ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP: CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY TẾ BÀO SÂM NGỌC LINH

Dương Tấn Nhựt và cộng sự, Đề tài “ Hoạt chất saponin từ các nguyên liệu nuôi cấy invitro của cây Sâm Ngọc Linh Panax vietnamensis Ha et Grushv.”, Trung Tâm Sâm và Dược Liệu TP... Với nỗ

1 Đầu đề Khóa luận tốt nghiệp:

CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY TẾ BÀO SÂM NGỌC LINH

2 Nhiệm vụ (yêu cầu về nội dung và số liệu ban đầu):

- Tổng quan về cây Sâm Ngọc Linh

- Tìm hiểu một số qui trình nuôi cấy tế bào Sâm Ngọc Linh

3 Ngày giao Khóa luận tốt nghiệp : 05/04/2010

4 Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 28/06/2010

5 Họ tên người hướng dẫn Phần hướng dẫn

CN BÙI VĂN THẾ VINH Toàn bộ

Nội dung và yêu cầu KLTN đã được thông qua Bộ môn

Ngày tháng năm 2010

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN NGƯỜI HƯỚNG DẪN CHÍNH

(Ký và ghi rõ họ tên) (Ký và ghi rõ họ tên)

CN BÙI VĂN THẾ VINH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC KTCN TPHCM CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAMĐỘC LẬP - TỰ DO – HẠNH PHÚC

-KHOA:MT & CNSH BỘ MÔN:CNSH NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP HỌ VÀ TÊN: NGUYỄN THỊ THU MSSV: 207111055 NGÀNH: CNSH LỚP: 07CSH PHẦN DÀNH CHO KHOA, BỘ MÔN Người duyệt (chấm sơ bộ): ………

Đơn vị:………

Ngày bảo vệ:………

Điểm tổng kết:………

Nơi lưu trữ Khóa luận tốt nghiệp: ………

LỜI CẢM ƠN

Vậy là ba năm học dưới mái trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ đã kết thúc.

Trong suốt thời gian học tập em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ tận tình từ phíathầy cô, gia đình và bạn bè

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới quí thầy cô trường Đại Học Kỹ ThuậtCông Nghệ nói chung cũng như quí thầy cô khoa Môi Trường và Công Nghệ SinhHọc đã giảng dạy, truyền đạt kiến thức để em có thể vững bước, tự tin với những gì

đã được học

Em xin gửi lời cảm ơn tới thầy Bùi Văn Thế Vinh đã tận tình giúp đỡ, hướngdẫn trong suốt quá trình học tập cũng như trong thời gian làm bài khóa luận tốtnghiệp

Xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ, để em có thêm nhiều độnglực hoàn thành tốt khóa học

Do vẫn còn nhiều hạn chế về trình độ và kiến thức nên bài tiểu luận vẫn cònnhiều hạn chế, thiếu sót Em mong quí thầy cô, bạn bè chỉ dạy, bổ sung và thông cảm

để em có thể rút ra nhiều kinh nghiệm làm bài trong quá trình học tập

MỤC LỤC

NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

LỜI CẢM ƠN

DANH SÁCH CÁC BẢNG BIỂU

DANH SÁCH CÁC HÌNH

CHƯƠNG I ĐẶT VẤN ĐỀ 01

1.1 Đặt vấn đề 01

1.2 Mục đích của đề tài 02

CHƯƠNG II TỔNG QUAN 03

2.1 Giới thiệu kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 0.3 2.1.1 Khái niệm 03

2.1.2 Các kỹ thuật nuôi cấy 04

2.1.3 Môi trường nuôi cấy 08

2.1.4 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật 09

2.1.5 Các nhân tố đảm bảo thành công trong nuôi cấy mô tế bào thực vật 11

2.2 Giới thiệu cây Sâm Ngọc Linh 15

2.2.1 Phân loại 15

2.2.2 Đặc điểm hình thái 16

2.2.3 Sinh thái và phân bố 18

2.2.4 Hiện trạng và tiềm năng của cây sâm Ngọc Linh 19

2.2.5 Thành phần hóa học 20

CHƯƠNG III CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY TẾ BÀO SÂM NGỌC LINH 27

3.1 Nuôi cấy mô sẹo 27

3.1.1 Nguyên liệu 27

3.1.2 Môi trường 27

3.1.3 Thiết bị và dụng cụ 27

3.1.4 Hóa chất 27

3.1.6 Điều kiện nuôi cấy 28

3.2 Tái sinh chồi từ mô sẹo 29

3.2.1 Nguyên liệu 29

3.2.2 Môi trường 29

3.2.3 Thiết bị và dụng cụ 29

3.2.4 Hóa chất 29

3.2.5 Qui trình thực hiện 29

3.2.6 Điều kiện nuôi cấy 29

3.3 Nuôi cấy rễ 30

3.3.1 Nguyên liệu 30

3.3.2 Môi trường 30

3.3.3 Thiết bị và dụng cụ 30

3.3.4 Hóa chất 30

3.3.5 Qui trình thực hiện 31

3.3.6 Điều kiện nuôi cấy 31

3.4 Nuôi cấy sinh khối 31

3.4.1 Nguyên liệu 31

3.4.2 Môi trường 31

3.4.3 Thiết bị và dụng cụ 31

3.4.4 Hóa chất 32

3.4.5 Qui trình thực hiện 32

3.4.6 Điều kiện nuôi cấy 32

3.5 Tái sinh cây qua con đường tạo phôi soma 33

3.5.1 Nguyên liệu 33

3.5.2 Môi trường 33

3.5.3 Thiết bị và dụng cụ 33

3.5.4 Hóa chất 33

3.5.5 Qui trình thực hiện 33

3.5.6 Điều kiện nuôi cấy 34

3.6 Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến nuôi cấy Sâm Ngọc Linh 35

3.6.1 Khảo sát ảnh hưởng của một số loại chất khử trùng 35

3.6.2 Khảo sát ảnh hưởng của các tổ hợp hoocmon lên sự phát sinh hình thái 36

3.6.3 Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng lên khả năng tạo mô sẹo từ lá và cuống lá 37

3.6.4 Ảnh hưởng của kích thước mẫu cấy ban đầu lên sự tăng sinh mô sẹo 38

3.6.5 Ảnh hưởng của auxin lên khả năng khởi tạo mô sẹo từ lá và cuống lá 39

3.6.6 Ảnh hưởng của auxin lên khả năng tăng sinh mô sẹo Sâm Ngọc Linh 40

3.6.7 Ảnh hưởng của BA và NAA đến khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo 41

3.6.8 Ảnh hưởng của BA lên quá trình tăng trưởng chồi Sâm Ngọc Linh invitro 43

3.6.9 Ảnh hưởng của nồng độ đường đến khả năng tăng trưởng chồi 43

3.6.10 Ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng tăng trưởng chồi invitro 44

3.6.11 Ảnh hưởng của IAA, IBA, NAA đến khả năng ra rễ bất định từ mô sẹo 45

3.6.12 Ảnh hưởng của IBA và NAA đến khả năng nhân rễ bất định 46

CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48

4.1 Kết luận 48

4.2 Kiến nghị 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC

DANH SÁCH CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 2.1: Thời gian tối thiểu để hấp khử trùng môi trường nuôi

cấy mô ở 1210C 13

Bảng 2.2: Nồng độ và thời gian sử dụng 1 số chất xử lí mô cấy thực vật 14

Bảng 2.3: Hàm lượng một số saponin chính trong sâm 20

Bảng 2.4: Hàm lượng saponin của Sâm Ngọc Linh so sánh với các loài Panax spp trồng trọt 21

Bảng 2.5: Các saponin chính yếu trong thành phần saponin dẫn chất protopanaxatriol 21

Bảng 2.6: Acid Oleanolic 22

Bảng 2.7: Ocotillol 22

Bảng 2.8: Các axid béo được tìm thấy 23

Bảng 2.9: Thành phần acid amin chủ yếu 24

Bảng 2.10: Các nguyên tố vi lượng 25

Bảng 3.1: Ảnh hưởng của các loại nồng độ khử trùng 35

Bảng 3.2: Ảnh hưởng của các tổ hợp hoocmon lên sự phát sinh hình thái của Sâm Ngọc Linh cấy mô 36

Bảng 3.3: Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng lên khả năng tạo mô sẹo từ lá và cuống lá 37

Bảng 3.4: Ảnh hưởng của kích thước mẫu cấy ban đầu lên sự tăng sinh mô sẹo 38

Bảng 3.5: Ảnh hưởng của auxin lên khả năng khởi tạo mô sẹo từ lá và cuống lá 39

Bảng 3.6: Ảnh hường của auxin lên khả năng tăng sinh mô sẹo Sâm Ngọc Linh 40

Bảng 3.7: Khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung BA và NAA 42

Bảng 3.8: Ảnh hưởng của BA lên quá trình tăng trưởng chồi Sâm Ngọc Linh invitro 43

Bảng 3.9: Ảnh hưởng của nồng độ đường đến khả năng

tăng trưởng chồi 44

Bảng 3.10: Ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng tăng trưởng chồi invitro 44

Bảng 3.11: Ảnh hưởng của IAA, IBA, NAA đến khả năng ra rễ bất định từ mô sẹo 45

Bảng 3.12: Ảnh hưởng của IBA và NAA đến khả năng nhân rễ của mẫu có nguồn gốc từ môi trường bổ sung NAA 47

Bảng 3.13: Ảnh hưởng của IBA và NAA đến khả năng nhân rễ của mẫu có nguồn gốc từ môi trường bổ sung IBA 47

DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1: Sâm Ngọc Linh ngoài tự nhiên 15

Hình 2.2: Hình thái Sâm Ngọc Linh 16

Hình 2.3: Cây Sâm Ngọc Linh 17

Hình 3.1: Mô sẹo Sâm Ngọc Linh 28

Hình 3.2: Chồi Sâm Ngọc Linh 30

Hình 3.3: Rễ Sâm Ngọc Linh 31

Hình 3.4: Nuôi cấy trong Bioreactor 32

Hình 3.5: Phôi vô tính Sâm Ngọc Linh 34

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Dương Tấn Nhựt và cộng sự, Đề tài “ Hoạt chất saponin từ các nguyên liệu nuôi cấy invitro của cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)”, Trung Tâm Sâm và Dược Liệu TP HCM.

2 Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên (2006), Công nghệ tế bào, Nxb

PHỤ LỤC

 Thành phần môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962):

Khoáng đa lượng (mg l -1 )

NH4NO3 1650

KNO3 1900

CaCL2.2H2O 440

Mg2SO4.7H2O 370

KH2PO4.7H2O 170

Khoáng vi lượng (mg l -1 ) KI 0.83 H3BO4 6.2 MnSO4.4H2O 22.3 ZnSO4.7H2O 8.6 Na2MoO4.2H2O 0.25 CuSO4.5H2O 0.025 CoCl2.6H2O 0.025 Na2.EDTA 27.8 Vitamin và các chất hữu cơ khác (mg l -1 ) Myo-Inositol 100 Nicotinic acid 0.5 Pyridoxine HCl 0.5 Thiamine HCl 0.1 Glycine 2.0

CHƯƠNG I ĐẶT VẤN ĐỀ

1.1 Đặt vấn đề:

Nhân sâm Panax ginseng C A Meyer là cây dược liệu được sử dụng từ hàng

ngàn năm nay Những tác dụng y học của Nhân Sâm, được dùng trong y học cổtruyền, hiện đã được chứng minh theo nguyên lý của y học hiện đại Nhân Sâm từcây thuốc huyền thoại của phương Đông đã xuất hiện rộng rãi ở phương Tây, vớinhững sản phẩm thương mại đa dạng Nhân Sâm ngày nay là cây thuốc mang lại giátrị kinh tế to lớn

Việt Nam tự hào có được một loài Nhân Sâm đặc hữu là Sâm Ngọc Linh (hay

còn gọi là Sâm Khu Năm) Panax vietnamensis Ha & Grutzv., được biết đến trên thế

giới với tên gọi Vietnamese ginseng Sâm Ngọc Linh có thành phần ginsenosid, dượcchất chính trong Nhân sâm, được đánh giá vào loại nhiều nhất so với các loài khác

của chi Panax trên thế giới Tuy nhiên, Sâm Ngọc Linh được phát hiện khá muộn

(vào năm 1985) cho nên, tuy có nhiều cố gắng để phát triển cây thuốc quý giá nàynhưng tiềm năng của Sâm Ngọc Linh vẫn chưa hoàn toàn được đánh thức Cộng vớiđịa bàn phân bố hẹp (chỉ có ở vùng núi Ngọc Linh), lại bị khai thác bừa bãi, nên SâmNgọc Linh sớm đứng trước nguy cơ tuyệt chủng Với nỗ lực của những địa phương

có Sâm Ngọc Linh phân bố, hiện nay loài dược liệu này đã có thể tránh bị tuyệt diệt.Nhưng để đưa Sâm Ngọc Linh thành cây thuốc ngang hàng với các loại Nhân sâm cótrên thị trường dược liệu cả về số lượng và chất lượng, cần có nhiều nghiên cứuchuyên sâu ứng dụng sản xuất hiệu quả

Trên thế giới, cây Nhân Sâm Panax ginseng C A Meyer đã được nhân giống

và sản xuất dược chất ginsenosid thành công bằng nuôi cấy mô Ginsenosid chiết từ

mô sẹo trong nuôi cấy mô cây Nhân sâm có cùng dạng với ginsenosid thu từ rễ NhânSâm tự nhiên, tác dụng dược lý của dịch chiết bằng rượu hoặc bằng methanol và bộtginsenosid từ mô sẹo hầu như giống với dịch chiết và bột thu từ rễ Nhân Sâm tựnhiên Do đó đã có các hệ thống nuôi cấy lớn như bioreactor dùng để sản xuấtginsenosid theo quy mô công nghiệp, cung cấp cho thị trường tiêu thụ ngày càng

rộng lớn, khắc phục được những hạn chế trong canh tác cây Nhân Sâm như: thời giantrồng kéo dài, bị giới hạn về khí hậu, thổ nhưỡng, nhiều sâu bệnh

Sâm Ngọc Linh được cả thế giới biết đến với tên gọi Vietnamese ginseng nhưngkhông có nhiều nhà khoa học quốc tế lưu ý nghiên cứu về nó Việt Nam cần tựnghiên cứu cũng như sản xuất, cố gắng đánh thức giá trị y học và giá trị kinh tế củaSâm Ngọc Linh Trong các hướng nghiên cứu, hướng nuôi cấy mô đã thật sự đưanông nghiệp lên bước phát triển tiên tiến, vì vậy muốn nghiên cứu đưa cây SâmNgọc Linh phát triển theo hướng hiện đại, mang lại hiệu quả kinh tế cao không thể

bỏ qua kỹ thuật này Thực tế, cây Sâm Ngọc Linh đã được nhân giống thành công từ

mô sẹo Nhưng tiến hơn một bước để sản xuất ginsenosid Sâm Ngọc Linh bằng nuôicấy mô thì chưa có nghiên cứu nào được công bố

Với mong muốn tìm hiểu về loại cây trồng có giá trị kinh tế này cùng với nhữngcông nghệ nuôi cấy tế bào đã và đang được thực hiện nhằm mục đích nhân giống vàsản xuất các hợp chất có giá trị kinh tế, tôi đã thực hiện khóa luận tốt nghiệp: “Công

nghệ nuôi cấy tế bào Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) dưới sự

hướng dẫn của thầy Bùi Văn Thế Vinh

1.2 Mục đích của đề tài:

- Tổng quan về Sâm Ngọc Linh

- Tìm hiểu một số công nghệ nuôi cấy tế bào Sâm Ngọc Linh

CHƯƠNG II TỔNG QUAN

2.1 Giới thiệu kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.1.1 Khái niệm

Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật mô tả các phương pháp nuôi cấy các bộphận thực vật ( tế bào đơn, mô, cơ quan…) trong điều kiện vô trùng

 Nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa trên hai nguyên tắc:

- Dựa vào tính toàn năng của tế bào:

Mỗi một tế bào bất kì của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềmtàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi Mỗi tếbào là một hệ thống mở, tự duy trì và tự sản xuất để tiến hành các chức năng chuyênbiệt và sản sinh thế hệ tế bào mới nếu cần thiết

- Dựa vào khả năng biệt hóa và phản biệt hóa của tế bào:

Biệt hóa là sự biến đổi của tế bào từ trạng thái tế bào phôi cho đến khi thểhiện một chức năng nào đó

Các tế bào dùng trong môi trường cấy đều có khả năng biệt hóa về cấu trúc vàchức năng Trong những điều kiện thích hợp, có thể làm cho những tế bào này trở lạitrạng thái của tế bào đầu tiên đã sinh ra chúng - tế bào phôi và quá trình đó gọi là quátrình phản biệt hóa Vì vậy những tế bào càng gần với trạng thái của tế bào phôi baonhiêu thì khả năng nuôi cấy thành công càng cao bấy nhiêu

 Ý nghĩa:

- Nhân nhanh giống cây trồng

- Bảo quản nguồn gen

- Tạo cây sạch bệnh

- Sản xuất các hoạt chất sinh học

- Mang tính công nghiệp

 Sơ lược lịch sử phát triển:

- 1665: Robert Hooke quan sát được tế bào sống dưới kính hiển vi vàđưa ra khái niệm tế bào

- 1838: Matthias Schleiden và Theodore Schwann đề xướng học thuyết

tế bào

- 1904: Hannig nuôi cấy phôi đầu tiên ở các loài họ cải

- 1934: Kogl xác định vai trò của IAA

- 1951: Skoog nghiên cứu sử dụng các hoá chất điều hoà sinh trưởng vàphát sinh cơ quan

- 1952: Morel và Martin thực hiện vi ghép invitro thành công.

- 1962: Murashige và Skoog phát minh môi trường nuôi cấy tế bào thựcvật

- 1964: Guha và Maheshwari lần đầu tiên thành công trong tạo được câyđơn bội từ nuôi cấy bao phấn của cây cà rốt

- 1969: Phân lập tế bào trần từ nuôi cấy tế bào dịch lỏng (huyền phù)

của Hapopappus gracilis.

- 1973: Phát hiện Cytokinin có khả năng phá ngủ ở Gerberas.

- 1978: Marton và cộng sự xây dựng quy trình chuyển gen vào tế bàotrần

- 1983: Công ty Mitsui Petrochemicals lần đầu tiên đã sản xuất chất traođổi thứ cấp trên quy mô công nghiệp bằng nuôi cấy tế bào dịch lỏng Lithospermumspp Mitsui 0Petrochemicals

- 1988: Klein và cộng sự tái sinh cây chuyển gen bằng phương pháp bắngen

- 1994: Thương mại hóa giống cà chua chuyển gen FlavrSavr

2.1.2 Các kỹ thuật nuôi cấy

2.1.2.1 Nuôi cấy phôi

Phôi phát triển qua hai giai đoạn dị dưỡng và tự dưỡng Ở giai đoạn dị dưỡngcần có các chất điều hòa sinh trưởng để phát triển

Trong nuôi cấy phôi, đường đóng vai trò rất quan trọng, đường sucrose chonhiều kết quả tốt hơn Ngoài ra một số chất tự nhiên như nước dừa, dịch chiết malt,

casein thủy phân là những chất rất cần trong nuôi cấy phôi Đối với các chất điều hòasinh trưởng, auxin thường dùng ở nồng độ thấp, kinetin có vai trò đặc biệt cho sựphát triển của phôi

Nhiệt độ, ánh sáng cũng ảnh hưởng đến sự phát triển của phôi, thường phôinuôi cấy cần nhiệt độ, ánh sáng thấp hơn phôi phát triển tự nhiên Nhiệt độ 25 ± 2oCthích hợp cho sinh trưởng và nảy mầm của phôi Các phôi thứ cấp rất khó sinhtrưởng đã hoạt động khi chúng được tách rời và nuôi ở điều kiện chiếu sáng 4.000lux hoặc hơn trong 4 giờ chiếu sáng suốt 4 ngày nuôi đầu tiên

 Kỹ thuật nuôi cấy phôi mang lại nhiều hiệu quả như:

- Nhân giống cây trồng

- Thử sức sống của phôi hạt

- Duy trì phôi yếu và cứu phôi lai xa

- Sản xuất hạt nhân tạo mà bản chất là tế bào phôi

2.1.2.2 Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời

Trong nuôi cấy mô và cơ quan tách rời, khâu chọn mẫu có tầm quan trọng đặcbiệt, mẫu phải ở tình trạng sinh lý tốt và đang phát triển

Nhu cầu dinh dưỡng khi nuôi cấy các bộ phận khác nhau của cây là khác nhaunhưng có một số yêu cầu chung như nguồn carbon, nguồn đường, nguyên tố đalượng, vi lượng và các chất điều hòa sinh trưởng Muốn duy trì sinh trưởng và pháttriển của cơ quan nuôi cấy cần thường xuyên cấy chuyền qua môi trường mới

Đối với nuôi cấy mô cần bổ sung thêm các chất hữu cơ chứa ít nitơ dưới dạngacide amine, đường và inositol Trong trường hợp nuôi cấy mô, các chất điều hòasinh trưởng có vai trò quan trọng hơn vì các mô tách rời không có khả năng tổng hợpcác chất này

 Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời được ứng dụng trong:

- Nghiên cứu điều kiện sinh trưởng đối với một bộ phận hoặc một mô của cây

- Nhân cây invitro.

- Tạo mô sẹo phục vụ cho các nghiên cứu như chọn dòng tế bào, đột biến soma,

…

2.1.2.3 Nuôi cấy mô phân sinh

Đặc điểm của mô phân sinh là chứa các tế bào non trẻ, phân chia mạnh, không

bị virus xâm nhập, vì vậy mô phân sinh là mô duy nhất của cây sạch virus Mô phânsinh thường là các mô đỉnh chồi và cành Các mô phân sinh dùng để nuôi cấy thườngtách từ các mầm non, các chồi mới hình thành hoặc các cành non

Trong nuôi cấy sự cân bằng giữa các chất điều hòa sinh trưởng rất quan trọng.Muốn tạo chồi cần bổ sung cytokinin hoặc tổ hợp cytokinin với auxin, muốn tạo rễthì bổ sung auxin

 Nuôi cấy mô phân sinh được sử dụng trong:

- Tạo cây sạch virus

- Nhân giống invitro.

- Tạo cây đa bội qua xử lý colchicin

- Nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan

2.1.2.4 Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn

Ưu điểm của nuôi cấy bao phấn là đơn giản về thao tác kỹ thuật và môi trườngnuôi cấy, nhưng có thể tạo ra cả cây lưỡng bội từ soma của thành bao phấn, do vậy sẽkhó phân biệt với cây tự lưỡng bội từ cây đơn bội

Hạt phấn nuôi cấy có thể phát triển thành cây đơn bội hoàn chỉnh trong điều

kiện nuôi cấy invitro bằng con đường tạo phôi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua tạo

mô sẹo và tạo cơ quan Phương pháp tạo cây đơn bội kép và phương pháp chọn lọctạo giống có hiệu quả chọn lọc rất cao, đặc biệt nếu được kết hợp với các phươngpháp tạo ra các biến dị di truyền khác nhau như lai hữu tính hoặc gây đột biến nhântạo

Thành phần môi trường nuôi cấy thay đổi tùy thuộc vào kiểu gen và tuổi củabao phấn cũng như các điều kiện mà ở đó cây cho bao phấn sinh trưởng Quá trìnhsinh trưởng về sau của phôi hạt phấn đòi hỏi bổ sung các muối khoáng vào môitrường Tần số phát sinh cây đơn bội và sinh trưởng của cây nói chung sẽ tốt hơn nếu

chúng được nuôi trong điều kiện chiếu sáng, mặc dù cây hạt phấn của một số kiểugen sinh trưởng trong cả hai điều kiện có chiếu sáng và trong tối.

 Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn được dùng cho tạo các dòng thuần để:

- Nghiên cứu gen lặn vì chúng không biểu hiện ở cơ thể dị hợp tử

- Chọn các dòng đột biến

2.1.2.5 Nuôi cấy tế bào đơn

Tế bào đơn có thể nhận được bằng con đường nghiền mô, hoặc xử lý enzyme.Sau đó chúng được nuôi cấy dịch lỏng, có khuấy hoặc lắc tạo điều kiện thuận lợi cho

sự trao đổi khí và tiếp xúc với môi trường dinh dưỡng Tế bào đơn được lọc và nuôicấy trong môi trường đặc biệt và tăng sinh khối

Mỗi loại cây, mỗi loại tế bào khác nhau đòi hỏi những kỹ thuật nuôi cấy khácnhau Yêu cầu dinh dưỡng cho nuôi cấy tế bào đơn khá phức tạp, do chúng bị mấtnhiều chất cần thiết cho sinh trưởng khi tách rời khỏi quần thể tế bào

 Nuôi cấy tế bào đơn được sử dụng cho các mục đích:

- Chọn dòng tế bào

- Nghiên cứu cấu trúc tế bào, phát triển và phân hóa tế bào trong những điềukiện khác nhau

- Thu nhận các chất trao đổi thứ cấp

2.1.2.6 Nuôi cấy protoplast

Tế bào trần là tế bào đã được tách bỏ thành tế bào bằng phương pháp cơ họchay sử dụng enzyme Trong điều kiện nuôi cấy phù hợp protoplast có thể tái sinhthành tế bào mới, phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh Ưu thế của kỹ thuậttách và nuôi cấy tế bào trần là tế bào không có màng cứng, ở trạng thái đơn bào, mật

độ tế bào thu được trên 1 đơn vị thể tích môi trường có thể rất cao (đạt 106 tế bào/1mlmôi trường)

 Ứng dụng nuôi cấy protopast:

- Tạo ra cây lai soma

- Chuyển các bào quan và chuyển gen Quá trình dung hợp protoplast có thểđược thực hiện trên hai đối tượng cùng loài hay khác loài

- Quá trình sinh tổng hợp màng tế bào.

2.1.3 Môi trường nuôi cấy

 Thành phần môi trường nuôi cấy gồm năm thành phần cơ bản sau:

- Muối khoáng đa lượng

- Muối khoáng vi lượng

- Vitamin

- Nguồn carbon

- Chất điều hòa sinh trưởng

- Ngoài ra có thể bổ sung các thành phần không xác định (nước dừa, dịch chiếtnấm men,…) và agar

 Môi trường nuôi cấy có thể chia thành ba loại:

- Môi trường nghèo dinh dưỡng: White, Knop

- Môi trường có hàm lượng chất dinh dưỡng trung bình: Gamborg

- Môi trường giàu dinh dưỡng: MS

Cơ sở cho việc xây dựng các môi trường nuôi cấy là xem xét các thành phầncần cho sự sinh trưởng và phát triển của cây

Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào và mô thực vật thay đổi tùy theo loài

và bộ phận nuôi cấy Đối với cùng một mẫu cấy nhưng tùy theo mục đích thí nghiệmthì thành phần môi trường cũng sẽ thay đổi tùy theo giai đoạn phân hóa của mẫu cấy

Tế bào mô thực vật đòi hỏi pH tối ưu cho sinh trưởng và phát triển trong nuôicấy Độ pH của môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng trực tiếp tới quá trình thu nhậncác chất dinh dưỡng từ môi trường vào tế bào Vì vậy cần điều chỉnh độ pH môitrường thích hợp trước khi nuôi cấy Thường sử dụng NaOH hay HCl loãng để điềuchỉnh độ pH

2.1.4 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật

2.1.4.1 Auxin

Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng rộng rãi trong nuôicấy mô thực vật IAA là auxin tự nhiên có trong mô thực vật, còn NAA, IBA, 2,4-D

là các auxin nhân tạo, thường các auxin nhân tạo có hoạt tính mạnh hơn

Chúng có mặt ở các bộ phận của cây như mô phân sinh đỉnh, các bộ phận nonkhác của cây

 Sự áp dụng loại và nồng độ auxin trong môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào:

- Kiểu tăng trưởng hoặc phát triển cần nghiên cứu

- Hàm lượng auxin nội sinh của mẫu cấy

- Khả năng tổng hợp auxin tự nhiên của mẫu cấy

- Sự tác động qua lại giữa auxin ngoại sinh và auxin nội sinh

- Đặc tính của auxin

 Vai trò của các chất thuộc nhóm auxin:

- Kích thích phân chia và kéo dài tế bào

- Chồi đỉnh cung cấp auxin gây ra ức chế sinh trưởng của chồi bên

- Kích thích sự phân hoá của các mô dẫn

- Ảnh hưởng khác nhau đối với sự rụng lá, quả, sự đậu quả, sự phát triển vàchín của quả, sự ra hoa trong mối quan hệ với điều kiện môi trường

- Tạo và nhân nhanh mô sẹo (callus)

- Kích thích tạo chồi bất định (ở nồng độ thấp)

- Tạo phôi soma (2,4-D)

2.1.4.2 Cytokinin

Các cytokinin là dẫn xuất của adenine Các cytokinin được sử dụng thườngxuyên nhất là BAP, Zeatin và 2-iP là các cytokinin tự nhiên, còn BA và kinetin là cáccytokinin nhân tạo Chúng được hòa tan trong NaOH hoặc HCl loãng

Tỷ lệ auxin/cytokinin rất quan trọng đối với sự phát sinh hình thái trong các

hệ thống nuôi cấy Đối với sự phát sinh phôi (embryogenesis), để tạo callus và rễ cần

có tỷ lệ auxin/ cytokinin cao, trong khi ở trường hợp ngược lại sẽ dẫn đến sự sinh sảnchồi và chồi nách

Cytokinin có mặt trong mô phân sinh đỉnh rễ, quả non

 Chức năng chủ yếu của các cytokinin:

- Kích thích phân chia tế bào

- Tạo và nhân callus

- Kích thích phát sinh chồi trong nuôi cấy mô

- Kích thích phát sinh chồi nách và kìm hãm ảnh hưởng ưu thế của chồi đỉnh

- Làm tăng diện tích phiến lá do kích thích sự lớn lên của tế bào

- Có thể làm tăng sự mở của khí khổng ở một số loài

- Tạo chồi bất định (ở nồng độ cao)

- Ức chế sự hình thành rễ

- Ức chế sự kéo dài chồi

- Ức chế quá trình già (hoá vàng và rụng) ở lá, kích thích tạo diệp lục

2.1.4.3 Gibberellin

Trong số hơn 20 chất thuộc nhóm gibberellin, GA3 là chất được sử dụngnhiều hơn cả trong thực tiễn GA3 kích thích kéo dài chồi và nảy mầm của phôi vôtính GA3 có tính hoà tan trong nước

Gibberellin được tạo ra trong đỉnh rễ, chồi, lá non, hạt

 Gibberellin có các chức năng cơ bản sau:

- Kích thích kéo dài chồi do tăng cường phân bào và kéo dài tế bào

- Phá ngủ hạt giống hoặc củ giống

- Kiểm soát sự ra hoa của các cây 2 năm tuổi

- Ức chế sự hình thành rễ bất định

- Kích thích sinh tổng hợp của α-amylase ở hạt cây ngũ cốc nảy mầm

- Các chất ức chế tổng hợp kích thích quá trình tạo củ (thân củ, thân hành vàcủ)

- Kích thích sự nảy mầm của phấn hoa và sinh trưởng của ống phấn

- Có thể gây tạo quả không hạt hoặc làm tăng kích thước quả nho không hạt

- Có thể làm chậm sự hoá già ở lá và quả cây có múi.

2.1.4.4 Abscisic acid (ABA)

Abscisic acid là một chất điều hòa sinh trưởng thực vật tự nhiên được tạo ratrực tiếp từ acid mevalonic hoặc do sự phân giải carotenoid

Chúng được tạo ra trong lá, quả, mũ rễ, hạt

 Các tác dụng cơ bản của ABA là:

- Kích thích sự rụng lá, hoa, quả ở hầu hết các cây trồng và gây ra sự nứt quả

- ABA thường được sản sinh khi có các yếu tố ức chế cây trồng như mất nước

 Các chức năng cơ bản của ethylene:

- Gây già hoá lá, kích thích sự rụng lá và quả

- Làm chín quả

- Sinh tổng hợp ethylene được tăng cường khi quả đang chín, cây đang bị úng,lão hoá, tổn thương cơ giới và bị nhiễm bệnh

- Điều khiển sự chín của một số loại quả

- Ethylene kìm hãm sự ra hoa của đa số cây Tuy vậy, sự ra hoa của xoài, dứa,một số cây cảnh lại được kích thích bởi ethylene

- Kích thích nở hoa, kích thích sự lão hoá của hoa và lá

2.1.5 Các nhân tố đảm bảo thành công trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.1.5.1 Đảm bảo điều kiện vô trùng

Môi trường nuôi cấy có chứa đường, muối khoáng, rất thích hợp cho cácloại nấm và vi khuẩn phát triển và với tốc độ phát triển nhanh hơn rất nhiều lần sovới tế bào thực vật.

- Dụng cụ thuỷ tinh: Rửa sạch, hấp trong nồi áp suất ở 121 oC/15 phút

- Nút đậy: Sử dụng nút cao su Nút được nhét bông gòn không thấmnước để bụi và không khí không được đi qua Sau đó đem đi hấp trong nồi hấp 121

- Vô trùng nơi thao tác và tủ cấy

- Môi trường: Môi trường thuờng được hấp khử trùng ở 121 oC, 1atmtrong 30 phút

Có một số chất trong môi trường nuôi cấy không bền nhiệt (vitamin, khángsinh, ), những chất này được lọc vô trùng sau đó được thêm vào môi trường sau khi

đã được hấp, làm nguội đến khi cầm trên tay được

2.1.5.2 Chọn đúng môi trường và chuẩn bị môi trường đúng cách

Tuỳ vào mục đích nuôi cấy, thu nhận sản phẩm Tuỳ thuộc vào từng loại nuôicấy sẽ có một môi trường tối ưu Thông thường ta phải trải qua quá trình thựcnghiệm, từ đó mới tìm một loại môi trường thích hợp cho từng mục đích

Môi trường để nuôi cấy mô và tế bào thực vật có chứa đường, muối khoáng,vitamin rất thích hợp cho các loại nấm và vi khuẩn phát triển Do tốc độ phân bàocủa nấm và vi khuẩn lớn hơn nhiều so với các tế bào thực vật, nếu trong môi trườngnuôi cấy bị nhiễm bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày sẽ phủ đầy vi khuẩnhoặc nấm, khi đó mô nuôi cấy sẽ chết dần thí nghiệm phải bỏ đi

Mức độ vô trùng trong thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật đòi hỏi rấtnghiêm ngặt, đặc biệt quan trọng trong nuôi cấy tế bào đơn trong các bioreactor.Nhiều loại protein, vitamin, amino axit, hormone, không bền nhiệt vì vậy nên dùngphin lọc micropore để khử trùng

 Có 3 nguồn nhiễm tạp chính:

- Dụng cụ thủy tinh, môi trường và nút đậy không được vô trùng tuyệt đối

- Trên bề mặt hoặc bên trong mô nuôi cấy

- Trong quá trình thao tác

Bảng 2.1: Thời gian tối thiểu để hấp khử trùng môi trường nuôi cấy mô ở

2.1.5.3 Chọn mô cấy và xử lý đúng cách

Tuỳ mục đích nuôi cấy để chọn loại mô cấy thích hợp Thông thường các môtrong cơ thể thực vật đều có thể dùng làm mô cấy, trừ những mô đã hoá gỗ Khi bắtđầu nghiên cứu nhân giống vô tính một cây nhất định thì trước tiên chú ý đến cácchồi nách và mô phân sinh ngọn

Nguồn lấy mẫu, vị trí lấy mẫu cấy từ cây mẹ là những yếu tố quan trọng trongviệc thiết lập quá trình nuôi cấy sạch Lấy mẫu vào mùa xuân khi cây đâm lộc, cácchồi mới nhú sạch hơn so với các chồi ngủ Cây trồng ngoài ruộng dễ bị nhiễm hơncây trồng trong nhà kính hoặc chậu trong phòng Các phần như rễ, củ hoặc gần nhưnằm trên mặt đất như thân bò, dạng củ, protocom của lan thì khó làm sạch hơn cácnguyên liệu thực vật khác

Có rất nhiều vi sinh vật bám trên bề mặt, trong các rảnh nhỏ hoặc giữa các lớpvảy chồi, mầm Để loại bỏ sự tạp nhiễm bề mặt, có thể rửa sơ bộ mô cấy với nước xàphòng để loại bỏ bụi, đất và làm tăng sự tiếp xúc với các chất khử trùng Để làm tăng

sự khử trùng có thể dùng chất hỗ trợ làm tăng sự tiếp xúc như Tween - 20, xà phòng.Thường dùng 1 - 3 giọt Tween cho 100 ml dung dịch nước khử trùng là tốt nhất.Ngoài ra để tăng sự tiếp xúc bằng cách lắc hoặc khuấy đều mẫu cấy trong lúc đangkhử trùng

 Qui trình khử trùng bề mặt:

- Rửa mẫu bằng chất tẩy nhẹ trước khi thao tác với dung dịnh khử trùng

- Rửa mẫu dưới vòi nước chảy từ 10-30 phút

- Nhúng ngập mẫu vào dung dịch khử trùng trong điều kiện vô trùng Đậy nắp

lọ rồi lắc nhẹ trong thời gian khử trùng

- Bỏ dung dịch khử trùng đi rồi rửa vài lần bằng nước cất vô trùng

Bảng 2.2: Nồng độ và thời gian sử dụng 1 số chất xử lí mô cấy thực vật:

2.2 Giới thiệu cây Sâm Ngọc Linh

2.2.1 Phân loại

 Lịch sử phân loại:

Việt Nam có nhiều cây thuốc được gọi là Sâm Nhưng chỉ có bốn loài Sâm

thuộc họ Nhân Sâm (Araliaceae) Chi Panax gần gũi với cây Nhân Sâm Panax gingseng C A Meyer là Sâm Ngọc Linh, Sâm Tam Thất, Sâm Nam và Sâm Vũ

Diệp, đều là các cây thuốc quý

Năm 1968, KS Vũ Đức Minh đã tìm thấy cây Sâm Ngọc Linh tại vùng núiNgọc Linh và tạm đặt tên nó là Sâm Khu 5 Năm 1973, đoàn điều tra cây thuốc của

Ban dân y Khu 5 do DS Đào Kim Long dẫn đầu đã phát hiện một loài Panax mọc

hoang thành quần thể ở độ cao 1.800 m trên vùng núi Ngọc Linh và tạm đặt tên là

Sâm Đốt Trúc với tên khoa học Panax articulatus, họ Nhân Sâm (Araliaceae) (Nguyễn Minh Đức, 2003) Tên khoa học của cây được công nhận là Panax vietnamensis Ha et Grush., họ Nhân Sâm Araliaceae, công bố tại Viện thực vật

Kamarov (Liên Xô trước đây) nǎm 1985 do Hà Thị Dung và I V Grushvistky đặttên (internet 4)

Hình 2.1: Sâm Ngọc Linh ngoài tự nhiên

- Loài: Panax vietnamensis Ha et Grush

- Tên khác: Sâm Việt Nam, Sâm Ngọc Linh, Sâm Khu Năm, Thuốc Dấu (XêĐăng)

- Tên nước ngoài: Vietnamese ginseng

sâm hoang dại rất phát triển có dạng con quay, hình trụ, có màu vàng nhạt mangnhiều rễ con với những vàm ngang Đối với sâm trồng, rễ củ rất phát triển, tăngtrưởng hàng năm rất rõ rệt, chúng có ba dạng chính: dạng củ cà rốt, dạng con quay vàdạng bó củ, đây là dạng rất phổ biến Sâm Ngọc Linh trồng thường cao đến 1 mmang nhiều lá kép có khi đến 7 lá chét to hơn bình thường.

Thân khí sinh mảnh, thẳng màu xanh hay hơi tím, mọc thẳng, mang 2 - 4 lákép chân vịt mọc vòng, mỗi lá kép có 5 lá chét hình trứng ngược hoặc hình mác, dài

10 - 14 cm, rộng 3 - 5 cm, gốc hình nêm, đầu thuôn dài thành mũi nhọn, mép khíarăng nhỏ

Hoa tự, cụm hoa mọc thành tán đơn ở ngọn thân, có cuống dài 10 - 20 cm cóthể kèm 1 - 4 tán phụ hay một hoa riêng lẻ ở phía dưới tán chính Hoa nhiều màu lụcvàng, hoa hình tán đơn mọc dưới các lá thẳng với thân Mỗi tán 60 - 100 hoa, cuốnghoa ngắn 1 - 1.5 cm, lá đài 5, cánh hoa 5, vàng nhạt, nhị 5, bầu 1 ô với 1 vòi nhụy.Đài có 5 răng dài, nhị 5, chỉ nhị hình sợi, bầu 1 ô với một vòi nhụy

Lá kép, chân vịt mọc vòng với 3-5 nhánh lá, cuống lá kép, mang 5 lá chét, láchét phiến bầu dục, mép khía răng cưa, chóp nhọn, có lông ở cả hai mặt

Quả hạch, hình trứng, khi chín có màu đỏ hay vàng nhạt, sau đen, hạt hìnhthận màu trắng, bề mặt hạt có nhiều chỗ lồi lõm, có vân, quả mọc tập trung ở trungtâm của tán lá, dài độ 0,8 - 1cm và rộng khoảng 0,5 - 0,6 cm, mỗi quả chứa một hạt,một số quả chứa 2 hạt và số quả trên cây bình quân khoảng 10 đến 30 quả

Mùa hoa: tháng 4 – tháng 6, mùa quả: tháng 7 – tháng 9

Hình 2.3: Cây Sâm Ngọc Linh

2.2.3 Sinh thái và phân bố

 Đặc điểm sinh thái:

Sâm Ngọc Linh là loại cây thân thảo ưa ẩm và ưa bóng, sinh trưởng ở độ cao

từ 1.200 – 2.100m so với mặt biển, mọc rải rác hay tập trung thành từng đám nhỏdưới tán rừng Môi trường rừng nơi có Sâm mọc luôn ẩm ướt, thường xuyên có mây

mù, nhiệt độ khoảng 15-18 0C, lượng mưa khoảng 3000 mm/ năm Đất rừng ở đâyđược tạo thành do lá cây mục lâu ngày, có màu nâu đen, tơi xốp, hàm lượng mùn cao

và chứa nhiều nước

Sâm Ngọc Linh sinh trưởng mạnh trong mùa xuân hè Mùa hoa quả từ tháng5- tháng 10, cây ra hoa quả tương đối đều hàng năm Sau khi quả chín rụng xuốngđất, tồn tại qua mùa đông khoảng 4 tháng và sẽ nảy mầm vào đầu mùa xuân năm sau,Sâm có khả năng tái sinh tự nhiên từ hạt khá tốt

Sâm có phần thân trên mặt đất lụi hàng năm, để lại các vết sẹo rõ Mỗi năm từđầu mầm thân rễ (kể cả phần thân rễ phân nhánh) chỉ mọc lên một thân mang lá Căn

cứ vào vết sẹo trên thân rễ để tính tuổi của Sâm

 Đặc điểm phân bố:

Trong số hơn mười loài và dưới loài đã biết của chi Nhân Sâm ( Panax), ở

Việt Nam có ba loài mọc tự nhiên và một loài là cây nhập trồng Sâm Ngọc Linhđược phát hiện sau cùng vào 1973 Đến 1985 nó mới được công bố là hoàn toàn mớiđối với khoa học Đến nay Sâm Ngọc Linh chỉ mới được phát hiện duy nhất ở vùngnúi Ngọc Linh thuộc hai tỉnh Quảng Nam và Kon Tum

Ngọc Linh là dãy núi cao thứ hai của Việt Nam, có tọa độ địa lý từ 107o50’ –

108o7’ kinh tuyến Đông và từ 15o0’ – 15o10’ vĩ tuyến Bắc, đỉnh cao nhất là NgọcLinh cao 2598 m Những điểm vốn trước đây có sâm Ngọc Linh mọc tự nhiên từ độcao khoảng 1500 m đến 2200 m, chủ yếu tập trung ở 1800 – 2000 m, thuộc địa bàncủa hai huyện Đăk Tô (tỉnh Kon Tum) và Trà My (tỉnh Quảng Nam) Về giới hạncũng như phân bố của loài sâm này ở núi Ngọc Linh hiện nay đã có nhiều thay đổi