Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano chứa epigallocatechin gallate (egcg) từ chiết xuất trà xanh bằng phương pháp tự kết tạo

Khảo sát các yếu tố chính ảnh hưởng lên sự hình thành và đặc tính tiểu phân nano tự kết tạo tải EGCG bao gồm: tỉ lệ lecithin:chitosan kl:kl, nồng độ poloxamer 407%, tốc độ khuấy vòng/phú

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS TS PHẠM ĐÌNH DUY

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu, kết quả nêu trongluận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nàokhác

TP Hồ Chí Minh, ngày 04 tháng12 năm 2021

Bùi Thị Ánh Mai

Luận văn Thạc sĩ dược học – Năm 2019 – 2021 NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ TIỂU PHÂN NANO CHỨA EPIGALLOCATECHIN GALLATE (EGCG) TỪ CHIẾT XUẤT TRÀ XANH

BẰNG PHƯƠNG PHÁP TỰ KẾT TẠO

Bùi Thị Ánh Mai Giảng viên hướng dẫn: PGS TS Phạm Đình Duy TÓM TẮT

Đặt vấn đề

Đề tài được thực hiện nhằm xây dựng công thức điều chế tiểu phân nano chứaEpigallocatechin gallate (EGCG) bằng phương pháp tự kết tạo và đánh giá một sốđặc tính của tiểu phân nano tạo thành

Phương pháp nghiên cứu

Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng EGCG bằng phương pháp quangphổ UV – vis và HPLC

Khảo sát các yếu tố chính ảnh hưởng lên sự hình thành và đặc tính tiểu phân nano

tự kết tạo tải EGCG bao gồm: tỉ lệ lecithin:chitosan (kl:kl), nồng độ poloxamer 407(%), tốc độ khuấy (vòng/phút), nhiệt độ (ºC) và thời gian đun hồi lưu (giờ) Tiếnhành đánh giá 5 thông số bao gồm kích thước tiểu phân nano (nm), chỉ số đa phântán PDI, thế zeta (mV), hiệu suất bắt giữ (%), hiệu suất tải (%) Từ kết quả khảo sát,chọn ra các thông số quy trình và thành phần công thức có khả năng tạo ra tiểu phânnano có đặc tính lý hóa mong muốn Tiến hành điều chế các công thức với nồng độEGCG trong pha cồn là 10 mg/mL, 5 mg/mL So sánh 5 thông số hóa lý và độ ổnđịnh trong 7 ngày để chọn ra công thức cho các đặc tính lý hóa như mong muốn và

ổn định trong thời gian khảo sát

Điều chế 3 lô công thức đã chọn với cỡ lô 100 mL Đánh giá một số tính chất của hệtiểu phân nano tự kết tạo tải EGCG về cảm quan, kích thước tiểu phân, chỉ số đaphân tán, thế zeta, hiệu suất bắt giữ, hiệu suất tải, phổ quét nhiệt vi sai

Kết quả nghiên cứu

Công thức được chọn để điều chế tiểu phân nano tự kết tạo tải EGCG chứa 40 mgEGCG, 100 mg Lipoid S100, 5 mg chitosan, 300 mg poloxamer 407, 10 µL acidacetic trong 100 mL hỗn dịch

Hệ nano tự kết tạo tải EGCG điều chế theo công thức được chọn cho kích thước tiểuphân 80,98 ± 10,06 nm; PDI 0,260 ± 0,019; thế zeta +17,17 ± 3,31 mV; hiệu suấtbắt giữ 89,90 ± 2,09 %; hiệu suất tải hoạt chất 26,07 ± 0,89 %

Kết luận

Đề tài đã xây dựng được công thức để điều chế tiểu phân nano tự kết tạo tải EGCG

và đánh giá các yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành và đặc tính tiểu phân nano tựkết tạo tải EGCG

PREPARATION OF EPIGALLOCATECHIN GALLATE (EGCG) FROM GREEN TEA EXTRACT LOADED SELF–ASSEMBLED NANOPARTICLES

Bui Thi Anh Mai Supervisor: Assoc Prof PhD Pham Dinh Duy ABSTRACT

Introduction

This essay was carried out to establish the formula of EGCG loadedself – assembled nanoparticles and to evaluate some characteristics of EGCG loadedself – assembled nanoparticles

Prepare 3 chosen formula samples with batch size 100 mL Evaluate somecharacteristics of EGCG loaded self-assembled nanoparticles about appearance,nanoparticle size, polydispersity index, zeta potential, entrapment efficiency, drugloading and differential scanning calorimetry

Chosen formula of EGCG loaded self-assembled nanoparticles has 40 mg EGCG,

100 mg Lipoid S100, 5 mg chitosan, 300 mg poloxamer 407, 10 µL acetic acid in

100 mL suspension

EGCG loaded self-assembled nanoparticles prepared following chosen formula hasparticle size of 80,98 ± 10,06 nm; PDI 0,260 ± 0,019; zeta potential +17,17 ± 3,31mV; entrapment efficiency 89,90 ± 2,09 %; drug loading 26,07 ± 0,89 %

Conclusion

This essay has developed the formula of the EGCG loaded self – assemblynanoparticles and evaluated the factors affecting the formation and characteristics ofnanoparticles

MỤC LỤC v

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT viii

DANH MỤC CÁC BẢNG ix

DANH MỤC CÁC HÌNH xi

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 TỔNG QUAN HỆ TIỂU PHÂN NANO TẢI HỢP CHẤT DƯỢC LIỆU 3

1.1.1 Công nghệ nano trong nghiên cứu phát triển các hợp chất dược liệu 3

1.1.2 Các hệ tiểu phân nano tải hoạt chất dược liệu 4

1.2 CÔNG NGHỆ NANO TỰ KẾT TẠO VỚI PHOSPHATIDYLCHOLINE VÀ CHITOSAN 7

1.2.1 Phosphatidylcholin 8

1.2.2 Đặc tính của chitosan 9

1.2.3 Cơ chế tự kết tạo 10

1.2.4 Ưu nhược điểm của phương pháp tự kết tạo với chitosan và phosphatidylcholine 12

1.3 TỔNG QUAN VỀ EPIGALLOCATHECHIN GALLATE (EGCG) 13

1.3.1 Tính chất lý hóa liên quan tới bào chế 13

1.3.2 Tác dụng dược lý 14

1.3.3 Dược động học và độc tính 16

1.4 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ EGCG DƯỚI DẠNG NANO 17

1.4.1 Tiểu phân nano chitosan chứa EGCG 17

1.4.2 Tiểu phân nano EGCG được bao bởi folate liên hợp chitosan 18

1.4.3 Phức bao nano (nanocomplexes) beta lactoglobulin chứa EGCG 19

1.4.5 Hệ vi hạt Maltodextrin-gôm arabic tải phytosome nhằm phân phối chiết

xuất trà xanh 19

1.4.6 Phytosome chứa polyphenol chiết xuất từ lá trà xanh 20

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 21

2.1.1 Nguyên liệu và hóa chất 21

2.1.2 Dụng cụ, trang thiết bị 21

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.2.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng EGCG bằng UV-vis và HPLC 22

2.2.2 Xây dựng công thức hỗn dịch nano tải EGCG và đề xuất quy trình bào chế 27

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 33

3.1 KẾT QUẢ XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG EGCG BẰNG UV-VIS VÀ HPLC 33

3.1.1 Kết quả xây dựng và thẩm định quy trình định lượng EGCG bằng UV-Vis 33

3.1.2 Kết quả xây dựng và thẩm định quy trình định lượng EGCG bằng HPLC 37

3.2 KẾT QUẢ XÂY DỰNG CÔNG THỨC HỖN DỊCH NANO TẢI EGCG VÀ ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH BÀO CHẾ 44

3.2.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố công thức, quy trình đến tính chất tiểu phân nano tải EGCG và lựa chọn thông số 44

3.2.2 Kết quả đo thông số hóa lý, phổ quét nhiệt vi sai của công thức được chọn và đề xuất quy trình bào chế 55

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 62

4.1 XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG EGCG BẰNG UV-VIS VÀ HPLC 62

4.2 XÂY DỰNG CÔNG THỨC HỖN DỊCH NANO TẢI EGCG VÀ ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH BÀO CHẾ 62

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 67

5.1 KẾT LUẬN 67

5.2 KIẾN NGHỊ 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

PHỤ LỤC 1 – COA EGCG NGUYÊN LIỆU

PHỤ LỤC 2 – COA EGCG CHUẨN

PHỤ LỤC 3 – THÔNG SỐ THẨM ĐỊNH EGCG BẰNG HPLC

PHỤ LỤC 4 – KẾT QUẢ ĐO KÍCH THƯỚC HẠT, CHỈ SỐ ĐA PHÂN TÁN VÀ THẾ ZETA CỦA 3 MẪU NANO EGCG

PHỤ LỤC 5 – KẾT QUẢ QUÉT NHIỆT VI SAI

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

TỪ VIẾT TẮT TỪ NGUYÊN NGHĨA TIẾNG VIỆT

calorimetry

Quét nhiệt vi sai

EGCG Epigallocatechin gallate

FTIR Fourier transform infrared

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

ICH International Conference on

Harmonization

RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối

microscopy

Kính hiển vi điện tửtruyền qua

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1.Đặc tính lý hóa của EGCG 13

Bảng 2.2 Danh sách các nguyên liệu, hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 21

Bảng 2.3 Danh sách các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 22

Bảng 2.4 Công thức bào chế dự kiến cho 100 mL hỗn dịch nano tải EGCG 27

Bảng 2.5 Các thông số của quy trình pha chế hỗn dịch nano EGCG 27

Bảng 2.6 Thông số quy trình và tỉ lệ thành phần các công thức khảo sát 30

Bảng 2.7 Thông số quy trình và tỉ lệ thành phần các công thức khảo sát 31

Bảng 2.8 Các chỉ tiêu và kết quả mong muốn 32

Bảng 3.9 Kết quả đo tính tuyến tính 34

Bảng 3.10 Kết quả khảo sát độ chính xác 35

Bảng 3.11 Kết quả khảo sát độ đúng 36

Bảng 3.12 Kết quả xác định tính tương thích hệ thống 38

Bảng 3.13 Số liệu đường tuyến tính định lượng EGCG 41

Bảng 3.14 Kết quả xác định độ chính xác mẫu thử 43

Bảng 3.15 Kết quả xác định độ đúng 43

Bảng 3.16 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các thông số quy trình (n = 3) 44

Bảng 3.17 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ lecithin : chitosan và nồng độ Poloxamer 407 (n = 3) 48

Bảng 3.18 Giá trị các yếu tố trong công thức khảo sát 51

Bảng 3.19 Kết quả khảo sát công thức với nồng độ EGCG trong pha cồn là 10 mg/mL (n = 3) 52

Bảng 3.20 Kết quả theo dõi độ ổn định của công thức 11 (n = 3) 53

Bảng 3.21 Kết quả khảo sát công thức với nồng độ EGCG trong pha cồn là 5

mg/mL (n = 3) 54

Bảng 3.22 Kết quả hiệu suất bắt giữ và hiệu suất tải của các công thức khảo sát (n = 3) 54

Bảng 3.23 Kết quả theo dõi độ ổn định của công thức 21 và 22 (n = 3) 55

Bảng 3.24 Kết quả đo thông số hóa lý của mẫu nano EGCG được chọn (n = 3) 56

Bảng 3.26 Các thông số của quy trình pha chế hỗn dịch nano tải EGCG 60

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Hai loại tiểu phân nano polymer 5

Hình 1.2 Cấu trúc liposome 7

Hình 1.3 Sơ đồ biểu diễn sự tương tác của chitosan và phospholipid để tạo thành tiểu phân nano tự kết tạo (SACPNs) 8

Hình 1.4 Cấu trúc hóa học của chitosan 9

Hình 1.5 Sự chuyển dạng của chitosan trong môi trường acid 10

Hình 1.6 Cơ chế tự kết tạo với chitosan 11

Hình 1.7 Cấu trúc hóa học của EGCG 13

Hình 2.8 Lưu đồ điều chế tiểu phân nano EGCG 28

Hình 3.9 Phổ UV-vis của (A) mẫu chuẩn, (B) mẫu thử, (C) mẫu thử thêm chuẩn và (D) mẫu placebo 33

Hình 3.10 Đường biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ EGCG và độ hấp thu 35

Hình 3.11 Sắc ký đồ tính đặc hiệu 40

Hình 3.12 Đường biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic 42

Hình 3.13 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tốc độ khuấy 45

Hình 3.14 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đun hồi lưu 46

Hình 3.15 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian đun hồi lưu 47

Hình 3.16 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ lecithin và chitosan 49

Hình 3.17 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Poloxamer 407 50

Hình 3.18 Hỗn dịch nano tự kết tạo tải EGCG theo công thức được chọn 56

Hình 3.19 Đồ thị phân bố kích thước tiểu phân của công thức đã chọn 57

Hình 3.20 Đồ thị thế zeta của công thức đã chọn 58

Hình 3.21 Kết quả quét nhiệt vi sai 59

Hình 3.22 Lưu đồ điều chế tiểu phân nano tải EGCG bằng phương pháp tự kết tạo 61

MỞ ĐẦU

Trà xanh, chiết xuất từ cây trà Camellia sinensis được xem là một loại thức

uống quen thuộc và mang tính toàn cầu Ngoài chức năng giải khát, trà còn có tácdụng sinh lý rất rõ rệt đối với sức khỏe con người Lá trà xanh có chứa chất xơ,protein, lipid, vitamin và khoáng chất, chất chuyển hóa thứ cấp như sắc tố,polyphenol Trong đó, EGCG là polyphenol chiếm tỷ lệ cao và được quan tâmnhiều do có hoạt tính mạnh nhất [26]

EGCG trong lá trà xanh đã nhận được sự chú ý đáng kể trong nhiều nghiêncứu do có khả năng chống oxy hóa mạnh [26], bảo vệ tim mạch [23], kháng insulin[36], chống béo phì [26], kháng viêm [51] [45], kháng ung thư [47],… Các nghiêncứu gần đây về mối liên hệ giữa flavonoid và nguy cơ tim mạch cho thấy việc sử

dụng EGCG giúp làm giảm nguy cơ tim mạch [26] Trong một số nghiên cứu in

vitro, EGCG cho thấy tác dụng chống oxy hóa cao hơn nhiều so với các catechin

khác, chứng tỏ có tiềm năng lớn trong điều trị bệnh [26] [1]

Tuy nhiên, tác dụng trị liệu của EGCG bị hạn chế do sinh khả dụng theođường uống thấp (nhỏ hơn 5%), độ ổn định kém, khó thấm qua màng ruột do bảnchất phân cực mạnh với cấu trúc phân tử có nhiều nhóm OH- [15] Các nghiên cứutrước đây đã cải thiện nhược điểm này bằng cách tạo ra các tiền dược như AcEGCG[24] hoặc sử dụng EGCG cùng với các hoạt chất khác như piperine [25], rutin [57],cafein [35] Đặc biệt, nghiên cứu bào chế tiểu phân nano được xem là có tiềm nănglớn trong việc bảo vệ và tăng cường sinh khả dụng của các hoạt chất dược liệu nóichung và EGCG nói riêng [7] Đề tài “Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano chứaepigallocatechin gallate (EGCG) từ chiết xuất trà xanh bằng phương pháp tự kếttạo” được thực hiện nhằm phát triển dạng bào chế nano cho EGCG nhằm tăng độ ổnđịnh, cải thiện độ hấp thu và sinh khả dụng của nó

Mục tiêu nghiên cứu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan hệ tiểu phân nano tải hợp chất dược liệu

1.1.1 Công nghệ nano trong nghiên cứu phát triển các hợp chất dược liệu

Từ xa xưa, cùng với sự phát triển của con người, thuốc từ dược liệu đã được sửdụng để chữa bệnh Tuy ngày nay nền công nghiệp hóa dược phát triển nhưng thuốc

từ dược liệu vẫn được sử dụng nhiều do ít tác dụng phụ và độc tính, tiết kiệm chiphí Bên cạnh đó, sự phong phú về thành phần hóa học trong dược liệu và làm cáchnào để cải thiện sinh khả dụng của các thuốc từ dược liệu là đề tài được quan tâmchú ý của các nhà khoa học Thống kê cho thấy từ năm 1981 đến 2006 có xấp xỉ50% thuốc được chấp nhận đưa vào thị trường có nguồn gốc trực tiếp hoặc gián tiếp

từ chiết xuất tự nhiên [6]

Cũng giống như những loại thuốc khác, để có được tác dụng, thuốc từ dược liệu cầnđến được nơi tác động và duy trì được nồng độ trị liệu Tuy nhiên, đa số các hợpchất dược liệu như flavonoid, tannin, terpenoid, tan tốt trong nước nhưng được hấpthu kém do không thể thấm qua màng lipid của tế bào, kích thước phân tử lớn, dẫnđến sinh khả dụng và hiệu quả bị giảm sút đáng kể Một số hợp chất dược liệukhông được sử dụng trên lâm sàng do những rào cản trên Các nghiên cứu chỉ ra

rằng các thuốc từ dược liệu cho hoạt tính tốt trong các thử nghiệm in vitro nhưng lại không thể tái lập trong thử nghiệm in vivo [6] Vì vậy, công nghệ nano tải các hợp

chất dược liệu được đề xuất nhằm phát huy tiềm năng điều trị bệnh của các hợp chấtdược liệu, giảm liều dùng và tác dụng phụ, đồng thời tăng hoạt tính của thuốc nhờnhững ưu điểm như [2] [37]:

- Bảo vệ hoạt chất không bị ảnh hưởng bởi các tác nhân bên ngoài trong quá trìnhbảo quản và các tác nhân bên trong cơ thể khi sử dụng, bảo vệ các mô, tế bào lànhđối với các hoạt chất độc tính cao, gây nhiều tác dụng phụ

- Thay đổi đặc tính giải phóng hoạt chất

- Tránh hiện tượng đa đề kháng thuốc

- Có thể đi qua các mao mạch nhỏ nhất

- Thâm nhập được vào khoảng giữa các mô và tế bào để đến các cơ quan đích như:gan, lách, phổi, tủy sống, hệ bạch huyết.

- Tăng tính bám dính trên bề mặt sinh học nhằm tăng khả năng hấp thu hoạt chất

- Tăng diện tích tiếp xúc bề mặt giúp tăng tốc độ phóng thích hoạt chất

- Tăng sinh khả dụng, giảm sự hấp thu có biến đổi, giảm được liều sử dụng

Sử dụng các hệ thống phân phối thuốc khác nhau dựa trên công nghệ nano, chẳnghạn như hạt nano polymer, tiểu phân nano lipid rắn (SLN), liposome và vi nhũtương,… là một giải pháp đầy hứa hẹn để cải thiện hoạt tính sinh học của hợp chấtdược liệu đồng thời khắc phục các vấn đề mà các thuốc từ dược liệu truyền thốngchưa khắc phục được

Tiểu phân nano là các tiểu phân phân tán cấu trúc đa phân tử có kích thước từ 1 nmđến 1000 nm, với một cấu trúc thiết kế thích hợp có vai trò như một phương tiệnchuyên biệt, đảm bảo chuyển giao hoạt chất đến đích sinh học

Tiểu phân nano rất đa dạng về cấu trúc, thành phần và đặc tính bề mặt Có thể phânloại tiểu phân nano như sau [2]:

- Phân loại theo thành phần: Tiểu phân nano cấu tạo polymer (polymericnanoparticles), tiểu phân nano cấu tạo lipid (lipid nanopartilces), tiểu phân nano cấutạo vô cơ (inorganic nanoparticles)

- Phân loại theo cấu trúc: tiểu phân cấu trúc dạng màng bao, tiểu phân cấu trúc dạngkhung xốp (matrix), tiểu phân cấu trúc dạng phức hợp (complex)

- Phân loại theo tính chất bề mặt tiểu phân: tiểu phân nano thụ động (passivenanoparticles), tiểu phân nano Stealth® (Stealth® nanoparticles), tiểu phân nanochủ động (active nanoparticles)

1.1.2 Các hệ tiểu phân nano tải hoạt chất dược liệu

Tiểu phân nano polymer:

Tiểu phân nano polymer là các tiểu phân phân tán cấu tạo đa phân tử polymer, kíchthước khoảng từ 10-1000 nm Cấu trúc tiểu phân nano polymer thường có 2 dạng

chính: nang nano (nanocapsule) và cầu nano (nanosphere) (Hình 1.1) [2] [12] So

với các dạng bào chế truyền thống, tiểu phân nano polymer giúp làm tăng độ tan,

giảm liều sử dụng, cải thiện độ hấp thu của hoạt chất Ngoài ra, tiểu phân nanopolymer còn có lợi khi được sử dụng trong máu, bởi vì chúng ổn định, không độchại, không gây dị ứng, không viêm, không kích hoạt bạch cầu trung tính, và tránh

hệ thống lưới nội mô Đôi khi, các hạt nano polymer được sử dụng để tiếp cận các

mô cụ thể hoặc hoạt động như một tế bào bề mặt [6] Tiểu phân nano polymer đượcứng dụng với các hợp chất tự nhiên như: curcumin [56], paclitaxel [18], berberine[8], quercetin [5] ,…

Hình 1.1 Hai loại tiểu phân nano polymer [12]

Tiểu phân nano lipid:

Tiểu phân nano lipid là các tiểu phân phân tán cấu tạo đa phân tử lipid, gồm một lớpmàng đơn lipid, bao quanh một lõi chứa lipid ở trạng thái rắn, lỏng hoặc rắn-lỏng ởnhiệt độ bảo quản cũng như ở nhiệt độ cơ thể (37°C), kích thước khoảng từ 10 nm –

1000 nm, với thiết kế phù hợp có vai trò như một phương tiện vận chuyển chuyênbiệt, đảm bảo chuyển giao hoạt chất đến đích tác dụng theo một đường dẫn thuốcphù hợp vào cơ thể người [2]

Tùy vào trạng thái của lõi lipid mà tiểu phân nano lipid được phân loại thành:

Tiểu phân nano polymer

Cầu nano (Nanosphere) Nang nano (Nanocapsule)

Lõi Khung xốp polymer

Hoạt chất

Màng polymer polymer

- Tiểu phân nano lipid rắn (SLN): lõi chứa khung xốp lipid rắn, hoạt chất đanxen trong khung xốp lipid ở dạng hòa tan hoặc kết tinh.

- Giá mang lipid cấu trúc nano (NLC): lõi chứa hỗn hợp lipid rắn – lỏng,khung xốp có thể có cấu trúc kiểu kết tinh không hoàn toàn, vô định hìnhhoặc nhũ tương kép

- Nang nano lipid: với cấu tạo dạng màng bao, gồm một thành lipid bao quanhmột lõi chứa dầu (lipid dạng lỏng)

- Nano nhũ tương (NE): thường gặp dạng nano nhũ tương Dầu/ Nước với tiểuphân phân tán dạng cầu, cấu trúc gồm một màng lipid đơn bao quanh một lõichứa chất lỏng thân dầu Một số hợp chất tự nhiên tiêu biểu đã được nghiêncứu dưới dạng nano lipid như silybin [38], quercetin [27],…

Liposome:

Liposome là hệ tiểu phân phân tán dạng túi, cấu tạo bởi một hoặc nhiều lớp màngkép của các phân tử lưỡng tính, bao quanh một lõi chứa nước, các tiểu phân nàyđược phân tán trong pha nước, kích thước tiểu phân thay đổi từ khoảng 20 nm đếnvài µm Với cấu trúc này liposome có thể tải cả các hợp chất thân nước (lõiliposome) và thân dầu (giữa lớp màng) [2] Liposome thường được tạo thành từphospholipid – thành phần cấu tạo màng tế bào, nên có thể thay đổi đặc tính dượcđộng học không chỉ của thuốc mà còn của dược liệu, vitamin và enzym Thêm nữaliposome còn có khả năng cải thiện độ tan, cải thiện sinh khả dụng, tăng cường hấpthu nội bào, tăng cường dược động học và phân bố sinh học, tăng độ ổn định Có rấtnhiều hợp chất dược liệu được nghiên cứu bào chế để tải vào liposome nhưsilymarin [16], quercetin [41], paclitaxel [11], curcumin [49], colchicine [46],vincristine [42], …

Hình 1.2 Cấu trúc liposome

Vi nhũ tương:

Vi nhũ tương là nhũ tương trong suốt với pha dầu được phân tán trong pha nước,ngoài chất diện hoạt có thể kết hợp thêm chất đồng diện hoạt, có sự ổn định nhiệtđộng giữa pha nước và pha dầu, kích thước giọt pha nội vào khoảng nm Hoạt chất

có thể được tải trong vi nhũ tương khi nó hoặc tan trong pha nước hoặc tan trongpha dầu Bên cạnh việc cho tác dụng kéo dài, vi nhũ tương còn giúp cải thiện độ tan

và độ ổn định, nhắm mục tiêu đến các mô và cơ quan nhất định [6] Một số hợp chất

tự nhiên tiêu biểu đã được nghiên cứu dưới dạng vi nhũ tương là triptolide [30],

chiết xuất từ cùi quả Syagrus romanzoffiana (họ Arecaceae) [31],…

1.2 Công nghệ nano tự kết tạo với Phosphatidylcholine và chitosan

Có rất nhiều kỹ thuật có khả năng tạo ra cấu trúc nano với sự đa dạng về đặc tínhnano tạo ra và chi phí sản xuất Tựu chung có thể chia các phương pháp này thànhhai loại: “top-down” sử dụng năng lượng làm giảm kích thước tiểu phân và

“bottom-up” hình thành các tiểu phân nano từ sự kết tủa [52]

Tự kết tạo (self – assembly) là một trong các kỹ thuật sản xuất nano theo phươngpháp “bottom-up”, trong đó các nguyên tử hoặc phân tử tự sắp xếp thành cấu trúc

nano có trật tự dựa trên tương tác vật lý hoặc hóa học trong các đơn vị nhỏ hơn.Phương pháp này có ưu điểm là hiệu suất cao, điều kiện thực hiện đơn giản, thờigian thực hiện ngắn, hiệu quả bắt giữ cao đồng thời tăng tính thấm qua màng sinhhọc và thời gian lưu của dược chất trong dịch thể Một số cấu trúc khó hoặc khôngthể tạo dạng nano với phương pháp thông thường có thể thực hiện bởi phương phápnày Hiện nay, phương pháp tự kết tạo với nguyên liệu là chitosan đã được chứngminh có tiềm năng lớn trong các hệ thống trị liệu đưa thuốc tới mục tiêu và phóngthích có kiểm soát [52].

1.2.1 Phosphatidylcholin

Phosphatidylcholin (PC) là thành phần chính của phospholipid trong màng tế bào.Với cấu trúc lưỡng tính bao gồm đầu cholin thân nước và đuôi phosphatidyl thândầu, PC được ứng dụng trong công nghệ bào chế dược phẩm như một chất nhũ hóa,chất tăng độ tan và là thành phần chính cấu tạo nên các dạng bào chế hướng mụctiêu như liposome, phytosome, nanoparticle,… [20]

PC có nhóm phosphat mang điện tích âm có thể dễ dàng liên kết với các tác nhânmang điện tích dương như chitosan theo cơ chế tự kết tạo để tạo thành màng baobảo vệ tiểu phân phyto-phospholipid và có tiềm năng trong nghiên cứu phát triển

các dạng thuốc phóng thích có kiểm soát Hình 1.3 biểu diễn sự tương tác của

chitosan và phospholipid để tạo thành tiểu phân nano tự kết tạo

Hình 1.3 Sơ đồ biểu diễn sự tương tác của chitosan và phospholipid để tạo thành

tiểu phân nano tự kết tạo (SACPNs) [29]

1.2.2 Đặc tính của chitosan

Chitosan là một polysaccharide cation có cấu trúc bao gồm glucosamine và N –acetylglucosamine liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4 glycoside, thu được bằngcách deacetyl hóa chitin bằng kiềm đặc [39]

Hình 1.4 Cấu trúc hóa học của chitosan [58]

Nhóm hydroxy và amino trong cấu trúc của chitosan hình thành liên kết hydro nộiphân tử và ngoại phân tử nên chitosan tồn tại dưới dạng tinh thể Mặc dù có cấu trúcthân nước, song chitosan vẫn thể hiện 1 phần thân dầu do sự xuất hiện của nhóm N– acetyl Đây cũng là nguyên nhân khiến chitosan bị kết tinh và khó tan trong môitrường trung tính Trong môi trường acid loãng (pH < 6,3), các nhóm amino củachitosan bị proton hóa cho phép chitosan hòa tan và dễ dàng liên kết với các cấutrúc mang điện tích âm, tạo điều kiện để tạo màng bảo vệ dược chất và hướng tớimục tiêu phóng thích hoạt chất có kiểm soát [58]

Trên thực tế, độ hòa tan của chitosan trong acid acetic 1% hoặc 0,1 M là một tiêuchí đơn giản và thực tế được sử dụng để phân biệt với chitin Tuy nhiên, độ hòa tanchitosan phụ thuộc vào mức độ deacetyl hóa của nó, nồng độ ion, pH và sự phân bốcác nhóm acetyl dọc theo chuỗi, cũng như điều kiện phân lập và sấy khô [39]

Hình 1.5 Sự chuyển dạng của chitosan trong môi trường acid

Có nhiều phương pháp được sử dụng để điều chế các tiểu phân nano chitosan nhưtạo gel ion, phun sấy, khâu mạch nhũ tương nước trong dầu (water-in-oil emulsioncross-linking), tạo micelle đảo, hợp nhất giọt nhũ tương (emulsion-dropletcoalescence), kết tụ nano (nanoprecipitation) và tự kết tạo [39]

Ngoài các đặc tính như dễ dàng phân hủy sinh học, tương thích sinh học và khônggây kích thích hệ miễn dịch, chitosan còn thể hiện một số đặc tính sinh học như khảnăng làm lành vết thương, kháng khuẩn và cầm máu Ngoài ra, chitosan cũng đượcbáo cáo về khả năng tương tác với chất nhày và tế bào biểu mô, làm yếu các liên kết

tế bào, từ đó dễ dàng vận chuyển thuốc và các phân tử có hoạt tính sinh học Nhờnhững đặc tính trên, chitosan được xem là một chất có tiềm năng trong việc pháttriển các hệ thống phân phối thuốc nhằm cải thiện sự phân bố sinh học, tăng tínhđặc hiệu và độ nhạy cảm, giảm độc tính Đặc biệt, tiểu phân nano chitosan đượcxem là thích hợp cho các đường dùng thuốc không xâm lấn: đường uống, mũi, phổi

và mắt [58]

1.2.3 Cơ chế tự kết tạo

Tự kết tạo là sự kết hợp của một số phân tử, đại phân tử với nhau để tạo thành mạnglưới ba chiều hoặc các cấu trúc khác với các đặc tính mới Quá trình tự kết tạo cóthể diễn ra ở cấp độ phân tử hoặc đại phân tử nhờ vào liên kết hydro, lực Van derWaals, tương tác tĩnh điện hoặc tương tác kỵ nước [58]

Chitosan có cấu trúc bao gồm cả phần mang điện tích dương và phần kỵ nước Khảnăng tự kết tạo liên quan trực tiếp tới cả 2 yếu tố này Các liên kết hydro nội phân tử

và liên phân tử do sự hiện diện của các nhóm -OH và -NH2 dọc theo mạch chitosancũng góp phần vào quá trình tự kết tạo Đối với chitosan, trọng lượng phân tử và

mức độ acetyl hóa là các yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình tự kết tạo Mức

độ acetyl hóa cao dẫn đến tính kỵ nước cao và mật độ điện tích thấp hơn, điều này

sẽ cản trở quá trình tự kết tạo Khối lượng phân tử cũng ảnh hưởng không nhỏ tớiquá trình tự kết tạo, kích thước phân tử càng lớn cấu trúc tạo thành càng cồng kềnh

Tự kết tạo của chitosan và các dẫn xuất của nó có thể được chia làm hai loại: tự kếttạo chỉ từ chitosan hoặc các dẫn xuất của nó và tự kết tạo có sự tham gia của ít nhấtmột loại phân tử khác với chitosan hoặc các dẫn xuất của nó

- Tự kết tạo chỉ từ chitosan hoặc các dẫn xuất của nó xảy ra do tương tác kịnước hoặc do sự hình thành liên kết hydro

- Tự kết tạo có sự tham gia của ít nhất một loại phân tử khác với chitosan hoặccác dẫn xuất của nó xảy ra chủ yếu do tương tác tĩnh điện hoặc liên kết hydro.Trong cả 2 trường hợp trên, lực tương tác van der Waals cũng là một yếu tố trong

cơ chế tự kết tạo, tuy nhiên lực này rất yếu và không mang nhiều ý nghĩa

Tương tác kị nước và tương tác tĩnh điện là hai cơ chế quan trọng trong quá trìnhkết tạo Tương tác kỵ nước bắt nguồn từ sự sắp xếp lại các phân tử sao cho các đầu

kị nước tiến đến gần nhau để tránh môi trường nước xung quanh Tương tác tĩnhđiện có thể làm các phân tử đẩy hoặc hút nhau tùy thuộc vào điện tích bề mặt củacác thành phần tương tác Lực tĩnh điện lớn hơn nhiều so với lực liên kết hydro (lựctĩnh điện: 500 – 1000 kJ/mol; lực liên kết hydro: 10 – 40 kJ/mol) Liên kết hydro cóthể là liên kết nội phân tử hoặc liên phân tử trên mạch chitosan Lực van der Waals

là tương tác yếu so với liên kết hydro và tương tác tĩnh điện

Hình 1.6 Cơ chế tự kết tạo với chitosan

Mạch chính

chitosan

1.2.4 Ưu nhược điểm của phương pháp tự kết tạo với chitosan và phosphatidylcholine

Công nghệ tạo nano bằng phương pháp tự kết tạo với chitosan vàphosphatidylcholine có những lợi thế nhất định như [29]:

- Quy trình đơn giản, không đòi hỏi máy móc phức tạp Tự kết tạo được thựchiện trong dung môi nước, nhiệt độ phòng, không yêu cầu tác dụng cơ học quá lớn.Cấu trúc nano được hình thành dưới lực khuấy tương đối nhỏ Đối với nguyên liệuchitosan có khối lượng phân tử lớn, có thể tác động bằng máy siêu âm trong thờigian ngắn

- Thời gian thực hiện ngắn, cho hiệu suất cao

- Tự kết tạo giữa chitosan và phospholipid bảo vệ hoạt chất tốt

- Tăng tính thấm, hấp thu và cải thiện các thông số dược động học nhờ nhữngđặc tính vốn có của chitosan và phosphatidylcholine, kéo dài thời gian lưu thuốc tại

vị trí tác động

Tuy nhiên, chitosan chỉ tan trong môi trường có pH acid, đây cũng là một yếu tốcần xem xét đối với quá trình bào chế các dạng thuốc không bền trong môi trườngacid

1.3 Tổng quan về epigallocathechin gallate (EGCG)

1.3.1 Tính chất lý hóa liên quan tới bào chế

Hình 1.7 Cấu trúc hóa học của EGCG

Bảng 1.1 Đặc tính lý hóa của EGCG [50]

Công thức hóa học C22H18O11Khối lượng phân tử 458,4 g/mol

Trạng thái

EGCG là thành phần chính của chiết xuất tràxanh Ở dạng nguyên chất, EGCG ở dạngbột hoặc tinh thể màu trắng không mùi, màuhồng nhạt, hoặc màu kem

EGCG bền trong môi trường có nhiệt độ và pH thấp (pH <4) Trong môi trườngkiềm, EGCG phân hủy nhanh chóng EGCG bị phân hủy khoảng 75% trong 30 phúttrong môi trường đệm bicarbonat Krebs-Ringer (pH 7,4; 37 ºC) và tương đối ổnđịnh trong môi trường acid [59] Xử lý nhiệt cũng làm giảm hàm lượng EGCG do

sự phân hủy nhiệt, oxy hóa, epime hóa và polyme hóa Hơn nữa, hàm lượng oxy cao

và hàm lượng chất chống oxy hóa thấp cũng làm tăng nhanh quá trình oxy hóaEGCG [3], [55]

1.3.2 Tác dụng dược lý

Hợp chất (-)-epigallocatechin-3-gallate (EGCG) là catechin chính được tìm thấy

trong trà xanh [Camellia sinensis L Ktze (Họ Theaceae)] Hợp chất polyphenol

này và một số catechin liên quan tạo ra những lợi ích sức khỏe mà trà xanh manglại Những lợi ích sức khỏe tiềm năng được ghi nhận của trà xanh và EGCG baogồm tác dụng chống oxy hóa, ngăn ngừa ung thư, cải thiện sức khỏe tim mạch, hỗtrợ giảm cân, bảo vệ da khỏi những tổn thương do bức xạ ion hóa gây ra và những

tác dụng khác Các nghiên cứu in vitro cho thấy nồng độ để cho được hiệu quả của

EGCG nằm trong khoảng từ 1 đến 100 µmol/L [7] Gần đây, các nghiên cứu lâmsàng mù đôi có đối chứng đã chứng minh hiệu quả của chiết xuất trà xanh và EGCGtinh khiết [33]

Các nghiên cứu dịch tễ học cho thấy rằng chế độ ăn uống giàu trà xanh có lợi chosức khỏe tim mạch nhờ vào hàm lượng flavonoid, đặc biệt là EGCG Nghiên cứucủa Shinichi Kuriyama và cộng sự được thực hiện trên dân số ở Nhật từ 40 đến 79tuổi suốt 11 năm (1994 – 2005) về mối liên hệ giữa sự tiêu thụ trà xanh và tỉ lệ tửvong cho thấy trà xanh làm giảm đáng kể nguy cơ tử vong do bệnh tim mạch và docác nguyên nhân khác trừ ung thư [23]

Mặc dù sinh khả dụng của chúng còn đang được bàn cãi, các nghiên cứu khác nhaucho thấy rằng EGCG điều chỉnh cơ chế tế bào và phân tử của các triệu chứng dẫnđến hội chứng chuyển hóa, bao gồm béo phì, kháng insulin, rối loạn lipid máu, tănghuyết áp [26]

Nhiều nghiên cứu đã chứng minh EGCG có khả năng ngăn ngừa béo phì Snoussi

và cộng sự báo cáo rằng sử dụng EGCG hàng ngày cho chuột Zucker đực được cho

ăn chế độ ăn nhiều chất béo (22% chất béo, 43% carbohydrate và 21% protein) dẫnđến giảm trọng lượng cơ thể trong vòng 1 tuần Ngoài ra, những con chuột được sửdụng EGCG giảm đáng kể lipid máu (50% triglyceride và 25% cholesterol) vàđường huyết (15%) Nghiên cứu của Fiorini và cộng sự cũng cho thấy tác dụng củaEGCG đối với bệnh béo phì và gan nhiễm mỡ ở chuột ob/ob thiếu leptin Điều trịbằng 85 mg/ kg EGCG trong 5 ngày dẫn đến giảm trọng lượng cơ thể so với chuộtđối chứng Điều trị bằng EGCG cũng làm giảm đáng kể tổng lượng chất béo tronggan (22,7% ± 11,0%), tăng dự trữ năng lượng gan và hoạt động chống oxy hóa ganthông qua việc tăng nồng độ glutathion ở chuột được điều trị bằng EGCG, so vớichuột đối chứng Nghiên cứu cũng cho thấy điều trị bằng EGCG làm giảm tìnhtrạng gan nhiễm mỡ thông qua việc giảm đáng kể acid palmitic và linoleic

EGCG cũng được xem là có tiềm năng trong điều trị bệnh đái tháo đường, một sốnghiên cứu đã được thực hiện nhằm đánh giá vai trò của EGCG trong việc kiểmsoát nồng độ glucose trong máu Trong một nghiên cứu được thực hiện trên chuộtdb/db được nuôi bằng chế độ ăn giàu EGCG cho thấy EGCG cải thiện dung nạpglucose và tăng tiết insulin khi so sánh với chuột đối chứng [36]

Trong một số nghiên cứu in vitro, EGCG cho thấy khả năng chống oxy hóa cao nhất

so với các catechin khác Thật vậy, EGCG có hiệu quả trong việc quét sạch các gốc

tự do, đáng chú ý là thông qua thử nghiệm thu dọn gốc tự do ATBS•+ Hoạt tínhchống oxy hoá của EGCG là do phản ứng chuyển vị hydro nguyên tử (HAT) hoặcphản ứng chuyển vị electron (SET) hoặc cả hai bao gồm cả nhóm hydroxyl Với vaitrò là chất chống oxy hoá theo cơ chế bẻ gãy mạch, EGCG trong trà làm gián đoạn

và triệt tiêu các phản ứng oxy hoá Ngoài ra, EGCG còn có khả năng tạo phức kimloại chủ yếu với sắt, đồng, crom, đây là những chất xúc tác để tạo gốc tự do [26].EGCG ức chế sự biểu hiện gen tiêu biểu cho quá trình viêm bằng cách ức chế tổnghợp NO và ức chế interferon liên quan yếu tố 1 Khi ủ tế bào với EGCG làm giảm

sự phosphoryl hóa yếu tố phiên mã STAT-1α, từ đó ức chế sự phiên mã các gen của

quá trình viêm [51] Tác dụng kháng viêm có được là do nhóm galloyl và nhómphenolic ở vị trí 3’ của phân tử EGCG [45].

Ngoài ra, EGCG còn được cho là một tác nhân chống và ngăn ngừa ung thư nhưung thư gan, dạ dày, da, phổi, tuyến vú và đại tràng Tuy nhiên, các nghiên cứu này

đa phần là các nghiên cứu in vitro Trong tương lai, cần có thêm các nghiên cứu in

vivo và nghiên cứu lâm sàng để chứng minh cho tác dụng này [47].

1.3.3 Dược động học và độc tính

Hấp thu:

Sử dụng EGCG đường uống được hấp thu qua ruột dựa trên sự khuếch tán nội bàoqua các tế bào biểu mô, tuy nhiên độ hấp thu kém (<5%) [26], sinh khả dụng đườnguống thấp do bị oxy hóa, chuyển hóa và do cơ chế bơm ngược EGCG gần nhưđược chuyển hóa hoàn toàn bởi hệ vi sinh vật đường ruột trước khi được hấp thu.Thông qua thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên, mù đôi, có đối chứng trên 60 tìnhnguyện viên khỏe mạnh nhằm kiểm tra dược động học khi uống liều đơn EGCGtinh khiết 94% với khoảng liều từ 50 mg đến 1600 mg, Ullmann và cộng sự quansát thấy chỉ những liều uống trên một gam EGCG mới thu được nồng độ EGCG tối

đa trong huyết tương lớn hơn 1 μM (liều 1600 mg, Cmax = 3392 ng/mL, khoảng:

130 - 3392 ng/mL) Nồng độ đỉnh đạt được trong khoảng 1,3 - 2,2 giờ và thời gianbán thải trung bình cuối t1/2z dao động từ 1,9 đến 4,6 giờ [54]

Phân bố:

Phần lớn EGCG tồn tại dưới dạng tự do trong hệ tuần hoàn (khoảng 92%) [54] Mặc

dù tỉ lệ phân bố thấp nhưng EGCG khuếch tán tốt đến các mô trong cơ thể, ngay cảnão [26] Trong nghiên cứu của Klyotaka Nakagawa và Teruo Miyazawa, EGCGđược tìm thấy trong máu và tất cả các bào quan được lấy mẫu sau khi tiêm liều 500mg/kg ở chuột Tổng lượng EGCG tìm thấy trong máu chuột chiếm 0,024% lượngEGCG sử dụng; 0,0003-0,45% lượng EGCG sử dụng được tìm thấy trong các mô,trong đó mô ruột non là nhiều nhất [34]

Chuyển hóa:

EGCG được chuyển hóa thông qua 2 con đường Con đường thứ nhất thông qua cácphản ứng liên hợp và methyl hóa bởi các enzym thành gan và ruột (UDP-glucuronosyl transferase, catechol-O-methyl transferase,…) để tạo ra các dẫn xuấtglucuronic, sulfate và O-methylate Con đường thứ hai là hệ vi sinh vật đường ruộttiết enzym tham gia vào quá trình phân hạch vòng của EGCG [34] [59] Ban đầu

EGCG được thủy phân thành EGC và axit gallic bởi vi khuẩn đường ruột ở chuột.

Sau đó, EGC tiếp tục trải qua một loạt các phản ứng chuyển hóa và phân hủy để tạo

ra 5-(3,5-dihydroxyphenyl)-4-hydroxyvaleric acid – sản phẩm chuyển hóa chínhcủa EGCG được tìm thấy ở cả manh tràng và phân chuột 5-(3’,5’-dihydroxyphenyl)-γ-valerolactone cũng là một sản phẩm của quá trình chuyển hóaEGCG ở ruột bởi vi khuẩn đường ruột, dạng liên hợp với glucuronid của nó là chấtchuyển hóa chính của EGCG qua đường tiểu [19]

Thải trừ: EGCG được bài tiết qua nước tiểu và qua phân [26].

Độ an toàn: Chow và cộng sự đã đánh giá độ an toàn của việc sử dụng EGCG tinh

khiết và chiết xuất trà xanh đã khử caffein được gọi là polyphenon E với liều 400

mg 2 lần/ ngày và 800 mg 1 lần/ ngày trong 4 tuần Kết quả cho thấy các triệuchứng như đầy hơi, đau dạ dày, buồn nôn, ợ chua, đau bụng, hoa mắt, chóng mặt,đau cơ,… Các triệu chứng ghi nhận được đều ở mức nhẹ và phần lớn không có sựkhác biệt đáng kể giữa nhóm sử dụng EGCG và nhóm sử dụng giả dược Buồn nônnhẹ được quan sát thấy thường xuyên hơn ở nhóm sử dụng EGCG liều 800 mg 1lần/ngày so với nhóm giả dược Cmax, tmax, t1/2 không có sự khác biệt ở các nhómtrên [10] Thử nghiệm của Ullmann và cộng sự cho thấy liều EGCG tinh khiết 1600

mg an toàn và dung nạp tốt [54]

1.4 Một số nghiên cứu bào chế EGCG dưới dạng nano

1.4.1 Tiểu phân nano chitosan chứa EGCG

Năm 2009, Admire Dube và cộng sự đã nghiên cứu bào chế tiểu phân nano chitosan– tripolyphosphate chứa catechin hoặc EGCG bằng phương pháp tạo gel ion và tiếnhành đánh giá độ ổn định của tiểu phân nano trong môi trường đệm phosphate pH

7,4 ở nhiệt độ 37°C So sánh độ ổn định của tiểu phân nano chứa EGCG và EGCGdạng tự do cho thấy thời gian bán hủy tăng từ 10 phút lên 40 phút, điều này chứng

tỏ việc bao EGCG giúp nâng cao độ ổn định trong môi trường kiềm, tiềm năng choviệc đưa EGCG ổn định trong ống tiêu hóa [14]

Dựa trên nghiên cứu trên, năm 2010, Admire Dube và cộng sự tiếp tục đánh giá sựhấp thu ở ruột của tiểu phân nano chitosan – tripolyphosphate chứa catechin hoặcEGCG Nghiên cứu được tiến hành trên mô hỗng tràng của chuột cho thấy việc baolàm tăng đáng kể sự hấp thu ở ruột Lượng EGCG được vận chuyển qua ruột tíchlũy tăng từ 57,9 ± 7,9 ng/ cm2 lên 206,8 ± 12,6 ng/ cm2 Sự tăng hấp thu được giảithích chủ yếu do tăng độ ổn định của EGCG sau khi bao [1]

1.4.2 Tiểu phân nano EGCG được bao bởi folate liên hợp chitosan

Năm 2013, Jin Liang và cộng sự đã nghiên cứu bào chế tiểu phân nano EGCG đượcbao bởi folate liên hợp chitosan bằng phương pháp tạo gel ion Tiểu phân nanođược hình thành nhờ liên kết chéo ion giữa nhóm amino tích điện dương củachitosan hydrochloride và các nhóm carboxyl methyl tích điện âm của folic acidmodified carboxymethyl chitosan Tiểu phân nano sau khi hình thành được kiểmcác chỉ tiêu kích thước trung bình tiểu phân, phân bố kích thước tiểu phân, thế zeta.Kết quả cho thấy đường kính trung bình tiểu phân nano thu được là 401,3 nm, thếzeta là +36.6 mV Quan sát hình dạng tiểu phân trên kính hiển vi điện tử truyền qua(TEM) cho thấy các tiểu phân nano có dạng hình cầu và kích thước đồng nhất.Quan sát quang phổ hồng ngoại biến đổi fourier (FTIR) chứng tỏ EGCG đã đượcbao trong tiểu phân nano Hiệu suất bắt giữ cao nhất đạt được là khoảng 75%

Nghiên cứu phóng thích hoạt chất in vitro trong môi trường pH 1,3 và 7,4 cho thấy

EGCG phóng thích trong môi trường pH 1,3 nhanh hơn trong môi trường pH 7,4

Thử nghiệm hoạt tính kháng khối u in vitro trên 3 dòng tế bào ung thư HeLa,

H1299 và Capan-1 cho thấy tiểu phân nano thu được có khả năng ức chế cả 3 dòng

tế bào ung thư cao hơn so với EGCG dạng tự do [28]

1.4.3 Phức bao nano (nanocomplexes) beta lactoglobulin chứa EGCG

Phức bao nano (nanocomplexes) beta lactoglobulin chứa EGCG đã được AviShpigelman và cộng sự nghiên cứu bào chế vào năm 2009 Khả năng sử dụng b-Lactoglobulin biến đổi nhiệt (b-Lg) để điều chế các hạt nano tự kết tạo nhằm phânphối EGCG đã được nghiên cứu, như một hệ thống phân phối polyphenol bằngprotein nhiệt Sử dụng quang phổ huỳnh quang, DLS và đo quang phổ Các tiểuphân nano tự kết tạo protein cảm ứng nhiệt-EGCG có đường kính nhỏ hơn 50 nm,

do đó tạo cho hỗn dịch trong suốt Các tiểu phân nano chứa EGCG này đã tạo ra sựbảo vệ đáng kể cho EGCG chống lại sự oxy hóa: tốc độ phân hủy ban đầu thấp hơn

33 lần và sự phân hủy chậm hơn 3,2 lần trong 8 ngày đã được ghi nhận khi so sánhEGCG được bao với EGCG không được bảo vệ [43] [44]

1.4.4 Tiểu phân nano tự kết tạo từ gelatin và EGCG

Năm 2017, Victor J Drew và cộng sự đã nghiên cứu bào chế tiểu phân nano tự kếttạo từ gelatin nhằm phân phối EGCG qua da để điều trị viêm da dị ứng Tiểu phânnano thu được có dạng hình cầu với đường kính trung bình khoảng 112 nm và thếzeta khoảng 23 mV Kết quả đánh giá sự phân phối EGCG vào tế bào nguyên bàosợi của người cho thấy tiểu phân nano có khả năng vận chuyển EGCG cao gấp 6 lần

so với dung dịch EGCG dạng tự do Tiểu phân nano làm giảm phản ứng viêm in

vitro trên tế bào nguyên bào sợi ở nồng độ EGCG là 1 µg/mL Nghiên cứu in vivo

trên da chuột cũng cho thấy tiểu phân nano EGCG được hấp thu vào da tốt hơn sovới EGCG dạng tự do mà không gây bất kỳ tác dụng không mong muốn nào [13]

1.4.5 Hệ vi hạt Maltodextrin-gôm arabic tải phytosome nhằm phân phối chiết xuất trà xanh

Effionora Anwar và cộng sự đã nghiên cứu bào chế phytosome bằng phương pháphydrate hóa lớp mỏng Phytosome bao gồm chiết xuất trà xanh tương đương 3%EGCG, phospholipid 97% chứa 30% phosphatidylcholine Tác giả đã khảo sát hàmlượng phospholipid ở 2%, 3,5% và 4% Kết quả cho thấy công thức chứa 4%phospholipid cho tiểu phân nano có dạng hình cầu, kích thước trung bình 42,58 nm

và hiệu suất bao là 50,61 ± 0,93% Trong khi công thức chứa 2% và 3,5%phospholipid không tạo ra tiểu phân nano có dạng hình cầu, kích thước trung bìnhlần lượt là 111,63 và 104,75 nm Vì vậy công thức chứa 4% phospholipid đượcchọn để tiếp tục quá trình hóa rắn bằng phương pháp phun sấy sử dụng chất mangmaltodextrin và gôm arabic Sau đó, sản phẩm tạo thành được đánh giá độ hòa tan

và độ ổn định ở các nhiệt độ 4°C, 28°C và 40°C trong 6 tuần Kết quả cho thấy vihạt ổn định nhất ở nhiệt độ 28°C [4]

1.4.6 Phytosome chứa polyphenol chiết xuất từ lá trà xanh

Nguyễn Trọng Điệp và cộng sự đã nghiên cứu xây dựng quy trình bào chế và đánhgiá một số chỉ tiêu chất lượng của phytosome chứa polyphenol chiết xuất từ lá tràxanh Nhóm tác giả đã xây dựng được qui trình bào chế phytosome polyphenol vớithông số phản ứng là: dung môi ethanol 60%, tỉ lệ polyphenol/phosphatidylcholine1/2, nhiệt độ phản ứng 40°C, thời gian 2 giờ Thông số phun sấy tạo bột khô là:nhiệt độ phun sấy 120 ± 2ºC, tốc độ cấp dịch 30 mL/phút, áp lực khí nén đầu phun0,2 bar Bằng phương pháp DSC, nhiễu xạ tia X, FTIR bước đầu đã chứng minh cóliên kết hóa học của polyphenol với phosphatidylcholine Phytosome polyphenol cóhàm lượng polyphenol tổng là 271,02 ± 13,92 mg/g và polyphenol dạng phức hợp là251,60 ± 12,91 mg/g Hiệu suất phytosome hóa là 85,69 ± 4,40% [1]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu và hóa chất

Các nguyên liệu và hóa chất sử dụng được trình bày trong Bảng 2.2.

Bảng 2.2 Danh sách các nguyên liệu, hóa chất sử dụng trong nghiên cứu STT Tên nguyên liệu Tiêu chuẩn Xuất xứ

6 Nước cất 2 lần Tiêu chuẩn DĐVN V Việt Nam

7 Ethanol tuyệt đối Tiêu chuẩn DĐVN IV Việt Nam

2.1.2 Dụng cụ, trang thiết bị

Danh sách các thiết bị sử dụng được trình bày trong Bảng 2.3.

Bảng 2.3 Danh sách các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

Máy khuấy từ gia nhiệt Scilogex SCI280 – Pro Mỹ

Máy đo kích thước hạt

Máy đo DSC NETZSCH DSC 204 F1 PHOENIX Đức

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng EGCG bằng UV-vis

và HPLC

2.2.1.1 Xây dựng phương pháp định lượng EGCG bằng UV-vis

Xây dựng quy trình định lượng

Dựa theo quy trình định lượng EGCG bằng phương pháp UV-vis trong nghiên cứucủa Li-qiang Zou và cộng sự (2014), đề tài tiến hành khảo sát và sửa đổi với quytrình như sau [60]:

Thiết bị: Máy quang phổ UV – vis Beckman DU 530

- Mẫu thử: mẫu tiểu phân nano chứa EGCG được bào chế bằng phương pháp tự kếttạo Pha loãng mẫu 40 lần bằng ethanol 99,5% để có nồng độ khoảng 10 µg/mL.

Thẩm định quy trình định lượng:

Tính đặc hiệu

Mẫu trắng: dung môi ethanol

Mẫu chuẩn: chuẩn bị như trong Chuẩn bị mẫu.

Mẫu thử: chuẩn bị như trong Chuẩn bị mẫu.

Mẫu thử thêm chuẩn: thêm chuẩn EGCG vào mẫu thử để có dung dịch có nồng độ

20 µg/mL

Mẫu placebo: hỗn dịch nano trắng được điều chế theo quy trình điều chế nano tự kếttạo tải EGCG, chứa tất cả các tá dược nhưng không có hoạt chất EGCG Mẫu saukhi chuẩn bị được pha loãng 40 lần với ethanol 99,5%

Tiến hành quét quang phổ UV-vis của mẫu placebo, mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu thửthêm chuẩn trong khoảng bước sóng 200 – 350 nm

Tính tuyến tính

Từ dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 1 mg/mL, hút chính xác lần lượt 100 µL, 500

µL vào bình định mức 100 mL, thêm ethanol vừa đủ, lắc đều (dung dịch có nồng độEGCG lần lượt khoảng 1 µg/mL, 5 µg/mL) Hút chính xác lần lượt 100 µL, 150 µL,

250 µL, 300 µL dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức 10 mL, thêm ethanol vừa

đủ, lắc đều (dung dịch có nồng độ EGCG lần lượt khoảng 10 µg/mL, 15 µg/mL,

25 µg/mL, 30 µg/mL) Đo độ hấp thu của các dung dịch thu được ở 275 nm Chuẩn

bị song song một mẫu trắng Xây dựng đường chuẩn với độ hấp thu là trục tung vànồng độ dung dịch là trục hoành Đánh giá tính thích hợp của phương trình hồi quy

và ý nghĩa của các hệ số bằng công cụ Regression (MS-Excel 2010)

Độ chính xác

Tiến hành lặp lại 6 lần quy trình định lượng mẫu thử có nồng độ như trong Chuẩn

bị mẫu, trong cùng điều kiện về phòng thí nghiệm, ngày phân tích và người phân

tích Ghi nhận độ hấp thu ở bước sóng 275 nm Tính hàm lượng EGCG có trong

mẫu thử

Yêu cầu: giá trị RSD(%) kết quả định lượng EGCG có trong các mẫu ≤ 2,0%.

Độ đúng

Thêm vào mẫu placebo một lượng chất chuẩn có nồng độ bằng 80%, 100% và

120% nồng độ EGCG có trong mẫu thử như trong Chuẩn bị mẫu Mỗi nồng độ thực

hiện 3 lần Ghi nhận độ hấp thu ở bước sóng λ= 275 nm Xác định tỷ lệ thu hồi.Yêu cầu: Độ đúng hay tỷ lệ thu hồi của phương pháp phải nằm trong khoảng 98,0%đến 102,0% và giá trị RSD ≤ 2,0%

2.2.1.2 Xây dựng phương pháp định lượng EGCG bằng HPLC

Xây dựng quy trình định lượng

Dựa theo quy trình định lượng EGCG bằng phương pháp HPLC trong nghiên cứucủa Joana F Fangueiro và cộng sự (2014), đề tài tiến hành khảo sát và sửa đổi chophù hợp với mục đích định lượng EGCG trong tiểu phân nano như sau [17]:

Thiết bị: hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Alliance e2695 - Waters, đầu dò PDA Chuẩn bị mẫu:

- Mẫu chuẩn: cân chính xác khoảng 10 mg EGCG cho vào bình định mức 10 mL,thêm dung môi methanol, lắc đều cho tan, sau đó thêm dung môi vừa đủ 10 mL,lắc đều thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 1 mg/mL Từ dung dịchchuẩn gốc, pha dung dịch chuẩn có nồng độ 50 µg/mL trong methanol Lọc quamàng lọc Millipore 0,45 µm

- Mẫu thử: pha loãng 8 lần một lượng hỗn dịch nano tải EGCG với methanol để

Yêu cầu: giá trị RSD% của thời gian lưu và diện tích pic từ 6 lần tiêm lặp lại khôngquá 2,0% Hệ số bất đối nằm trong khoảng 0,8-1,5; số đĩa lý thuyết lớn hơn 2000.

Tính đặc hiệu

Mẫu thử: chuẩn bị như trong Chuẩn bị mẫu

Mẫu trắng: dung môi methanol

Mẫu chuẩn: chuẩn bị như trong Chuẩn bị mẫu.

Mẫu thử thêm chuẩn: thêm chuẩn EGCG vào mẫu thử để có dung dịch có nồng độ

100 µg/mL

Mẫu placebo: hỗn dịch nano trắng được điều chế theo quy trình điều chế nano tự kếttạo tải EGCG, chứa tất cả các tá dược nhưng không có hoạt chất EGCG, được phaloãng trong methanol bằng số lần pha loãng của mẫu thử

Tiến hành sắc ký mẫu trắng, mẫu placebo, mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu thử thêmchuẩn Ghi lại các sắc ký đồ Xác định thời gian lưu, độ tinh khiết và phổ UV củapic EGCG trong sắc ký đồ mẫu thử và mẫu chuẩn

- Phổ UV của pic EGCG trong sắc ký đồ mẫu chuẩn và mẫu thử giống nhau Độ

tinh khiết của pic EGCG trong mẫu chuẩn và mẫu thử đạt yêu cầu (Purity Angle

Yêu cầu: hệ số R2 ≥ 0,998

Độ chính xác

Tiến hành sắc ký 6 mẫu thử hỗn dịch nano tải EGCG khác nhau có nồng độ như

trong Chuẩn bị mẫu Tính hàm lượng EGCG có trong mẫu thử.

Yêu cầu: giá trị RSD% hàm lượng EGCG có trong các mẫu ≤ 2,0%

Độ đúng

Thêm vào mẫu placebo một lượng chất chuẩn có nồng độ bằng 80%, 100% và

120% nồng độ EGCG có trong mẫu thử như trong Chuẩn bị mẫu Mỗi nồng độ thực

hiện 3 lần, tiến hành sắc ký các mẫu này, xác định tỷ lệ thu hồi

Yêu cầu: Độ đúng hay tỷ lệ thu hồi của phương pháp phải nằm trong khoảng 98,0%đến 102,0% và giá trị RSD ≤ 2,0%