Đồ án khảo sát khả năng nhiễm coliforms và e coli trong nước uống, nước uống có gas trên địa bàn quận bình thạnh, TP hồ chí minh

Mặc dù, việc kiểmđịnh chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm được các cơ quan chức năng thực hiệnthường xuyên nhưng vẫn không kiểm soát hết được những sản phẩm kém chấtlượng trôi nổi trên

Chương 1: GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Xã hội ngày càng phát triển, cuộc sống con người không ngừng cải thiện, tiệnnghi và đầy đủ hơn Con người không chỉ ăn no mặc ấm mà còn được ăn ngon mặcđẹp và quan trọng hơn hết sức khỏe con người được chăm sóc tốt và chu đáo Songsong những mặt tích cực nhận thấy được thì mặt trái của vấn đề cũng rất đáng quantâm, đặc biệt trong lĩnh vực ăn uống, vệ sinh an toàn thực phẩm

Các loại thực phẩm, đồ uống ngày nay rất phong phú về chủng loại, màu sắc,thành phần và giá cả cũng như giá trị dinh dưỡng Bên cạnh những sản phẩm chấtlượng, uy tín tồn tại không ít các sản phẩm có chất lượng kém Mặc dù, việc kiểmđịnh chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm được các cơ quan chức năng thực hiệnthường xuyên nhưng vẫn không kiểm soát hết được những sản phẩm kém chấtlượng trôi nổi trên thị trường Do đó, người tiêu dùng sử dụng những sản phẩm này

sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe

Khả năng nhiễm đối với các loại sản phẩm đồ uống thuộc các thương hiệu nổitiếng: Pepsi, Lavie, Coca Cola… tuy thấp nhưng không phải không có Còn đối vớicác loại nước uống không đóng chai như nước mía, nước sâm, nước đậu nành…được bày bán khắp đường phố thì nguy cơ tiềm ẩn mầm bệnh rất cao Do nhu cầuthị hiếu người tiêu dùng “ngon, bổ, rẻ” nên quy trình chế biến những sản phẩm nàyrất “đơn giản” là đã có được một ly nước mát Chính vì thế, các bệnh liên quan tới

ăn uống như rối loạn đường tiêu hóa, hô hấp, tiêu chảy… không ngừng phát triểnthậm chí thành dịch ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe con người Mà điển hìnhtrong những loại vi sinh vật gây hại cho sức khỏe con người có nhiều trong thực

phẩm, đồ uống phải kể tới đó là Coliforms và E.coli.

Từ thực tiễn nêu trên và được sự đồng ý của khoa Môi Trường và Công Nghệ

Sinh Học, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Khảo sát khả năng nhiễm

Coliforms và E.coli trong nước uống, nước uống có gas trên địa bàn quận

Bình Thạnh, TP Hồ Chí Minh” Đề tài này được thực hiện tại phòng Thí nghiệm

Vi sinh, Khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại học Kỹ ThuậtCông Nghệ TP.HCM

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Khảo sát tỷ lệ nhiễm Coliforms và E.coli trong các loại nước uống, nước uống

có gas trên địa bàn quận Bình Thạnh góp phần đánh giá mức độ an toàn của nhữngsản phẩm đồ uống đang lưu hành trên thị trường

1.3 Nội dung nghiên cứu

Đánh giá tỷ lệ nhiễm Coliforms trong các sản phẩm nước uống

Đánh giá tỷ lệ nhiễm E.coli trong các sản phẩm nước uống.

1.4 Phạm vi nghiên cứu

Đề tài thực hiện thông qua việc khảo sát giới hạn định lượng, khảo sát mật độ

nhiễm và đánh giá tình hình nhiễm Coliforms và E.coli của một số mẫu nước uống

trên địa bàn quận Bình Thạnh

MỤC LỤC

Trang

Nhiệm vụ đồ án tốt nghiệp i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh sách các chữ viết tắt vii

Danh sách các bảng ix

Danh sách các hình x

Chương 1: GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.3 Nội dung nghiên cứu 2

1.4 Phạm vi nghiên cứu 2

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan về nước giải khát 3

2.1.1 Khái niệm 3

2.1.2 Lịch sử hình thành và phát triển 3

2.1.3 Dinh dưỡng trong nước giải khát 4

2.1.4 Tình hình sản xuất và thị trường nước giải khát trên thế giới và Việt Nam hiện nay 4

2.1.5 Mức độ vệ sinh an toàn của nước giải khát hiện nay 6

2.2 Một số vi sinh vật liên quan đến vệ sinh an toàn thực phẩm 8

2.2.1 Coliforms 8

2.2.2 E.coli 10

2.3 Một số phương pháp định lượng vi sinh vật trong nước 20

2.3.1 Phương pháp đổ đĩa 20

2.3.2 Phương pháp màng lọc 23

2.3.3 Phương pháp MPN (Most Probable Number) 24

Chương 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

3.1 Địa điểm và thời gian 27

3.1.1 Địa điểm 27

3.1.2 Thời gian 27

3.2 Vật liệu 27

3.2.1 Mẫu 27

3.2.2 Hóa chất và môi trường 27

3.2.3 Dụng cụ và thiết bị 28

3.3 Bố trí thí nghiệm 29

3.3.1 Thu mẫu 29

3.3.2 Thí nghiệm 29

3.4 Phương pháp nghiên cứu 29

3.4.1 Định lượng Coliforms và E.coli bằng phương pháp MPN (Most Probable Number) 30

3.4.2 Xử lý số liệu 32

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

4.1 Đánh giá cảm quan các mẫu nước 36

4.1.1 Các mẫu nước không đóng chai 36

4.1.2 Các mẫu nước đóng chai 37

4.2 Đánh giá mức độ nhiễm Coliforms và E.coli trong các mẫu nước không đóng chai 40

4.2.1 Đánh giá mức độ nhiễm Coliforms trong các mẫu nước không đóng chai 40

4.2.2 Đánh giá mức độ nhiễm E.coli trong các mẫu nước không đóng

chai 41

4.3 Đánh giá mức độ nhiễm Coliforms và E.coli trong các mẫu nước đóng chai 42

Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 45

5.1 Kết luận 45

5.2 Đề nghị 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO 46

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về nước giải khát

Theo dòng lịch sử, loại nước giải khát không gas (không CO2) đầu tiên xuấthiện vào thế kỷ 17 với thành phần pha chế gồm nước lọc, chanh và một chút mậtong Năm 1676, Công ty Compagnie de Limonadiers tại Paris (Pháp) độc quyềnbán các loại nước chanh giải khát Đến năm 1767, Tiến sĩ Joseph Priestley – mộtnhà hóa học người Anh – đã pha chế thành công loại nước giải khát có ga Ba năm

sau, nhà hóa học Thụy Điển Torbern Bergman phát minh loại máy có thể chế tạonước có ga từ đá vôi bằng cách sử dụng acid sulfuric Máy của Bergman cho phépsản xuất loại nước khoáng nhân tạo với số lượng lớn Năm 1810, bằng sáng chế Mỹđầu tiên dành cho các loại máy sản xuất hàng loạt nước khoáng nhân tạo được traocho Simons và Rundell ở Charleston thuộc Nam Carolina (Mỹ) Tuy nhiên, mãiđến năm 1832 loại nước khoáng có gas mới trở nên phổ biến nhờ sự ra đời hàngloạt của loại máy sản xuất nước có gas trên thị trường

John Mathews – cha đẻ nước giải khát Mỹ là người tiên phong trong lĩnh vựckinh doanh nước giải khát ở Mỹ, ông nhập cư vào Mỹ từ năm 1832, trước đó ông làngười đi đầu trong ngành kinh doanh nước giải khát tại Anh Mathews đã học một

số nguyên lý cơ bản về pha chế khí cacbonic và máy tạo gas từ Joseph Bramah(nhà phát minh máy nén thủy lực từ thế kỷ thứ 18) Mathews định cư hẳn tại Mỹ vàbắt đầu cung cấp nước giải khát có gas cho các cơ sở giải khát ở khu vực NewYork – thời gian này thường phổ biến loại thức uống ướp lạnh nhưng không cóhương vị Nhờ tay nghề cao của Mathews, ngành công nghiệp nước giải khát Mỹphát triển nhanh chóng

Những thập niên sau đó – kể từ 1852, với việc nước gừng được tung ra thịtrường, các sản phẩm có thương hiệu đã xuất hiện và được cấp quyền kinh doanh.Bắt đầu từ những năm 1880, thị trường nước giải khát tràn ngập các loại nước uống

có nhãn hiệu như Coca – Cola (1886), Moxie (1885), Dr.Pepper (1885), Pepsi –

Cola (1898) (Theo inventors.com)

2.1.3 Dinh dưỡng trong nước giải khát

Đối với các loại nước đóng chai không có gas chẳng hạn nước khoáng tựnhiên lấy từ mạch nước ngầm sâu, đó là các dung dịch muối có chứa nhiều chấtkhoáng Các loại nước khoáng tự nhiên có tính phóng xạ thường dùng để chữabệnh, giải khát Nước khoáng nhân tạo được sản xuất bằng cách bão hòa nước ăn

với khí CO2 và một số muối khoáng Bên cạnh đó, loại nước giải khát bằng hoa quả

tự nhiên như nước chanh, cam, dưa hấu, dứa, bưởi …phải chứa ít nhất từ 15 – 20%dịch quả tự nhiên, thêm đó là năng lượng, các vitamin, khoáng chất…tốt cho sứckhỏe Ngoài ra, các loại nước bằng hoa quả hay nước giải khát có gas, có chất màu

và khí CO2 hòa tan trong nước như Pepsi, Coca Cola…(Theo vneconomy.vn)

2.1.4 Tình hình sản xuất và thị trường nước giải khát trên thế giới và Việt Namhiện nay

2.1.4.1 Tình hình sản xuất và thị trường nước giải khát trên thế giới

Ngành công nghiệp nước giải khát thế giới đã hình thành và phát triển từ rấtlâu nhưng chỉ bùng nổ thực sự từ thế chiến thứ hai và kéo dài tới ngày nay mà điểnhình nhất đó là hai đại gia Coca Cola và Pepsi

Tiêu thụ toàn cầu vượt quá 327 tỷ lít mỗi năm, Trong đó Châu Âu, Bắc Mỹ,Nhật là những thị trường lớn nhất của ngành công nghiệp này

Do không ngừng mở rộng thị trường nên hai ông lớn này chi phối cổ phần thịtrường thế giới là tất nhiên Coca Cola nắm khoảng ½ thị phần thế giới và bán 4loại nước giải khát hàng đầu Doanh thu bán hàng trong năm 2006 đạt 241 tỷ USD,lợi nhuận đạt 20% và có hơn 400 dự án đang triển khai

Xếp thứ 2 và thứ 3 thế giới trong ngành giải khát phải kể tới đó là Pepsi vàCadbury Schweppes kiểm soát hầu hết thị phần còn lại Doanh thu đạt hơn 129 tỷUSD Một số sản phẩm của Pepsi như: Pepsi, Diet Pepsi, Slice, Moutain Dew vàRoot Beer Mug Một số sản phẩm của Cadbury Schweppes gồm: La Casere, Trina,Spring Vallye và Ware

Ngoài ra trong năm 1898, Pepsi – Cola được thành lập ở New Bern, Bắc Carolina, bởi Caleb Bradham DPepsiCo Inc nắm giữ khoảng một phần ba của thị

trường Hoa Kỳ (Theo inventors.com)

2.1.4.2 Tình hình sản xuất và thị trường nước giải khát tại Việt Nam

Việt Nam là một trong những thị trường tiêu thụ nước giải khát không cồn cótốc độ tăng trưởng nhanh nhất thế giới Đó là nhận định của GS Phạm Song, Chủtịch Tổng hội Y học Việt Nam GS cũng cho biết thêm, trung bình mỗi năm, mộtngười Việt Nam mới chỉ uống khoảng 3 lít nước giải khát đóng chai không cồn,trong khi mức bình quân của người Philippines là 50 lít/năm Theo dự báo đến năm

2012, tổng lượng đồ uống bán lẻ ở Việt Nam sẽ tăng gần 50% so với năm 2007.Mức tăng trưởng này cũng chưa thể đáp ứng nhu cầu còn quá lớn trong thời điểmhiện nay Ông Nguyễn Thanh Phong, Cục phó Cục An toàn Vệ sinh Thực phẩm(Bộ Y tế) cho biết, miếng bánh của thị trường nước giải khát Việt Nam còn khá

nhiều đối với doanh nghiệp trong nước (Nguyễn Thị Tuyết (2008), Giáo trình

Thương phẩm hàng thực phẩm và đồ uống).

Hiện nay, đa số người tiêu dùng đều hướng tới nhu cầu sử dụng những thựcphẩm từ tự nhiên Những sản phẩm này không chỉ có lợi cho sức khỏe mà còn thânthiện với môi trường Nhiều doanh nghiệp Việt Nam sản xuất nước giải khát đangtriển khai những sản phẩm với thành phần tự nhiên, đảm bảo vệ sinh an toàn thựcphẩm, đáp ứng nhu cầu thực tế của người dân trong nước

Trước sự thay đổi thị hiếu của thị trường, các doanh nghiệp sản xuất nước giảikhát đã lập tức thay đổi cơ cấu sản xuất, đầu tư dây chuyền sản xuất ngày càng hiệnđại, đồng thời nghiên cứu và cho ra đời những sản phẩm với hương vị mới Các đạigia: Vinamilk, Tribeco, Wonderfarm, Number One… đã tung ra thị trường nhiềuloại nước trái cây: táo, xoài, nho, mãng cầu, trà xanh, trà thảo mộc không đườngdành cho người mắc bệnh tiểu đường hay không thích thức uống có đường để đápứng nhu cầu khách hàng Hiện các doanh nghiệp kinh doanh nước giải khát đã tăngsản lượng vượt mức so với năm ngoái: Vinamilk tăng 30% sản lượng nước trái câynhãn hiệu Fresh, Pepsi tăng 30% sản lượng nước giải khát không gas Các nhànhập khẩu cũng làm đa dạng thêm thị trường bằng những mặt hàng cùng loại có

thương hiệu: Ligo, Welch"s, Regain, Berri, Drwitt Công ty Delta cũng khẳngđịnh sẽ sản xuất nhiều sản phẩm nước trái cây, đặc biệt là các loại sử dụng nguyên

liệu có tác dụng thanh nhiệt: atisô, mía lau, sâm, bí đao (Lê Văn Nam (2007), Thị

trường đồ uống).

2.1.5 Mức độ vệ sinh an toàn của nước giải khát hiện nay

Theo ông Nguyễn Thanh Phong cho biết, miếng bánh của thị trường nước giảikhát Việt Nam còn khá nhiều đối với doanh nghiệp trong nước Tuy nhiên, theoông Phong, không vì thế mà doanh nghiệp Việt Nam lơ là việc nâng cao chấtlượng, nhằm đem đến những sản phẩm tốt nhất cho người tiêu dùng Sự cạnh tranhtrên thị trường đồ uống ngày càng trở nên khốc liệt, đòi hỏi doanh nghiệp khôngngừng đẩy mạnh nghiên cứu, nhằm đưa ra những sản phẩm mới có chất lượng cao.Chính vì thế, ngày càng nhiều các cơ sở sản xuất, các doanh nghiệp nước giải khátmọc lên Bên cạnh những đại gia: Vinamilk, Pepsi, Tribeco, Coca Cola…luôn luôntung ra thị trường những sản phẩm mới cạnh tranh, hạ giá thành, đáp ứng nhu cầukhách hàng Tuy nhiên, không ít sản phẩm có giá cạnh tranh nhưng chất lượng

“trời ơi”

Đầu tháng 05/2010, một sản phẩm nổi tiếng nước khoáng Joy của công tyTNHH Coca Cola Việt Nam đã xuất hiện nhiều mảng rêu màu xanh đen bằng đầungón tay út Qua xác nhận của công ty cho thấy sản phẩm bị nhiễm mốc

Đến giữa tháng 05/2010, xuất hiện một mùi lạ trong nước uống Vĩnh Hảo,một thương hiệu uy tín Đại diện công ty, sau khi lấy mẫu nước về phân tích xácnhận, đó là mùi hôi thối từ xác chết chuột

Và cũng gần đây ngày 20/05/2010, theo kết quả nghiên cứu Bang Virginia(Mỹ) đăng trên tạp chí Quốc tế Food Microbiology, 48% thức uống từ chiếc máy

bán nước giải khát có chứa Coliforms và 11% chứa E.coli (có thể gây bệnh tiêu

chảy, nhiễm trùng đường tiểu, bệnh về hô hấp và viêm phổi…) Điều đó cho thấykhả năng thức uống này đã bị làm nhiễm bẩn.

Những trường hợp nêu trên đều thuộc các thương hiệu nổi tiếng, thế cònnhững sản phẩm bán rong ngoài đường phố thì sao?

Các sản phẩm nước uống đường phố hiện nay bày bán tràn lan mà khôngđược kiểm soát Các đợt thanh tra về loại nước uống đường phố cho thấy đa số cácloại nước uống này bị nhiễm khuẩn rất cao, không đảm bảo vệ sinh an toàn thựcphẩm Theo kết quả khảo sát 50 mẫu thực phẩm giải khát (tháng 07/2003) của Viện

Y tế vệ sinh công cộng thành phố Hồ Chí Minh cho thấy: 75% mẫu sữa, 55% mẫunước giải khát trái cây tươi không đạt tiêu chuẩn vi sinh vì trong đó có nhiều loại vi

khuẩn như: C.perringens, Coliforms, E.coli, S.faecalis, Staphylococcus aureus,

P.aeruginosa vượt quá tiêu chuẩn cho phép nhiều lần

Trong số mặt hàng sử dụng nước đá có 93% sử dụng đá cây là loại đá chưađược kiểm soát nguồn nước xem có đạt tiêu chuẩn vệ sinh hay không Hơn 47%điểm bán thức ăn, nước uống đường phố không che đậy, 27% điểm bán có thừađược sử dụng lại để bán tiếp cho ngày hôm sau Kết quả cho biết: 29% khách hàngkhi được hỏi đã bị đau bụng, ói mửa hoặc tiêu chảy sau khi ăn hay uống loại thức

ăn đồ uống đường phố này và tỷ lệ nhập viện vì ngộ độ là 3,5%

Cũng trong một lần khảo sát mới đây của Viện Y tế thành phố Hồ Chí Minhtrên 400 người mua, 400 người bán thức ăn, đồ uống đường phố cho thấy: 85,7% làbán cố định trên vỉa hè, lề đường, 29% điểm bán gần các khu cống, rãnh, bãi rác

hoặc nhà vệ sinh (Viện Y tế thành phố Hồ Chí Minh (7/2009), Báo cáo An toàn vệ

sinh thực phẩm TP Hồ Chí Minh).

2.2 Một số vi sinh vật liên quan đến vệ sinh an toàn thực phẩm

2.2.1 Coliforms

2.2.1.1 Khái niệm

Coliforms và Feacal coliforms (Coliforms phân) là nhóm các vi sinh vật dùng

để chỉ thị khả năng có sự hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm.Hay nói cách khác Coliforms có nghĩa là các vi khuẩn có khả năng lên men sinhhơi trong khoảng 48 giờ khi được ủ ở 370C trong môi trường canh Brilliant GreenLactose Bile Salt (BGBL)

Coliforms không có nguồn gốc từ phân, chúng có nguồn gốc từ thủy sinh hay

từ đất, mọc nhanh ở 40C trong 3 – 4 ngày và trong 100C trong 1 ngày Không mọc ở

410C, 440C ức chế hoàn toàn

2.2.1.3 Đặc điểm

a Đặc điểm chung

Coliforms là nhóm những trực khuẩn đường ruột gram âm, không sinh bào tử,

kỵ khí tùy nghi, có khả năng sinh acid, sinh hơi do lên men lactose ở 370C trong 24– 48 giờ

b Đặc điểm sinh hóa

Coliforms có khả năng lên men sinh hơi trong môi trường canh BGBL.Coliforms chịu nhiệt là những Coliforms có khả năng lên men lactose sinh hơi

trong môi trường canh EC Coliforms phân (Feacal Coliforms hay E.coli giả định)

là Coliforms chịu nhiệt có khả năng sinh Indol trong canh trypton E.coli chính là

Coliforms phân cho kết quả thử nghiệm IMViC + + - - (Indol +, Methyl Red +,Voges – Proskauer -, Citrate -)

Tính chất sinh hóa đặc trưng của nhóm Coliforms được thể hiện qua các thửnghiệm IMViC

Bảng 2.1: Tính chất sinh hóa của Coliforms

Escherichia Citrobacter Klebsilla Enterobacter

+(-) -(+) -(+) -(+)

+ + - -

- + +

+ + +

-Ghi chú: + phản ứng dương tính, - phản ứng âm tính, +(-): đa số là phản ứng dương tính và

-(+): đa số là phản ứng âm tính.

c Đặc điểm nuôi cấy

Coliforms có khả năng lên men sinh hơi trong khoảng 48 giờ khi được ủ ở

370C trong môi trường canh BGBL Coliforms chịu nhiệt là những Coliforms cókhả năng lên men lactose sinh hơi trong khoảng 24 giờ khi được ủ ở 440C trong

môi trường canh EC Coliforms phân (Feacal Coliforms hay E.coli giả định) là

Coliforms chịu nhiệt có khả năng sinh Indol khi được ở 44,50C khoảng 24 giờ trongcanh trypton Coliforms phân được dùng để chỉ thị mức độ vệ sinh trong quá trình

chế biến, bảo quản… E.coli chính là Coliforms phân cho kết quả thử nghiệm

IMViC + + - - (Indol +, Methyl Red +, Voges – Proskauer -, Citrate -)

2.2.1.4 Vai trò của Coliforms trong thực phẩm

Nhóm Coliforms hiện diện rộng rãi trong tự nhiên, trong ruột người và độngvật Coliforms được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị: số lượng hiện diện của chúngtrong thực phẩm, nước hay các loại mẫu môi trường được dùng để chỉ thị khả nănghiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng khi sốColiforms của thực phẩm cao thì khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnhkhác cũng cao Tuy nhiên, mối liên hệ giữa vi sinh vật gây bệnh và vi sinh vật chỉthị này vẫn còn nhiều tranh cãi.

2.2.2 E.coli

2.2.2.1 Khái niệm

Escherichia coli (E.coli) là vi sinh vật hiếu khí tùy nghi hiện diện trong đường

ruột của người và các loại động vật máu nóng, ở phần cuối của ruột non và ruột già

Hầu hết các dòng E.coli không gây hại và đóng vai trò quan trọng trong việc ổn

định sinh lý đường ruột Tuy nhiên, có 5 dòng có thể gây bệnh cho người chẳnghạn rối loạn đường tiêu hóa và một số loài động vật

Chúng hiện diện rộng rãi trong môi trường bị ô nhiễm phân hay chất thải hữu

cơ, phát triển và tồn tại rất lâu trong môi trường E.coli dễ dàng nhiễm vào thực

phẩm từ nguyên liệu hay thông qua nguồn nước trong quá trình sản xuất, chế biến 2.2.2.2 Phân loại

Dựa vào đặc điểm gây bệnh gồm các đặc tính độc lực, sự tác động khác nhaulên màng nhày ruột, hội chứng lâm sàng của bệnh và sự khác nhau về mặt dịch tễ

của bệnh E.coli được chia thành 5 nhóm:

 VTEC (Verotoxigenic E.coli) hoặc STEC (Shiga toxin – producing E.coli)

và EHEC (Enterohaemorrhagic E.coli), E.coli gây xuất huyết ở ruột.

 EPEC (Enteropathogenic E.coli), E.coli gây bệnh đường ruột.

 ETEC (Enterotoxigenic E.coli), E.coli sinh độc tố ruột.

 EAGGEC hay EAEC (Enteroaggregative E.coli), E.coli kết tập ở ruột.

 EIEC (Enteroinvasive E.coli), E.coli xâm lấn niêm mạc ruột.

2.2.2.3 Đặc điểm

a Đặc điểm chung

E.coli là trực khuẩn Gram âm, hình que ngắn, kích thước trung bình từ 0,5 x 1

– 3µm hai đầu tròn, di động bằng tiên mao quanh tế bào, đứng riêng lẻ, đôi khi xếpthành chuỗi ngắn, không tạo bào tử, loại có độc lực thì có vỏ bao capsule, loạikhông có động lực thì không có vỏ bao capsule

Theo hệ thống phân loại của Bergey, vi khuẩn Escherichia coli (E.coli) thuộc:

 Lớp: Schgzomycetes

 Bộ: Eubacteriales

 Họ: Enterobacteriaceae

 Gống: Escherichia

 Loài: Eschierchia Coli

Hình 2.1: Vi khuẩn Escherichia E.coli

Escherichia coli còn có tên là Bacteriam colic được ông Theodor Eschrich

nhà nghiên cứu người Đức phát hiện và phân lập năm 1885 trong trường hợp tiêuchảy ở trẻ em

b Đặc điểm sinh hóa

E.coli lên men sinh hơi lactose, glucose, manitol, galactose, không sinh hơi

đường maltose, lên men không đều saccarose, không lên men dextrin, glycogen

E.coli không sinh H2S, không tan chảy gelatin, không phân hủy đạm, hoànnguyên nitrate thành nitrite.

Phân biệt E.coli với các vi khuẩn đường ruột khác thông qua thử nghiệm

IMViC: + + - -; phản ứng Indol dương tính (+), phản ứng Methyl Red (MR) dươngtính (+), phản ứng Voges – Proskauer (VP) âm tính (-) và Citrate âm tính (-)

c Đặc điểm nuôi cấy

E.coli là loại hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi Nhiệt độ thích hợp cho sự phát

triển từ 35 – 370C, nhưng có thể phát triển trên 400C, pH thích hợp 6,4 – 7,5 nhưng

pH tối ưu nhất từ 7,2 – 7,4

 Trên môi trường thạch dinh dưỡng (NA) tạo khuẩn lạc tròn ướt (dạng S)sau 24 giờ, màu trắng đục hơi lồi, kích thước khoảng 2 – 3mm, để lâu có dạng khôrìa hơi nhăn (dạng R)

 Trên thạch máu có chủng dung huyết α hoặc β

 Trên môi trường chẩn đoán chuyên biệt EMB (Eozin Methylen Blue) tạokhuẩn lạc có ánh kim tím

 Trên môi trường Rapid có khuẩn lạc màu tím

 Trên môi trường MacConkey (MCK) khuẩn lạc màu hồng đỏ

 Trên thạch Gelatin không tan chảy

 Trên môi trường thạch nghiêng Triple Sugar Iron Agar: E.coli tạo

 Trên môi trường canh dinh dưỡng: sau 4 – 5giờ E.coli làm đục nhẹ môi

trường, để càng lâu càng đục, sau lắng xuống đáy có màu tro nhạt hay xám, sinh

H2S có mùi hôi thối, sau vài ngày có thể có váng mỏng nổi trên mặt môi trường 2.2.2.4 Kháng nguyên

E.coli có cấu trúc kháng nguyên rất phức tạp Năm 1947 Kauffmann đưa ra hệ

thống phân nhóm huyết thanh (serotype) dựa vào việc xác định kháng nguyên bềmặt O, H, K

a Kháng nguyên thân O (somatic antigen): có bản chất là lipopolysaccharidecủa màng ngoài tế bào, bền với nhiệt và cồn Khi đung nóng ở 1000C trong 2 giờvẫn giữ được tính kháng nguyên, kháng cồn không bị hủy khi tiếp xúc với cồn50%, bị hủy bởi formol 5%, rất độc chỉ cần 0,05mg đủ giết chết chuột nhắt sau 24giờ Kháng nguyên O có thể phát hiện được bằng phản ứng ngưng kết Khángnguyên O giữ vai trò nhất định đối với khả năng gây bệnh của dòng vi khuẩn và cótính chất chuyên biệt cho từng loài vật chủ Kháng nguyên O tạo nền tảng cho việc

phân loại serogroup của E.coli Có hơn 170 serogroup kháng nguyên O và được

chia làm 4 nhóm chính OI, OII, OIII, OIV Trong mỗi serogroup có một hay nhiềuserotype, kháng nguyên O bám vào nhung mao ruột làm giảm sự hấp thụ

b Kháng nguyên lông H (flagellar antigen): có bản chất là protein, tạo nênkhả năng di động của E.coli, kém chịu nhiệt, bị hủy bởi cồn 50% và các proteinase,không bị hủy bởi formol 5% , có khoảng 50 type kháng nguyên H

c Kháng nguyên giáp mô K (capsular antigen): kháng nguyên K lúc đầu đượcxác định bằng phản ứng ngưng kết Người ta xác định có sự hiện diện của khángnguyên K ở vi khuẩn nếu vi khuẩn chỉ ngưng kết với kháng nguyên huyết thanh Okhi bị đun nóng Dựa vào khả năng chịu nhiệt người ta chia kháng nguyên K thành

3 type là A, L và B Về sau người ta phân loại kháng nguyên K dựa vào thành phầnhóa học của chúng và đã có hơn 80 loại kháng nguyên K được xác định

Hình 2.2: Vị trí các loại kháng nguyên trên E.coli

2.2.2.5 Độc tố

a Khả năng gây bệnh của STEC

STEC sản xuất độc tố Shiga toxin (Stx) Họ độc tố Stx gồm 2 nhóm chínhkhông phản ứng chéo với nhau là Stx1 và Stx2, Stx1 có tính bảo tồn cao, trong khi

đó Stx2 rất thay đổi về trình tự Một dòng STEC có thể sản sinh Stx1 hay Stx2hoặc cả Stx1 và Stx2, thậm chí nhiều dạng của Stx2

Cả hai độc tố Stx1 và Stx2 đều được cấu tạo từ 5 tiểu đơn vị B 7,7kDa và 1tiểu đơn vị A 32kDa Tiểu đơn vị A gồm peptide A1 28kDa và peptide A2 4kDanối với nhau bằng cầu disulfur Peptide A1 có hoạt tính enzyme và peptide A2 cónhiệm vụ gắn tiểu đơn vị A vào những tiểu đơn vị B Những tiểu đơn vị B giúp độc

tố kết hợp với receptor đặc hiệu Gb3 (globotriaosylceramide) hiện diện trên bề mặtcủa những tế bào eukaryote (Stx2e có receptor là Gb4) Sau khi được chuyển vàobên trong tế bào tiểu đơn vị A đến tế bào chất và tác động lên tiểu phần 60S củaribosome Peptide A1 có hoạt tính enzyme hoạt động như một N – glycosidase cắtmột gốc adenine khỏi rRNA 28S của ribosome, do đó gây trở ngại cho tổng hợpribosome Do không tổng hợp được protein, những tế bào bị Stx tác động (tế bào

nội mô của thận, tế bào biểu mô ruột, tế bào Vero, tế bào Hela hay bất cứ tế bàonào có receptor là Gb3, receptor Gb4 đối với Stx2e) sẽ chết Hậu quả gây độc cho

tế bào ruột do Stx và các yếu tố độc lực khác của STEC là gây sự hư hại những tếbào nhung mao ruột, gây tiêu chảy và viêm kết màng xuất huyết (haemorrhagiccolits – HC) Sự hư hại những tế bào thành mạch máu do Stx2 gây ra sẽ dấn đếnhiện tượng phù thủng Những tổn thương ở tế bào nội mô thận gây nên hội chứnghuyết niệu (haemolytic uraemic syndrome) – HUS) ở người

b Khả năng gây bệnh của EPEC

EPEC là nhóm E.coli gây tiêu chảy quan trọng có liên quan đến tiêu chảy ở

trẻ sơ sinh tại những nước đang phát triển

Dấu hiệu của sự nhiễm bệnh do EPEC là hình thành bệnh tích kiểu A/E, cóthể quan sát được trên mẫu sinh thiết ruột từ những bệnh nhân hay những thúnhiễm bệnh và trong nuôi cấy tế bào Kiểu hình riêng biệt này được đặc trưng bởi

sự hư hại của các vi nhung mao và sự dính kết chặt giữa vi khuẩn và màng tế bàobiểu mô Moon và ctv (1983) báo cáo rằng kiểu tổn thương này liên quan rộng rãiđến EPEC thì thuật ngữ “ngắn kết và gây hư hại” (“attaching và effacing” – A/E)mới được đưa ra Gen cần thiết cho việc tạo ra tổn thương A/E là gen eae mã hóaprotein intimin Protein này là yếu tố độc lực cần thiết của EPEC

Đáp ứng viêm tại chỗ và sự tăng tính thấm của ruột trong đáp ứng với EPECgóp phần vào tiêu chảy Điểm đáng lưu ý nhất về mặt dịch tễ học của bệnh doEPEC về sự phân bố về lứa tuổi của người bệnh Bệnh chủ yếu xảy ra tên trẻ emdưới 2 tuổi Bệnh thường biểu hiện cấp tính với tiêu chảy nghiêm trọng Lý do liênquan đến khả năng đề kháng được với người trưởng thành và trẻ em lớn còn chưađược biết rõ nhưng có lẽ là do mất các receptor đặc hiệu Tuy nhiên EPEC cũng cóthể gây tiêu chảy ở người lớn nếu số lượng vi khuẩn đủ lớn

c Khả năng gây bệnh của Enterotoxigenic E.coli (ETEC)

Nhóm ETEC gồm có hai nhóm quyết định độc lực chính là độc tố ruột(Enterotoxin) và yếu tố định vị (colonization facter – CF).

thông qua việc tiết độc tố đường ruột ST và LT E.coli, nhóm này có thể chỉ tiết

độc tố ST hay LT hoặc cả hai

 Độc tố không chịu nhiệt (heat – labile toxin – LT): độc tố LT của

E.coli là oligopeptide gồm có hai serogroup chính là LT – I và LT – II, chúng

không có phản ứng chéo về mặt miễn dịch

LT – I được tiết bởi những dòng E.coli gây bệnh trên người và thú, còn LT –

II được tìm thấy chủ yếu ở E.coli trên thú và hiếm khi ở người.

LT – I là một oligopeptide khoảng 86kDa, được cấu tạo bởi 1 tiểu đơn vị A28kDa và 5 tiểu đơn vị B 11,5kDa Tiểu đơn vị A chịu trách nhiệm trong hoạt tínhenzyme của độc tố gồm peptide A1 và peptide A2 liên kết với nhau bởi cầu nốidisulfur Những tiểu đơn vị B sắp xếp thành vòng nhẫn, liên kiết chắc chắn vớiganglioside GM1 và liên kết lỏng lẻo với GD1b và vài glycoprotein ruột – chúng làcác receptor của LT Gen mã hóa cho LT là elt hay LT – I nằm trên plasmid màplasmid này có thể chứa cả gen mã hóa ST và hoặc cả gen mã hóa kháng nguyênchứa yếu tố định vị (colonization factor antigen – CFA)

Sau khi độc tố đi vào nội bào, chúng di chuyển trong tế bào nhờ hệ thống vậnchuyển Golgi Đích của LT trong tế bào là enzyme andenylate cyclase nằm ở lớpmàng ngoài của tế bào biểu mô ruột Peptide A có hoạt tính ADP –ribosyltransferase chuyển phần ADP – rybosyl từ NAD đến của protein liên kết

GTP là Gs, gây hoạt hóa enzyme adenylate cyclase, làm tăng AMP vòng (cAMP)trong tế bào Vì vậy, enzyme cAMP – dependent protein kinase (A kinase) đượchoạt hóa dẫn đến sự phosphoryl hóa kênh Cl- ở màng tế bào biểu mô vượt quá mứcbình thường Kết quả dây chuyền là kích thích tế bào bên dưới tiết Cl- và ngăn cản

sự hấp thu NaCl bởi những tế bào có lông nhung Hàm lượng ion trong lòng ruộtgia tăng kéo theo sự di chuyển thụ động của nước từ tế bào vào lòng ruột gây tiêuchảy

LT – II: nhóm LT – II giống với LT – I khoảng 55 – 57% ở tiểu đơn vị Anhưng không giống ở tiểu đơn vị B, LT – II không liên quan đến bệnh trên người

và thú

 Độc tố chịu nhiệt (heat – stable toxin – ST): ngược với LT, ST có trọnglượng phân tử nhỏ và những cầu nối disulfur của nó giải thích cho khả năng chịunhiệt của độc tố này ST được chia thành 2 nhóm là STa và STb, khác nhau về cấutrúc và cơ chế hoạt động Gen mã hóa cho cả 2 nhóm chủ yếu được tìm thấy trênplasmid và vài gen mã hóa ST cũng được tìm thấy trên transposon STa và STb đềuđược tạo bởi ETEC

STa là một peptide gồm 18 – 19 amino acid với trọng lượng phân tử khoảng2kDa Receptor chính của STa là enzyme xuyên màng guanylate cylase C (GC –C) Sự kết hợp của STa vào GC – C kích thích hoạt tính GC dẫn đến việc gia tănglượng cGMP nội bào Hoạt động này cuối cùng dẫn đến sự kích thích tiết Cl- vàhoặc ngăn cản sự hấp thụ NaCl, gây sự tiết chất lỏng trong ruột

STb không như STa, STb gây ra những tổn thương về mặt mô học trên lớpbiểu mô ruột như mất tế bào nhung mao của biểu mô ruột và teo nhung mao mộtphần Receptor của STb chưa được biết rõ mặc dù gần đây người ta cho rằng độc tố

có thể kết hợp không đặc hiệu với màng tế bào chất trước khi vào trong tế bào.Không tạo ra sự tiết Cl- như STa, nhưng kích thích tế bào ruột tiết bicarbonate

(HCO3-) STb không làm tăng cAMP hay cGMP nội bào mặc dù nó kích thích tănglượng canxi nội bào từ ngoại bào

 Yếu tố định vị (colonization factor – CF)

Để gây tiêu chảy ETEC đầu tiên phải kết dính vào tế bào ruột non nhờ lôngtrên bề mặt của vi khuẩn gọi là yếu tố định vị (CF)

d Enteroaggregative E.coli (EAEC hay EAggEC)

EAEC hay EAggEC là nhóm E.coli không sinh enterotoxin và bám dính vào

tế bào Hep – 2 theo kiểu bám dính kết tập (aggregative adhetion – A/A) Nhóm

EAEC gồm cả dòng E.coli gây bệnh và không gây bệnh Tất cả các EAEC đều có

60MDa chứa gen tạo tổn thương dạng A/A và mã hóa A/A trên plasmid cần thiếtcho quá trình gây bệnh

EAEC gây tiêu chảy kéo dài (trên 14 ngày) Trong hầu hết các báo cáo đều

mô tả EAEC ở các ca tiêu chảy lẻ tẻ nhưng cũng có thể là tác nhân gây thành ổdịch

e Khả năng gây bệnh của Enteroinvasive E.coli (EIEC)

Triệu chứng lâm sàng của bệnh do những E.coli dòng EIEC bao gồm sốt, đau

bụng quặn, khó chịu, nhiễm trùng máu và tiêu chảy nước hay bệnh lỵ điển hình vớimáu, dịch nhày và nhiều bạch cầu trong phân EIEC có khả năng xâm nhập vào tếbào biểu mô kết tràng và chúng điều tiết một hay nhiều độc tố ruột liên quan đếntiêu chảy EIEC cũng có thể gây tiêu chảy ở khách du lịch và liên quan đến những

vụ ngộ độc thực phẩm do ăn phải thức ăn bị ô nhiễm

Tóm lại, một số gen độc lực quan trọng của những nhóm E.coli bao gồm:

Bảng 2.2: Các gen độc lực quan trọng của E.coli

2.2.2.6 Tình hình nhiễm

Coliforms và E.coli là vi khuẩn thường thấy trong ruột người và động vật máu

nóng Coliforms là vi sinh vật chỉ thị an toàn thực phẩm, trong khi đó hầu hết các

chủng E.coli vô hại tuy nhiên, một số chủng có thể gây bệnh nghiêm trọng Nó

xâm nhiễm vào con người chủ yếu thông qua tiêu thụ thức ăn, thức uống bị ônhiễm, chẳng hạn như sản phẩm thịt chưa nấu chín dính bụi bẩn hay các loại nướcgiải khát nhiễm khuẩn hoặc các loại rau củ quả chưa được ngâm và rửa sạch

E.coli O157: H7 là EHEC serotype quan trọng nhất liên quan đến các dịch

bệnh Các triệu chứng của bệnh gây ra bởi EHEC bao gồm đau bụng và tiêu chảy

có thể có trong một số trường hợp tiến triển thành bệnh tiêu chảy máu (xuất huyếtviêm đại tràng), sốt và ói mửa cũng có thể xảy ra Ngoài ra, tiêu chảy là mộtnguyên nhân chính của suy dinh dưỡng ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ

Tỷ lệ nhiễm khuẩn EHEC thay đổi theo nhóm tuổi nhưng tỷ lệ mắc cao nhấtthường xảy ra ở trẻ em độ tuổi dưới 15 với khoảng 100000 trường hợp tại tại Hoa

1 2 3 4 5 6 7 8

Eae Hly Stx1 Stx2 Stx2e Sta Stb

LT - I

EPEC, STEC STEC STEC STEC STEC ETEC ETEC ETEC

Kỳ năm 1982 Năm 1996, một ổ dịch của E.coli O157: H7 liên quan đế thức ăn và

đồ uống đường phố tại Nhật Bản làm hơn 6300 học sinh bị ảnh hưởng và kết quả là

2 ca tử vong Ngày 15/5/2000, tại Ontario, Canada Các đơn vị y tế công cộng cho

biết tại thị trấn Walkerton với dân số 5000 đã có một ổ dịch của E.coli O157: H7

làm 5 người thiệt mạng và 27 ca nằm viện

Số lượng ca mắc ngộ độc thực phẩm và đồ uống là khó xác định chính xác,nhưng một được báo cáo của WHO nói rằng trong năm 2005 đã làm 1.800.000người chết vì bệnh tiêu chảy

Ở các nước công nghiệp hóa, tỷ lệ phần trăm của dân số bị bệnh từ thực phẩmmỗi năm đã được báo cáo để được lên đến 30% Trong khi đó, tỷ lệ nhiễm này ởcác nước đang phát triển chắc chắn sẽ còn cao hơn nhiều so với các nước phát triển

và điều này đã gây thiệt hại nặng về người và tổn hại nền kinh tế Sự xuất hiện lạicủa dịch tả tại Peru vào năm 1991 có trong xuất khẩu sản phẩm thuỷ sản và cá dẫnđến sự mất mát của Mỹ 500000000 USD năm đó Tại Mỹ, các dịch bệnh liên quan

ước tính chi phí lên đến 35 tỷ USD hàng năm (Theo Tổ chức Y tế thế giới)

Trong khi đó, tháng 7/2007 tại Đà Nẵng, Việt Nam 53% mẫu thức ăn và đồ

uống đường phố nhiễm Coliforms và 25,3% thức ăn nhiễm E.coli, đó là con số

thống kê của Trung tâm Y tế dự phòng thành phố Đà Nẵng qua đợt kiểm tra gần

400 cơ sở thức ăn và đồ uống đường phố trong thời gian vừa qua (Trung tâm Y tế

dự phòng thành phố Đà Nẵng (2007), Báo cáo vệ sinh an toàn thực phẩm đường

phố).

2.3 Một số phương pháp định lượng vi sinh vật trong nước

2.3.1 Phương pháp đổ đĩa

2.3.1.1 Khái niệm

Phương pháp đổ đĩa hay còn gọi là phương pháp đếm khuẩn lạc cho phép xácđịnh số lượng tế bào vi sinh vật còn sống, hiện diện trong mẫu Tế bào sống là tếbào có khả năng phân chia tạo khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc.

Phương pháp này cho phép định lượng chọn lọc vi sinh vật tùy môi trường vàđiều kiện nuôi cấy Phương pháp đếm khuẩn lạc có thể thực hiện bằng kỹ thuật hộp

đổ hay hộp trải với các thiết bị hỗ trợ đọc kết quả

Số lượng khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa phụ thuộc vào lượng mẫu sử dụng, môitrường và điều kiện ủ Các tế bào trên đĩa không tăng trưởng và hình thành khuẩnlạc với tốc độ như nhau, do vậy nhiều tế bào chưa kịp hình thành khuẩn lạc nếuthời gian ủ chưa đủ dài Thông thường trong điều kiện nuôi cấy (môi trường, nhiệt

độ, thời gian) cần đảm bảo sao cho số lượng khuẩn lạc xuất hiện tối đa Phươngpháp đếm khuẩn lạc dễ cho sai số lớn nên cần thực hiện lặp lại trên ít nhất hai đĩa Phương pháp đếm khuẩn lạc được cho là tốt nhất để xác định mật độ tế bàosống Ngoài ra, phương pháp này còn có ưu điểm là độ nhạy cao, cho phép địnhlượng vi sinh vật ở mật độ thấp trong mẫu Phương pháp này được sử dụng rộng rãitrong nước, thực phẩm, bệnh phẩm

2.3.1.2 Quy trình thực hiện

a Pha loãng mẫu theo dãy thập phân

Mẫu được pha loãng tuần tự thành dãy các nồng độ thập phân 10-1, 10-2,….Mỗi bậc pha loãng là 1/10 được thực hiện bằng cách dùng 1ml mẫu (hoặc dungdịch có độ pha loãng trước đó) thêm vào 9ml nước hoặc môi trường trong ốngnghiệm

Hình 2.3: Hệ thống pha loãng mẫu

b Kỹ thuật đổ đĩa

Dùng pipetman và đầu tip vô trùng, thao tác vô trùng chuyển 1ml dịch chứagiống vi sinh vật lên bề mặt môi trường trong đĩa petri Đổ khoảng 15 – 20ml môitrường đã đun chảy và để nguội đến 45 – 550C vào đĩa petri đã cấy mẫu Xoay nhẹđĩa petri cùng chiều và ngược chiều kim đồng hồ vài lần để dung dịch giống đượctrộn đều trong môi trường cấy Đậy nắp đĩa petri, để đông tự nhiên, lật ngược đĩalại mang ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp

2.3.1.3 Cách tính kết quả

Công thức tính số lượng khuẩn lạc có trong 1ml mẫu nước như sau:

A = N / (n1v1f1 + n2v2f2 + n3v3f3 + … + nivifi)

Trong đó:

A: tổng số vi sinh vật hiếu khí có trong 1ml (g) mẫu

N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa

n1: số đĩa ở độ pha loãng f1

ni: số đĩa ở độ pha loãng fi

vi: thể tích mẫu lấy ở mỗi độ pha loãng

fi: độ pha loãng

2.3.2 Phương pháp màng lọc

Phương pháp này thường được dùng để định lượng vi sinh vật chỉ thị trongmẫu nước khi tiến hành các thử nghiệm môi trường nơi có mật độ vi sinh tương đốithấp Phương pháp này bao gồm bước lọc để tập trung vi sinh vật trong một mẫunước trên màng lọc và xác định số tế bào vi sinh vật dựa vào số khuẩn lạc đếmđược sau khi đặt màng lọc lên trên môi trường thạch có thành phần môi trườngdinh dưỡng thích hợp cho loại vi sinh cần kiểm tra Dựa trên khối lượng mẫu nướcban đầu và quy ước là mỗi khuẩn lạc được hình thành từ một tế bào vi sinh vật,người ta quy ra số lượng vi sinh vật có trong một đơn vị thể tích Như vậy, phươngpháp này là sự kết hợp của phương pháp lọc vô trùng và phương pháp đếm khuẩnlạc trên đĩa petri Màng lọc có kích thước lỗ là 0,45µm hoặc 0,2µm được chế tạo từcác nguyên liệu là các sợi thủy tinh siêu mảnh, sợi polypropylene, thường đượccung cấp trong trạng thái vô trùng

Ngoài màng lọc bình thường hiện nay, người ta còn sử dụng màng lọc kỵnước trên đó có in các ô vuông bằng vật liệu kỵ nước Các vạch chia ô bằng vậtliệu này ngăn càn sự mọc lan của các khuẩn lạc Khác với trường hợp màng lọcbình thường, từ số các ô vuông có khuẩn lạc mọc, mật độ vi sinh vật trong mẫu

được tính và trình bày dưới dạng số có xác suất lớn nhất (MPN) của lượng vi sinhvật có trong một đơn vị thể tích theo mẫu công thức:

MPN = Nln(N/N – x)Trong đó:

N: tổng số các ô vuôngx: ô có số khuẩn lạc mọc2.3.3 Phương pháp MPN (Most Probable Number)

2.3.3.1 Khái niệm

Phương pháp MPN (phương pháp có số xác suất cao nhất, số tối khả) cònđược gọi là phương pháp pha loãng tới hạn hay phương pháp chuẩn độ Đây làphương pháp dùng để đánh giá số lượng vi sinh vật theo số lượng vi sinh vật có xácsuất lớn nhất hiện diện trong một đơn vị thể tích mẫu Đây là phương định lượngdựa trên kết quả tính của một loạt thí nghiệm lặp lại ở một số độ pha loãng khácnhau Thông thường, việc định lượng này được thực hiện lặp lại 3 lần ở 3 độ phaloãng bậc 10 liên tiếp, tổng cộng 3 x 3 = 9 ống nghiệm

2.3.3.2 Quy trình thực hiện

Cho vào các ống nghiệm có chứa môi trường thích hợp cho sự tăng trưởngcủa đối tượng vi sinh vật cần định lượng một thể tích chính xác dung dịch mẫu ở 3nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp (ví dụ 1/10, 1/100, 1/1000) Ủ ở nhiệt độ và thờigian thích hợp Dựa vào kết quả biểu kiến chứng minh sự tăng trưởng của vi sinhvật cần kiểm định trong từng ống nghiệm (thường là các hiện tượng sinh hơi, đổimàu, đục ), ghi nhận số ống nghiệm dương tính ở từng độ pha loãng Sử dụng sốliệu này nà dựa vào bảng Mac Cardy suy ra mật độ vi sinh vật được trình bày dướidạng số MPN/100ml hay số MPN/1g mẫu

2.3.3.3 Cách lập chỉ số MPN

 Trường hợp 1: có ít nhất ba ống dương tính cho một độ pha loãng Chọn

độ pha loãng cao nhất (tức là dịch pha loãng có nồng độ mẫu nhỏ nhất) cho ba ốngdương tính, cùng với hai độ pha loãng cao hơn kế tiếp (tức là độ pha loãng này cónồng độ mẫu là 1/10 và 1/100 của độ pha loãng thứ nhất đã được chọn)

Nếu các dịch pha loãng tiếp theo ngoài dịch pha loãng cao nhất cũng cho baống dương tính thì chọn tiếp ba độ pha loãng cao nhất trong cả dãy (tức là những

độ pha loãng có nồng độ mẫu nhỏ nhất)

 Trường hợp 2: không có độ pha loãng nào cho ba ống dương tính Chọn

ba độ pha loãng cao nhất trong dãy pha loãng (tức là những độ pha loãng có nồng

độ mẫu nhỏ nhất), trong số đó ít nhất thu được một kết quả dương tính

 Các trường hợp đặc biệt: trong tất cả các trường hợp khi có nhiều hơn mộttrong ba độ pha loãng được chọn theo trường hợp 1 và 2 không cho ống dươngtính, thì hãy chọn từ các độ pha loãng này độ pha loãng thấp nhất không cho cácống dương tính (tức là độ pha loãng có nồng độ mẫu cao nhất) và hai độ pha loãngthấp hơn kế tiếp trong dãy pha loãng (tức là có nồng độ mẫu gấp 10 lần và 100 lần

độ pha loãng thứ nhất đã chọn), trừ khi các ống dương tính chỉ tìm thấy ở mức phaloãng đầu tiên được chuẩn bị từ mẫu thử trong trường hợp cuối cùng này cần chọn

ra ba độ pha loãng đầu tiên để tính MPN thậm chí loạt ống này bao gồm hai độ phaloãng không cho các ống dương tính nào

2.3.3.4 Cách tính kết quả

Số vi sinh vật trên ml hoặc trên gam của sản phẩm được tính bằng cách nhânchỉ số MPN với số đảo của độ pha loãng thấp nhất được chọn (tức là dịch phaloãng có nồng độ mẫu cao nhất)

Khi độ pha loãng thấp nhất được chọn tương ứng với các ống được chuẩn bịvới môi trường nồng độ kép (tức là cấy với 10ml), thì trước hết hãy chia chỉ sốMPN cho 10.

Hình 2.4: Hệ thống định lượng vi sinh vật bằng MPN

Chương 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Địa điểm và thời gian

3.1.1 Địa điểm

Đề tài được thực hiện tại phòng Thí nghiệm Vi sinh, Khoa Môi Trường vàCông Nghệ Sinh Học, Trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ Thành Phố Hồ ChíMinh

 Mẫu nước không đóng chai: nước mía, sâm và rau má.

 Mẫu nước đóng chai có gas: nước khoáng Vĩnh Hảo, Pepsi, và 7upRevive

 Mẫu nước đóng chai không có gas: trà xanh không độ O0, trà xanh C2,nước khoáng Joy và Sapuwa

3.3.2 Hóa chất và môi trường

3.2.2.1 Hóa chất

Thuốc thử Kovac’s, Methyl Red, dung dịch α – naphthol, KOH 40%, cồn 960,

700 và nước cất

3.2.2.2 Môi trường

a Môi trường lỏng Lactose Broth (LB)

b Môi trường Brilliant Green Bile Lactose Broth (canh BGBL)

c Môi trường EB Broth (canh EC)

d Môi trường Eosin Methylene Blue Lactose agar (EMB)

e Môi trường canh Trypton (Tryptophane) Borth 1%

f Môi trường MR – VP Broth

g Môi trường Simmon Citrate Agar

Ống nghiệm, ống durhamĐĩa petri

Pipet các loại 10ml, 1ml, 0,1mlPipetman

Đầu týpĐèn cồnQue cấy vòng, thẳngGiá ống nghiệmQuẹt gas

Bông gòn (loại thấm và không thấm nước)Bao PE vô trùng

Giấy dầuĐũa khuấy 3.2.3.2 Thiết bị

Tủ ấm 370C

Tủ ủ

Tủ lạnhNồi hấp AutoclaveCân phân tích

Bể điều nhiệt