Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của cá mú chấm cam Epinephelus coioides (Hamilton, 1822) nuôi tại Khánh Hòa đối với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus

Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của cá mú chấm cam Epinephelus coioides (Hamilton, 1822) nuôi tại Khánh Hòa đối với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

NGUYỄN THỊ THANH THÙY

NGHIÊN CỨU ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH Ở

CÁ MÚ CHẤM CAM (Epinephelus coioides

Hamilton, 1822) NUÔI TẠI KHÁNH HÒA ĐỐI

VỚI VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus

Chuyên ngành : Nuôi trồng Thủy sản

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

NGUYỄN THỊ THANH THÙY

NGHIÊN CỨU ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH Ở

CÁ MÚ CHẤM CAM (Epinephelus coioides

Hamilton, 1822) NUÔI TẠI KHÁNH HÒA ĐỐI

VỚI VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

KHÁNH HÒA - 2014

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu “ Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch ở

cá mú chấm cam (Epinephelus coioides Hamilton, 1822) đối với vi khuẩn Vibrio

parahaemolyticus” là kết quả nghiên cứu nghiêm túc của bản thân tôi trong suốt

thời gian từ năm 2007-2012 dưới sự hướng dẫn tận tình của Thầy Cô hướng dẫn Tôi xin cam đoan các kết quả, số liệu trong luận án là trung thực và chưa từng được

ai công bố trong bất kỳ công trình nào

Khánh Hòa, năm 2014

Nghiên cứu sinh

Nguyễn Thị Thanh Thùy

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến Ban giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Khoa Nuôi Trồng Thuỷ Sản, Khoa Sau Đại học đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận án

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ban Lãnh Đạo Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản III, Dự án “Mô hình hóa ven biển và quản lý sức khỏe cá- NUFUPRO 2007/10086” đã tạo mọi điều kiện thuận lợi về thời gian và hỗ trợ toàn

bộ kinh phí cho tôi thực hiện luận án

Lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tôi muốn dành riêng cho hai Thầy Cô giáo hướng dẫn: TS Nguyễn Hữu Dũng và Giáo sư Heidrun I Wergeland đã định hướng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án

Xin chân thành cảm ơn Trung tâm quan trắc cảnh báo môi trường và phòng ngừa dịch bệnh khu vực miền Bắc; Trung tâm quan trắc cảnh báo môi trường và phòng ngừa dịch bệnh khu vực miền Nam đã cung cấp chủng vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu này

Xin chân thành cảm ơn đến PGS.TS Đỗ Thị Hòa, TS Lê Văn Bé, TS Phạm Quốc Hùng, TS Đặng Thúy Bình, ThS Nguyễn Thị Thoa đã sẵn lòng giúp đỡ, đóng góp ý kiến quý báu, chia sẻ kinh nghiệm và động viên tinh thần trong quá trình thực hiện luận án

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các chuyên gia Phòng nghiên cứu miễn dịch

- Khoa sinh học - Trường đại học Bergen: TS Ragnhild A Jakobsen, TS Gyri T Haugland, TS Eirin F Pettersen, NCS Anita Ronneseth và KS Paul H Lovik đã tận tình hướng dẫn các kỹ thuật phân tích các thông số miễn dịch trong thời gian tôi thực hiện nghiên cứu tại Trường Đại học Bergen, Nauy

Cuối cùng, tự đáy lòng cho phép tôi được bày tỏ tình cảm, lòng biết ơn sâu sắc nhất đến những người thân yêu của tôi: Má, anh chị, chồng tôi Nguyễn Văn Hùng và con gái Nguyễn Anh Thi đã luôn bên cạnh động viên khích lệ tinh thần cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận án

Tôi xin trân trọng cảm ơn và tri ân tất cả tình cảm và sự giúp đỡ quý báu đó

Khánh Hòa, năm 2014

Nguyễn Thị Thanh Thùy

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC BẢNG viii

DANH MỤC HÌNH ix

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Vài nét về đối tượng cá mú chấm cam Epinephelus coioides 4

1.1.1 Một số đặc điểm sinh học chủ yếu 4

1.1.2 Nghề nuôi cá mú trên thế giới và tại Việt Nam 6

1.1.3 Một số bệnh thường gặp ở cá mú nuôi 8

1.2 Vi khuẩn Vibrio và bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra trên cá biển 10

1.2.1 Vi khuẩn Vibrio 10

1.2.2 Bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra trên cá biển 15

1.3 Đặc điểm hệ miễn dịch ở cá xương 17

1.3.1 Miễn dịch tự nhiên 18

1.3.2 Miễn dịch đặc hiệu 23

1.3.3 Các nhân tố ảnh hưởng đáp ứng miễn dịch ở cá 27

1.4 Sử dụng vaccine và các chất kích thích miễn dịch trong nghề nuôi cá 29

1.4.1 Nghiên cứu ứng dụng các chất kích thích miễn dịch ở cá nuôi 29

1.4.2 Nghiên cứu và sử dụng vaccine ở cá nuôi 30

1.5 Tình hình nghiên cứu miễn dịch và vaccine cho cá ở Việt Nam 36

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40

2.1 Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 40

2.1.1 Đối tượng 40

2.1.2 Vật liệu 40

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu 41

2.1.4 Thời gian nghiên cứu 41

2.2 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu chính của luận án 42 2.3 Phương pháp nghiên cứu 42

2.3.1 Nghiên cứu đặc điểm của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 42

2.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của β-glucan đến đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu ở cá mú chấm cam 45 2.3.3 Nghiên cứu đặc điểm phân tử kháng thể của cá mú chấm cam 50 2.3.4 Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của cá mú chấm cam đối với vi

khuẩn Vibrio parahaemolyticus 52

2.4 Phương pháp xử lý số liệu 56

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 57

3.1 Đặc điểm vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh lở loét ở cá mú chấm cam 57 3.1.1 Bệnh xuất huyết lở loét ở cá mú chấm cam nuôi tại Khánh Hòa 57

3.1.2 Đặc điểm của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 59 3.1.3 Độc lực của các chủng Vibrio parahaemolyticus V1, V2, V3 và A đối với

cá mú chấm cam 67 3.2 Ảnh hưởng của β-glucan đến các thông số miễn dịch không đặc hiệu và khả năng kháng bệnh do Vibrio parahaemolyticus gây ra ở cá mú chấm cam 70 3.2.1 Thành phần, đặc điểm hình thái và kích thước các loại tế bào máu của cá

mú chấm cam 71 3.2.2 Ảnh hưởng của β-glucan đến thành phần bạch cầu trong máu của cá mú chấm cam 74 3.2.3 Ảnh hưởng của β-glucan đến chỉ số thực bào của tế bào bạch cầu tiền thận cá mú chấm cam 77 3.2.4 Ảnh hưởng của β-glucan đến hoạt tính bùng nổ hô hấp của tế bào bạch cầu tiền thận cá mú chấm cam 80

3.2.5 Ảnh hưởng của β-glucan đến khả năng kháng bệnh do vi khuẩn Vibrio

parahaemolyticus gây ra ở cá mú chấm cam 83

3.3 Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu ở cá mú chấm cam đối với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 86 3.3.1 Đặc điểm phân tử kháng thể IgM ở cá mú chấm cam 86 3.3.2 Đáp ứng tạo kháng thể ở cá mú chấm cam đối với 4 chủng vi khuẩn

Vibrio parahaemolyticus bất hoạt formalin không có FIA 88

3.3.3 Đáp ứng miễn dịch dịch thể và khả năng kháng bệnh của cá mú chấm cam

sau khi gây miễn dịch bằng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus V3 bất hoạt bằng formalin

có bổ sung chất bổ trợ FIA 89

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 102

Kết luận 102

Đề xuất ý kiến 103

TÀI LIỆU THAM KHẢO 104 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

PHỤ LỤC

DANH MỤC KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ tiếng Anh Viết đầy đủ tiếng Việt (Nếu có)

Blood agar base

Brain Heart Infusion

Colony Forming Unit

Cell-Mediated Immunity

C-reaction protein

Direct Immersion

Freund’s complete Adjuvant

Freund’s Incomplete Adjuvant

Humpback grouper nervous necrosis

Membrane attacking complex

Multivalent Adhesion Molecule

Major histocompatibility complex

Nutrient Broth

Non-specific cytotoxic cell

Natural killer cell

Môi trường thạch máu Môi trường nuôi cấy vi khuẩn Đơn vị tính khuẩn lạc vi khuẩn Miễn dịch qua trung gian tế bào Protein phản ứng C

Ngâm trực tiếp Đáp ứng miễn dịch Chất bổ trợ toàn phần Freund Chất bổ trợ bán phần Freund Loại virus gây hoại tử thần kinh ở cá mú lưng gù

Ngâm trong dung dịch ưu trương

Kiểm định hấp phụ miễn dịch liên kết enzyme gián tiếp

globulin miễn dịch globulin miễn dịch lớp M

Đơn vị tính khối lượng phân tử protein Liều gây chết 50%

Phức hợp tấn công màng Phân tử gắn kết đa trị Phức hợp hòa hợp mô chủ yếu lớp II Môi trường dinh dưỡng dạng lỏng

Tế bào độc không đặc hiệu

Tế bào diệt tự nhiên Nuôi trồng thủy sản

Phosphate Buffered Saline

Respiratory burst activity

Relative Percent Survival

Relative Percent Protection

Serum Amyloid Protein

Sodium Dodecyl Sulfate

-Polyacrylamide Gel Electrophoresis

Surface immunoglobuline

Thiosulphate citrate bile salt agar

Thermostable direct haemolysin

Thermolabile haemolysin

alpha Tumor Necrosis Factor

Trypticase Soya Agar

Trypticase Soya Broth

tdh-related hemolysin

Viral Nervous Necrosis

Mật độ quang Protein ngoại mạc Hoạt tính thực bào Dung dịch đệm muối photphat Hoạt tính bùng nổ hô hấp

Hệ số sinh tồn tương đối

Hệ số bảo vệ tương đối Protein huyết thanh dạng sợi Điện di trên gel polyacrylamide có SDS

Phân tử globulin miễn dịch bề mặt

Môi trường phân lập vi khuẩn Vibrio

Độc tố gây dung huyết bền nhiệt Độc tố gây dung huyết không bền nhiệt Yếu tố anpha gây hoại tử khối u

Tác nhân gây bệnh Môi trường thạch dinh dưỡng tổng hợp Môi trường lỏng dinh dưỡng tổng hợp

Độc tố gây dung huyết liên quan tdh Bệnh do vi khuẩn Vibrio

Bệnh hoại tử thần kinh do vi rút

Vi sinh vật

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Bệnh do vi khuẩn Vibrio trên cá mú nuôi 9 Bảng 3.1: Đặc điểm hình thái, sinh hóa, sinh lý của 4 chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 60 Bảng 3.2: Kích thước của các loại tế bào máu ở cá mú chấm cam Epinephelus coioides 72

Bảng 3.3: Sự biến đổi tỷ lệ các loại bạch cầu trong máu ở cá mú chấm cam sau

2 tuần được cho ăn β-glucan 74 Bảng 3.4: Hoạt tính thực bào của tế bào bạch cầu tiền thận cá mú chấm cam khi được bổ sung β-glucan vào thức ăn ở các nồng độ khác nhau 77

Bảng 3.5: Tỷ lệ chết tích lũy và hệ số bảo hộ của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus bất hoạt bằng formalin đối với cá mú Epinephelus coioides 99

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cá mú chấm cam Epinephelus coioides 4

Hình 1.2: Xu hướng sản lượng và giá trị cá mú trên thế giới 6

Hình 1.3: Sản lượng cá mú ở các quốc gia và vùng lãnh thổ nuôi chủ yếu 7

Hình 1.4: Đặc điểm cấu tạo màng tế bào vi khuẩn Vibrio 11

Hình 1.5: Vị trí và cấu tạo tuyến ức cá mú Epinephelus malabaricus 26

Hình 2.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu 42

Hình 2.2: Hệ thống bể (a) và cá mú chấm cam thí nghiệm (b) 46

Hình 2.3: Các dụng cụ, thiết bị sử dụng phân lập bạch cầu 48

Hình 2.4: Các bước khảo sát hoạt tính thực bào 49

Hình 3.1: Cá mú chấm cam Epinephelus coioides bị bệnh lở loét thu tại Khánh Hòa 57

Hình 3.2: Vibrio parahaemolyticus trên môi trường thạch máu 62

Hình 3.3: Kết quả điện di trên gel agarose gen 16s rDNA của các chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 63

Hình 3.4: Cây phát sinh loài các chủng vi khuẩn Vibrio 63

Hình 3.5: Thành phần protein của các chủng Vibrio parahaemolyticus 66

Hình 3.6: Cá mú chấm cam Epinephelus coioides cảm nhiễm vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 68

Hình 3.7: Tỷ lệ chết tích lũy (%) của cá mú chấm cam Epinephelus coioides khi bị cảm nhiễm bởi Vibrio parahaemolyticus với các chủng và mật độ vi khuẩn khác nhau 68

Hình 3.8: Hình ảnh các loại tế bào máu cá mú chấm cam Epinephelus coioides 72

Hình 3.9: Chỉ số thực bào của bạch cầu tiền thận cá mú chấm cam Epinephelus coioides 78

Hình 3.10: Hình ảnh thực bào của các tế bào bạch cầu mô thận cá mú chấm cam Epinephelus coioides 79

Hình 3.11: Hoạt tính RB của tế bào bạch cầu tiền thận cá mú chấm cam Epinephelus coioides 81

Hình 3.12: Tỷ lệ chết tích lũy của cá mú chấm cam Epinephelus coioides cảm nhiễm vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus ở ngày thứ nhất (a) và ngày thứ 15 (b) sau khi ngừng cho ăn β-glucan 83

Hình 3.13: Kết quả phân tích phân tử globulin miễn dịch (IgM) của cá mú chấm cam bằng các kỹ thuật SDS-PAGE và Western Blot 86

Hình 3.14: Biến động hiệu giá kháng thể ở cá mú chấm cam sau khi gây miễn dịch bằng 4 chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus bị bất hoạt bằng formalin được xác

định bằng kỹ thuật ELISA đo ở bước sóng 490 nm 88

Hình 3.15: Biểu hiện liên kết giữa kháng thể của cá mú chấm cam Epinephelus

coioides với protein của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus V3 bằng kỹ thuật Western

Blot 90

Hình 3.16: Biến động hiệu giá kháng thể ở cá mú chấm cam Epinephelus coioides sau khi gây miễn dịch bằng chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus V3 đã bất hoạt

bằng formalin được xác định bằng kỹ thuật ELISA đo ở bước sóng 490 nm 93

Hình 3.17: Tỷ lệ chết tích lũy ở cá mú chấm cam Epinephelus coioides công cường

độc ở thời điểm 30 ngày sau khi gây miễn dịch 97

Hình 3.18: Tỷ lệ chết tích lũy ở cá mú chấm cam Epinephelus coioides công cường

độc ở thời điểm 60 ngày sau khi gây miễn dịch 98

MỞ ĐẦU

Nuôi trồng thủy sản (NTTS) là nguồn cung cấp thực phẩm quan trọng phục vụ nhu cầu dinh dưỡng cho con người, đồng thời đem lại kim ngạch xuất khẩu cho nhiều nước có tiềm năng phát triển NTTS, trong đó có Việt Nam

Hiện nay, xu hướng phát triển NTTS thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng

là nâng cao năng suất trên đơn vị diện tích ven bờ nhưng đảm bảo sự phát triển bền vững, thân thiện với môi trường tự nhiên Tuy nhiên, cùng với mức độ thâm canh hóa, dịch bệnh là trở ngại chính cho sự phát triển bền vững sản lượng NTTS

Trong những năm qua, việc chữa trị các bệnh do vi khuẩn và do một số tác nhân khác bằng thuốc kháng sinh và hóa chất đã gây ra nhiều hậu quả tiêu cực, đã không mang lại hiệu quả chữa trị như mong muốn mà còn làm tăng chi phí sản xuất Ngoài ra, việc lạm dụng kháng sinh trong điều trị dẫn đến phát sinh các chủng vi khuẩn kháng thuốc, không đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm [19] và ảnh hưởng tới thị trường xuất khẩu thủy sản của Việt Nam

Trước bối cảnh đó, nghiên cứu và phát triển vaccine phòng bệnh cho các đối tượng nuôi thủy sản có giá trị kinh tế thực sự là một cuộc cách mạng trong phát triển NTTS; đây là việc làm cấp thiết và phù hợp với mục tiêu phát triển NTTS ổn định, bền vững và thân thiện với môi trường Để thực hiện định hướng này, các nghiên cứu cơ bản về đặc điểm hệ miễn dịch của đối tượng nuôi là một trong những bước khởi đầu quan trọng cần tập trung ưu tiên

Trên thế giới, nghiên cứu miễn dịch ở cá bắt đầu từ những năm 50 của thế kỷ thứ 18 và ngày càng có nhiều công trình nghiên cứu và ứng dụng miễn dịch học ở

cá [204] Trong vài chục năm gần đây, nghiên cứu sản xuất và sử dụng vaccine phòng bệnh cá đã được thực hiện ở nhiều nơi trên thế giới và gần 100 loài cá đã được nghiên cứu về miễn dịch ở mức độ khác nhau [12]

Ở Việt Nam, nghiên cứu về miễn dịch ở cá vẫn còn khá mới mẻ và chúng ta chỉ mới ở những bước đi đầu tiên Điều này thể hiện qua số lượng công trình nghiên cứu liên quan đến miễn dịch và vaccine ở cá còn rất hạn chế Chỉ một vài cơ quan nghiên cứu trong cả nước bắt đầu nghiên cứu cũng như hợp tác với các tổ chức

trong và ngoài nước về vaccine thủy sản và đa phần là nghiên cứu vaccine vi khuẩn trên cá nước ngọt Mặc dù vậy, cho tới nay vẫn chưa có sản phẩm vaccine nào được công bố một cách chính thức trong nước

Cá mú chấm cam (Epinephelus coioides) là một trong những loài cá mú có giá

trị dinh dưỡng cao, lớn nhanh nên được nuôi rất phổ biến ở nhiều nước trên thế giới

và Việt Nam Tuy nhiên, nghề nuôi cá mú đang chịu thiệt hại nặng nề do dịch bệnh trong những năm gần đây Nhiều tác nhân gây bệnh (TNGB) trên cá mú đã được thông báo như virus [81], [89], ký sinh trùng [50], [49], [81], vi khuẩn [26], [81],

[171] Trong đó, bệnh do vi khuẩn Vibrio (dưới đây viết tắt là Vibriosis) đã được

phát hiện trên khoảng 48 loài cá biển và gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến nghề nuôi thủy sản ở nhiều nước [27] Riêng ở cá mú, Vibriosis có thể gây chết đến 70 % đàn

cá mú nuôi [174] Tại Việt Nam, Vibrio cũng đã được xác định là TNGB xuất

huyết, lở loét, mòn vây ở cá mú nuôi và gây thiệt hại kinh tế đáng kể cho người nuôi [5], [14], [148]

Để giảm thiểu những tổn thất kinh tế do Vibriosis gây ra, nhiều nghiên cứu biện pháp phòng trị bệnh bằng kháng sinh và hóa chất đã được chú ý Tuy nhiên, hiệu quả đem lại vẫn chưa ổn định mà còn kéo theo nhiều hệ lụy Thiệt hại do bệnh vẫn luôn là mối đe dọa cho nghề nuôi cá mú tại Việt Nam và các nước trong khu vực; và cũng là nguyên nhân gây trở ngại trong việc phát triển cá mú trở thành đối tượng nuôi ở qui mô công nghiệp và xuất khẩu Vì vậy, các nghiên cứu cơ bản về miễn dịch học của cá mú đối với TNGB sẽ góp phần cung cấp thêm những thông tin

về cơ chế kháng bệnh ở cá, làm tiền đề cho nghiên cứu sản xuất vaccine phòng bệnh cho cá là hướng đi đúng đắn và cần thiết

Xuất phát từ thực tiễn trên, được sự cho phép của Trường Đại học Nha Trang,

đề tài “Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch ở cá mú chấm cam (Epinephelus coioides Hamilton,1822) nuôi tại Khánh Hòa đối với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus”

đã được thực hiện

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là làm rõ đặc điểm đáp ứng miễn dịch

(ĐƯMD) ở cá mú chấm cam đối với vi khuẩn V parahaemolyticus

Nội dung nghiên cứu:

1 Nghiên cứu đặc điểm của vi khuẩn V parahaemolyticus gây bệnh lở loét ở

cá mú chấm cam

2 Nghiên cứu ĐƯMD không đặc hiệu của cá mú chấm cam đối với vi khuẩn

V parahaemolyticus và ảnh hưởng của chất kích thích miễn dịch β-glucan

đến đáp ứng này

3 Nghiên cứu ĐƯMD đặc hiệu của cá mú chấm cam đối với vi khuẩn V

parahaemolyticus bất hoạt bằng formalin

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án:

1 Về khoa học: Kết quả của luận án đóng góp những thông tin khoa học về

đặc điểm ĐƯMD của cá mú chấm cam đối với vi khuẩn Vibrio; Góp phần xây dựng

nền tảng để mở ra hướng nghiên cứu về miễn dịch học ở cá biển, một hướng mới đã góp phần nâng cao hiệu quả trong NTTS ở nhiều nước tiên tiến nhưng chưa được phát triển ở Việt Nam

2 Về thực tiễn: Kết quả nghiên cứu của luận án là cơ sở khoa học cho nghiên cứu ứng dụng sản xuất vaccine và dùng chất kích thích miễn dịch để phòng Vibiosis cho cá biển nuôi và đặc biệt là cá mú chấm cam tại Việt Nam

Tính mới của luận án

1 Luận án là một trong những công trình đầu tiên nghiên cứu cơ bản về miễn dịch học ở cá biển nói chung và cá mú nói riêng tại Việt Nam

2 Luận án là một trong số ít công trình đầu tiên tại Việt Nam nghiên cứu về ảnh hưởng của chất kích thích miễn dịch β-glucan đến ĐƯMD không đặc hiệu của

cá mú chấm cam thông qua biến đổi thành phần tế bào máu, hoạt tính thực bào, hoạt tính hô hấp và khả năng kháng bệnh

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Vài nét về đối tượng cá mú chấm cam Epinephelus coioides

1.1.1 Một số đặc điểm sinh học chủ yếu

Hình 1.1: Cá mú chấm cam Epinephelus coioides

Tên tiếng Anh: Orange-spotted grouper [163], Green grouper [118]

Tên tiếng Việt: Tùy theo từng địa phương mà loài này có các tên gọi là cá mú chấm cam, cá mú chấm nâu, cá mú đen

Cá mú chấm cam có đặc điểm chung của giống cá mú Epinephelus như có

thân thuôn dài, mình hơi hẹp, miệng rộng, có nhiều răng nhỏ, sắc nhọn Đặc điểm nhận biết riêng như vây lưng có XI gai cứng và 13 - 16 tia vây mềm, vây ngực có

18 - 20 tia mềm, vây bụng có I gai cứng và 5 tia mềm, vây hậu môn có III gai cứng

và 8 tia mềm; vây đuôi mềm và tròn Đường bên của cá có 58 - 65 vẩy Vẩy trên cơ thể có dạng hình lược, trừ ở ngực, bụng và vùng trên vây hậu môn Cuống đuôi thường hẹp Mỗi bên mang, lược mang có 8 - 10 phiến mang trên và 14 - 17 phiến mang dưới Nắp mang có 3 gai thẳng và thường bị phủ dưới da Trên cơ thể có nhiều chấm màu cam hoặc nâu, màu sắc cơ thể thay đổi thích nghi theo môi trường sống, giai đoạn phát triển và trạng thái sinh lý [163] Cá thể có khối lượng lớn nhất ghi nhận được là 32 kg, chiều dài đạt 120 cm [68]

Giống với nhiều loài trong họ cá mú, cá mú chấm cam phân bố chủ yếu ở các vùng biển nhiệt đới và cận nhiệt đới, là loài thích sống nơi có rạn san hô và bãi đá ngầm Đa số các loài phân bố ở độ sâu nhỏ hơn 100 m, chỉ một vài loài phân bố ở

độ sâu 100 - 200 m (có trường hợp đến 500 m) [68], [163] Ở Việt Nam, cá mú chấm cam phân bố từ vịnh Bắc Bộ đến vịnh Thái Lan, tập trung chủ yếu ở khu vực miền Trung nơi có nhiều vịnh, biển ven bờ với các rạn san hô, bãi đá ngầm, cỏ biển rất thích hợp cho cá mú sinh sống [10]

Cá mú chấm cam thuộc loài cá dữ, trong tự nhiên, chúng ăn giáp xác, cá có kích thước nhỏ, động vật thân mềm Tập tính bắt mồi của cá mú rất đặc trưng là rình trong các khe đá, bụi rong, san hô để chộp mồi Khả năng bắt mồi của cá mú tốt nhất ở 22 - 30 oC và có xu hướng giảm khi nhiệt độ nước thấp hơn 18 oC [163]

Cá mú chấm cam có tuổi thọ trung bình khoảng 22 năm, cá thể cái trưởng thành đạt chiều dài thân từ 25 - 30 cm ở 2 đến 3 năm tuổi, hiện tượng chuyển đổi giới tính xảy ra khi kích thước của cá đạt từ 55 - 75 cm [75] Cá mú chấm cam trưởng thành có hiện tượng kết cặp trong mùa sinh sản, thường vào tháng 3 đến tháng 6 hàng năm Sức sinh sản thực tế phụ thuộc kích thước cá cái, dao động khoảng 85 vạn trứng (cá cái dài 35 cm) đến gần 3 triệu trứng (cá cái dài 62 cm) Cá

mú chấm cam thường đẻ trứng ở vùng biển khơi, nơi có độ mặn thích hợp từ 30 - 35

‰ và nhiệt độ khoảng 30 °C Ấu trùng cá mú chấm cam sống ở vùng cửa sông, nơi

có nhiều bùn lẫn cát, sỏi hoặc ở vùng rừng ngập mặn [68], [88]

1.1.2 Nghề nuôi cá mú trên thế giới và tại Việt Nam

Nuôi trồng thủy sản trên thế giới ngày càng phát triển mạnh mẽ với nhiều đối tượng nuôi có giá trị nhằm đáp ứng nhu cầu sử dụng của con người Trong đó, cá

mú được xem là loài có giá trị kinh tế ở khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới Thống

kê của Pierre et al (2007) cho thấy khoảng 90 % thực phẩm trên thế giới có nguồn

gốc từ biển, trong đó, cá mú chiếm tỷ lệ khá lớn [158] Với đặc tính dinh dưỡng cao, thịt thơm ngon nên cá mú rất được ưa chuộng ở thị trường Nhật Bản, Hàn Quốc, Hồng Kông, Trung Quốc và một số nước Châu Mỹ Giá cá mú sống tại thị trường phía Nam Trung Quốc và Hồng Kông lên tới 100 USD/kg [116]

Sản lượng cá mú tăng liên tục trong những năm gần đây Trong đó, sản lượng khai thác chiếm phần lớn trong tổng sản lượng cá mú trên toàn thế giới và ngày càng có xu hướng tăng chậm do nguồn lợi suy giảm trong khi sản lượng nuôi đang tăng lên nhanh chóng Thống kê của FAO (2012) cho thấy sản lượng khai thác năm

2010 đạt hơn 300 ngàn tấn, tăng 25 % so với sản lượng năm 2000 (244 ngàn tấn) và chiếm 79 % tổng sản lượng cá mú trong cùng năm Trái lại, sản lượng cá mú nuôi tăng đột biến từ 9,5 ngàn tấn (năm 2000) đến 81 ngàn tấn (năm 2010), tăng hơn 747

%, chiếm 21 % tổng sản lượng cá mú trên toàn thế giới [69] (Hình 1.2)

Hình 1.2: Xu hướng sản lượng và giá trị cá mú trên thế giới [69]

(a Sản lượng cá mú nuôi và khai thác; b Sản lượng cá mú nuôi và giá trị)

b

Mặc dù số liệu thống kê thể hiện sản lượng cá mú nuôi tăng lên nhưng tổng giá trị ở các năm lại không ổn định, có năm lại giảm mạnh như năm 2006 và năm

2008 (Hình 1.2.b) Điều này cho thấy hiện tượng bão hòa của thị trường đối với cá

mú nuôi, đặc biệt do người nuôi chuyển sang sản xuất các loài cá mú có giá thấp hơn nên dẫn đến tổng giá trị giảm xuống [141]

Nghề nuôi cá mú đã bắt đầu từ năm 1970 ở Singapore, Malaysia, Hồng Kông, Thái Lan và Đài Loan [179] Ngày nay, cá mú được nuôi ở nhiều quốc gia và vùng lãnh thổ trên thế giới như Trung Quốc, Indonesia, Malaysia, Philippines, Thái Lan, Đài Loan, Hồng Kông, Hàn Quốc, Australia…[158] Sản lượng cá mú nuôi trong giai đoạn từ năm 2000 đến 2010 tại các quốc gia và vùng lãnh thổ nuôi cá mú chủ yếu được thể hiện ở Hình 1.3

Hình 1.3: Sản lượng cá mú ở các quốc gia và vùng lãnh thổ nuôi chủ yếu [69]

Hình 1.3 cho thấy Trung Quốc, Đài Loan, Indonesia, Malaysia là những quốc gia và vùng lãnh thổ có sản lượng cá mú nuôi cao nhất thế giới và đối tượng được nuôi phổ biến nhất là cá mú chấm cam

Tại Việt Nam, nghề nuôi cá mú bắt đầu hình thành từ năm 1988, được duy trì

và phát triển đến ngày nay Vùng nuôi cá mú tập trung ở Hải Phòng, Quảng Ninh, Phú Yên, Khánh Hòa, Vũng Tàu Các đối tượng nuôi chủ yếu bao gồm cá mú chấm

cam E coioides, cá mú chấm đen E malabaricus, cá mú chấm đỏ E akaara, cá mú

sỏi E bleekeri, cá mú mỡ E tauvina, cá mú cọp E fuscoguttatus, cá mú sáu vạch E

sexfasciatus, cá mú chấm tổ ong E merra, cá mú chấm xanh Plectropomus leopardus [13] Nguồn cá mú giống cung cấp cho nuôi thương phẩm chủ yếu được

đánh bắt từ tự nhiên và hình thức nuôi chủ yếu là nuôi lồng trên biển hoặc nuôi ao đìa vùng triều với qui mô hộ gia đình Hiện nay, cả nước có khoảng gần 7000 lồng nuôi cá biển, trong đó, lồng nuôi cá mú chiếm 80 % và khoảng 500 ha ao đìa nuôi

cá mú với sản lượng ước tính khoảng 3.000 tấn/năm [13]

1.1.3 Một số bệnh thường gặp ở cá mú nuôi

 Bệnh do vi rút ở cá mú nuôi

Bệnh do vi rút nguy hiểm nhất đối với cá mú là bệnh hoại tử thần kinh do vi rút Viral Nervous Necrosis (VNN) Bệnh này xuất hiện trên cá ở các giai đoạn từ con giống cho đến trưởng thành và gây chết với tỷ lệ cao, có thể lên đến 100 %

quần đàn trong thời gian ngắn Bệnh xảy ra phổ biến nhất ở cá mú chấm đỏ E

akaara, cá mú cọp E fuscogutatus, cá mú chấm đen E malabaricus…[81] Cá

giống 2 – 5 cm bị nhiễm VNN thường có những biểu hiện đặc trưng là thân có màu đen, bơi xoay vòng không định hướng và chết rất nhanh, không có biểu hiện tổn thương ở bên ngoài Tác nhân gây bệnh do virus trên cá mú đã được nghiên cứu bởi nhiều tác giả trên thế giới và biện pháp khắc phục thiệt hại do bệnh này đến nay chủ yếu là phòng bệnh [81], [89]

 Bệnh do ký sinh trùng ở cá mú nuôi

Bệnh do ký sinh trùng (KST) gây ra cũng rất phổ biến ở cá mú [50], [49], [81] Hơn 80 % nông hộ cho biết cá nuôi có những biểu hiện bệnh liên quan đến KST Các loại KST gặp nhiều nhất trên cá mú nuôi lồng là sán lá đơn chủ

Monogenea, giáp xác Copepoda, Isopoda và động vật đơn bào (Trichodina, Cryptocaryon, Apiosoma) Chúng ký sinh trên da, trong miệng, mang, nắp mang,

gây tưa mang, khó thở, làm cá bỏ ăn, chậm lớn và thường gây chết cao ở giai đoạn

cá nhỏ [81]

 Bệnh xuất huyết lở loét do vi khuẩn Vibrio

Bệnh xuất huyết lở loét là một trong những bệnh thường gặp nhất và xuất hiện

ở hầu hết các giai đoạn phát triển của cá mú nuôi, gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi cá

mú ở nhiều nước TNGB thuộc giống Vibrio, các loài thường gặp là V

parahaemolyticus, V alginolyticus, V vulnificus, V carchariae…[81] Dấu hiệu đầu

tiên của bệnh là cá bỏ ăn, bơi lờ đờ, màu sắc thân đen dần Cá nhiễm nặng thường có hiện tượng mất thăng bằng, bơi ngửa bụng, mang nhợt nhạt, xuất huyết quanh miệng

và vây, có nhiều vết loét trên bề mặt cơ thể; nội quan có hiện tượng xuất huyết ở thận, gan và thành ruột Tỷ lệ chết của cá mú nuôi do Vibriosis có thể đến 70 %

quần đàn [174] Một số vi khuẩn Vibrio gây bệnh cho cá mú nuôi trên thế giới được

tổng hợp ở Bảng 1.1

Bảng 1.1: Bệnh do vi khuẩn Vibrio trên cá mú nuôi

Malaysia Malaysia Indonesia Trung Quốc Italia

Philippines

E malabaricus

E salmoides Epinephelus spp

E malabaricus Epinephelus spp

E coioides

Chi et al (1997)(Trích [82]) Lee et al (1999) (Trích [82]) Yii et al (1997) [214]

Tại Việt Nam, nhiều nghiên cứu cũng đã phát hiện vi khuẩn V

parahaemolyticus, V alginolyticus, V carchariae, V vulnificus là TNGB xuất

huyết lở loét cho cá mú nuôi ở cả 3 miền Bắc, Trung, Nam Dấu hiệu bệnh lý đặc

trưng là các vết xuất huyết lở loét trên thân, bệnh lây lan nhanh và có thể gây chết đến 30 % đàn cá nuôi [5], [8], [14], [148]

Trong các bệnh thường gặp ở cá mú, bệnh lở loét xuất huyết do vi khuẩn

Vibrio spp gây ra là bệnh thường gặp nhất và có mức độ lây lan nhanh Những

hiểu biết sâu hơn về đặc điểm cấu tạo, cơ chế gây độc của vi khuẩn Vibrio cũng

như tác hại của chúng trên các đối tượng nuôi trở nên rất cần thiết, là cơ sở ứng dụng nghiên cứu phòng trị bệnh nhằm mang lại lợi ích kinh tế cho người nuôi

1.2 Vi khuẩn Vibrio và bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra trên cá biển

 Đặc điểm hình thái cấu tạo, sinh thái, sinh lý và sinh hóa

Giống Vibrio thuộc họ Vibrionaceae có đặc điểm chung là vi khuẩn Gram âm,

cấu tạo có dạng hình que hay hình dấu phẩy, kích thước tế bào từ 0,3 - 0,5 m x 1,4

- 2,6 m Vibrio có khả năng di động nhờ một tiên mao hoặc nhiều tiên mao mảnh,

đa phần có phản ứng Oxydase dương tính, có khả năng oxy hoá và lên men trong môi trường O/F glucose, không có khả năng sinh H2S và nhạy với Vibriostat 2,4-diamino-6,7-diisopropylpteridine phosphate (0/129) Môi trường TCBS là môi

trường chọn lọc của Vibrio spp

Hầu hết các loài thuộc giống Vibrio đều phân bố trong môi trường nước mặn,

thích hợp ở 20 - 40 ‰, cá biệt có loài có thể phát triển ở độ mặn 70 ‰ [4]

Màng tế bào vi khuẩn Gram âm cấu tạo gồm 3 lớp: lớp trong (inner membrane), lớp peptidoglycan và lớp màng ngoài (outer membrane) (Hình 1.4a) Thành phần chính của màng là protein, lipopolysacharides (LPS) và phospholipids Trong đó, protein và phospholipid là thành phần không bền nhiệt trong khi LPS khá bền với nhiệt

LPS tạo nên lớp màng ngoài vi khuẩn Gram âm, thành phần gồm lipid và polysaccharide Cấu trúc của LPS gồm 3 phần (Hình 1.4b): phần lipid A gồm các acid béo làm cầu nối giữa chuỗi polysaccharide và màng tế bào, tiếp đến là phần lõi (core) là một Oligosaccharide, và ngoài cùng là phần chuỗi O-polysaccharide gồm các phân tử đường gắn với nhau tạo thành chuỗi, đây là phần khác nhau giữa các loài vi khuẩn Gram âm Trong đó, lipid A, thành phần gây độc của phân tử LPS, gây nên sự giải phóng hàng loạt các cytokine gây viêm và hoạt hóa hệ bổ thể, trong khi đó phần chuỗi O tạo nên tính kháng nguyên đặc hiệu ở vi khuẩn Gram âm [137]

Hình 1.4: Đặc điểm cấu tạo màng tế bào vi khuẩn Vibrio [137]

(a: Cấu tạo màng tế bào; b: Cấu trúc sợi Lipopolysacharite)

Dựa trên sự tổ hợp giữa các thành phần mang tính kháng nguyên có mặt ở vách tế bào chủ yếu là LPS (Kháng nguyên O) và ở lớp vỏ tế bào (Kháng nguyên

K) tạo nên các tuýp huyết thanh (Serotype) khác nhau của vi khuẩn V

parahaemolyticus [56] Tổng hợp tài liệu đã công bố, Christopher et al (2011) đã

xác định có khoảng 13 loại kháng nguyên O với hơn 70 loại kháng nguyên K và có

ít nhất 12 serotype của V parahaemolyticus được nhận dạng [44]

Sự phân bố của V parahaemolyticus có mối liên quan chặt chẽ với nhiệt độ

nước Ở những vùng nước có nhiệt độ trên 15 o

C, chúng có mặt quanh năm trong nước, chất lắng cặn và có mật độ tăng cùng với sự tăng lên của nhiệt độ nước [44], [108] Ngoài ra, pH của môi trường cũng có ảnh hưởng đến hoạt động của vi khuẩn

này Nghiên cứu của Kazuyuki et al (1979) cho thấy cả 20 chủng V

parahaemolyticus thí nghiệm đều phát triển được trên môi trường NB với pH biến

thiên từ 6,0 - 9,0 Tuy nhiên, ở pH 9,0 vi khuẩn không tiết ra hemolysin trong khi ở các pH khác đều có hiện tượng này Hơn nữa, khả năng vận động bằng tiên mao của vi khuẩn bị ức chế trong môi trường kiềm nhưng không bị ảnh hưởng ở môi trường trung tính và axit Kết quả nghiên cứu này cho thấy pH của môi trường có

ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất và khả năng vận động của V

parahaemolyticus [110] Nghiên cứu của Christopher et al (2011) cho thấy khi ở độ

mặn thích hợp và pH 8,0, vi khuẩn V parahaemolyticus có khả năng di động bằng

tiên mao với vận tốc 60 μm/s [44]

 Độc tính của vi khuẩn Vibrio

Vi khuẩn Vibrio gây bệnh cho ký chủ thông qua các loại độc tố (toxin), đây là

các hoạt chất sinh học có bản chất protein hoặc không phải protein do vi khuẩn tiết

ra nhằm gây độc cho tế bào vật chủ Quá trình gây bệnh của chúng diễn ra theo trình

tự bám dính, xâm nhập vào tế bào vật chủ và tiết ra các độc tố phá vỡ màng tế bào

và gây độc cho tế bào vật chủ Nghiên cứu của Krachler et al (2011) cho thấy sự bám dính đầu tiên của V parahaemolyticus vào tế bào vật chủ thông qua phân tử

gắn kết đa trị (Multivalent Adhesion Molecule - MAM) chứa 6 hoặc 7 vùng gắn kết (Trích [44]) Hoạt tính dung huyết, thủy phân, phân giải protein, lipid, phospholipid,

cytotoxin, yếu tố gây bám dính, ngưng kết đều liên quan tới khả năng gây bệnh của

nhiều loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio và được quy định bởi các gen độc tố đặc

trưng [217]

Đã có nhiều công trình nghiên cứu liên quan đến yếu tố gây độc ở một số loài

vi khuẩn thuộc giống Vibrio như: V cholerae, V parahaemolyticus, V harveyi,

V alginolyticus, V anguillarium….[43], [145], [162], [184], [217]

Nghiên cứu của Lee (1995) đã khảo sát các yếu tố gây độc của vi khuẩn V

alginolyticus phân lập từ cá mú E malabaricus nuôi tại Đài Loan Kết quả nghiên

cứu cho thấy liều gây chết 50 % (LD50) ở cá khi tiêm cảm nhiễm bằng tế bào vi khuẩn là 0,5 x 103 cfu/g cá; bằng sản phẩm ngoại bào do vi khuẩn này tiết ra là 0,52 µg/g cá và bằng protein có khối lượng phân tử 34 kDa được tách chiết từ sản phẩm

ngoại bào của vi khuẩn này là 0,17 µg/g cá [121] Nghiên cứu của Quinones et al (2010) cho thấy tất cả các chủng V vulnificus phân lập từ hầu ở Mexico đều có độc

tố proteolysin, 98 % các chủng có khả năng bám chặt vào các tế bào biểu mô, 91,4

% có khả năng phân giải DNA, 77,6 % phân giải mucin, 97,8 % phân giải lecithine

và 79,8 % có khả năng phân giải lipid [162]

Cũng như các loài vi khuẩn khác thuộc giống Vibrio, vi khuẩn V

parahaemolyticus cũng tồn tại rất nhiều chủng mang các yếu tố gây độc khác nhau

Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng hoạt tính dung huyết (haemolysis) là một trong những

yếu tố gây độc của vi khuẩn V parahaemolyticus đối với vật chủ Haemolysin là

một exotoxin, chúng bám lên màng tế bào hồng cầu, gây thủng màng và giải phóng haemoglobin Kết quả là tạo ra hiện tượng dung huyết hoàn toàn (β-haemolysis) hoặc không hoàn toàn (α-haemolysis) [217]

Ngày nay, người ta đã phát hiện có 4 nhóm protein độc tố gây ra hiện tượng

dung huyết ở vi khuẩn Vibrio bao gồm TDH (Thermostable direct haemolysin), Hly

A (E1 Tor haemolysin), TLH (Thermolabile haemolysin) và δ-VPH (Thermostable

haemolysin) [217] Trong đó, TDH, TLH và δ-VPH thường gặp ở V

parahaemolyticus trong khi Hly A thường gặp ở V cholerae [217]

Độc tố TDH thường được phân lập từ các mẫu viêm ruột ở người, đặc trưng bởi hiện tượng Kanagawa dương tính (KP) TDH gây dung huyết kiểu β Cấu trúc protein này là một dimer bao gồm hai tiểu đơn vị và mỗi tiểu đơn vị có khối lượng

21 kDa, rất bền nhiệt (không bị bất hoạt ở 100 oC trong 10 phút) và có tính kháng

nguyên cao [149], [213] TDH ở V parahaemolyticus đã được chứng minh gây vỡ

tế bào bằng cách bám dính, tạo ra các lỗ tấn công màng tế bào vật chủ forming toxin), làm rối loạn trao đổi ion và phá vỡ màng tế bào do mất cân bằng thẩm thấu [194] Tuy nhiên, Han và Chai (1992) cho rằng không phải tất cả các

(pore-chủng vi khuẩn V parahaemolyticus đều gây bệnh, có 96,5 % các (pore-chủng vi khuẩn

này phân lập từ các bệnh nhân ngộ độc thực phẩm thủy sản có hiện tượng Kanagawa dương tính nhưng đến 99 % các chủng phân lập từ môi trường tự nhiên có

Kanagawa âm tính và chúng thường không phải là TNGB [80] Mặt khác, Honda et

al (1988) đã phát hiện một số chủng V parahaemolyticus gây dung huyết kèm theo

tích dịch nhưng có KP âm tính, hiện tượng này do yếu tố tdh-related hemolysin gây

ra [91] Đây là một loại độc tố không bền nhiệt (biến tính ở 60 oC trong 10 phút) và

cũng có cơ chế gây độc cho tế bào tương tự TDH [213] Các chủng V

parahaemolyticus phân lập được có thể chứa một trong hai loại độc tố này hoặc có

thể chứa cả hai loại và quy định mức độ độc tính khác nhau [56]

Ngoài ra, nhiều nghiên cứu đã xác định tính kháng nguyên và độc tố từ protein

ngoại mạc (OMP - outer membrane protein) của vi khuẩn V parahaemolyticus

[126], [139], [209] Bằng kỹ thuật SDS-PAGE, sau khi sốc nhiệt ở nhiệt độ 37 oC và

42 oC trong 1 - 2 giờ, Wong và Chen (2003) xác định các protein chính của V

parahaemolyticus có khối lượng phân tử 33, 55, 61, 66, 71, 78 và 92 kDa [209]

Với phương pháp cải tiến, Mao et al (2007) phát hiện thêm các protein có khối

lượng phân tử nhỏ hơn là 27, 32, 33, 47 và 48 kDa [139] Gần đây, khi nghiên cứu

OMP của 19 chủng vi khuẩn thuộc nhóm Vibrio, Li et al (2010) đã phát hiện loại

protein màng OmpK có khối lượng phân tử 28 và 31 kDa có mặt ở hầu hết các

chủng vi khuẩn nghiên cứu thuộc 3 loài V harveyi, V alginolyticus và V

parahaemolyticus Từ kết quả nghiên cứu, nhóm tác giả này cũng cho rằng đây là

những protein có tính kháng nguyên cao và khuyến nghị nên sử dụng làm vaccine

để ngừa bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra (Vibriosis) ở cá biển [126]

Nhìn chung, các nghiên cứu về độc tố và cơ chế gây độc của Vibrio, nhất là

V parahaemolyticus đã được nghiên cứu tương đối sâu, chủ yếu là nghiên cứu các

chủng phân lập từ người Kết quả đạt được mang lại nhiều ý nghĩa quan trọng trong

y học, giúp chẩn đoán và điều trị bệnh do vi khuẩn này gây ra Tuy nhiên, số lượng công trình nghiên cứu cơ bản về các loại vi khuẩn gây bệnh cho đối tượng thủy sản vẫn còn hạn chế Việc tìm hiểu đặc điểm, cơ chế gây độc và tác hại của chúng trên đối tượng nuôi là rất cần thiết nhằm tìm ra các giải pháp hạn chế thiệt hại do vi khuẩn gây ra cho đối tượng thủy sản

1.2.2 Bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra trên cá biển

 Ký chủ

Nhiều loài cá biển có giá trị kinh tế phân bố ở các vùng biển khác nhau đều

nhiễm bệnh do vi khuẩn Vibrio Bao gồm: các loài cá ở vùng biển lạnh như cá hồi vân (Oncorhynchus spp.), cá tráp (Sparus aurata), cá chẽm Châu Âu (Dicentrarchus

labrax), cá bơn (Scophthalmus maximus); và các loài cá ở vùng biển ấm như cá chẽm

(Lates calcarifer), cá hồng (Lutjanus spp.), cá giò (Rachycentron canadum), cá mú (Epinephelus spp.) Bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra được báo cáo đã gây thiệt hại

kinh tế cho nghề nuôi cá biển ở nhiều nước trên thế giới [4], [26], [81], [146]

 Dấu hiệu chính của bệnh

Bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra đặc trưng bởi sự xuất hiện các đốm đỏ, xuất

huyết (bên ngoài hoặc nội quan bên trong) Vẩy cá bị tróc, rụng, tạo nên các vết loét ngày càng lan rộng và sâu Vây cá có thể bị mòn cụt, xơ xác Giải phẫu mẫu cá bệnh cho thấy hiện tượng xuất huyết nội tạng và xuất huyết trong cơ của cá Cá bị bệnh

có thể chết hàng loạt khi bị cấp tính, hoặc chết rải rác khi ở thể thứ cấp tính [4]

 Tác nhân gây bệnh

Tác nhân gây bệnh Vibriosis ở động vật thủy sản thường gặp do một số loài vi

khuẩn thuộc giống Vibrio, chúng có thể là tác nhân sơ cấp hoặc tác nhân thứ cấp (tác nhân cơ hội) Các loài Vibrio gây bệnh cho cá nuôi vùng nước ấm thường gặp như V parahaemolyticus, V harveyi, V vulnificus, V alginolyticus, V carchariae,

V anguillarum [26], [81], [132], [199] Các loài Vibrio gây bệnh cho cá nuôi

vùng nước lạnh như V salmonicida, V anguillarum, V logei, V wodanis, V

viscosus [26], [199]

 Đặc điểm phân bố và lan truyền bệnh

Bệnh Vibriosis xảy ra ở khắp mọi nơi có nghề nuôi động vật thủy sản nước lợ

và nước mặn Bệnh xảy ra cả trên cá nuôi lẫn cá tự nhiên Vi khuẩn Vibrio có ảnh

hưởng nghiêm trọng đến nghề nuôi thủy sản của hơn 14 nước và gây bệnh trên

khoảng 48 loài cá biển [27] Vi khuẩn Vibrio xâm nhập vào ao, bể theo một số con

đường như nguồn nước, dụng cụ, cá bố mẹ hoặc cá giống, thức ăn, đặc biệt là thức

ăn tươi sống Khả năng bùng phát của bệnh phụ thuộc vào các yếu tố môi trường, yếu tố gây độc của chủng vi khuẩn và tình trạng sức khỏe của chính vật nuôi

 Chẩn đoán và cách phòng, trị bệnh

Chẩn đoán

Bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra được chẩn đoán dựa vào những dấu hiệu bệnh

lý đặc trưng như đã mô tả ở trên Nuôi cấy phân lập Vibrio trên môi trường chọn lọc

TCBS và định danh dựa vào các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa [22] Ngoài ra,

định danh Vibrio bằng các phương pháp sinh học phân tử như phân tích trình tự gen

16S ribosomal DNA (rDNA) [84] hoặc các gen độc tố đặc trưng [35]

Cách phòng, trị bệnh

Một số nghiên cứu đã đề xuất biện pháp trị bệnh Vibriosis cho cá biển bằng cách cho ăn, tắm hoặc tiêm kháng sinh Nghiên cứu của Bùi Quang Tề (2007) đã trị bệnh Vibriosis cho cá biển bằng cách tắm kháng sinh Oxytetracyline, Rifamycine

và Erythromycine với nồng độ 30 - 50 ppm trong 30 - 60 phút; hoặc tắm thuốc tím

10 ppm trong 15 - 20 phút; hoặc cồn iốt 15 - 20 ppm từ 10 - 20 phút Trong trường hợp cá lớn và bỏ ăn, biện pháp tiêm kháng sinh Sulfamethoxazole 250 mg/kg cá, Colistin sulfate, Sulfonamide 150 mg/kg cá đã cho thấy có hiệu quả tốt [8] Biện pháp trộn kháng sinh vào thức ăn như trộn Tetracyline 75 - 100 mg/kg cá, Streptomycine

50 - 75 mg/kg cá, Oxolinic acid 10 mg/kg cá và cho ăn liên tục trong 7 đến 10 ngày

cũng cải thiện được tình trạng nhiễm bệnh do vi khuẩn Vibrio [26]

Nhìn chung, kháng sinh là phương pháp chọn lựa đầu tiên dùng trị bệnh do vi khuẩn Mặc dù kháng sinh đã đem lại hiệu quả điều trị nhất định trong một số trường hợp, nhưng việc lạm dụng kháng sinh đã tạo ra các chủng vi khuẩn kháng

thuốc gây khó khăn cho quá trình điều trị Nghiên cứu của Shyne et al (2008) về khả năng nhạy cảm với kháng sinh của vi khuẩn V parahaemolyticus phân lập từ cá

mú bệnh Kết quả cho thấy hầu hết các chủng đều kháng lại Sulphadiazine và Amoxicillin, 87 % kháng lại Gentamycine, 89 % kháng lại Kanamycine và Oxytetracycline [182] Ngoài ra, tồn dư kháng sinh trong sản phẩm thủy sản còn ảnh hưởng đến an toàn vệ sinh thực phẩm và môi trường [19] Vì vậy, việc sử dụng kháng sinh để trị bệnh cho vật nuôi thủy sản vẫn không nên khuyến khích và cần cân nhắc thận trọng trong từng trường hợp

Chính vì những mặt trái do sử dụng kháng sinh, việc phòng bệnh cho cá nuôi vẫn luôn được chú ý trong suốt quá trình nuôi Phương pháp phòng bệnh tổng hợp thường được các trại nuôi áp dụng như sát trùng bể, ao và dụng cụ trước mỗi đợt sản xuất, xử lý nguồn nước trước khi đưa vào sử dụng Thả cá nuôi với mật độ thích hợp, tránh làm cá bị tổn thương trong quá trình vận chuyển, tắm định kỳ để phòng các loại bệnh ký sinh trùng và chú ý chất lượng thức ăn Tuy nhiên, đây chỉ là những biện pháp phòng bệnh đơn giản với mục đích giảm thiểu nguy cơ nhiễm bệnh, những thiệt hại do bệnh vẫn đang tiếp tục diễn ra và gây ảnh hưởng lớn cho nghề nuôi cá biển

Hiện nay, giải pháp nâng cao sức đề kháng cho vật nuôi bằng cách sử dụng các chất gây kích thích miễn dịch (Immunostimulants) và vaccine phòng bệnh là phương pháp phòng bệnh chủ động mang lại hiệu quả cao, đã và đang được tập trung nghiên cứu ở nhiều nước trên thế giới Song, để chế tạo ra các loại vaccine đặc hiệu hay chọn lựa được các hoạt chất kích thích miễn dịch đem lại hiệu quả bảo

hộ cao cho vật nuôi vẫn là một thử thách không nhỏ ở phía trước Những hiểu biết

về hệ thống miễn dịch cũng như cơ chế tạo đáp ứng miễn dịch ở cá trở nên vô cùng cần thiết; là nền tảng quan trọng cho việc nghiên cứu vaccine, sử dụng vaccine và các chất kích thích miễn dịch có hiệu quả, góp phần thúc đẩy nghề NTTS phát triển

ổn định và bền vững

1.3 Đặc điểm hệ miễn dịch ở cá xương

Miễn dịch học ở cá được Hermann F Stannius bắt đầu nghiên cứu từ những năm 50 của thế kỷ 18 Những hiểu biết về miễn dịch học cá thời gian này rất sơ

khai, chỉ là những mô tả về hình thái giải phẫu các cơ quan và khẳng định sự hiện diện của tế bào thực bào trong máu cá Mãi đến năm 1940, miễn dịch học ở cá mới được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu và những hiểu biết về hệ miễn dịch

cá ngày càng hoàn thiện [204]

1.3.1 Miễn dịch tự nhiên

Miễn dịch tự nhiên (hay còn gọi là miễn dịch không đặc hiệu) là khả năng tự bảo vệ sẵn có của cá thể ngay từ khi mới sinh, không đòi hỏi phải có sự tiếp xúc trước với TNGB và mang tính di truyền giống nhau giữa các cá thể cùng loài Vai trò của hệ miễn dịch tự nhiên được coi như là tuyến phòng thủ đầu tiên bảo vệ cơ thể chống lại các vật lạ xâm nhập và nó có ý nghĩa vô cùng quan trọng cho giai đoạn đầu đời, khi mà hệ miễn dịch thích nghi chưa được hoàn thiện

Nhiều nghiên cứu về các khía cạnh khác nhau của hệ miễn dịch không đặc

hiệu ở cá xương đã được tổng quan bởi các tác giả Chistiakov et al (2007) [41], Ellis (2001) [64], Magnadottir (2006) [138], Rombout et al (2005) [169], Van

Muiswinkel (2008) [204], Whyte (2007) [206] Hầu hết các nghiên cứu đều mô tả

về thành phần cấu thành và chức năng của chúng trong cơ chế tạo đáp ứng miễn dịch tự nhiên ở cá Ba thành phần chính tạo nên hệ miễn dịch tự nhiên ở cá bao gồm hàng rào vật lý, hàng rào dịch thể và hàng rào tế bào không đặc hiệu

Các kháng nguyên (Bao gồm TNGB cho đến các chất kích thích vô cơ) xâm nhập vào cơ thể cá qua vùng bề mặt biểu bì bị tổn thương, qua mang, đường bên và ống tiêu hóa [64] Chúng gặp rào cản đầu tiên là toàn bộ vỏ bọc cơ thể cá bao gồm vảy, da, mang và các lớp biểu bì Ngoài ra, lớp dịch nhờn ở da và niêm mạc ruột của

cá không những có chức năng bẫy bắt các vật ngoại lai, mà còn chứa các yếu tố có khả năng kháng vi khuẩn Ví dụ như lectins có khả năng gắn kết với carbohydrates trên bề mặt tế bào vi khuẩn, ngăn chặn chúng xâm nhập gây bệnh [25]; Lysozyme tấn công vào lớp peptidoglycan của vách tế bào vi khuẩn gây thủng màng và tiêu diệt chúng [64]; Các peptides kháng khuẩn (anti-bacteria peptides) như pleucoridin

bảo vệ cá hồi kháng lại V anguillarum [102] Các yếu tố này thường được tìm thấy

trong trứng, huyết thanh và dịch nhờn của nhiều loài cá và được chứng minh khả năng kháng lại các nhóm vi khuẩn khác nhau [24], [183]

Nếu vi khuẩn vượt qua hàng rào vật lý và hóa học, vào được bên trong cơ thể

cá thì chúng sẽ tiếp tục bị chặn lại bởi hàng loạt các yếu tố miễn dịch thuộc hàng rào dịch thể có chức năng bảo vệ cơ thể theo nhiều cách khác nhau

Nhóm ức chế sinh trưởng của vi sinh vật thông qua việc chia sẻ các chất dinh dưỡng thiết yếu hoặc cản trở quá trình trao đổi chất của chúng bao gồm Transferrin,

Interferon đã được nhiều chú ý nghiên cứu ở cá hồi Đại Tây Dương ( Salmo salar) [117], [138], [157], [187], [188], cá nóc chấm xanh (Tetraodon nigroviridis) [30],

cá mú vằn (Danio rerio) [23] và gần đây đã tìm thấy ở cá mú chấm cam E coioides

[37], [53]

Nhóm ức chế enzyme có chức năng bảo vệ cơ thể kháng lại quá trình tự huỷ của chính cơ thể đồng thời tham gia trung hoà các enzyme do TNGB sản sinh ra,

ví dụ α-2 macroglobulin bảo vệ cá hồi kháng lại vi khuẩn A salmonicida [138]

Nhóm các protein gây kết tủa và kết dính (precipitin và agglutinin) bao gồm các lectins và pentraxins có trong huyết thanh và dịch nhờn của nhiều loài cá [138] Lectins có khả năng gắn kết đặc hiệu với các loại đường khác nhau trên bề mặt tế bào

vi khuẩn, gây ngưng kết, kết tủa nhiều loại vi khuẩn như liên kết đường mannose, rhamnose, fucose, galactose dẫn đến hiện tượng opsonine hóa, thực bào và hoạt hóa

hệ bổ thể [206] Các pentraxins gồm protein phản ứng C (C-reaction protein- CRP)

và protein huyết thanh dạng sợi (serum amyloid protein- SAP), chúng có trong dịch thể và xuất hiện ở các phản ứng pha cấp tính CRP có khả năng kết hợp với phosphoryl cholin có trong vách tế bào VSV có ion canxi trong khi SAP ưa kết hợp với phosphoryl-ethanolamin, gây kết tủa, hoạt hóa thực bào và hệ bổ thể [138] Một

số loài cá chỉ có một trong hai loại protein trên như cá tuyết (Gadus morhua L.) có CRP trong khi cá hồi Đại Tây Dương, cá heo (wolfish- Anarhichas minor ), cá bơn (Hippoglossus hippoglossus L.) chỉ có SAP hoặc những loài khác thì có cả 2 loại pentraxin này như cá bơn sao (Pleuronectes platessa L.), cá hồi vân (Oncorhynchus

mykiss) [138]

Nhóm chất dung giải (lysin) là các enzyme mà bản thân chúng hoặc tương tác giữa chúng ngoài việc gây dung giải tế bào TNGB, còn có vai trò opsonin, hoạt hóa

thực bào Chúng là các lysozyme, chitinase, các thành phần của hệ bổ thể có trong

mô và dịch cơ thể [76], [103]

Bổ thể là tập hợp khoảng hơn 20 loại protein huyết thanh lưu thông trong dịch

cơ thể, là phần cốt yếu của hệ thống miễn dịch tự nhiên và là nhân tố bảo vệ quan trọng nhất Tương tự như động vật có xương sống bậc cao, cơ chế hoạt động chủ yếu

hệ bổ thể ở cá là tạo nên các lỗ thủng màng tế bào nhờ hoạt hóa bằng 3 con đường khác nhau: con đường cổ điển, con đường khác và con đường lectin [206] Kết quả của 3 con đường này là gây hiện tượng dung giải tế bào, opsonin và tiêu diệt mầm bệnh Ngoài ra, hệ bổ thể còn có vai trò hoạt hóa phản ứng viêm, gây tăng tính thấm thành mạch, hóa ứng động bạch cầu và kích thích thực bào [173], [206] Không giống như ở động vật có vú, hệ bổ thể của cá có hoạt tính tốt trong khoảng nhiệt độ rộng, từ

15 oC đến 25 oC và vẫn có thể duy trì hoạt tính ở nhiệt độ thấp (0 - 4 oC) [119]

Yếu tố C3 là thành phần trung tâm của hệ bổ thể trong cả 3 con đường hoạt hóa kể trên Chúng chiếm tỷ lệ lớn nhất trong protein huyết thanh Chức năng của C3 là tăng cường kích thích thực bào thông qua opsonin, hóa ứng động các tế bào miễn dịch, kích thích phản ứng viêm, kích thích tế bào B sinh sản và hoạt hóa phức hợp tấn công màng MAC (Membrane Attacking Complex) [206] MAC ở cá hồi

vân (O mykiss) đã được nghiên cứu và chứng minh cơ chế hoạt động của nó là tạo

ra các lỗ nhỏ trên màng tế bào vi khuẩn tương tự như ở động vật có vú [156] Tùy từng loài cá xương, yếu tố C3 xuất hiện từ 11 đến 57 ngày sau khi nở và là hàng rào miễn dịch quan trọng trong thời gian đầu của ấu trùng khi chức năng của các cơ quan lympho chưa hoàn thiện [206] Các dạng cấu trúc và chức năng của phân tử C3 (isotypes) được mã hóa bằng nhiều gen khác nhau làm cho các phân tử C3 càng trở nên đa dạng [172] Các dạng C3 đã được nghiên cứu ở nhiều loài cá như cá hồi,

cá chép, cá tráp và cá mú vằn [206] và số lượng các dạng C3 phát hiện ở các loài cá rất khác nhau: cá hồi có 4 dạng C3, ở cá tráp có 5 dạng C3 [206], cá chép có 8 dạng

và cá sóc (Oryzias latipes) có 3 dạng [192] Sự đa dạng phân tử C3 của hệ bổ thể

thể hiện sự tiến hóa của hệ thống miễn dịch và giúp cá tăng cường khả năng nhận biết của miễn dịch tự nhiên [191]

Mặc dù không mang đặc tính nhớ và tạo đáp ứng miễn dịch thứ cấp mạnh mẽ khi tái nhiễm TNGB, hàng rào các tế bào của hệ miễn dịch không đặc hiệu đóng vai trò quan trọng trong cơ chế bảo vệ sẵn có của cơ thể vật chủ đối với mầm bệnh Các

tế bào trung tâm tạo nên hàng rào tế bào miễn dịch không đặc hiệu này bao gồm bạch cầu (BC) đơn nhân (Monocyte)/ đại thực bào (Macrophage), BC trung tính (Neutrophil) và tế bào độc không đặc hiệu (NCC- Non-specific cytotoxic cells) [67], [72] Các hoạt tính hóa ứng động bạch cầu (Leukocyte mobilization), thực bào (Phagocytosis Activity- PA), bùng nổ hô hấp (Respiratory Burst Activity- RBA), gây độc tế bào và tạo ra các yếu tố miễn dịch như Interleukin 1 (IL-1) hoặc yếu tố anpha gây hoại tử khối u ( alpha Tumor Necrosis Factor – αTNF) là các chức năng

đã được nghiên cứu trên nhiều loài cá xương và chứng minh vai trò bảo vệ cơ thể của hàng rào tế bào ở cá [17], [36], [51]

Ở cá xương, 2 loại tế bào tham gia chính vào quá trình thực bào là đại thực bào (ĐTB) và BC trung tính Chúng loại bỏ vi khuẩn xâm nhập thông qua các sản phẩm có hoạt tính oxy hóa cao trong quá trình bùng nổ hô hấp khi tiếp xúc kháng nguyên [176]

Đại thực bào là BC không hạt lớn nhất, được biệt hóa từ các BC đơn nhân, phân bố rộng rãi ở các mô, bao gồm cả mang cá và xoang cơ thể, nhưng chủ yếu được tìm thấy ở mạng lưới nội bì của thận, lách Ở một vài loài cá, ĐTB còn được tìm thấy ở tâm nhĩ [4] Nhiều nghiên cứu cho rằng chức năng ĐTB bao gồm khả năng thực bào, hóa ứng động tiêu diệt tế bào vi khuẩn nhờ có các sản phẩm Interleukin 1 và yếu tố αTNF, xử lý và trình diện kháng nguyên Mặc dù các thụ thể trên bề mặt ĐTB cá chưa được biết rõ, nhưng nhiều nghiên cứu cho thấy có sự hiện diện của thụ thể gắn kết kháng nguyên, thụ thể bổ thể và phức hợp hòa hợp mô chủ yếu lớp II (MHC II) [166]

Ở một số loài cá, trong số BC có hạt, ngoài BC hạt trung tính còn có BC ưa axít (Eosinophils) và BC ưa kiềm (Basophils) trong khi ở một số loài cá khác vắng mặt một trong 2 loại BC này Tỷ lệ của các loại BC này trong máu các loài cá rất khác nhau [18] Trong đó, BC trung tính phân bố ở thận, lách, máu và các ổ viêm loét với

các tỷ lệ khác nhau giữa các loài cá Ví dụ ở cá tuyết, tỷ lệ tế bào BC trung tính phân

bố ở máu nhiều hơn ở thận trong khi ở cá hồi Đại Tây Dương thì ngược lại [170] Tương tự như đại thực bào, BC trung tính tham gia chính quá trình thực bào và tiêu diệt vi khuẩn do sở hữu myeloperoxidase có hoạt tính oxy hóa cao và lysozyme trong các hạt lysosomes nội bào [70] Ngoài ra, BC trung tính cũng có sự hiện diện của thụ thể gắn kết kháng nguyên và thụ thể bổ thể [157] Khi nghiên cứu quá trình phát triển

của tế bào BC, Willett et al (1999) đã thông báo nguyên tủy bào BC trung tính

(Neutrophilic myelocyte) bắt đầu xuất hiện ở 34 đến 48 giờ sau khi trứng thụ tinh và các tế bào trưởng thành xuất hiện ở các mô khác nhau sau 72 giờ [207]

BC ưa axít và BC ưa kiềm ở cá không tham gia thực bào Mặc dù chức năng của chúng chưa được biết rõ, nhiều nghiên cứu đã chứng tỏ chúng có vai trò tham gia phản ứng viêm và bảo vệ cơ thể chống lại ký sinh trùng [18]

Một loại tế bào khác cũng tham gia đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu, đó là

tế bào độc không đặc hiệu (Non-specific cytotoxic cell - NCC) Mặc dù khác nhau

về hình thái cấu tạo, nhưng chúng có chức năng tương tự như tế bào diệt tự nhiên (Natural killer cells- NK) ở động vật có vú, loại tế bào được biệt hóa từ tế bào lympho lớn có hạt Gần đây, một phát hiện mới về điểm khác biệt của NCC ở cá so với NK ở động vật có vú ở chỗ NCC của cá là những tế bào lympho kích thước nhỏ không hạt phân bố trong các cơ quan lympho như tiền thận và lách nhưng ít gặp ở trong máu [181], [203] Chúng có khả năng diệt nhiều loại tế bào đích khác nhau, bao gồm các dị bào kể cả các tế bào nuôi cấy nhân tạo, các tế bào nhiễm virus, tế bào khối u và động vật đơn bào ký sinh mà không đòi hỏi sự tham gia của kháng thể [157] NCC được mô tả đầu tiên ở cá da trơn, sau đó hoạt tính của nó cũng được

chứng minh ở nhiều loài cá khác như cá rô phi (Oreochromis niloticus), cá hồi vân,

cá chép và cá tráp [52], [181], [203] Hoạt tính gây độc tế bào của chúng phụ thuộc nhiều yếu tố như nhiệt độ [119], Vitamins [52], và các chất kích thích miễn dịch như Chitin [66] và Levamisole [52]

Bên cạnh các nhân tố bảo vệ nêu trên, cơ thể vật chủ còn có khả năng phối hợp cùng lúc rất nhiều cơ chế miễn dịch không đặc hiệu bao gồm cả các yếu tố tế bào lẫn

yếu tố dịch thể trong phản ứng viêm Đặc điểm của phản ứng viêm là tăng tính thấm thành mạch, hóa ứng động bạch cầu từ máu tới ổ viêm [4] Khi cơ thể bị tổn thương, khởi đầu là sự gia tăng số lượng BC trung tính, tiếp đến là sự xuất hiện của BC đơn nhân và ĐTB tại ổ viêm BC trung tính tập trung khoảng một giờ sau khi tiêm tác nhân gây viêm và đạt số lượng cực đại sau 48 h (Trích [4]) Tại đây, hàng loạt các tế bào thuộc hệ miễn dịch không đặc hiệu bị kích hoạt và thực hiện chức năng thực bào, bùng nổ hô hấp, gây độc để tạo ra một lượng độc tố trung gian như O- hay NO-

đủ lớn để tiêu diệt mầm bệnh [112], [140], [168]

1.3.2 Miễn dịch đặc hiệu

Miễn dịch đặc hiệu hay còn gọi là miễn dịch mắc phải (Miễn dịch thích nghi)

là đáp ứng miễn dịch (ĐƯMD) chỉ có thể thấy ở động vật có xương sống và có vai trò quan trọng trong việc bảo vệ cơ thể chống lại sự tái nhiễm bệnh Đặc điểm quan trọng của cơ chế ĐƯMD này là tính đặc hiệu, tính đa dạng và tính nhớ, nhờ đó mà khi gặp lại cùng loại kháng nguyên, cơ thể sẽ hình thành nên ĐƯMD thứ cấp đặc trưng với thời gian phản ứng nhanh và cường độ mãnh liệt hơn

Cho đến nay, các nghiên cứu tương đối đầy đủ các khía cạnh liên quan ĐƯMD đặc hiệu ở cá chỉ mới tập trung trên các đối tượng quen thuộc như cá hồi, cá da trơn và

cá chép [169], [193], [203] Những yếu tố cơ bản của hệ miễn dịch mắc phải là các thụ quan tế bào lympho T, lympho B, các phân tử kháng thể (Immuno globulin- Ig) [203]

1.3.2.1 Cơ quan lympho ở cá và các lympho bào

Lympho bào có mặt trong máu, các cơ quan lympho và các mô Tế bào lympho T (Tế bào T) biệt hoá ở tuyến ức (Thymus), các tế bào lympho B (Tế bào B) biệt hoá ở tuỷ xương Trong đó, tế bào T đảm trách ĐƯMD qua trung gian tế bào

và hỗ trợ tế bào B sản sinh kháng thể Ngoài ra, các tế bào lympho này còn có chức năng nhớ và dung thứ miễn dịch Chúng mang các thụ thể với các chức năng riêng biệt trên bề mặt như thụ quan nhận diện kháng nguyên trên bề mặt tế bào B (Surface immunoglobuline- sIg), hoặc thụ quan CD4 trên bề mặt tế bào T có nhiệm vụ hoạt hóa tế bào B sinh kháng thể, hay tế bào T mang thụ quan CD8 làm nhiệm vụ của các tế bào độc [4], [157]

Thời điểm xuất hiện đầu tiên của các loại tế bào lympho tại các cơ quan lympho cũng khác nhau tùy loài cá, ngày tuổi và còn phụ thuộc khá nhiều vào nhiệt

độ môi trường Ví dụ ở cá chép (Cyprinus carpio) xuất hiện tế bào lympho ở tuyến ức,

tiền thận và lách lần lượt sau 3, 6 và 8 ngày sau khi nở ở nhiệt độ 22 oC Trong khi đó,

ở cá hồi vân (O mykiss) xuất hiện các tế bào này ở các cơ quan lympho trên tuần tự

sau 3, 5 và 6 ngày sau khi nở ở 14 oC [196]

Tuyến ức, tiền thận và lách là ba cơ quan lympho lớn nhất ở cá xương [215]

Sự hình thành các cơ quan lympho và xuất hiện các tế bào lympho trong các cơ quan này có ý nghĩa rất quan trọng trong nghiên cứu ĐƯMD ở cá

Tuyến ức của cá là một cặp đối xứng nằm ở mặt lưng xoang mang và ở vị trí rất nông, chỉ được che chở bởi lớp ngoại bì của xoang mang (Hình 1.5) Lớp nội bì của mạch máu trong tuyến ức và biểu bì xoang mang bao phủ tuyến ức liên kết nhau rất chặt chẽ và ngăn chặn tuyệt đối việc tiếp xúc giữa các nguyên bào T với kháng nguyên Tuyến ức là nơi biệt hóa tế bào T Trong tuyến ức có thể thấy các tế bào T

ở nhiều giai đoạn phát triển khác nhau, ngoài ra còn có các đại thực bào, dưỡng bào, hồng cầu [64] Ở cá, tuyến ức phát triển hoàn thiện trong những tuần đầu sau khi

nở, kích thước tương đối của tuyến ức đạt cao nhất khi cá còn non, khoảng 2-3 tháng tuổi Tuy nhiên, Nakanishi (1991) cho rằng sự hoàn thiện hệ miễn dịch phụ thuộc nhiều vào kích thước cơ thể hơn là vào độ tuổi, đúng hơn là phụ thuộc vào số lượng tế bào lympho có mặt tại các cơ quan lympho (Trích [196]) Sự phát triển của tuyến ức đã được nghiên cứu ở nhiều loài cá và các tác giả đều cho rằng thời điểm hoàn thiện tuyến ức khác nhau tùy loài cá và phụ thuộc khá nhiều vào nhiệt độ môi trường [32], [130]

Cơ quan lympho quan trọng thứ hai ở cá là thận Thận cá cấu tạo gồm 2 phần: phần trước hay tiền thận (Head kidney) có chức năng tạo máu chủ yếu; phần giữa

và sau hay còn gọi là phần thân (Trunk kidney) có chức năng bài tiết Tiền thận của

cá, ngoài chức năng tạo máu còn là nơi chứa các tế bào lympho B sinh kháng thể

Ngoài ra, tiền thận còn chứa các tế bào độc tự nhiên, dưỡng bào và các đại thực bào tập trung trong các trung tâm Melanomacrophage [157] Ở cá hồi vân, các tế bào lympho và kháng thể IgM ở thận xuất hiện khoảng 12-14 ngày sau khi nở [203] Lách cũng là cơ quan lympho quan trọng của cá Mô lympho ở lách cá là một lớp rìa mỏng bao quanh hệ thống các thể ellipsoid và các trung tâm Melanomacrophage chứa các đại thực bào, tế bào lympho, các kháng thể và dưỡng bào [157] Ngoài ra, thể ellipsoid lách cá có khả năng lưu giữ kháng nguyên trong thời gian dài nên có vai trò quan trọng tạo nên ký ức miễn dịch ở cá [203]

Những hiểu biết về sự phát triển của các cơ quan lympho có ý nghĩa rất quan trọng trong việc xác định thời điểm sử dụng vaccine cho cá nhằm đem lại hiệu quả

ĐƯMD cao Hrubec et al (2004) nghiên cứu mối tương quan giữa độ tuổi với khả năng ĐƯMD của con lai cá vược (Giữa 2 loài Morone chrysops và Morone

saxatilis) Thí nghiệm triển khai trên cá ở 5 nhóm tuổi khác nhau là 4, 6, 9, 15 và 19

tháng tuổi, cá được gây miễn dịch bằng phương pháp ngâm vaccine thương mại

chống vi khuẩn Vibrio Kết quả cho thấy nhóm cá ít tháng tuổi hơn có mức độ hình

thành kháng thể thấp hơn sau khi gây miễn dịch [93]

Ở cá mú, vài nghiên cứu về sự phát triển của các cơ quan lympho đã đem lại những thông tin cơ bản và có ý nghĩa ứng dụng Với phương pháp mô hóa miễn

dịch, Lin et al (2005) cho thấy chức năng các cơ quan lympho cá mú E

malabaricus như tuyến ức, thận, lách đã xuất hiện ở ấu trùng 10 ngày tuổi [129]

Tuy nhiên, nghiên cứu của Kato et al (2004) ở cá mú E bruneus thông báo rằng các

cơ quan lympho thận, lách và tuyến ức đã lần lượt hoàn thiện ở các ngày thứ 1, 6 và

12 sau khi nở Các tế bào lympho xuất hiện ở các cơ quan này lần lượt sau 30, 33

và 21 ngày sau khi nở [109] Dựa vào kết quả này, Lin et al (2007) đã thử nghiệm vaccine chống lại virus VNN ở cá mú chấm cam E coioides ngay giai đoạn ấu

trùng 18 ngày tuổi, kết quả cho thấy sau 2 ngày liên tục cho cá ăn Artemia được nhồi vaccine đã tạo nên kháng thể đặc hiệu với hệ số bảo hộ đến 69,5 % khi cảm nhiễm nhân tạo [128]

Hình 1.5: Vị trí và cấu tạo tuyến ức cá mú Epinephelus malabaricus [129]

( A: Mũi tên chỉ vị trí của tuyến ức; B: Mặt cắt thẳng đứng của tuyến ức hiển thị cấu tạo gồm phần lõi ( Medulla - M) và phần vỏ ( Cortex - C) với các mũi tên chỉ các trung tâm Melanomacrophage bắt màu đỏ đậm khi nhuộm Haematocylin và Eosin)

1.3.2.2 Kháng thể của cá

Kháng thể là một nhóm protein trong huyết thanh giúp sinh vật chống đỡ các yếu tố kháng nguyên xâm hại cơ thể, được gọi là globulin miễn dịch (Immunoglobulin – Ig) Kháng thể tham gia bảo vệ cơ thể thông qua việc trung hoà hoặc thay đổi hoạt tính độc tố do vi khuẩn, virus tiết ra; hoặc tạo mạng lưới ngưng kết, ngưng tụ đối với tế bào vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng; hoạt hoá hệ bổ thể

Cấu trúc của Ig là một phân tử protein có 4 chuỗi polypeptit giống nhau từng đôi một bao gồm 2 chuỗi nặng và 2 chuỗi nhẹ, nối với nhau bằng cầu nối disulfide

Ở cá xương có 4 loại Ig đã được báo cáo, bao gồm IgM, IgD, IgZ và IgT [40] Trong đó, IgM là kháng thể gặp ở hầu hết các loài cá xương

Đã có nhiều công trình nghiên cứu chứng minh sự tồn tại của IgM trong huyết thanh cá xương chủ yếu với cấu trúc tetramer, song cũng đã phát hiện cả IgM dạng dimer và monomer trong huyết thanh ở một số loài cá [203] Ở cá hồi, ái lực của IgM dạng monomer và tetramer tương tự nhau nhưng IgM dạng tetramer có khả năng hoạt hóa bổ thể hiệu quả hơn [58]

Khối lượng phân tử của kháng thể IgM rất khác nhau giữa các loài cá: IgM ở

cá chép có khối lượng phân tử 608 kDa [165]; ở cá vược là 833 kDa; ở cá tuyết là

680 kDa [87]; ở cá chỉ vàng là 766 kDa gồm 2 chuỗi nặng (71,8 và 67,6 kDa) và 2 chuỗi nhẹ (30,2 và 29,0 kDa) [143]; ở cá hồi có một chuỗi nặng 72 kDa và 2 chuỗi nhẹ 27 và 25 kDa [87]; IgM ở cá nheo có 3 chuỗi nhẹ 22, 24 và 26 kDa [135]; ở cá trắm cỏ có chuỗi nặng 77,3 kDa và chuỗi nhẹ 26,6 kDa [12]

Ở cá mú chấm cam, nghiên cứu của Cheng (2006) cho thấy phân tử IgM có khối lượng chuỗi nặng và chuỗi nhẹ lần lượt là 78 và 27 kDa Ngoài ra, nghiên cứu này còn tìm thấy thêm một polypeptide có khối lượng 50 kDa và nghi ngờ là chuỗi nặng thứ hai của phân tử IgM ở loài cá này [40]

Mặc dù phân tử kháng thể IgM có cấu trúc và số lượng các tiểu đơn vị khác nhau giữa các loài cá, tuy nhiên, đến nay vẫn chưa có bằng chứng cho thấy sự khác nhau này có liên quan đến sự phát triển và phát sinh loài trong bậc thang tiến hóa [180]

Hàm lượng kháng thể trong huyết thanh cá rất khác nhau tùy thuộc đặc điểm loài, giai đoạn phát triển và các yếu tố ngoại cảnh tác động (đặc biệt là nhiệt độ và chế độ dinh dưỡng) [203] Hàm lượng kháng thể IgM trong huyết thanh cá chép là 1,7 mg/mL chiếm 6,34 % protein huyết thanh [165]; ở cá hồi vân là 2,1 mg/mL [59]; ở cá hồi Đại Tây Dương là 0,8-1,3 mg/mL [87]

Ở cá, ngoài sự có mặt ở các cơ quan lympho, kháng thể còn được tìm thấy ở mật [100], dịch nhờn ở da [86], ở mang [136] và ở ruột [104]

1.3.3 Các nhân tố ảnh hưởng đáp ứng miễn dịch ở cá

Các nhân tố ảnh hưởng đến ĐƯMD ở cá có thể được chia thành 2 nhóm chính: Các nhân tố nội tại và các nhân tố ngoại cảnh

Các nhân tố nội tại chủ yếu liên quan đến quá trình phát triển của cá thể Hệ miễn dịch của cá phát triển hoàn thiện chỉ vài ngày sau khi nở, phụ thuộc sự hình thành và xuất hiện các tế bào lympho tại các cơ quan lympho Vì vậy, trong nuôi trồng thủy sản, việc xác định thời điểm hệ miễn dịch hoàn thiện nhằm xác định thời điểm sớm nhất có thể sử dụng vaccine cho cá có ý nghĩa hết sức quan trọng, có ảnh

hưởng trực tiếp đến hiệu quả bảo hộ của vaccine trên cá Ví dụ như hệ số bảo vệ tương đối (Relative Percent Protection- RPP) đạt được khi gây miễn dịch cho cá hồi

bằng vaccine bất hoạt Vibrio đạt rất thấp khi cá 2 tuần tuổi và tăng lên 100 % khi cá

ở 10 tuần tuổi [63]

Nhân tố ngoại cảnh ảnh hưởng lớn nhất đến khả năng tạo ĐƯMD ở cá là nhiệt

độ Trong phạm vi thích ứng của loài, nhiệt độ càng cao thì ĐƯMD càng nhanh và cường độ càng cao Vào mùa đông, nhiệt độ giảm làm cho quá trình sinh tổng hợp kháng thể bị ngưng trệ và đặc biệt khi nhiệt độ giảm đột ngột, quá trình sinh kháng thể có thể bị rối loạn [31] Chính vì vậy, sức đề kháng của cá thường giảm đi vì chúng thường bị thiếu máu và giảm đáng kể hàm lượng protein trong huyết thanh sau thời kỳ ngủ và nhịn đói trong mùa đông Vào mùa xuân, khi nhiệt độ nước ấm lên, quá trình trao đổi chất diễn ra nhanh hơn, điều kiện môi trường không thuận lợi làm cá bị stress, nguyên nhân làm tăng hàm lượng corticosteroid trong máu dẫn đến tăng sự mẫn cảm của cá với mầm bệnh [95] Tuy nhiên, ảnh hưởng do nhiệt độ thấp đối với miễn dịch tự nhiên thường không rõ ràng và ít đặc trưng hơn so với miễn dịch thích nghi [31] Khả năng tạo ĐƯMD thích nghi ở những loài cá phân bố ở vùng biển ấm thường xảy ra nhanh hơn so với những loài phân bố ở vùng biển lạnh Đối với

cá hồi Đại Tây Dương, ở nhiệt độ thích hợp từ 10-12 oC, kháng thể chỉ được phát hiện sau khi tiêm vaccine từ 4-6 tuần Trong khi đó, đối với cá chẽm, ở nhiệt độ 22 oC, kháng thể có thể được phát hiện chỉ 1 tuần sau khi gây miễn dịch [186]

Ngoài ra, khả năng ĐƯMD ở cá còn liên quan đến tình trạng sức khỏe, giới tính, tác động của hoạt động nuôi trồng, các chất gây ô nhiễm, các loại hóa chất, thuốc kháng sinh, chế độ dinh dưỡng [82]

Như vậy, những hiểu biết về sự hình thành các cơ quan lympho, cơ chế ĐƯMD cũng như các nhân tố ảnh hưởng đến ĐƯMD ở các đối tượng cá nuôi có ý nghĩa rất quan trọng trong NTTS Ngày nay, việc sử dụng vaccine và các hoạt chất sinh học tác động đến hệ miễn dịch của cá nuôi là một trong những biện pháp phòng bệnh hữu hiệu, là chìa khóa thành công trong NTTS, đặc biệt là nghề nuôi cá biển ở quy mô công nghiệp