Giải thích hiện tượng: Do trong môi trường kiềm, các liên kết peptide phản ứng với sulfate đồng CuSO 4 tạo phức chất màu tím.. Màu của phản ứng phụ thuộc vào lượng đồng Cu và số lượng
Trang 1TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC HÀNH SINH HÓA
Nhóm 1:
Vương Vĩnh Hưng 2008170048
Trần Phước Huy 2008170051
Võ Thảo Hạnh 2008170036
Huỳnh Ngọc Khiêm 2008170057
BÀI 1: PROTEIN
1 Định tính -amino acid bằng phản ứng ninhydrin.
Chuẩn bị:
Cốc 100ml 1 Lòng trắng trứng gà ~ 40 mL
Ống nghiệm 2 Nước cất 1 lit
Phễu 1 C2H5O2N 0,02 g
Giấy lọc 1 Ancohol 96% 10 mL
Bông thấm 1 C9H6O4 0,1 g
Kẹp gắp ống nghiệm 1
Bóp cao su 1
Tiến hành:
Chuẩn bị nguyên liệu, hóa chất:
- Dung dịch protein trứng: Lấy 1 lòng trắng trứng gà (~ 40mL) pha loãng 20 lần bằng nước cất Lọc bông thấm, sau đó lọc lại bằng giấy lọc, bảo quản ở 240C Pha trước khi làm thí nghiệm
- Dung dịch glycine 0,02%: Cân 0,02g C2H5O2N, định mức bằng nước cất đến đủ 100mL dung dịch
Trang 2- Dung dịch thuốc thử ninhydrin 0,1%: Lấy 10mL Ancohol 96% để hòa tan 0,1g C9H6O4, rồi định mức bằng nước cất đến đủ 100mL dung dịch Bảo quản trong lo thủy tinh màu nâu, tránh sáng
Tiến hành thí nghiệm:
- Lấy 2 ống nghiệm, đánh số 1 và 2, cho vào:
+ Ống 1: 1mL dung dịch glycine 0,02%
+ Ống 2: 1mL dung dịch protein trứng
- Thêm vào mỗi ống 5 giọt dung dịch thuốc thử ninhydrin 0,1%
- Đun nóng cả 2 ống nghiệm trong ngọn lửa đèn cồn (~ 30 giây) hoặc đặt trong nôi cách thủy ở
700C trong 5 phút
Kết quả quan sát:
- Ống 1: Không xuất hiện màu
- Ống 2: xuất hiện màu xanh tím
Giải thích hiện tượng: Sự xuất hiện màu xanh tím là do phản ứng của ninhydrin và amino acid
+NH 3 +CO2 +RCHO
Ninhydrin +NH3 +Ninhydrin bị khử
Ninhydrin
bị khử
Phức chất màu xanh tím
Trang 32 Định tính protein bằng phản ứng biuret.
Chuẩn bị:
Cốc 100ml 1 NaOHrắn 10g
Ống nghiệm 2 CuSO4.5H2O 1,6g
Thìa nhựa 2 Tinh thể urea 0,1g
Chai nhựa trắng 1 dd protein trứng 1 mL
Đèn cồn 1 Nước cất 500mL
Kẹp gắp ống nghiệm 1
Bóp cao su 1
Tiến hành:
Chuẩn bị nguyên liệu, hóa chất:
- dd sodiun hydroxide 10%: cân 10g NaOH, định mức bằng nước cất đến đủ 100mL, bảo quản trong lọ nhựa màu trắng
- dd copper sunfate 1%: Cân 1,6g CuSO4.5H2O, định mức bằng nước cất đến đủ 100mL
Tiến hành thí nghiệm:
- Lấy 2 ống nghiệm, đánh số 1 và 2, cho vào:
+ Ống 1: 0,1g tinh thể urea
+ Ống 2: 1mL dd protein trứng
- Đun nóng ống 1 trên ngọn lửa đèn cồn, lúc đầu urea nóng chảy, sau đó bắt đầu cứng lại được biuret, để nguội
- Thêm vào mỗi ống 1ml đ NaOH 10% và 1 giọt dd CuSO4 1% Lắc đều
Chú ý: Không nên cho nhiều dd CuSO4 vì màu xanh cảu dd Cu(OH)2 có thể lấn át màu của phản ứng biuret
Phản ứng được coi là dương tính khi có màu tím rõ
Trang 4Kết quả quan sát:
- Ống 1: có sự xuất hiện của màu tím hồng
- Ống 2: có sự xuất hiện của màu tím
Giải thích hiện tượng: Do trong môi trường kiềm, các liên kết peptide phản ứng với sulfate đồng (CuSO 4 ) tạo phức chất màu tím
Màu của phản ứng phụ thuộc vào lượng đồng (Cu) và số lượng các liên kết peptide trong phân tử chất tham gia phản ứng
Ống 1: Biuret được tạo thành từ urea trong điều kiện nhiệt độ
cao Khi môi trường kiềm chứa Cu2+ sự hình thành màu tím hồng trong dd biuret
Ống 2: dd protein trứng
chuyển thành dd có màu xanh tím trong môi trường kiềm có chứa Cu2+
Trang 63 Tìm điểm đẳng điện của protein bằng phương pháp tạo pH khác nhau.
Chuẩn bị:
Cốc 1L 2 Na2HPO4.12H2O 71,6g
Ống nghiệm 3 C6H8O7.H2O 21g
Pipet 1mL 3 dd protein trứng 1 mL
Lọ thủy tinh màu nâu 1 Nước cất 3L
Bóp cao su 1 Cồn 960
Tiến hành:
Chuẩn bị nguyên liệu, hóa chất:
- dd sodiun phosphate dibasic 0,2M: cân 71,6g Na2HPO4.12H2O, định mức bằng nước cất đến đủ 1L
- dd acid citric 0,1M: Cân 21g CuSO4.5H2O, định mức bằng nước cất đến đủ 1L Bảo quản trong
lọ thủy tinh màu nâu
Tiến hành thí nghiệm:
- Lấy 3 ống nghiệm, đánh số 1, 2 và 3, cho vào:
+ Ống 1: 0,3mL dd Na2HPO4.12H2O 0,2M + 0,7mL dd C6H8O7.H2O 0,1M (pH=3,7)
+ Ống 2: 0,5mL dd Na2HPO4.12H2O 0,2M + 0,5mL dd C6H8O7.H2O 0,1M (pH=4,7)
+ Ống 3: 0,7mL dd Na2HPO4.12H2O 0,2M + 0,3mL dd C6H8O7.H2O 0,1M (pH=5,7)
- Lắc đều các ống nghiệm để dung dịch đệm đảm bảo độ pH tương ứng
- Thêm vào mỗi ống nghiệm 1mL dd protein trứng, lắc nhẹ
- Thêm vào mỗi ống nghiệm 1mL cồn 960, lắc đều, để yên 5 phút
Trang 7Kết quả quan sát:
- Cả 3 ống thu được đều có kết tủa trắng
- Thời gian kết tủa giữa các ống có sự khác nhau Phản ứng kết tủa ở ống 2 diễn ra nhanh hơn các ống còn lại
Giải thích:
- Phản ứng kết tủa protein ở điểm đẳng điện diễn ra nhanh chóng
-Mà ta có pHi của Albumine trứng là 4,6
pH môi trường là 4,7
Vì vậy ống 2 chính là môi trường lý tưởng tạo điều kiện cho albumine trứng kết tủa nhanh hơn
Nguyên tắc:
Các amino acid và protein là các chất điện ly lưỡng tính, do đó tùy thuộc vào pH dung dịch, mức độ phân ly của các nhóm carboxle và amine tự do
Trang 84 Kết tủa protein bằng muối trung tính (NH 4 ) 2 SO 4 và bằng cách đun sôi trong các môi trường khác nhau.
Chuẩn bị:
Cốc 100ml 4 (NH4)2SO4 78g
Ống nghiệm 7 CH3COOH 98% 9,7 mL
Thìa nhựa 2 dd protein trứng nguyên chất 1 mL
Pipet 5mL 1
Kẹp gắp ống nghiệm 1
Bóp cao su 1
Tiến hành:
Chuẩn bị nguyên liệu, hóa chất:
- dd ammonium sunlfate bão hòa: cân 78g (NH4)2SO4, hòa tan với 100mL nước cất
- dd acid acetic 10%: hút 9,7mL CH3COOH 98% định mức bằng 100mL nước cất
- dd acid acetic 1%: pha loãng 10 lần dung dịch acid acetic 10% bằng nước cất
- dd muối ăn bão hòa: cân 36,3g NaCl, hòa tan với 100mL nước cất
Tiến hành thí nghiệm:
- Kết tủa thuận nghịch protein:
Lấy 2 ống nghiệm đánh số 1 và 2, cho vào mỗi ống 1 mL dd lòng trắng trắng nguyên chất + Ống 1: 1 mL dd (NH4)2SO4 bão hòa, lắc nhẹ, xuất hiện các thể vẩn trắng globuline
+ Ống 2: thêm từ từ tinh thể (NH4)2SO4 lắc cho đến khi dung dịch trở thành bão hòa (NH4)2SO4
Trang 9Kết quả quan sát:
- Các ống nghiệm thu được đều có xuất hiện tủa keo trắng
Giải thích:
- Protein là chất keo ưa nước, độ bền của dung dịch keo protein tùy thuộc vào nhiều yếu tố như: sự tích điện của phân
tử protein, mức độ hydrate hóa, nhiệt độ,…
- Với phản ứng kết tủa thuận nghịch protein: dưới tác dụng của các chất như (muối trung tính kim loại kiềm, kiềm thổ, muối ăn (NaCl), ammoniun sulfate (NH4)2SO4, magnesium sulfate (MgSO4),…); các dung môi hữu cơ (cồn, ether, acetone,…) trong điều kiện nhiệt độ thấp có tác dụng gây kết tủa protein
Trang 10- Kết tủa không thuận nghịch:
Lấy 5 ống nghiệm, đánh số từ 1 đến 5, cho vào mỗi ống 1mL dd protein trứng
Sau đó tiến hành:
+ Ống 1: đun nóng
+ Ống 2: thêm 2 giọt CH3COOH 1%, đun nóng
+ Ống 3: thêm 2 giọt CH3COOH 10%, đun nóng
+ Ống 4: thêm 2 giọt CH3COOH 10% và 2 giọt NaCl bão hòa, đun nóng
+ Ống 5: thêm 1 giọt NaOH 10%, đun nóng
Kết quả quan sát:
- Thu được 3 ống có kết tủa trắng, 1 ống không kết tủa, 1 ống có dd màu vàng sánh
Giải thích
- Ống 1: Các phân tử protein bị đông tụ tạo tủa Vì
hầu hết các protein không ổn định dưới tác dụng của nhiệt, ở nhiệt độ cao (50550C) các liên kết hydro, liên kết kị nước bị đứt, tạo tủa trắng đục
- Ống 2: Các phân tử protein bị đông tụ tạo tủa Vì acid CH3COOH 1% tạo nên môi trường acid yếu, làm protein trứng bị kết tủa màu trắng đục
- Ống 3: dd có màu trắng trong, không tạo tủa Vì các acid CH3COOH 10% tạo nên môi trường acid mạnh đối với protein trứng, làm cho các protein trở nên tích chủ yếu điện dương, nên không tạo kết tủa
- Ống 4: Các phân tử protein bị đông tụ tạo tủa Vì trong môi trường acid mạnh CH3COOH 10% có sự
bổ sung đầy đủ muối trung tính, đem đun nóng, sẽ làm protein kết tủa trắng đục
- Ống 5: Không có kết tủa khi cho 1 giọt NaOH 10%, đun nóng không tạo tủa nhưng dd chuyển sang màu vàng sánh Vì NaOH 10% tạo môi trường kiềm, đun sôi các điện âm của phân tử vẫn còn Protein tích điện âm, không tạo tủa
Trang 115 Định lượng protein niệu (Kỹ thuật Mestrezat).
Chuẩn bị:
Cốc 100ml 2 Protein mẫu 28mL
Ống nghiệm 11 Nước tiểu trong 5mL
Bóp cao su 1 Lượng protein g/L 6 g/L
Pipet 5mL 2 Nước cất 50mL
Tiến hành:
Lấy 11 ống nghiệm đánh số từ 1 đến 10 và ống mẫu, cho theo thứ tự các lượng thuốc thử sau: Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Mẫu Protein mẫu 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 0 Nước cất 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0 0
Lượng protein g/L 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 ?
Lắc đều để yên 15 phút
Sau đó lắc kỹ so sánh ống mẫu với dãy ống nghiệm từ 1 đến 10
Để ống mẫu ở giữa 2 ống có độ đục gần giống ống mẫu
Để 3 ống lên hàng chữ của sách quay ra ánh sáng, so sánh độ mờ của chữ qua ống