H2O/lit), lắc cho đờm loãng đều trong 15 phút, ly tâm lấy cặn Bước 2 Tách ADN của vi khuẩn lao trong bệnh phẩm (phương pháp Boom):

Phá tế bào bằng dung dịch ly giải tế bào chứa Guanidium thiocyanate (120g GuSCN, 100ml 0.1 M Tris-HCl pH 6.4, 22ml 0.2M EDTA pH 8.0 và 2.6 ml Triton

X 100) và Diatom (celite) 20%; tinh khiết và tách ADN bằng Ethanol 70%, acetone

và dung dịch TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1mM EDTA)

Bước 3 Chạy phản ứng PCR: 10ul ADN được cho vào ống phản ứng đã chứa sẵn hỗn dịch mix (NaCl 500 mM, Gelatin 0,1% (w/v), MgCl2 25mM, dNTP (hỗn hợp),

mồi Pt18/INS2 (0,2uM) (Pt18: GTGCGGATGGTCGCAGAGAT-3’; INS2: GCGTAGGCGTCGGTGACAAA-3’), Ampli Taq polymerasa (1U/50ul) và men khử nhiễm Uracil-ADN-glycosylase (UNG) 1U/ul)

5’ Chương trình chạy PCR: 10 phút ở 40OC và 40 chu kỳ PCR gồm 1,5 phút ở 94OC (bất hoạt ADN), 2 phút ở 65OC ( gắn mồi) và 3 phút ở 72OC

- Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 2% (2 gr agarose/100 ml đệm TBE pH 8,3 với 0,89M Tris, 0,89M axit boric và 0,02 EDTA) ở hiệu điện thế 110 V, dòng điện

40 mA, từ 30 đến 45 phút Kết quả đuợc ghi nhận dưong tính khi trên gel agarose

xuất hiện vạch ADN có độ dài phân tử là 249 đôi bazơ

a Phương pháp xử lý số liệu:

Các số liệu thu thập được nhập bằng chương trình EPI-Data 3 và phân tích xử lý thống kê bằng phần mềm Stata 8.0

- So sánh hai giá trị tỷ lệ bằng Test X2;

- Tính tỷ xuất chênh (Odd ration) OR bằng công thức sau:

a/b

OR = -, trong đó a: số truờng hợp dương tính của nhóm phơi nhiễm

c/d b: tổng số trường hợp dương tính của nhóm không phơi

nhiễm c: số trường hợp âm tính của nhóm phơi nhiễm

d: số trường hợp âm tính của nhóm không phơi nhiễm

3 kết quả nghiên cứu

3.1 Mức độ kháng thể dịch thể kháng đặc hiệu M.tuberculosis trong huyết

thanh các nhóm cộng đồng nghiên cứu

Kết quả xác định mức độ kháng thể IgG và IgM huyết thanh kháng kháng nguyên

M.tuberculosis siêu nghiền trên tổng số 4.283 đối tượng thuộc các nhóm cộng đồng

khác nhau trong đó có nhóm bộ đội (2.801 người), nhóm dân cư người lớn sinh sống tại thành phố và nông thôn (625 người), nhóm trẻ em dưới 10 tuổi (277 em) và nhóm bệnh nhân lao phổi mới (580 bệnh nhân) được phân tích và lần lượt nêu trong các bảng số liệu dưới đây Mức độ kháng thể dịch thể đặc hiệu của đối tượng được biểu diễn thông qua giá trị mật độ quang học (OD) và kết quả đáp ứng dương tính khi so với giá trị ngưỡng Giá trị ngưỡng của hệ thống ELISA sử dụng kháng nguyên siêu

nghiền M.tuberculosis phát hiện IgG, IgM đặc hiệu, đã được chúng tôi xác định từ

những nghiên cứu trước (2,4-7), bằng giá trị OD trung bình của cộng đồng người khoẻ mạnh bình thường cộng với hai lần độ lệch chuẩn Giá trị này được xác định là 0,450

3.1.1 Mức độ kháng thể IgG và IgM huyết thanh đặc hiệu của nhóm cộng đồng dân cư khoẻ mạnh bình thường

Trên tổng số 902 đối tượng cộng đồng dân cư người lớn với độ tuổi trung bình tương

đương (27 ± 9,5 và 26 ± 4,5) và trẻ em < 10 tuổi sinh sống tại thành phố (Hà nội,

Hải phòng) và nông thôn (các huyện thuộc Thanh hoá), giá trị OD trong phản ứng ELISA và tỷ lệ có mức độ IgG, IgM huyết thanh đặc hiệu dương tính với kháng

nguyên M.tuberculosis siêu nghiền được xác định, kết quả nêu trong Bảng 1

Giá trị OD trung bình của cộng đồng dân cư thành phố (484 người) đạt 0,209 ± 0,12

đối với IgG và 0,205 ± 0,12 đối với IgM; tỷ lệ đối tượng có mức độ IgG và/hoặc IgM đặc hiệu dương tính trong nhóm này là 4,1% Nhóm cộng đồng dân cư vùng nông thôn Thanh hoá gồm 141 người có giá trị OD trung bình là 0,297 ± 0,17 Tỷ lệ

người có IgG đặc hiệu dương tính với M.tuberculosis đạt 4,9% Mức độ kháng thể

IgG đặc hiệu của 277 trẻ em < 10 tuổi sinh sống tại Hải phòng thấp hơn đáng kể 0,121 ± 0,18 (p<0,05) so với của cộng đồng người lớn Ngược lại, mức độ IgM đặc hiệu của nhóm trẻ em cao hơn so với của người lớn với giá trị OD trung bình đạt 0,258 ± 0,18 và tỷ lệ đối tượng có IgM đặc hiệu dương tính đạt 3,0%

Bảng 1 Mức độ IgG và IgM huyết thanh kháng M.tuberculosis siêu nghiền ở cộng đồng dân cư khoẻ mạnh

Giá trị OD trung bình ±

ĐLC Nhóm cộng đồng Số lượng

(n=902)

Tuổi trung bình

IgG IgM

Tỷ lệ

đáp ứng IgG (+)

Dân cư thành phố 484 27±9,5 0,209 ± 0,12 0,205 ± 0,12 4,1 Dân cư nông thôn 141 26±4,5 0,297 ± 0,17 - 4,9* Trẻ em 277 <10 0,121 ± 0,18 0,258 ± 0,18 3,0**

Chú thích: ĐLC- độ lệch chuẩn; * Tỷ lệ đáp ứng (+) với IgG; ** Tỷ lệ đáp ứng (+) với IgM

3.1.2 Mức độ kháng thể IgG và IgM huyết thanh đặc hiệu của nhóm bộ đội

Kết quả xác định mức độ IgG và IgM huyết thanh đặc hiệu với M.tuberculosis của

2801 bộ đội biên phòng và bộ đội học viên được nêu trong Bảng 2

Bảng 2 Mức độ IgG và IgM kháng M.tuberculosis siêu nghiền ở cộng đồng bộ

đội khoẻ mạnh (biên phòng và học viên các trường )

Giá trị OD trung bình ±

ĐLC Nhóm cộng đồng

Số lượng (n=2801

Tuổi trung

Tỷ lệ

đáp ứng IgG (+)

Tuổi trung bình của nhóm bộ đội dao động từ 23,2 ± 4,0 (bộ đội học viên) đến 26,8

± 6,3 (bộ đội biên phòng) Giá trị OD xác định IgG đặc hiệu trung bình của hai nhóm dao động từ 0,231 ± 0,14 đến 0,287 ± 0,18 và tỷ lệ đáp ứng dương tính đạt 5,0% (bộ đội học viên) và 10,9% (bộ đội biên phòng) Trong tổng số 1.458 bộ đội biên phòng, có 265 bộ đội biên phòng phía Bắc (Hải phòng), 433 bộ đội biên phòng miền Trung (Nghệ an-Hà tĩnh) và 760 bộ đội biên phòng đóng quân tại khu vực phía Nam (Tây ninh, Biên hoà) Độ tuổi trung bình của ba nhóm bộ đội biên phòng tương

đương nhau Kết quả thu được nêu trong Bảng 2 cho thấy mức độ kháng thể IgG và

IgM đặc hiệu M.tuberculosis của các nhóm bộ đội đóng quân ở ba khu vực đều

tương đương nhau với giá trị OD IgG đặc hiệu dao động từ 0,254 ± 0,157 đến 0,292

± 0,132 và giá trị OD đối với IgM dao động từ 0,166 ± 0,099 đến 0,269 ± 0,123

Phổ phân bố các giá trị OD đối với IgG và IgM kháng M.tuberculosis ở các nhóm

bộ đội biên phòng khu vực khác nhau được biểu diễn trên Hình 1-6

►Bộ đội biên phòng khu vực phía Bắc (Hải phòng)

Giá trị OD trung bình đối với IgG và IgM của 265 mẫu huyết thanh thu thập từ nhóm bộ đội Hải phòng là 0.292 ± 0.132 và 0.190 ± 0.105 Phổ dao động của hầu hết các giá trị OD đối với IgG và IgM của nhóm này không lớn, phần lớn nằm dưới giá trị ngưỡng, đặc biệt rất tập trung đối với chỉ số IgM với độ lệch chuẩn trung bình

Hình1: Phân bố của bộ đội Hải phòng

theo mức độ đáp ứng IgG đặc hiệu lao

chỉ khoảng 0,105 (Bảng 1)

►Bộ đội biên phòng khu vực miền Trung (Nghệ an-Hà tĩnh)

Nhóm bộ đội Nghệ an Hà tĩnh có giá trị OD trung bình đối với IgG là 0,286 ± 0,164

và đối với IgM là 0,269 ± 0,123 So với phổ dao động của cả hai chỉ số IgG và IgM

thu đ−ợc từ bộ đội Hải phòng, nhóm bộ đội Nghệ an-Hà tĩnh có phổ dao động rộng hơn với độ lệch chuẩn của giá trị IgG là 0,164 và của giá trị IgM là 0,123 (Hình 3,4), tuy nhiên sự khác biệt ch−a có ý nghĩa thống kê

0

Hình 4: Phân bố của bộ đội Nghệ an - Hà tĩnh theo mức độ đáp ứng IgM đặc hiệu lao

Hình 7: Phân bố của bộ đội Biên Hoà theo mức độ đáp

ứng IgG đặc hiệu lao

Hình 8: Phân bố của bộ đội Biên Hoà theo mức độ đáp

ứng IgM đặc hiệu lao

►Bộ đội biên phòng khu vực phía Nam (Biên hoà, Tây ninh)

Nhóm bộ đội biên phòng đóng quân ở khu vực phía Nam (Biên hoà và Tây ninh)

cũng có mức độ IgG (0.266 ± 0.19) và IgM (0.166 ± 0.1) đặc hiệu tương đương với

hai nhóm bộ đội trên (Bảng 2) Phổ dao động của các giá trị OD đối với IgG và IgM

đều nhỏ, và không đáng kể đối với IgM (Hình 5,6)

3.1.3 Mức độ kháng thể IgG và IgM huyết thanh đặc hiệu với M.tuberculosis siêu nghiền của bệnh nhân lao phổi mới

Giá trị OD trung bình xác định được khi đo phản ứng IgG và IgM huyết thanh kháng

kháng nguyên M.tuberculosis của 580 bệnh nhân lao phổi mới là 0,491 ± 0,36 và

0,360 ± 0,24 Bệnh nhân lao được chia làm hai nhóm dựa trên kết quả soi kính tìm trực khuẩn kháng cồn kháng axit (AFB): nhóm AFB âm tính (gồm 182 bệnh nhân)

và nhóm AFB dương tính (398 bệnh nhân) Bệnh nhân AFB âm tính có giá trị OD IgG và IgM đặc hiệu trung bình là 0,451 ± 0,320 và 295 ± 0,209, khác biệt có ý nghĩa thống kê so với giá trị tương ứng của nhóm AFB dương tính (0,531 ± 0,408 và 0,426 ± 0,282) (Bảng 3)

Bảng 3 Giá trị OD IgG, IgM đặc hiệu M.tuberculosis siêu nghiền và tỷ lệ đáp ứng dương tính ở bệnh nhân lao phổi mới

Giá trị OD và tỷ lệ (+) Nhóm bệnh nhân:

Tỷ lệ (+) IgG + IgM

Bệnh nhân lao phổi AFB (+) 398 0,531 ± 0,41

tỷ lệ này gia tăng đến 67,0% và 50,5% (Bảng 3)

3.1.4 So sánh mức độ kháng thể IgG đặc hiệu của các nhóm cộng đồng nghiên cứu

Mức độ kháng thể IgG huyết thanh đặc hiệu kháng M.tuberculosis siêu nghiền của

các nhóm cộng đồng khác nhau được biểu diễn thông qua giá trị OD trung bình và

tỷ lệ % đáp ứng dương tính trong các Hình 7, 8 và 9

Hình 7 Giá trị OD trung bình và phổ dao động trong phản ứng xác định IgG huyết thanh đặc hiệu kháng M.tuberculosis của các cộng đồng nghiên cứu

(Chú thích: AFB(+): bệnh nhân lao soi kính đờm dương tính; AFB(-): bệnh nhân lao soi kính đờm

âm tính;BĐBP: bộ đội biên phòng; BĐHV: bộ đội học viên, CĐTP: cộng đồng thành phố; CĐNT: cộng đồng nông thôn)

► So sánh giá trị OD trung bình

Giá trị OD trung bình trong phản ứng xác định IgG huyết thanh đặc hiệu với

M.tuberculosis của nhóm bộ đội biên phòng cao hơn có ý nghĩa thống kê so với các

nhóm cộng đồng khoẻ mạnh khác Bệnh nhân lao phổi mới có giá trị OD trung bình cao hơn có ý nghĩa thống kê so với giá trị này của nhóm các cộng đồng khoẻ mạnh (p<0,01) Trong nhóm bệnh nhân lao phổi mới, bệnh nhân AFB (+) có giá trị OD trung bình cao hơn có ý nghĩa thống kê so với bệnh nhân AFB (-) Giá trị OD của