Giáo trình thí nghiệm công nghệ protein enzyme

hí nghiệm thể hiện tính chất của enzyme đối với tính bột và Saccharose Ống số 1 (tính bột) do amylase thủy phân tinh bột thành glucose, khối protein đơn bào, quy trình tách chiết, thu nhận enzyme từ thực vật, động vật và vi sinh vật và phương pháp xác định hoạt tính enzyme amylase.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG

1

YÊU CẦU ĐỐI VỚI SINH VIÊN HỌC THÍ NGHIỆM

1 Tuân thủ nội quy PTN

2 Sinh viên phải có mặt đủ và đúng giờ trong các buổi thí nghiệm Nếu nghỉ học có lý do chính đáng thì sinh viên phải xin phép giáo viên sắp xếp cho làm thí nghiệm bù Thiếu một bài thí nghiệm coi như chưa hoàn tất chương trình Tuy nhiên rất hạn chế đi bù, muốn đi bù phải có giấy xin phép trước đó và được sự đồng ý của giáo viên kí xác nhận

và ngày đi bù phải đem giấy xin phép theo mới được vào lớp (chỉ giải quyết cho các trường hợp bệnh tật, các trường hợp khác sẽ bị trừ điểm)

3 Sinh viên phải đọc kỹ, nắm vững nội dung bài thí nghiệm và chuẩn bị sẵn bản báo cáo kết quả trước khi đến phòng thí nghiệm Trước buổi thí nghiệm giáo viên hướng dẫn sẽ kiểm tra việc chuẩn bị của sinh viên Đạt yêu cầu, sinh viên mới được làm thí nghiệm

4 Áp dụng điểm trừ trên từng bài thí nghiệm: không chuẩn bị bài trước; không có áo blouse; đi trễ quá 15 phút; không giữ trật tự, tác phong không nghiêm túc; vi phạm nội qui PTN; thao tác cẩu thả không cẩn thận; chép bài báo cáo của nhau; viết báo cáo không đúng mẫu qui định; nộp báo cáo không đúng qui định

5 Trong phòng thí nghiệm phải mặc áo blouse, rất thận trọng khi sử dụng dung môi dễ cháy nổ và hóa chất độc hại

6 Khi làm thí nghiệm phải trật tự, cẩn thận, giữ sạch nơi làm thí nghiệm, tiết kiệm hóa chất Làm vỡ, hoặc gây hư hỏng dụng cụ, thiết bị thì phải bồi thường Không tự ý xê dịch máy móc thiết bị và không được sử dụng khi chưa có sự hướng dẫn của giáo viên

7 Sau khi thí nghiệm, sinh viên phải rửa sạch dụng cụ bằng xà phòng – tráng lại bằng

nước cất, sắp xếp lại dụng cụ - hóa chất đúng chỗ, lau sạch bàn thí nghiệm và bàn giao

cho cán bộ phòng thí nghiệm Mỗi buổi thí nghiệm lớp cử một tổ trực nhật Tổ trực nhật có nhiệm vụ nhắc nhở các bạn giữ vệ sinh chung và làm sạch phòng thí nghiệm sau giờ thí nghiệm

8 Cuối buổi thí nghiệm sinh viên phải nộp bản báo cáo kết quả thí nghiệm và kết quả tính tóan cho giáo viên hướng dẫn Viết và nộp báo cáo thí nghiệm theo mẫu theo đúng thời gian quy định

9 SV tự trang bị ổ khóa khi đi học thí nghiệm để đảm bảo an toàn tài sản cho SV và

sử dụng tủ chứa túi xách đúng mục đích

2

MỤC LỤC

Đánh giá môn học và quy định viết báo cáo 3

Bài 1: Thu nhận chế phẩm casein và whey protein từ sữa bò 4

Bài 2: Thu nhận và tinh sạch enzyme urease từ đậu nành 10

Bài 3: Thu nhận và tinh sạch enzyme bromelain từ dứa 16

Bài 4: Thu nhận và tinh sạch enzyme invertase từ nấm men 21

Bài 5: Xác định thông số động học của enzyme invertase 25

Bài 6: Điện di protein 30

Phụ lục 1: CÁCH TÍNH NỒNG ĐỘ (NH4)2SO4 BỔ SUNG 34

Phụ lục 2: ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN THEO PHƯƠNG PHÁP BRAFORD 35

Phụ lục 3: XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH PROTEASE THEO PP ANSON CẢI TIẾN 37

Phụ lục 4: XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH UREASE THEO PHƯƠNG PHÁP NESSLER 39

Phụ lục 5: ĐỊNH LƯỢNG NITƠ TỔNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJENDAHL 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

Bố trí thí nghiệm 45

3

ĐÁNH GIÁ MÔN HỌC

- Kiểm tra đầu giờ + Bài báo cáo + thái độ học tập: 50%

- Thi cuối kì: 50%

QUY ĐỊNH VIẾT BÁO CÁO

- Mỗi nhóm viết 1 bài báo cáo cho mỗi bài thí nghiệm, đánh máy, khổ A4, chữ rõ ràng, sạch sẽ, trình bày ngắn gọn nhưng đầy đủ Tên file : Bài thí nghiệm – nhóm SV – nhóm lớp

- Các bài báo cáo phải ghi rõ mã số SV và họ tên các thành viên trong nhóm, mã số nhóm và nộp vào buổi học thí nghiệm kế tiếp

- Bài báo cáo gồm các phần :

I Tổng quan: về đối tượng, nguyên liệu nghiên cứu;

II Sơ đồ quy trình công nghệ và thuyết minh các bước thực hiện thực tế

III Kết quả – Bàn luận

Trình bày ngắn gọn kết quả phân tích và tính toán kết quả thu được

Bàn luận về kết quả thu được hoặc phương pháp làm thí nghiệm, các ý kiến đóng góp

để bài TN hoàn thiện hơn…

4

BÀI 1 THU NHẬN CHẾ PHẨM CASEIN VÀ

WHEY PROTEIN TỪ SỮA BÒ 1.1 GIỚI THIỆU VỀ CASEIN SỮA

Sữa có chứa hàng trăm loại protein nhưng hầu hết trong số này chỉ chiếm một lượng rất nhỏ Protein có thể được phân loại theo nhiều cách dựa vào tính chất hóa học hay vật lý, và chức năng sinh học của chúng Thông thường, người ta phân loại protein sữa thành casein (không hòa tan) , whey protein (hòa tan) và các protein thiểu số

Trong sữa bò casein chiếm gần 80% tổng số protein (khoảng 26 g trong 1 lít sữa) Casein được chia làm bốn nhóm phụ: αs1, α s2 , β và κ-casein Cả bốn nhóm này đều có cấu trúc không đồng nhất

Điểm chung giữa casein α và β là các amino acid được este hóa bởi phosphoric acid Acid phosphoric này liên kết với calci (có chứa nhiều trong sữa) để hình thành các liên kết nội phân tử và ngoại phân tử Điều này khiến casein dễ dàng tạo chuỗi polymer có chứa một vài loại casein giống hay khác nhau Do có nhiều nhóm phosphate và những nhóm kỵ nước trong phân tử casein, các phân tử polymer được hình thành từ casein rất đặc biệt và bền Những phân tử này được cấu tạo từ

5

hàng trăm và hàng nghìn những phân tử đơn lẻ và hình thành nên dung dịch keo, tạo nên màu trắng của sữa Những phức chất này được gọi là các micelle casein Hình dưới cho thấy các micelle casein bao gồm một phức hợp các sub-micelle, có đường kính từ 10 đến 15 nm Một micelle casein với kích thước trung bình có tới 400 đến 500 sub-micelle và có thể có kích thước lớn tới 0.4 µm

1.2 CÁC DẠNG CHẾ PHẨM PROTEIN:

Protein concentrate

Protein concentrate là một loại chế phẩm protein có hàm lượng protein tối thiểu là 65% Chế phẩm chứa nhiều chất xơ, giàu protein và amino acid được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như là thực phẩm chức năng, bổ sung trong các lọai ngũ cốc, bánh ngọt, sản phẩm ăn chay, thức ăn gia súc làm gia tăng giá trị dinh dưỡng của sản phẩm

Protein concentrate có nhiều dạng: hạt, sệt, hoặc bột mịn

Protein isolate

Giống chế phẩm trên nhưng chứa hàm lượng protein thực vật rất cao 90% Nó chứa hầu hết các amino acid cần thiết cho sự phát triển mặt khác nó chứa lượng chất béo rất thấp, giúp ngăn ngừa chứng loãng xương, ung thư, các triệu chứng thời kì mãn kinh

6

1.3 DỤNG CỤ – HÓA CHẤT (cho 1 nhóm 4SV)

Dụng cụ - thiết bị:

Máy lọc chân không

Bể điều nhiệt

Tủ sấy

Máy UV-Vis

Cốc 250mL 2

Đũa khuấy 1

Ống nhỏ giọt 1

pipette 10mL 1

pipette 5 mL 1

Micropipette 1000 μL + đầu tip 1

Micropipette 100 μL + đầu tip 1

Ống nghiệm 10 Erlen 250 mL 2

Bình vô cơ hóa 1

Giấy lọc 4

Nguyên liệu – Hóa chất

Sữa tươi thanh trùng 100 mL Acetic acid 10% 100mL Ethanol 95% 200mL Ether ethylic 200mL

Nước cất

Hóa chất PP Kjeldahl:

H2SO4 đđ

H2SO4 0,1N NaOH 40%

NaOH 0,1N Xúc tác (CuSO4:K2SO4:Se) Phenolphthalein

Hóa chất PP Bradford:

Albumin 0,1 mg/mL Thuốc thử Bradford

7

1.4 THỰC HÀNH:

1.4.1 Quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm protein casein và whey protein từ sữa bò:

Hình 1.1 Sơ đồ QTCN sản xuất chế phẩm casein và whey protein từ sữa bò

 Rửa tủa: rửa tủa trên máy lọc chân không lần lược bằng: nước cất 4 C, ethanol 95%

và ether ethylic để loại béo

Kết tủa Whey protein (pH 4, 2 hours, 70  C)

Lọc chân không

Sấy khô

Whey protein

8

 Sấy khô: sấy giấy lọc và casein đến khối lượng không đổi, cân giấy lọc và casein từ

đó tính ra lượng casein thu nhận

 Kết tủa whey protein: whey được ủ trong bể điều nhiệt đến 70 C, dùng dung dịch acetic acid 10% điều chỉnh pH whey đến 4,0, để yên trong 2h cho đến khi tùa protein xuất hiện Tiến hành các bước thu tủa như trên

1.4.2 PHÂN TÍCH CHẾ PHẨM PROTEIN CASEIN VÀ WHEY PROTEIN

a Xác định độ ẩm của chế phẩm protein bằng máy đo độ ẩm tự động (Phụ lục 5)

b Xác định hàm lượng protein trong chế phẩm bằng phương pháp Bradford (phụ lục 2) hoặc theo phương pháp Kjeldahl (phụ lục 6)

c Tính hiệu suất thu nhận protein Và cho biết chế phẩm protein thu được thuộc loại isolate hay concentrate

9

BÀI 2 THU NHẬN VÀ TÌNH SẠCH ENZYME UREASE TỪ ĐẬU NÀNH

2.1 GIỚI THIỆU VỀ ENZYME UREASE:

Urease là enzyme thuộc nhóm enzyme thuỷ phân (hydrolase), phân nhóm amidase Urease có

số hiệu phân loại quốc tế là EC 3.5.1.5 Tên hệ thống là: Carbamate amide hydrolase Trong đó: số 3 chỉ nhóm chính – hydrolase, số 5 chỉ nhóm phụ enzyme tác dụng lên liên kết C - N khác liên kết peptide, số 1 chỉ phân nhóm phụ cắt các amide thẳng (amide hyrolase), số 5 chỉ

số thứ tự của urease trong phân nhóm phụ

Bảng 3.1: Các đặc tính enzyme urease

Trọng lượng phân tử

Số trung tâm hoạt động/ 1 phân tử

Phân tử lượng mỗi trung tâm hoạt động

5 – 5,1

Ni2+

45 - 50oC Kim loại nặng (Ag+, Cu2+, Hg2+), borate,

H2O2, acid ascorbic…

Urea, hydroxyurea Đặc hiệu cơ chất tuyệt đối

Trong tự nhiên có hơn 200 loài vi khuẩn có khả năng tổng hợp enzyme urease như H

pylori, Klebsiella aerogenses, Proteus mirabilis, Yersinia enterocolitica, Bacillus pasterurii, Escherchia coli… Enzyme urease cũng có ở dịch tiêu hoá của các động vật như trâu, bò, dê,

chó

Enzyme urease còn có nhiều trong các cây bậc cao, đặc biệt là các cây thuộc họ đậu

như đậu rựa (Canavalia ensiformis, jack bean), đậu nành (Glycine hispida)…

Urease xúc tác cho phản ứng thuỷ phân urea, tạo thành khí carbonic và amoniac theo phương trình sau:

10

CN

H2N

H2

O + 1H2O urease CO2 + 2NH3

Lợi dụng tính chất đặc hiệu của urease, người ta ứng dụng urease trong việc nhận biết

sự có mặt của ure trong thực phẩm, nước giải khát lên men và trong sữa

2.2 HÓA CHẤT – DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM: dành cho 1 nhóm 4 SV

- Muỗng cân hóa chất: 1

- Quả bóp cao su: 1

- Ống hút nhỏ giọt nhựa: 2

Nguyên liệu – Hóa chất

- Đậu nành (200g/lớp)

- Acetone, Ether dầu hỏa, Ammonium sulfate

- Dung dịch Ba(OH)2 2%

- Dung dịch Cystein 5.10-3M, EDTA 5.10

-3M pha trong đệm phosphate 1/15M pH 7

- Dung dịch NH4Cl chứa 10μg NH3/mL

- Thuốc thử Nessler (Merck)

- Dung dịch urea 2% pha trong đệm phosphate 1/15M pH 7

- Cách pha thuốc thử Nessler:

 KI: 35 g pha trong 100 ml nước cất

 HgCl2: 17 g pha trong 300 ml nước cất

 Dung dịch NaOH 20%: 200g pha trong 1000 ml nước cất

11

Cho KI vào bình định mức 1000 ml, đổ từ từ HgCl2 vào đến khi kết tủa không tan hết thì dừng, dùng dung dịch NaOH 20% định mức đến 1000 ml, cho tiếp 1-2 ml giọt HgCl2 tạo kết tủa đỏ Cho dung dịch vào một lọ màu tối, để dung dịch lắng trong qua đêm, rồi đem lọc qua bông thủy tinh, bảo quản trong lọ tối

- Các quá trình đều đều phải được thực hiện ở nhiệt độ lạnh, thấp hơn 4C

Đậu nành

Xay nhỏ

Trích ly loại lipid

Trích ly urease (pH 7, 12h)

Ly tâm (5000 vòng/phút, 10’) hoặc lọc chân không

Dịch enzyme urease thô

Ete dầu hoả (tỷ lệ: 1g bột: 2mL ete)

Dung dịch EDTA 5.10

-3M, Cystein 5.10-3M

Bã lipid

12

2.3.2 Kết tủa enzym urease:

Dịch urease thô được kết tủa enzyme bằng một trong 2 phương pháp:

- Tủa acetone: tính lượng acetone cần sử dụng để kết tủa urease trong dịch enzyme thô tại nồng độ 60% acetone Dịch urease thô được làm lạnh đến 4C, rót dung môi acetone (đã làm lạnh đến -20 oC) chảy thành dòng theo thành cốc hay nhỏ từng giọt, khuấy nhẹ để hạn chế biến tính protein Để lắng tủa trong 30 phút, ly tâm 5000 v/ph trong 5-10 phút Kết tủa urease được giữ trong tủ lạnh cho đến khi bay hơi hết acetone

- Tủa phân đoạn ammonia sulfate theo phương pháp sau:

Ghi chú:

- Cách tính lượng (NH4)2SO4 bổ sung xem Phụ lục 1

Để yên 30’, to phòng

Tủa (NH4)2SO4 55% bão hòa

Tủa (NH4)2SO4 20% bão hòa

Enzym urease Dịch urease

Đông khô

13

- Thẩm tích: tủa urease được hòa tan trong một lượng nhỏ đệm phosphate 1/15M pH 7 chứa 5.10-3M, Cystein 5.10-3M, cho vào túi cellophane Quá trình thẩm tích được thực hiện trong dung dịch đệm phosphate 1/15M pH 7 chứa 5.10-3M, Cystein 5.10-3M, thay đệm sau mỗi 2h cho đến khi kiểm tra hết muối trong tủa enzyme

Bột enzym urease thu được từ 2 phương pháp trên sẽ được xác định hàm lượng protein và hoạt tính urease

2.3.3 Tinh sạch enzyme urease bằng sắc ký rây phân tử:

tử lượng ra cùng một lúc Những chất có phân tử lượng càng lớn ra càng nhanh và chất có phân tử lượng nhỏ nhất ra cuối cùng

(A) Mẫu đưa vào có chứa những phân tử có kích thước lớn và nhỏ

(B) Những phân tử có kích thước lớn không thể xâm nhập vào bên trong hệ thống matrix của gel, vì vậy chúng di chuyển nhanh qua cột gel

(C) Sự phân tách những phân tử lớn

Tiến hành:

14

Ngâm: Cân 1.5 g Sephadex G-75 ngâm trong 40ml nước cất ở nhiệt độ phòng Thỉnh

thoảng khuấy nhẹ Ngâm trong 2-3h, độ trương nở là 15 lần

Hoạt hóa:

- Cho gel vào phểu lọc chân không

- Rửa HCl 0.5M 3 lần Mổi lần 50ml

- Rửa bằng nước cất 10 lần

- Rửa NaOH 0.5M 3 lần Mỗi lần 50ml

- Rửa nước cất đến khi dịch qua lọc không cho màu hồng với chỉ thị phenolphtalein

Nhồi cột: qua các bước sau:

- Cho 1 miếng xốp vào đáy cột

- Cho nước vào đầy cột, tránh tạo bọt khí

- Đặt phểu thủy tinh lên cột (thẳng và cố định)

- Khuấy đều và đổ gel vào phểu

- Khuấy đều gel trên phểu, đảm bảo gel trải đều thành từng lớp trên cột Thể tích gel phải bằng thể tích nước trong cột

- Điều chỉnh tốc độ chảy 3-4 s/giọt

- Sau khi nhồi cột, lấy phểu ra và đặt lên đó một miếng giấy lọc

- Rửa cột bằng đệm photphate 1/15M pH 7 qua đêm

Chạy sắc ký:

Lấy 1 ml dung dịch chứa urease cho vào cột Sephadex G-75 (6x1.2 cm) Chú ý cho mẫu vào

từ từ, để ngấm sâu, sau đó mới cho dung dịch rửa giải vào

Cho dung dịch đệm phosphate 1/15M pH 7 Mỗi lần cho 1ml rồi thu vào các ống nghiệm đánh số thứ tự từ 1-15, mỗi ống 1 ml, tốc độ chảy là 3-4 s/ giọt

Dịch enzyme urease thô, tủa enzyme urease sẽ được xác định các chỉ tiêu sau:

1 Xác định hàm lượng protein theo Bradford (Phụ lục 2 )

2 Xác định hoạt tính urease theo phương pháp Nessler (Phụ lục 4)

Tính hoạt tính riêng, so sánh độ tinh sạch và hiệu suất thu hồi enzyme giữa phương pháp kết tủa bằng dung môi và kết tủa bằng muối ammonia sulfate

16

BÀI 3 THU NHẬN VÀ TINH SẠCH ENZYME BROMELAIN

TỪ DỨA

3.1 GIỚI THIỆU VỀ ENZYME BROMELAIN

Bromelain là một enzyme thuộc lớp enzyme thủy phân (hydrolase), phân giải protein Mã số của bromelain: EC.3.4.4.24 Bromelain được tìm thấy trong mô thực vật của cây họ Dứa (họ

Bromeliaceae)

Hiện tại, bromelain có nhiều ứng dụng trong ngành thực phẩm và dược phẩm Trong ngành thực phẩm, bromelain được sử dụng làm mềm thịt, thủy phân protein… Trong ngành dược phẩm, bromelain được sử dụng trong các loại thuốc kháng viêm, kháng sinh… Ngoài ra, bromelain còn được sử dụng trong một số ngành công nghiệp khác

3.2 DỤNG CỤ – HÓA CHẤT: cho 1 nhóm 4SV

Dụng cụ - thiết bị:

Máy ly tâm - ống falcon 15 mL

Máy sấy đông khô

Máy xay sinh tố

Máy đo UV

Cốc 500 ML 1

Cốc 250mL 2

Đũa khuấy 1

Ống nhỏ giọt 1

pipette 10mL 1

pipette 5 mL 1

Micropipette 1000 μL 1

Micropipette 100 μL 1

Ống nghiệm 10 Giấy lọc 2

Rây mịn Nguyên liệu – Hóa chất Dứa 200 g Ethanol 98 %v/v 300mL Amonium sulfate Giấy cellophane Chỉ Nước cất Dd tyrosine chuẩn 1mol/mL: 18,118mg tyrosine hòa trong 100mL HCl 0,2N Dung dịch casein 2% pha trong đệm phosphate pH7 TCA 5% Thuốc thử Folin-Ciocalteu pha loãng 5 lần Dung dịch NaOH 0,5 N Dung dịch HCl 0,5 N và HCl 0,2 N Thuốc thử Bradford

xơ Dịch thu được sau ly tâm được dùng để xác định hàm lượng protein, hoạt tính protease và

để thu nhận enzyme bromelain Dịch dứa được bảo quản lạnh ở 4 C

Ly tâm

Sắc ký rây phân tử

Ly tâm

18

để yên ở 4C trong 30 phút Đem ly tâm hỗn hợp với tốc độ 6000 vòng/phút trong 5 phút thu tủa, phơi tủa bromelain trong tủ lạnh cho bay hơi hết ethanol

Tủa bằng amonium sulfate

Muối amonium sulfate được bổ sung từ từ vào dung dịch nước dứa sau ly tâm ở 4C Vừa cho vừa khuấy đều để dung dịch đạt nồng độ amonium sulfate 70% bão hòa Hỗn hợp được để yên ở nhiệt độ phòng trong 30 phút Sau đó đem ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 5 phút Thu nhận tủa, thẩm tích

 Tinh sạch enzyme bằng sắc ký rây phân tử

tử lượng ra cùng một lúc Những chất có phân tử lượng càng lớn ra càng nhanh và chất có phân tử lượng nhỏ nhất ra cuối cùng

Hình 3.1: Hình minh họa cho quá trình sắc ký rây phân tử

(A) Mẫu đưa vào có chứa những phân tử có kích thước lớn và nhỏ

(B) Những phân tử có kích thước lớn không thể xâm nhập vào bên trong hệ thống matrix của gel, vì vậy chúng di chuyển nhanh qua cột gel

(C) Sự phân tách những phân tử lớn

Tiến hành:

19

Ngâm: Cân 1.5 g Sephadex G-50 ngâm trong 40ml nước cất ở nhiệt độ phòng Thỉnh

thoảng khuấy nhẹ Ngâm trong 2-3h, độ trương nở là 15 lần

Hoạt hóa:

- Cho gel vào phểu lọc chân không

- Rửa HCl 0.5M 3 lần Mổi lần 50ml

- Rửa bằng nước cất 10 lần

- Rửa NaOH 0.5M 3 lần Mỗi lần 50ml

- Rửa nước cất đến khi dịch qua lọc không cho màu hồng với chỉ thị phenolphtalein

Nhồi cột: qua các bước sau:

- Cho 1 miếng xốp vào đáy cột

- Cho nước vào đầy cột, tránh tạo bọt khí

- Đặt phểu thủy tinh lên cột (thẳng và cố định)

- Khuấy đều và đổ gel vào phểu

- Khuấy đều gel trên phểu, đảm bảo gel trãi đều thành từng lớp trên cột Thể tích gel phải bằng thể tích nước trong cột

- Điều chỉnh tốc độ chảy 3-4 s/giọt

- Sau khi nhồi cột, lấy phểu ra và đặt lên đó một miếng giấy lọc

- Rửa cột bằng đệm photphate 1/15M pH 7 qua đêm

20

Dịch enzyme urease thô, tủa enzyme bromelain, chế phẩm enzyme bromelain sau sắc ký sẽ được xác định các chỉ tiêu sau:

1 Xác định hàm lượng protein theo Bradford (Phụ lục 2 )

2 Xác định hoạt tính protease theo phương pháp Anson (Phụ lục 3)

Tính hoạt tính riêng, độ tinh sạch và hiệu suất thu hồi enzyme của chế phẩm bromelain so với dịch dứa thô ban đầu

21

BÀI 4 THU NHẬN VÀ TINH SẠCH INVERTASE TỪ

NẤM MEN 4.1 GIỚI THIỆU VỀ ENZYME INVERTASE

Invertase là một enzyme thủy phân liên kết α-1,2-glycosidic của saccharose, còn được gọi là

β-fructofuranocidase (E.C.3.2.1.26) Invertase có nhiều ứng dụng trong sản xuất bánh kẹo,

nước giải khát, bánh và dược phẩm Invertase được dùng nhiều nhất trong sản xuất syrup

đường nghịch đảo - hỗn hợp fructose và glucose tỷ lệ 1:1 từ sucrose

Invertase được sản xuất từ Saccharomyces cerevisiae thường hoạt động ở môi trường acid

nhẹ đến trung tính (3.0-7.0), và trong khoảng nhiệt độ khoảng 30C đến 75C.[8]

4.2 DỤNG CỤ – HÓA CHẤT: cho 1 nhóm 4SV

Dụng cụ - thiết bị:

Máy ly tâm - ống falcon 15 mL

Máy sấy đông khô

Máy xay sinh tố

Nguyên liệu – Hóa chất

Nấm men Saccharomyces cerevisiae

Glucose: 50g;

Saccharose: 50g Peptone: 10g;

KH2PO4: 3g;

MgSO4.7H2O: 2g;

Agar: 20g Dung dịch DNS Dung dịch glucose – fructose (1:1) 10 µmol/mLDung dịch sucrose 0,3 M pha trong đệm acetate pH 4,7

Đệm acetate 0,1M pH 4,7 Thuốc thử Bradford

Cồn 70

Cát sạch

22

4.3 QUY TRÌNH THU NHẬN ENZYM INVERTASE TỪ NẤM MEN

4.3.1 Sản xuất sinh khối nấm men

- Cấy chuyền nấm men: cấy chuyền nấm men trên môi trường Hansen nghiêng (Glucose: 50g; Peptone: 10g; KH2PO4: 3g; MgSO4.7H2O: 2g; Agar: 20g; Nước: 1000ml)

- Nhân giống cấp 1: nhân giống nấm men với môi trường Hansen lỏng, lắc trong 24h ở nhiệt

độ phòng

- Nhân giống cấp 2: chuyển giống cấp 1 sang môi trường nhân giống cấp 2 (thay glucose trong môi trường Hansen bằng saccharose), lắc trong 24h ở nhiệt độ phòng

Sauk hi nhân giống cấp 2, dịch men giống được ly tâm tách nước thu sinh khối

Lưu ý: môi trường cần được hấp khử trùng trước khi cấy chuyền và nhân giống

4.3.2 Thu nhận và kết tủa enzyme invertase từ sinh khối nấm men:

- Phá vỡ tế bào nấm men và trích ly invertase:

Phương pháp nghiền: 5-10 g sinh khối nấm men được cho vào cối, thêm H2O (tỷ lệ 1:1) và một ít cát sạch Hỗn hợp được nghiền kỹ để phá vỡ tế bào nấm men Sau khi nghiền, tiếp tục thêm nước (tỷ lệ 9:1 so với khối lượng NM) vào cối, khuấy đều, ly tâm thu dịch enzyme Phương pháp siêu âm: 20-30g sinh khối nấm men được cho vào becker (250mL), thêm 50 mL nước cất Thực hiện siêu âm hỗn hợp trên trong 3 phút (siêu âm 30s, dừng 5s) Trong quá trình siêu âm cần giữ lạnh hỗn hợp nấm men Kết thúc quá trình ly tâm, tiếp tục thêm nước (tỷ

lệ 9:1 so với khối lượng NM) vào cốc, khuấy đều, ly tâm thu dịch enzyme

- Dịch enzyme được bổ sung acetone tuyệt đối với tỷ lệ thể tích 1 enzyme: 3 acetone, khuấy nhẹ, để yên 15 phút sau đó ly tâm thu tủa invertase Tủa enzyme được bảo quản ở nhiệt độ <

4C

4.4 PHÂN TÍCH CHẾ PHẨM INVERTASE

Dịch enzyme invertase trích ly từ nấm men và kết tủa enzyme invertase sẽ được xác định: hàm lượng protein theo phương pháp Bradford (Phụ lục 2) và xác định hoạt tính invertase bằng thuốc thử DNS

+ Lấy vào becher 60 – 70mL nước cất và 1,6 g NaOH, khuấy đều trên máy khuấy từ

+ Khi NaOH tan hết, thêm vào becher 1g DNS, khuấy cho tan hết

+ Sau cùng, bổ sung vào becher 30g muối Tatrat Na – K

+ Chuyển toàn bộ dung dịch vào bình định mức 100mL và định mức đến vạch bằng nước cất + Đem dung dịch bảo quản trong chai nâu ở nhiệt độ 6 – 8 C (dung dịch dùng trong 15 ngày)

-Dung dịch đường chuẩn: dung dịch chứa glucose và fructose tỷ lệ là 1:1 nồng độ 10 µmol/mL

Lắc đều đến khi dung dịch không còn phân lớp

- Đo độ hấp thu ở bước sóng  = 540 nm Tính OD từ đó vẽ đồ thị OD theo nồng độ đường chuẩn