Đồ án tốt nghiệp: Nhân nhanh plb mẫn thiên hồng (doritaenopsis sp.) trong một số hệ thống khác nhau

Bảng 3.1: Ảnh hưởng của các môi trường nuôi cấy khác nhau đến sự tăng sinh PLB Mãn Thiên Hồng Doritaenopsis sp.. hỏi phải có một kỹ thuật mới ra đời, đó là nhân giống vô tính in – vitro.

NUÔI CẤY KHÁC NHAU

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MÃ SỐ NGÀNH: 111

GVHD:CN BÙI VĂN THẾ VINH SVTH: TRẦN XUÂN NGỌC HUY

TP HỒ CHÍ MINH, THÁNG 07 NĂM 2010

KHOA: MT & CNSH

1 Đầu đề đồ án tốt nghiệp

NHÂN NHANH PLB MÃN THIÊN HỒNG (Doritaenopsis sp.) TRONG MỘT SỐ HỆ THỐNG NUÔI CẤY KHÁC NHAU.

2 Nhiệm vụ (yêu cầu về nội dung và số liệu ban đầu):

 Xác định môi trường tối ưu nhất để nhân nhanh PLB Mãn Thiên Hồng

(Doritaenopsis sp.).

 So sánh khả năng nhân nhanh PLB Mãn Thiên Hồng (Doritaenopsis sp.) trong một

số hệ thống nuôi cấy khác nhau: rắn, lỏng tĩnh, lỏng lắc.

 Bước đầu thực hiện nhân nhanh PLB Mãn Thiên Hồng (Doritaenopsis sp.) bằng hệ

thống Bioreactor tự tạo.

3 Ngày giao Đồ án tốt nghiệp: ngày 01/04/2010.

4 Ngày hoàn thành Đồ án: 28/06/2010.

5 Họ tên người hướng dẫn Phần hướng dẫn

Nội dung và yêu cầu LVTN đã được thông qua Bộ môn

Ngày …… tháng …… năm 2010

(Ký và ghi rõ họ tên) (Ký và ghi rõ họ tên)

PHẦN DÀNH CHO KHOA, BỘ MÔN

Người duyệt (chấm sơ bộ):………

Đơn vị:………

Ngày bảo vệ:………

Điểm tổng kết:………

Nơi lưu trữ Đồ án tốt nghiệp:………

Em xin chân thành cảm ơn:

Ban Giám hiệu Trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Khoa Môi Trường & Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tập tại Trường

Thầy Bùi Văn Thế Vinh đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài, cũng như khoảng thời gian bốn năm em được học tại Trường

Thầy Cô quản lý phòng thí nghiệm: Thầy Huỳnh Văn Thành, Thầy Nguyễn Trung Dũng, Cô Vũ Ngọc Yến Ly

đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em hoàn thành tốt Đồ

Sinh viên thực hiện: Trần Xuân Ngọc Huy

Lời cảm ơn

Mục lục

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình vẽ, các đ62 thỊ, các bản vẽ

MỞ ĐẦU 1

1 Mục đích nghiên cứu: 1

2 Ý nghĩa thực tiễn: 2

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Sơ lược về Phong Lan Mãn Thiên Hồng: 3

1.1.1 Phân loại cây Phong Lan Mãn Thiên Hồng: 3

1.1.2 Sự sinh trưởng và phát triển của Mãn Thiên Hồng ngoài tự nhiên: 3

1.1.3 Cây Mãn Thiên Hồng trên thị trường: 5

1.1.4 Các kỹ thuật nhân giống Mãn Thiên Hồng: 10

1.2 Tiền củ: 11

1.3 Kỹ thuật nhân giống in vitro (nuôi cấy mô tế bào thực vật): 13

1.3.1 Ưu và nhược điểm của kỹ thuật nhân giống in vitro: 13

1.3.2 Các giai đoạn trong quy trình nhân giống vô tính in vitro: 14

1.3.3 Các vấn đề liên quan đến nhân giống in – vitro: 17

1.3.3.1 Ảnh hưởng của mẫu cấy và môi trường đến nhân giống in – vitro: 17

1.3.3.2 Tính bất định về mặt di truyền: 19

1.3.3.3 Việc sản xuất các chất gây độc từ mẫu cấy: 20

1.3.3.4 Hiện tượng thủy tinh thể: 20

1.4 Hệ thống nuôi cấy Bioreactor: 21

1.4.2 Cấu trúc và phân loại bioreactor: 22

1.4.2.1 Cấu trúc bioreactor: 22

1.4.2.2 Phân loại bioreactor: 23

1.4.3 Quy trình nhân sinh khối thực vật bằng kỹ thuật nuôi cấy lắc và bioreactor: 24

1.4.4 Sự phát triển thực vật trong bioreator: 25

1.4.4.1 Quá trình phát sinh phôi soma: 25

1.4.4.2 Quá trình phát sinh cơ quan: 25

1.4.5 Một số vấn đề thường gặp trong nuôi cấy lỏng: 26

1.4.6 Thuận lợi và khó khăn trong nuôi cấy bằng bioreactor: 27

1.4.6.1 Thuận lợi 27

1.4.6.2 Khó khăn: 28

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu: 29

2.2 Vật liệu: 29

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu: 29

2.2.2 Trang thiết bị và dụng cụ: 29

2.2.3 Môi trường nuôi cấy: 29

2.2.4 Điều kiện nuôi cấy trong phòng nuôi cấy in – vitro: 30

2.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm: 30

2.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát môi trường nhân nhanh PLB Lan Hồ Điệp Mãn Thiên Hồng (Doritaenopsis sp.) 30

2.3.2 Thí nghiệm 2: So sánh khả năng nhân PLB Mãn Thiên Hồng trong 3 hệ thống khác nhau: rắn, lỏng tĩnh, lỏng lắc 31

Hồng bằng hệ thống Bioreactor tự tạo 31

2.4 Phân tích thống kê: 32

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

3.1 Khảo sát môi trường nhân nhanh PLB Lan Hồ Điệp Mãn Thiên Hồng (Doritaenopsis sp.): 33

3.2 Thí nghiệm 2: So sánh khả năng nhân PLB Mãn Thiên Hồng trong 3 hệ thống khác nhau: rắn, lỏng tĩnh, lỏng lắc 38

3.3 Thí nghiệm 3: Bước đầu nghiên cứu khả năng nhân nhanh PLB Mãn Thiên Hồng bằng hệ thống bioreactor tự tạo: 41

Chương 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 43

4.1 Kết luận: 43

4.2 Đề Nghị: 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

PHỤ LỤC 46

ADN: acid deoxynucleotide

ABA: abscisic acid

NAA: α – naphtaleneacetic acid

PLB: protocorm – like - body

Phal: Phalaenopsis

2,4-D : 2,4 – dichlorophenoxyacetic acid

Bảng 1.1 Danh sách các loài Mãn Thiên Hồng trên thị trường.

Bảng 2.1: Môi trường MS ½ bổ sung BA và NAA ảnh hưởng lên sự nhân

nhanh PLB Mãn Thiên Hồng

Bảng 3.1: Ảnh hưởng của các môi trường nuôi cấy khác nhau đến sự tăng

sinh PLB Mãn Thiên Hồng Doritaenopsis sp.

Bảng 3.2: Ảnh hưởng của BA lên sự tăng sinh PLB Mãn Thiên Hồng

Bảng 3.3: Ảnh hưởng của NAA lên sự tăng sinh PLB Mãn Thiên Hồng

Bảng 3.4: Ảnh hưởng của các hệ thống nuôi cấy khác nhau lên sự hình thành PLBMãn Thiên Hồng

Hình 1.1: Mãn Thiên Hồng

Hình 1.2: Một số loài Mãn Thiên Hồng thương mại

Hình 1.3: Một số loài Mãn Thiên Hồng thương mại

Hình 1.4: Hình thái PLB được quan sát dưới kính hiển vi soi nổi

Hình 1.5: PLB được nhân nhanh trong môi trường rắn

Hinh 1.6: Hai dạng bioreactor phổ biến

Hình 3.1: Hệ thống bioreactor tự tạo

hỏi phải có một kỹ thuật mới ra đời, đó là nhân giống vô tính in – vitro.

Phong Lan Mãn Thiên Hồng là một trong những cây cảnh được mọi người

ưa chuộng nhiều vì hoa có màu sắc đẹp, phát hoa có nhiều hoa, lâu tàn, dễ dàngchăm sóc và có thể đặt ở những nơi ít ánh sáng Chính vì thế, rất tiện lợi khitrồng trong nhà, nên rất thích hợp cho việc trồng thưởng thức của người dân ởThành Phố

Cây Phong Lan Mãn Thiên Hồng (Doritaenopsis sp.) có giá trị kinh tế cao

ở trong nước cũng như nước ngoài Trong tự nhiên cây Phong Lan Mãn ThiênHồng tăng trưởng chậm Thông thường, việc tạo cây con trong tự nhiên đượcthực hiện bằng hạt và bằng cách tách chiết, tuy nhiên với phương pháp này thờigian nhân giống rất dài và hệ số nhân giống rất thấp, hơn nữa cây con tạo thành

có sức sống không cao

Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học,ngành vi nhân giống cây trồng, đặc biệt trên đối tượng cây hoa lan từng bướcphát triển, nhiều đơn vị nhà nước cũng như tư nhân đã mạnh dạn đầu tư để sảnxuất cây giống phục vụ cho nông dân Tuy nhiên việc phát triển sản xuất hoa lantrong nước còn gặp nhiều khó khăn đặc biệt là cây giống Các cơ sở sản xuất câygiống trong nước không đủ đáp ứng nhu cầu sản xuất, các nhà vườn phải nhậpcây giống từ nước ngoài bằng nhiều hạn nghạch khác nhau Điều này rất khókhăn cho việc kiểm soát dịch bệnh và gây thụ động trong sản xuất hoa thươngphẩm Vì vậy, việc tập trung phát triển sản xuất cây giống trong sản xuất là cấpthiết ở nước ta hiện nay

Đề tài “Nhân nhanh PLB Mãn Thiên Hồng (Doritaenopsis sp.) trong một

số hệ thống nuôi cấy khác nhau” nhằm mục đích tìm ra môi trường thích hợp

nhất để nhân PLB Mãn Thiên Hồng Doritaenopsis sp nhằm đạt hiệu suất nhân

giống cao nhất, đồng thời xác định với hệ thống nuôi cấy nào sẽ cho hiệu suấtnhân nhanh cao nhất Đồng thời bước đầu thử nghiệm trên hệ thống Bioreactor

tự tạo

2 Ý nghĩa thực tiễn:

Hiện nay để nhân giống các loại Lan, giai đoạn nhân PLB – một giai đoạnchuyển tiếp từ hạt sang phôi – được ứng dụng rộng rãi và sử dụng phổ biến Nókhông những ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất và chất lượng cây giống mà cònảnh hưởng đến chất lượng hoa thương phẩm Việc nhân PLB chất lượng cao làtiền đề thúc đẩy phát triển cây Lan giống trong nước, góp phần khắc phục hiệntượng thiếu hụt cây giống trong sản xuất hiện nay, từng bước nâng cao trình độ

kỹ thuật nhân giống và thu nhập cho người sản xuất, hạn chế sự lây lan nguồnbệnh từ nước ngoài qua con đường nhập cây giống

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU1.1 Sơ lược về Phong Lan Mãn Thiên Hồng:

1.1.1 Phân loại cây Phong Lan Mãn Thiên Hồng:

 Cây Phong Lan Mãn Thiên Hồng

(Doritaenopsis sp.) là loài cây đơn thân,

sống biểu sinh, thuộc:

Ngành: MagnoliophytaLớp : Liliopsida

Bộ : Orchidales

Họ : Orchidaceae

Hình 1.1: Mãn Thiên Hồng

 Mãn Thiên Hồng là một loại lan lai Chúng được lai từ Lan Hồ Điệp

(Phalaenopsis sp.) và Kim Hồ Điệp (Doritis sp.) Do đó Mãn Thiên

Hồng được mang cả hai ưu điểm của cây cha và mẹ như hoa nhiều, to,đẹp và cây dễ trồng, rất khỏe chịu đựng được nhiều mức độ khí hậukhác nhau

1.1.2 Sự sinh trưởng và phát triển của Mãn Thiên Hồng ngoài tự nhiên:

 Cơ quan dinh dưỡng:

Cơ quan dinh dưỡng bao gồm một trục đơn thân, tạo ra bởi một đỉnhsinh trưởng hoạt động liên tục, có hai hàng lá, xếp đối diện, cách nhaubởi những đốt thân rất ngắn, không có giả hành

Lá hơi mọng nước hình dạng đơn giản (elipe thuôn dài, ngọn giáo), có

bẹ ôm thân, lá dưới cùng héo rụng thì lá mới mọc lên từ ngọn Tổngquan một cây có từ 4 – 5 lá hoạt động

Mỗi trục lá có hai chồi xếp chồng, chồi bên trên cho một trục phát hoasau khi cảm ứng ra hoa, chồi bên dưới cho ra một cây con trong trườnghợp có sự cố về hoạt động của đỉnh sinh trưởng ngọn

Rễ bất định khí sinh được mọc từ gốc của thân xuyên qua bẹ lá Rễ rấtnhiều và phân nhánh, rễ mập, dầy nạc, sự phân nhánh này tùy thuộc vào

sự sinh trưởng của cây Rễ bám chặt trên giá thể

Cây hút hơi nước trong không khí và những khoáng chất từ những cây

mà nó sống bám trên đó, màu xanh của rễ cho thấy chắc chắn chúng cóhoạt động quang hợp

 Cơ quan sinh sản:

Sự tạo thành trục phát hoa sớm được phân biệt với sự phát triển của rễ

Sự xuất hiện của đầu trục phát hoa tạo thành một khe thẳng xuyên quabao vỏ lá, trục phát hoa bên, đơn giản hay phân nhánh, mang hoa ở haibên, hoa đính vào trục nhờ cuống hoa Trong khi ấy, sự xuất hiện của rễđược ghi nhận bởi một sự mở vòng tròn

Khi một hay hai trục phát hoa sinh ra từ những chồi bên Chúng sẽcạnh tranh các chất dinh dưỡng của cây Trong trường hợp hai phát hoaxuất hiện cùng một lúc, thì sự phát triển của nó tùy thuộc vào thứ tựngọn, nhưng không phải lúc nào cũng có trường hợp trên

Trong giai đoạn trổ hoa, sự phát triển của cơ quan dinh dưỡng có phần

bị chậm lại, nhưng nếu cây được tưới nước và dinh dưỡng đầy đủ thì câyvẫn tiếp tục tăng trưởng tốt

Những đoạn lóng mang các mầm hoa có chiều dài thay đổi rất khácnhau, tùy thuộc vào giống và chế độ trồng trọt (Troll, 1974) (trích từ VõThị Bạch Mai, 1996) Các mầm bên trên của nhánh phát hoa được baobởi những lá thu nhỏ lại, mỗi mầm sẽ phát triển thành chồi dinh dưỡnghoặc chồi sinh sản sau khi xử lý chất điều hòa sinh trưởng thực vật(CĐHSTTV)

Cây Mãn Thiên Hồng không có giai đoạn nghỉ, khi nhiệt độ thấp sựtăng trưởng của cây hoàn toàn chậm lại để cảm ứng ra hoa Dưới cùngmột chế độ cảm ứng như cùng một vĩ tuyến, vào mùa đông các cây trồngtrong nhà kính thì thời kì trổ hoa tùy theo loài

Đối với những giống lai, giai đoạn trổ hoa khó có thể xác định mộtcách chính xác

Sau khi được thụ phấn, bầu noãn lớn dần, khoảng tám đến chín thángsau thì trái chín Trái chứa rất nhiều hạt, hạt nhỏ li ti, không có phôi nhũ,phôi không phân hóa

1.1.3 Cây Mãn Thiên Hồng trên thị trường:

Bảng 1.1 Danh sách các loài Mãn Thiên Hồng trên thị trường.

Boy x Doritaenopsis

(Mt Beauty x HamaLip)

Cành hoa dài, cánhhoa màu trắng Môimàu đỏ, đôi khi cóánh hồng

x Nobby's Purple)

Hoa màu hồng vớinhững đường kẻ sọcmàu hồng, đôi khi cóchấm

(Tom Boy x MountBeauty)]

Hoa màu trắng vớimàu với môi màu đỏtương phản

Taisuco Jewel)

Hoa màu hồng và gầngiống với QueenBeer

(Mount Beauty xHama Lip) x I-HsinActor]

Hoa màu trắng trongsuốt với các môi màuhồng đến màu đỏ

"KH6079" x (SogoDavis x MinhoValentine) 86-3#1"

Được nhân giốngnhiều Hoa có màuhồng đậm

Strawberry x Luchia Smile)

Cành hoa dài phânnhánh với những bônghoa màu hồng, đỏtươi

Doritaenopsis Chain

Xen Pearl

Phal Ching Hua Spring x Dtps Nobby's Pink Lady

Hoa màu hồng vớinhững chấm nhỏ màutrắng trên nền cánhhoa sẫm màu

Doritaenopsis Fuchsia Dtps pulcherima x P Hoa màu sáng bóng

Princess Coral Gleam với những cánh môi

sẫm màu

Doritaenopsis Han

Ben's Girl 'HB728' Dtps (Tom Boy x Han Ben's Lip) Những bông màu trắng,lớn Tương phản với

những cánh môi màuđỏ

Phal Golden Sun xDtps Leopard Prince

Hoa màu trắng được

tô điểm them nhữngchấm màu trắng

Shang's Stripes x DtpsMinho Princess

Đẹp nhất, dễ trồng

Có hoa màu hồng

Dtps Purple Gem xDtps Taisuco Jewel

Cành hoa trãi rộng vớinhững bông hoa màu

Minho Valentine x Phal New Cinderella

Canh hoa dài, phânnhánh Chứa đến 11hoa màu hồng tối

Doritaenopsis Sogo

Vivien'

Dtps Sogo Alice x Phal Zuma's Pixie

Hoa màu tím vớinhững đường viềnmàu trắng kem

Doritaenopsis Taida

Salu ‘Taida’

Dtps (Salu Spot x Happy Beauty)

Hoa màu đỏ tươi vớinhững đường viềncánh hoa màu vàngkem

Hình 1.2: Một số loài Mãn Thiên Hồng thương mại

Hình 1.3: Một số loài Mãn Thiên Hồng thương mại.

1.1.4 Các kỹ thuật nhân giống Mãn Thiên Hồng:

 Nhân giống in – vivo:

Nhân giống Mãn Thiên Hồng bằng cách tạo cây con trên cọng pháthoa Chồi của Mãn Thiên Hồng được tạo ra ngay trên đốt hoa có mangmầm ngủ bằng cách bao quanh đốt một lớp rêu nước để giữ ẩm (Shara,

1938, 1952) (trích trong Arditti và Ernst, 1993) [10] Rêu nước cũng cóthể được sử dụng tạo cây con từ các phần phát hoa cắt rời bằng phươngpháp bán vô trùng (semiaseptic method) (Grimes, 1987)[13] Trongnhững năm gần đây, chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng để

cảm ứng tạo cây con trên phát hoa trong in – situ Cytokinin được trộn

với chất mang và xử lý trực tiếp lên phát hoa (Võ Thị Bạch Mai, 1996 )[9] hay ở dạng bột nhão quấn quanh đốt hoa (McFarlane, 1977; Brasch

và Kocsis, 1980) Để cho kết quả tốt nhất, vật liệu sử dụng là cây MãnThiên Hồng đã ra hoa chứa cả nụ hoa và hoa đã nở (Arditti và Ersnt,1993)

 Nhân giống in – vitro:

Đốt phát hoa có mang mầm ngủ của cây Mãn Thiên Hồng được cắtthành những đoạn có kích thước 65mm được khử trùng và đặt trên môitrường biến đổi Vacin – Went Kết quả là chồi được hình thành sau mộttháng nuôi cấy Hầu hết chồi đều có rễ khỏe sau hai tháng Kết quả ghinhận được từ nuôi cấy đoạn phát hoa có mang mầm ngủ của nhiều tácgiả cho thấy từ các mầm ngủ gần cuối cùng của đoạn phát hoa sẽ pháttriển tạo thành cây con trực tiếp còn các mầm ở vị trí trên sẽ phát triểntạo thành phát hoa thứ cấp, khi dùng phương pháp này không phá hủy vàgây nguy hiểm đến cây mẹ, nhưng không được thuận lợi là sự hìnhthành mô sẹo rất khó xảy ra Phương pháp này bị giới hạn chỉ có giá trịcho nhân giống tạo chồi từ đốt hoa nên hệ số nhân giống không cao(Arditti và Ersnt, 1993)[10]

Để cải thiện sự tăng trưởng chồi từ đốt thân Hồ Điệp người ta sử dụngcác chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong môi trường nuôi cấy, BAPkích thích tốt sự tăng trưởng chồi từ mầm ngủ (Koch, 1974)[14] Khi

tăng BA trong khoảng 0.1 – 3 mg/l, trọng lượng chồi cũng tăng theo.NAA hiện diện trong môi trường nuôi cấy làm giảm sự hình thành chồi(Tse và cộng sự, 1971) IAA, KNA (auxin – potassium αnaphtaleneacetate) và 2,4-D làm tăng chiều dài của sơ khởi chồi nhưnglại ức chế các giai đoạn sau đó (Koch, 1974) Để kích thích tăng sốlượng chồi thì các mầm ngủ trên các đoạn phát hoa được cảm ứng khinuôi cấy trên môi trường REM có bổ sung 25mg/l BA Rễ được cảmứng hình thành khi chuyển chúng sang môi trường không chứa chất điềuhòa sinh trưởng thực vật nhưng có chứa 10% w/v dịch chiết chuối(Arditti và Ernst, 1993).

Nhân giống lan Mãn Thiên Hồng thông qua việc gây vết thương trêncác chồi con được tạo thành từ phát hoa Một vài chồi thân hoa lan MãnThiên Hồng không tăng trưởng tiếp tục mà được cảm ứng để tạo thành

mô sẹo (Tse và cộng sự, 1971; Hackett và cộng sự, 1973) [17] Mỗi đốtmang chồi trước khi đặt vào môi trường Knudson C hay môi trườngMureshige – Skoog có hoặc không có bổ sung 2,0 mg/l NAA, phải gâyvết thương bằng cách hoặc cắt theo hướng chéo và song song với trụcthân hoặc đâm vào đỉnh chồi mầm ngủ bằng dao cấy vô trùng Kết quả

mô sẹo được hình thành (Arditti và Ernst, 1993)[10]

Trong môi trường Murashige – Skoog biến đổi, lá Mãn Thiên Hồngvừa mới nhú lên từ chồi con, được tách rời và cấy vào môi trưởng lỏngVacin – Went biến đổi có bổ sung 2,5mg/l BAP và chứa 20% (v/v) nướcdừa, kết quả là tạo được PLBs từ mô cấy (Tanaka và Sakanashi, 1978)[18]

Ngoài ra, có thể dùng môi trường MS lỏng có bổ sung IAA – ala vàBAP để tạo ra số lượng lớn PLB từ chồi con có hai lá được phát triển từmầm ngủ Kết quả PLB được phát triển từ phần gốc lá (Arditti và Ernst,1993) [10]

1.2 Tiền củ:

Theo Edwin F George Ph.D năm 1993 cho rằng hạt lan chứa một phôi nhỏ

có đường kính khoảng 0,1 mm và chúng không có nội nhũ dự trữ Khi hạt nảy

mầm, phôi tăng rộng để hình thành một cấu trúc nhỏ giống như là corm và đượcgọi là protocorm (tiền củ) và chúng phát triển thành một cực chồi và một cực rễđối diện nhau Trong tự nhiên, protocorm có màu xanh và tích tụ carbonhydratethông qua quang hợp Sự tích tụ dự trữ chất hữu cơ với mục đích là giúp cựcchồi và cực rễ tăng trưởng thành cây hoàn chỉnh Việc tạo somatic protocorm

trong nuôi cấy in – vitro thì không tương tự như ở hạt, chính vì thế nhiều nhà

nuôi cấy mô dùng thuật ngữ “protpcorm – like body (PLBs)” đại diện chosomatic protocorm

Champagnat và Morel (1972) và Norstog (1979) xem sự tạo PLB như là mộtgiai đoạn đặc biệt trong con đường phát triển phôi Như vậy, protocorm đại diệnnhư là một giai đoạn sinh phôi sớm Sự tạo thành protocorm ở họ lan được xemnhư là đại diện cho sự sinh phôi trực tiếp (protocorm hình thành từ mô cấy màkhông qua giai đoạn tạo mô sẹo) hoặc sinh phôi gián tiếp (protocorm hình thành

từ mô sẹo có khả năng sinh phôi)(Edwin F George Ph D., 1993)

Tiền củ (protocorm) là thuật ngữ chỉ riêng cho họ orchidaceae Chúng tadùng thuật ngữ tiền củ để chỉ cho tất cả các giai đoạn mà khối mô chưa hìnhthành lá Tiền củ không có hình dạng rõ ràng và chúng không có một cấu trúchình thái rõ ràng như ở thân và rễ

Hình 1.4: Hình thái PLB được quan sát dưới kính hiển vi soi nổi.

Hình 1.5: PLB được nhân nhanh trong môi trường rắn

1.3 Kỹ thuật nhân giống in vitro (nuôi cấy mô tế bào thực vật):

1.3.1 Ưu và nhược điểm của kỹ thuật nhân giống in vitro:

 Ưu điểm:

Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao: Trong hầu hết các trường hợp,công nghệ vi nhân giống đáp ứng tốc độ nhân nhanh cao, từ một cây trongvòng 1 – 2 năm có thể tạo thành hàng triệu cây

Sản phẩm cây giống đồng nhất: Vi nhân giống về cơ bản là công nghệnhân dòng Nó tạo ra quần thể có độ đồng đều cao dù xuất phát từ cây mẹ cókiểu gen dị hợp hay đồng hợp

Tiết kiệm không gian: Vì hệ thống sản xuất hoàn toàn trong phòng thínghiệm, không phụ thuộc vào thời tiết và các vật liệu khởi đầu có kích thướcnhỏ Mật độ cây tạo ra trên một đơn vị diện tích lớn hơn rất nhiều so với sảnxuất trên đồng ruộng và trong nhà kính theo phương pháp truyền thống Nâng cao chất lượng cây giống: Nuôi cấy mô là một phương pháp hữu

hiệu để loại trừ virus, nấm khuẩn khỏi các cây giống đã nhiễm bệnh Cây

giống sạch bệnh tạo ra bằng cấy mô thường tăng năng suất 15 - 30% so vớigiống gốc

Lợi thế về vận chuyển: Các cây con kích thước nhỏ có thể vận chuyển

đi xa dễ dàng và thuận lợi

 Nhược điểm:

Hạn chế về chủng loại sản phẩm: Trong điều kiện kỹ thuật hiện nay,không phải tất cả cây trồng đều được nhân giống thương phẩm bằng vi nhângiống Nhiều cây trồng có giá trị kinh tế hoặc quý hiếm vẫn chưa thể nhânnhanh để đáp ứng nhu cầu thương mại hoặc bảo quản nguồn gen Nhiều vấn

đề lý thuyết liên quan đến nuôi cấy và tái sinh tế bào thực vật in vitro vẫn

chưa được giải đáp

Chi phí sản xuất cao: Vi nhân giống đòi hỏi nhiều lao động kỹ thuậtthành thạo Do đó, giá thành sản phẩm còn khá cao so với các phương pháptruyền thống như chiết, ghép và nhân giống bằng hạt

Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình: Cây con nuôi cấy mô cóthể sai khác với cây mẹ ban đầu do hiện tượng biến dị tế bào soma Kết quả

là cây con không giữ được các đặc tính quý của cây mẹ Tỷ lệ biến dị thườngthấp ở giai đoạn đầu nhân giống, nhưng sau đó có chiều hướng tăng lên khinuôi cấy kéo dài và tăng hàm lượng các chất điều hòa sinh trưởng Hiệntượng biến dị này cần được lưu ý khắc phục nhằm đảm bảo sản xuất hàngtriệu cây giống đồng nhất về mặt di truyền

1.3.2 Các giai đoạn trong quy trình nhân giống vô tính in vitro:

Nhân giống vô tính cây trồng thường trải qua các bước sau:

 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

 Tạo thể nhân giống in – vitro

 Nhân giống in – vitro

 Tái sinh thành cây hoàn chỉnh in – vitro

 Chuyển cây ra vườn ươm để thuần hóa

 Nhân giống in – vitro

 Tạo cây con bầu đất

 Đưa các cây ra đồng ruộng

 Chọn lọc cây đầu dòng

 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng:

Mẫu được nuôi cấy thường còn ở giai đoạn non, quá trình phânchia và phân hóa mạnh Đỉnh sinh trưởng và chồi bên được sử dụng ởhầu hết các loại cây trồng Ngoài ra, chồi đỉnh và chồi non của hạt mớinảy mầm cũng được sử dụng Đỉnh sinh trưởng nhỏ được tách bằng kínhlúp Môi trường được sử dụng rộng rãi trong nhân giống hiện nay là môitrường Murashige và Skoog Đối với mẫu dễ bị hóa nâu môi trườngthường được bổ sung than hoạt tính hay ngâm mẫu với hỗn hợp ascorbicacid và citric acid (25-150 mg/l)

 Tạo thể nhân giống in – vitro:

Mẫu nuôi cấy được cấy trên môi trường chọn lọc đặc biệt nhằm

mục đích tạo thể nhân giống in – vitro Có hai thể nhân giống in – vitro :

thể chồi (multiple shoot) và thể cắt (cutting) đốt ngoài ra còn có tiền củ

(protocorm) Tạo thể nhân giống in –vitro dựa vào đặc điểm nhân giống

ngoài tự nhiên của cây trồng Tuy nhiên có những cây trồng không cókhả năng nhân giống người ta thường nhân giống bằng cách tạo cụm chồibằng mô sẹo Để tạo thể nhân giống trong môi trường thường bổ sungCytokinin, Auxin, GA3 và các chất hữu cơ khác

 Nhân giống in – vitro:

Là giai đoạn quan trọng trong việc nhân giống cây trồng bằngphương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khốithể nhân giống Vật liệu nuôi cấy là những thể chồi, đôi khi nồng độ chấtsinh trưởng giảm thấp cho phù hợp với quá trình nuôi cấy kéo dài Điềukiện nuôi cấy thích hợp giúp cho quá trình tăng sinh được nhanh chóng

Cây nhân giống in – vitro có trạng thái sinh lý trẻ và được duy trì trong

thời gian vô hạn

 Tái sinh cây hoàn chỉnh in – vitro:

Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân lá và rễchuẩn bị chuyển ra vườn ươm Cây con phải khỏe mạnh nhằm đảm bảosức sống khi ra ngoài môi trường bên ngoài Các chất có tác dụng tạochồi được loại bỏ thay vào đó là các chất kích thích quá trình tạo rễ Điềukiện nuôi cấy tương tự với quá trình nuôi cấy ngoài tự nhiên, một bước

thuần hóa trước khi được tách ra khỏi điều kiện in – vitro Thường dùng

các chất thuộc nhóm auxin kích thích ra rễ

 Chuyển cây in – vitro ra vườn ươm:

Đây là giai đoạn khó khăn nhất trong quá trình nhân giống vô tính

Cây in - vitro được nuôi cấy trong điều kiện ổn định về dinh dưỡng, ánh

sáng, nhiệt độ Khi chuyển ra đất với điều kiện tự nhiên hoàn toàn kháchẳn cây con dễ bị mất nước, mau bị héo Để tránh tình trạng này, vườnươm nuôi cấy mô phải mát, cường độ chiếu sáng thấp, nhiệt độ khôngkhí mát, độ ẩm cao… Cây con thường được cấy trong luống ươm có cơ

chất dễ thoát nước, tơi xốp giữ được ẩm Trong những ngày đầu cầnđược phủ nilon để giảm quá trình thoát hơi nước Rễ được tạo ra trongquá trình nuôi cấy mô sẽ dần lụi đi và rễ mới xuất hiện Cây con thườngđược xử lý với chất kích thích ra rễ bằng cách ngâm hay phun lên lá đểrút ngắn thời gian ra rễ.

 Nhân giống ex – vitro:

Cây con sau khi được chuyển ra luống ươm hay cấy vào bầu đấtsau 7-10 ngày thì bắt đầu ra rễ sau đó được phun dinh dưỡng với hỗn

hợp N, P, K (1g/l cho mỗi loại) Tuy nhiên do quá trình nhân giống in

vitro có nhiều tốn kém thì cây con được sử dụng như là cây mẹ và được

tiếp tục nhân giống trên luống ươm Điều kiện nhân giống trên luốngươm phải tiếp tục đảm bảo cây mẹ ở trạng thái tốt nhất bằng cách giảmdinh dưỡng, duy trì độ ẩm cao, nhiệt độ không khí thấp…Hệ số nhângiống trên luống ươm càng cao giúp cho việc giảm giá thành càng có ýnghĩa

 Cây con bầu đất:

Cây con từ ống nghiệm hay được nhân giống trên luống ươm đượccấy trên luống đất 15-20 ngày cho cây ra rễ và phát triển khỏe, sau đóđược cấy vào bầu đất (cây chuối) Bầu đất có cơ chất xốp đầy đủ chấtdinh dưỡng tỉ lệ đất/phân là 1/1, ngoài ra hàng tuần được phun dinhdưỡng khoáng 1-2 lần/tuần thường dùng phân khoáng có tỉ lệ N- P- K:20-20-20 Thời gian cây con ở giai đoạn bầu đất phụ thuộc đặc điểm câytrồng khoảng 20 ngày (khoai tây) đến 2,5 tháng (cây chuối) Cây bầu đấtđược đặt ở nơi có nhiều ánh sáng, độ ẩm cao, nhiệt độ không khí mát đểcây phát triển nhanh và khỏe

 Trồng cây ra ruộng:

Cây con sau khi đạt được kích thước về chiều cao, số lá đườngkính thân thích hợp sẽ được chuyển ra trồng ở đồng ruộng Duy trì độ ẩmcao trong giai đoạn này giúp cây thích nghi dần với điều kiện tự nhiên,các nhân tố nông học khác được tác động giống như cây trồng tập quán

 Chọn lọc cây đầu dòng:

Là vấn đề quan trọng đối với cây ăn trái nhằm tạo ra một quần thểđồng đều có năng suất cao và ổn định Những cây được chọn đầu dòngđược đưa vào nhân giống trở lại bằng nuôi cấy mô.

Hiện tại công nghiệp nhân giống được ứng dụng nhiều trong kinh tế đểgiải quyết nhu cầu về giống cho sản xuất, giống cho cây lâm nghiệp,trồng rừng, rau, ngũ cốc, cây ăn trái, hoa và cây dược liệu

1.3.3 Các vấn đề liên quan đến nhân giống in – vitro:

1.3.3.1. Ảnh hưởng của mẫu cấy và môi trường đến nhân giống in – vitro:

 Mẫu nuôi cấy:

Các nhân tố khi chọn mẫu bao gồm kiểu gen, cơ quan được chọn, tuổisinh lý, mùa vụ, giai đoạn sinh trưởng, độ khỏe của mẫu và nguồn mẫu

 Kiểu gen: ảnh hưởng sâu sắc đến quá trình nuôi cấy, số lượng chồi tạođược, sự khác nhau về tăng sinh chồi, sự khác nhau về khả năng phátsinh phôi

 Chọn cơ quan: hết các loại cơ quan và mô đều có khả năng sử dụng

nuôi cấy in – vitro Ví dụ: Nuôi cấy thân mầm cây để tạo protoplast có

khả năng phát sinh phôi Nuôi cấy lát cắt mỏng ở mô lá cây thuốc lá

có thể tái sinh các cơ quan khác nhau như chồi và rễ phụ thuộc vàolớp mỏng tế bào ở bộ phận nào của cây được nuôi cấy và các hocmonđược sử dụng

 Tuổi và sinh lý: Tuổi thực của mẫu nuôi cấy và tuổi theo mùa trongnăm của mẫu nuôi cấy có ảnh hưởng quan trọng đến sự biệt hóa tếbào Tùy vào đối tượng cây thì có tuổi sinh lý khác nhau Ví dụ: Khảnăng tái sinh cao ở lá cây trưởng thành so với lá cây còn non Ngược

lại mẫu non cắt cành của Hedora helix dễ ra mẫu hơn so với mẫu

trưởng thành và nuôi cấy lá non phát sinh cơ quan tốt hơn so với nuôicấy lá trưởng thành

 Sức sống của mẫu: Mẫu cây mẹ có ảnh hưởng rất quan trọng đến nuôi

cấy in – vitro Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng để loại virus sản xuất ra cây

sạch bệnh

 Ảnh hưởng của môi trường:

Môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) được sử dụng phổ biếnnhất trong nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Nhưng các loài khác nhau có thể đòihỏi môi trường nuôi cấy khác nhau Samartin (1989) đã sử dụng 6 công thức

muối đa lượng khác nhau đối với cây trà Camelia japonica và thấy rằng môi

trường MS cho tốc độ sinh trưởng nhanh nhất khi thu mẫu từ cây non Môitrường MS đã chứng tỏ không thích hợp cho mẫu lấy từ cây già, trong khimôi trường muối loãng hơn (Heller, 1953) lại cho kết quả khá

Tính độc của môi trường MS cũng được quan sát ở một số loài(Sommer, 1982; Vieitez, 1983) do môi trường này chứa hàm lượng muối đa

lượng cao, có thể gây độc cho tế bào in – vitro, nhất là protoplast Phương

pháp đơn giản nhất là giảm nồng độ muối khoáng xuống 1/3 hoặc 1/2(Grosser, 1994) Môi trường cơ bản MS có hàm lượng NH4NO3, KNO3 giảmmột nửa, bổ sung thêm glutamine 1,550 mg/l, KCl 750 mg/l rất tốt cho nuôicấy mô sẹo phôi hoá và giảm tích luỹ tinh bột ở một số giống Citrus(Grosser và Gmitter, 1990)

Trong số các muối đa lượng, muối nitơ có ý nghĩa quyết định đến sựtái sinh chồi Welander (1985) cho biết khi nồng độ NH4NO3 và KNO3 trong

MS giảm đi 1/2, đỉnh sinh trưởng của dâu tây phát triển khá hơn, rễ tái sinhmạnh hơn Giảm muối khoáng trong một số trường hợp có tác dụng tốt đốivới sự ra rễ ở một số loài (Murashige, 1977; Hasegawa, 1980; Drew, 1987)như trường hợp chồi hoa hồng ra rễ tốt hơn khi nồng độ nitơ tổng số giảm(Hyndman cs., 1982)

Nguồn carbon cũng rất quan trọng đối với nuôi cấy đỉnh sinh trưởng.Nồng độ đường 1- 3 % được sử dụng phổ biến Nồng độ đường sucrose caohơn 3% tỏ ra độc ở một số trường hợp (Rublue và Kartha, 1985) Chong vàPua (1985) đã sử dụng sucrose, glucose, fructose and sorbitol nồng độ từ 1-7% trong nuôi cấy đỉnh sinh trưởng giống táo Ottawa 3 và thấy rằng nồng độsucrose 3% là tối ưu cho sinh trưởng, 100% chồi tạo rễ và chất lượng câycon khoẻ mạnh

Trạng thái vật lý của môi trường cũng có ý nghĩa quan trọng trongnuôi cấy đỉnh sinh trưởng Đa số các trường hợp người ta sử dụng môitrường agar nhưng khi nuôi cấy đỉnh sinh trưởng một số loài, môi trườnglỏng tỏ ra tốt hơn (Mellor và Stace Smith, 1969)

Nồng độ các chất kích thích sinh trưởng thấp trong môi trường có thểlàm giảm các biến dị tế bào soma (Grosser và Gmitter, 1990) Tế bào mô sẹophôi hoá ở cây có múi có thể nuôi cấy và bảo quản lâu dài trong môi trườngkhông có chất kích thích sinh trưởng

1.3.3.2.Tính bất định về mặt di truyền:

Mặc dù kỹ thuật nhân giống vô tính được sử dụng nhằm mục đích tạo ra quầnthể cây trồng đồng nhất với số lượng lớn nhưng phương pháp này cũng tạo ranhững quần thể biến dị tế bào soma qua nuôi cấy mô sẹo và nuôi cấy tế bào đơn.Những biến dị này được nghiên cứu vận dụng vào cải thiện giống cây trồngnhưng rất ít những biến dị có lợi được báo cáo

Tần số biến bị hoàn toàn khác nhau và không lặp lại nuôi cấy mô sẹo và tếbào đơn có sự biến dị nhiều hơn nuôi cấy chồi đỉnh

Cây trồng biến dị tế bào soma qua nuôi cấy thường là biến dị về chất lượng,

số lượng và năng suất, và biến dị này không di truyền Nguyên nhân gây ra biến

dị chưa được làm sáng tỏ chủ yếu là do những biến đổi trong vật chất di truyềnnhư đứt gãy, chuyển đoạn ADN hoặc đảo đoạn Những nguyên nhân gây biến dị

tế bào soma là:

+ Kiểu di truyền

+ Thể bội : cây đa bội thể tần số biến dị cao hơn cây nhị bội

+ Số lần cấy truyền: số lần cấy truyền càng cao thì tần số biến dị càng lớn+ Loại mô

1.3.3.3 Việc sản xuất các chất gây độc từ mẫu cấy:

Hiện tượng hóa mẫu hóa nâu hay bị đen là chết mẫu hay làm giảm sựtăng trưởng Nguyên nhân của hiện tượng này là do mẫu nuôi cấy có chứanhiều tannin hay hydroxyphenol có nhiều trong mô già hơn mô sẹo

Một số phương pháp làm giảm sự hóa nâu mẫu:

- Tách các phần tử phenol ra khỏi môi trường

- Bổ sung các chất khử redox (oxidation-redution) phenol vào môitrường

- Ngăn chặn sự hoạt động của enzyme phenolase

- Giảm lượng phenol có sẵn trong mẫu bằng môi trường lỏng giốngmôi trường rắn

- Mẫu chuẩn bị có vết cắt nhỏ, để ngoài vài giờ trước khi cấy, haynơi cấy trong môi trường không có ánh sáng

Than hoạt tính được đưa vào môi trường để hấp thụ chất kìm hãmphenol, ngăn chặn quá trình hóa nâu hay đen, đặc biệt có hiệu quả trên cácloại phong lan, nồng độ thường 0,1-0,3% Tuy nhiên than hoạt tính sẽ làmchậm quá trình phát triển của mô do hấp thụ chất kích thích sinh trưởng vàcác chất khác Polyvinylpyrolidone (PVP), một chất thuộc loại polyamide,hấp thụ phenol qua vòng hydrogen, ngăn chặn sự hóa nâu, hiệu quả phụthuộc vào các loài cây trồng khác nhau

1.3.3.4 Hiện tượng thủy tinh thể:

Nhân giống vô tính in – vitro chỉ có hiệu quả khi cây con được nhân

giống chuyển ra đồng ruộng có tỉ lệ sống cao Có hiện tượng trong nuôi cấy

mô là xuất hiện cây in – vitro thủy tinh thể Khi chuyển ra khỏi bình nuôi

cấy, cây con đễ dàng bị mất nước và tỉ lệ sống thấp Đây là một dạng bệnhsinh lý Dạng này thường thấy khi nuôi cấy trên môi trường lỏng hay môitrường thạch có hàm lượng thạch thấp, đặc biệt khi sự trao đổi khí thấp, quátrình thoát hơi nước tập trung trong cây

 Đặc điểm cây thủy tinh thể:

Nhận thấy là có sự khác nhau về hình thành lớp sáp ở cây nuôi cấy mô vàcây ngoài tự nhiên Lượng sáp chứa trong cây ngoài vườn ươm cao hơn hẳn

cây in vitro Tế bào có chứa nhiều phân tử có cực dễ dàng nhận phân tử nước

gắn trên nó, gia tăng độ mất nước và tốc độ hô hấp của tế bào trong nhân vôtính và đưa đến sự chết của mô trong nuôi cấy

Ngăn chặn quá trình thủy tinh thể