Chú ý: không được chạm trực tiếp vào giữa màng lai vì có thể sẽ làm “bẩn” màng, khiến cho quá trình gắn đầu dò lên màng là không tốt.. - Việc đánh dấu này là nhờ vào phản ứng PCR cùng vớ
Trang 1Họ và tên: Lê Đức Sơn
Mã SV: 16000615
Lớp: K61 CNSH
Ca thực hành: Thứ 6 , 9h30-11h
BÁO CÁO THỰC HÀNH NHẬP MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Bài 1: Quy trình hoạt hóa màng
1 Mục đích
- Gắn các đầu dò đặc hiệu lên màng Đây là bước đầu tiên cho phép màng lai có thể tạo cặp
bổ sung với sản phẩm PCR đặc hiệu
2 Cơ sở lý thuyết
- Đầu dò oligonucleotide allele đặc hiệu là một đoạn oligonucleotide dài 15-21 nucleotides vàđược thiết kế bổ sung đặc hiệu với một allele ở trong hệ gen
Cấu trúc của oligonucleotide amino-linker và spacer arm.
- Cấu trúc của một đầu dò:
● Đầu 5’- NH2: Giúp đầu dò có thể liên kết với gốc COO-trên màng lai
● Vùng Spacer Arm gồm 12 gốc Carbon: tăng tính linh hoạt của đầu dò, giúp cho việc
“tìm kiếm” những đoạn DNA đặc hiệu trong dung dịch lai tốt hơn
● Vùng oligo: là vùng có trình tự nucleotides được thiết kế để lai đặc hiệu với sản phẩmPCR Tính đặc hiệu cao đến mức sai khác một nucleotide cũng ảnh hưởng lớn tới khảnăng bắt cặp Nhờ vậy mà kỹ thuật lai điểm ngược này có thể phát hiện những allenđột biến dù chỉ một nucleotide
- Màng được sử dụng cho kỹ thuật lai điểm ngược là màng nylon Biodyne C tích điện âm (docác gốc COO-)
- Các nhóm carboxyl trên màng được hoạt hóa bằng EDC thành dạng O-acylurea Dạng chấttrung gian này lập tức phản ứng với nhóm amin trên đầu dò oligo thành liên kết amide bềnvững
Trang 2- Đánh dấu chiều của màng bằng cách cắt chéo góc trên
bên trái Lấy bút chấm các điểm trên màng lai để chia
khu vực cho từng đầu dò (xem ảnh bên)
Chú ý: không được chạm trực tiếp vào giữa màng lai
vì có thể sẽ làm “bẩn” màng, khiến cho quá trình gắn
đầu dò lên màng là không tốt
- Để màng vào trong đĩa nhựa, thêm khoảng 1.5ml HCl
0.1N Đậy nắp và lắc nhẹ, ủ 3’ ở nhiệt độ phòng
- Dùng pipet 1000 hút bỏ dung dịch HCl, sau đó thêm
vào khoảng 2ml nước cất để rửa màng (để ngâm
khoảng 30s)
- Thêm vào đĩa nhựa 2ml dung dịch EDC, ủ 15’ ở nhiệt độ phòng Trong lúc ủ có thể lắc nhẹđĩa để dung dịch EDC được phủ đều trên bề mặt màng
- Rửa màng với nước và để đến khô ở nhiệt độ phòng
Chú ý: màng cần được khô hoàn toàn rồi mới tiến hành nhỏ (dot) đầu dò lên Nếu màng chưa khô,
đầu dò khi nhỏ lên có thể loang ra không đều, dẫn tới các nốt bị xấu
- Dot 1µl đầu dò và đối chứng lên màng theo đúng vị trí đã định sẵn Khi thao tác, ta cần đẩydung dịch đầu dò ra, tạo thành giọt nhỏ hình tròn trên đầu pipet Sau đó chấm vuông góc
Trang 3lên màng lai Nhờ vào lực mao dẫn mà dung dịch đầu dò sẽ được thấm xuống và tỏa đều raxung quanh, tạo thành hình tròn.
- Để khô màng 10 phút ở nhiệt độ phòng
- Ủ màng với 1.5ml NaOH 0.1N trong 10 phút ở nhiệt độ phòng
- Để màng khô hoàn toàn, sau đó cho vào túi zip và bảo quản ở 4oC để tránh ẩm
5 Giải thích
- Dung dịch HCl tạo tính acid cho màng, giúp các gốc COO-trên màng dễ dàng tương tác vớiEDC
- Tác dụng của EDC:
Quá trình liên kết đồng hóa trị giữa đầu dò amino và gốc carboxyl.
Chúng có tác dụng như một chất xúc tác Ban đầu liên kết với các gốc COO-trên màng và
làm thay đổi điện tích của nhóm này Nhờ vậy mà các gốc COO-có thể dễ dàng liênkết với phân tử amin bậc 1 có trên đầu dò
- Dung dịch NaOH có tác dụng loại bỏ các gốc COO- thừa đã được hoạt hóa nhưng khôngđược gắn với đầu dò Nếu không loại bỏ những những gốc hoạt hóa này thì chúng sẽ rất dễphản ứng với bất kỳ tác nhân nào có trong dung dịch, làm giảm độ nhạy của kỹ thuật lai
- Đối chứng dương P+:
+ Đây là những oligonucleotide ngắn, có gắn với biotin
+ Kiểm tra quá trình gắn mồi vào màng
+ Kiểm tra cơ chất có hoạt động hay không
+ Nếu những điều kiện trên là tốt, khi lai màng P+ sẽ lên màu xanh
- Đối chứng âm P-:
+ Đây là những đoạn oligonucleotide ngắn không có biotin nhưng có khả năng tương tác
với vùng bảo thủ của chỗ nối intron-exon trong sản phẩm PCR
+ Kiểm tra xem mồi có tương tác được với sản phẩm PCR hay không
+ Nếu sự tương tác này là tốt, đối chứng âm sẽ cho màu xanh sau khi lai màng
Trang 4- Nồng độ đầu dò đưa lên màng (đơn vị: µM ; thể tích đưa lên màng: 1µl/đầu dò).
+ Cd41/42N: 0.5
+ Cd41/42M: 7.5
+ P+ : 0.5
+ P-: 1
6 Trả lời câu hỏi cuối bài
Câu 1: Tại sao phải dùng cả mồi đột biến và mồi thường biến Nêu lý do các mồi có nồng độ
khác nhau?
Sử dụng cả mồi đột biến và mồi thường biến là để xác định xem trong mẫu bệnh phẩm
có chứa đồng thời cả allen đột biến và allen gây bệnh hay không Điều này sẽ giúp xácđịnh kiểu gen của người đó là bình thường, đồng hợp đột biến hay di hợp
- Nếu chỉ mồi N (normal) bắt màu thì người này là bình thường
- Nếu chỉ mồi M (mutant) bắt màu thì người này là đồng hợp bệnh
- Nếu cả 2 mồi đều lên màu tức là người này dị hợp về allen đột biến đó
Câu 2: Tìm vị trí đột biến trong bài trên gene beta-globin của hồng cầu người ?
Trang 5Vị trí của các đầu dò trên trình tự gene HBB ở người.
- Những vị trí khác biệt giữa 2 loại đầu dò được bôi màu đỏ
- Vị trí Cd17 xảy ra đột biến điểm thay thế nucleotide A thành T
- Vị trí Cd41/42 xảy ra đột biến mất 4 nucleotides TCTT
- Theo như trong tài liệu thực hành, vị trí Cd26 sẽ xảy ra đột biến điểm thay thế 1 nucleotide.Tuy nhiên trình tự đầu dò bình thường và đầu dò đột biến khác nhau rất nhiều Thậm chícòn không tìm ra vị trí của đầu dò Cd26 N trên gen HBB
- Nghi ngờ đã cho sai trình tự đầu dò Cd26 N
Trang 6Bài 2: Quy trình đánh dấu biotin
1 Mục đích
- Đánh dấu đoạn DNA có chứa đột biến mà ta cần xác định
- Việc đánh dấu này là nhờ vào phản ứng PCR cùng với sự tham gia của các nucleotidesdUTP có gắn chất phát huỳnh quang biotin
2 Cơ sở lý thuyết
- Về bản chất, đây vẫn là phương pháp PCR thông thường Chỉ khác ở chỗ phản ứng PCRđánh dấu Biotin sẽ được bổ sung thêm một loại nucleotide tự do khác có gắn biotin trênphân tử bazơnitơ
- Cấu trúc của nucleotide dUTP có gắn biotin:
+ Phần cấu trúc điển hình của một dUTP: 3 gốc phosphate, đường ribose, bazơ nito uridine.+ Gốc biotin ở cuối
+ Phần “đuôi” gồm 11 gốc carbon, nối phân tử biton với gốc bazonito uridine Bởi lẽ phân
tử biotin có cấu trúc khá cồng kềnh, và để DNA polymerase có thể bám được vớidUTP thì cần phải có cầu nối, đảm bảo tính linh hoạt
Cấu trúc của nucleotide dUTP-11-Biotin.
Cấu trúc của các bazơnitơ.
Trang 7Cấu trúc phân tử biotin-11-dCTP (trái) và biotin-11-dATP (phải).
3 Hóa chất và dụng cụ
- Hệ genome được tách chiết từ hồng
cầu người mang bệnh thiếu máu
- Mồi ASO-β-F 1µM
- Mồi ASO-β-R 1µM
- dNTPs 2mM mỗi loại
- Dream Taq polymerase (5U/µl)
- Đệm Dream Taq polymerase 10X
Trang 8Nồng độ dTTP lớn hơn Biotin-11-dUTP là để hạn chế việc biotin được gắn quá nhiều, dẫn
tới bắt cặp với lượng lớn enzyme alkaline-phosphatase Khi đưa cơ chất vào sẽ lênmàu xanh quá đậm Tỷ lệ dTTp/dUTP-biotin là 3/2
6 Trả lời câu hỏi cuối bài
Câu 1: Vai trò của các thành phần trong phản ứng PCR ?
Nước oãng nồng độ các dung dịch về nồng độ cuối tối ưu nhất cho phản ứng
PCR
Buffer Dream ng dịch đệm thích hợp cho phản ứng, đặc biệt là cho hoạt động của taq
polymerase Vai trò chính của nó là ổn định pH của môi trường
ucleotide tự do:
- d(A,C,G)TP
- dTTP
cấp các nucleotide tự do cho phản ứng tổng hợp sợi DNA mới
Biotin-11-dUTP cấp nucleotide tự do có gắn phóng xạ Cần thiết cho việc đánh dấu biotin
Trang 9Dream Taq me bền nhiệt có khả năng gắn các nucleotide tự do vào đầu 3’OH của mồi.
Nhờ vậy tổng hợp được đoạn DNA mới
DNA tổng số n cho phản ứng PCR
Câu 2: Tại sao biotin lại được gắn vào các đoạn DNA được tổng hợp lên ?
- Biotin được dùng để đánh dấu sản phẩm PCR Nhờ vậy, ta có thể dễ dàng phát hiện được vịtrí của những đoạn DNA này
- Ở bài này, sản phẩm PCR sau đó sẽ được lai với màng Do vậy, nhờ việc đánh dấu biotin, ta
có thể biết được đầu dò và sản phẩm PCR có lai được với nhau hay không
Câu 3: Tại sao phải có hai phản ứng, một đánh dấu và một không đánh dấu biotin?
- Khi làm thí nghiệm, phải luôn có dối chứng để kiểm tra các bước làm hay toàn bộ thí
nghiệm có xảy ra đúng như mong đợi hay không
- Ở đây, mẫu không đánh dấu có vai trò như một mẫu đối chứng âm, giúp kiểm tra xem cóthực sự những nucleotide gắn biotin đã được gắn vào sản phẩm PCR hay không Và việcđiện di kiểm tra là điều chắc chắn phải làm
Câu 4: Kết quả kỳ vọng ?
- Những đoạn DNA có gắn biotin sẽ có khối lượng lớn hơn đoạn DNA cùng kích thướcnhưng không gắn biotin Do vậy, khi điện di, mẫu có gắn biotin sẽ chạy chậm hơn so vớibăng DNA của mẫu không gắn biotin
- Đồng thời, tỉ lệ gắn của nucleotide-biotin vào mỗi sợi DNA là khác nhau Do vậy khi điện
di, tuy cùng 1 sản phẩm PCR những có thể tạo thành nhiều băng khác nhau
Câu 5: Xác định độ dài đoạn PCR ở gene beta-globin được nhân lên bởi hai mồi.
Trang 10Vị trí của cặp mồi ASO trên gene HBB Mồi ASO-F: màu xanh lá ; mồi ASO-R: màu đỏ.
Mồi ASO-F, kích thước: 20 nucleotides
Trình tự trên gene 5’-TCC TGA GGA GAA TCT GCC GT-3’
Trình tự mồi 5’-TCC TGA GGA GAA TCT GCC GT-3’
Mồi ASO-R, kích thước: 23 nucleotides
Trình tự trên gene 3’-AAC GGG TAT TGT CGT AGT CCT CA-3’
5’-TTG CCC ATA ACA GCA TCT GGA GT-3’
Trình tự mồi 5’-GTT GGC CTA AAC GCA TCA GGA GT-3’
Nhận xét:
- Độ dài đoạn DNA được khuếch đại: 159bp
- Những vị trí không bắt cặp giữa mồi và khuôn được bôi màu đỏ
- Mồi ASO-R có đến 5 nucleotides không bắt cặp Điều này có thể là để điều chỉnh cho Tmcủa 2 mồi ASO-F và ASO-R không bị chênh nhau quá nhiều, giúp việc chuẩn điều kiệnPCR là tốt hơn Năm nucleotides không bắt cặp này nằm gần đầu 5’ của mồi nên cũngkhông ảnh hưởng nhiều tới khả năng khuếch đại của taq polymerase
Trang 11Bài 3: Phản ứng ARMS-PCR
1 Mục đích
- Xác định đột biến điểm trên gene beta-globin ở người thông qua phương pháp ARMS-PCR.
- Nhờ vào mồi đặc hiệu cho allen bình thường và allen đột biến, ta có thể biết được kiểu gencủa mẫu bệnh phẩm này là bình thường, đồng hợp đột biến hay dị hợp
- So sánh kết quả PCR với kết quả lai màng để biết quá trình thí nghiệm có bị sai, phươngpháp nào là tốt hơn
2 Cơ sở lý thuyết
- Phương pháp này dựa trên đặc tính DNA polymerase yêu cầu nucleotide ở đầu 3’của mồibắt cặp bổ sung với nucleotide trên sợi khuôn Nếu không thì DNA polymerase sẽ khôngthể tổng hợp được
- Do đó, kỹ thuật này đòi hỏi nucleotide ở đầu 3’ của mồi phải mang tính đặc hiệu
- Khi bổ sung thêm vị trí bắt cặp sai tại một trong 5 nucleotide cuối cùng của mồi làm tăngtính đặc hiệu của sản phảm
3 Hóa chất và dụng cụ
- DNA tổng số được tách chiết từ hồng
cầu người mang bệnh thiếu máu
- Mồi 95 NF 10µM
- Mồi Control R 10µM
- Mồi 41/42 NF 10µM
- Mồi 41/42 MR 10µM
- dNTPs 2mM mỗi loại A,T,G,C
- Gotaq Master Mix 2X
Ta chọn đối chứng âm chứa mồi bình thường là do lo sợ bị nhiễm DNA mang allen lành
từ môi trường xung quanh Do hầu hết mọi người đều không bị bệnh β-Thalassemia nên
Trang 12mỗi cơ thể đều sẽ có ít nhất một allen bình thường Vì vậy, rất dễ bị nhiễm DNA mangallen lành và làm cho kết quả PCR là không chính xác.
Phản ứng với mồi bình thường (2 phản ứng)
Thành phần phản ứng (µl) Nồng độ cuối Master mix x2
Sau đó, chia hỗn hợp master mix ra 2 ống phản ứng và thêm vào các thành phần như trong sau:
Nước Thêm vào phản ứng
2µl nước Không thêm nướcDNA Không thêm DNA Thêm vào phản ứng
Trang 136 Giải thích
Sự khác biệt về nồng độ mồi giữa các phản ứng là để tối ưu điều kiện cho PCR Cặp mồi95NF/Control R được thiết kế để khuếch đại vùng chứa các đột biến được nghiên cứu(Cd17, Cd26, Cd41/42) Và do vậy, băng DNA này lại được sử dụng làm khuôn cho các
Trang 14mồi bên trong Lưu ý, mỗi mồi bên trong lại sử dụng lượng khuôn IC khác nhau cho quátrình tổng hợp DNA của nó.
Tùy vào nồng độ mồi mà băng IC có thể được tạo ra nhiều hay ít Nếu băng DNA nộikiểm quá nhiều sẽ không đủ nguyên liệu cho sự tổng hợp của các đoạn DNA bên trong
Do vậy cần tối ưu nồng độ các mồi cho phản ứng PCR đạt hiệu quả cao
7 Trả lời câu hỏi cuối bài
Câu 1: Nêu vai trò của các thành phần trong phản ứng PCR
- Cặp mồi nội kiểm (IC) 95NF / Control R xác định sự có mặt của gen
beta-globin trong DNA tổng số.
- Cặp mồi 41/42NF / Control R xác định allen bình thường
- Cặp mồi 95NF / 41/42MR xác định allen đột biến
DNA T108 Mẫu DNA tổng số T108, đại diện cho mẫu bệnh phẩm của một người
Câu 2: Kết quả kỳ vọng
- Đối chứng âm (N-) không bị nhiễm
- Vì lý do thể tích của mẫu N+ bị thiếu nên khả năng cao là sẽ không lên băng DNA Tuynhiên, em cho rằng nếu đã có đủ các thành phần, dù thể tích bị thiếu thì phản ứng vẫn xảy
ra, chỉ khác ở độ đậm nhạt của băng DNA Do vậy, em vẫn mong sản phẩm PCR sẽ lênbăng
- Băng DNA của cặp mồi nội kiểm lên đẹp ở cả 2 mẫu N+ và M+
- Một trong 2 băng DNA, hoặc allen đột biến hoặc allen bình thường phải lên Khi đó, ta mới
có thể xác định được kiểu gen của người bệnh
Trang 15- Nếu băng IC hoặc băng DNA đột biến của cả 2 mẫu N+ và M+ không lên tức là phản ứngPCR có vấn đề.
- Vì đã tối ưu nồng độ mồi nên các băng DNA nếu lên phải có độ đậm như nhau
Câu 3: Xác định độ dài đoạn PCR ở gene beta-globin được nhân lên bởi 2 mồi.
- Cặp mồi nội kiểm 95NF/Control R: 700bp
- Cặp mồi xác định allen bình thường của vị trí Cd41/42: 41/42NF/Control R - 355bp
- Cặp mồi xác định allen đột biến của vị trí Cd41/42: 95NF/41/42MR - 405bp
Vị trí các mồi trên gen beta-globin và kích thước sản phẩm PCR tương ứng của chúng.
Bài 4: Điện di các sản phẩm ARMS-PCR trên gel agarose.
1 Mục đích
- Điện di kiểm tra sản phẩm PCR của bài thực hành số 3 (ARMS-PCR)
- Dựa vào kết quả điện di, ta có thể biết được PCR tốt hay không, kiểu gen của người bệnh làbình thường, đồng hợp đột biến hay dị hơp
2 Cơ sở lý thuyết
- Các acid nucleic (DNA và RNA) có chứa gốc phosphate trong phân tử nên sẽ tích điện âm
ở pH trung tính hoặc kiềm
- Do sự tích điện này, những phân tử DNA và RNA sẽ di chuyển về phía cực dương trongđiện trường của dòng điện một chiều
- Tốc độ di chuyển của phẩn tử sẽ phụ thuộc vào:
● Kích thước phân tử: phân tử nhỏ di chuyển nhanh hơn phân tử lớn
● Cấu trúc phân tử: phân tử có cấu hình gọn di chuyển nhanh hơn phân tử cócấu hình cồng kềnh
Trang 16● Nồng độ gel: gel agarose khi đông lại tạo thành cấu trúc mạng lưới, giúp phântách các DNA có kích thước lớn, từ 100bp-vài chục kb Nồng độ gel càng lớn,khả năng phân tách càng tốt.
- Để quan sát băng DNA, ta có thể sử dụng một số thuốc nhuộm như ethidium bromide, redsafe, sybr safe…Đây là những chất có khẳ năng liên kết với mạch đôi của phân tử DNA vàphát huỳnh quang khi được kích thích bằng ánh sáng tia tử ngoại (tia UV) Với EtBr, ta phảinhuộm gel sau khi điện di Còn với Red safe hay Sybr safe, ta sẽ trộn sẵn vào trong gelagarose khi pha
3 Hóa chất và dụng cụ
- Sản phẩm ARMS-PCR
- Thang chuẩn DNA 1kb fermentas
- Gel agarose 2% có chứa Sybr safe
- Đệm TBE 1X
- Bể điện di
- Bộ nguồn điện di agarose
- Pipet 20, đầu côn 200
- Máy UV
4 Cách tiến hành
- Đặt bản gel vào bể điện di có đệm TBE 1X
- Dùng pipet hút mỗi mẫu 15µl sản phẩm PCR (toàn bộ thể tích) và tra vào giếng
Chú ý: tra đúng thứ tự các giếng, tránh chọc đầu côn quá sâu gây thủng giếng hoặc để đầu
côn quá nông gây tràn mẫu ra ngoài
- Bật bộ nguồn và điện di ở 100V cho đến khi thấy dye màu (xanh) chạy đến cuối bản gel
- Đưa bản gel lên máy UV và quan sát, chụp ảnh
5 Kết quả và giải thích
Trang 17Kết quả điện di sản phẩm ARMS-PCR.
Chú thích:
- Thể tích điện di của mẫu: 15µl/lane
- Marker: 1kb fermentas
- Ký hiệu mẫu: + N: mẫu xác định allen bình thường
+ M: mẫu xác định allen đột biến
+ V/1: ca thực hành số 5 (thứ 6 9h30-11h); tổ 1
Nhận xét:
- Kết quả điện di của nhóm em (nhóm 4) được khoanh vùng màu đỏ
- Băng điện di xấu, nguyên nhân có lẽ do lúc tra giếng đẫ để đầu côn chọc mạnh vào gel, làmcho bề mặt giếng không còn thẳng mà hơi lõm
- Băng IC không lên, mẫu M lên một băng DNA, còn mẫu N không lên băng nào Như vậyphản ứng PCR đã bị hỏng
- Về băng DNA của mồi đột biến, mẫu M của tổ 3 và tổ 4 đều lên băng kích thước tươngđồng nhau Và do tổ 3 có băng IC nên ta chắc chắn, băng DNA này có kích thước 405bp
- IC không lên những mẫu M lại lên băng Nghi ngờ do mồi bắt cặp không đặc hiệu, dẫn đếnhiện tượng dương tính giả - một đặc điểm thường thấy ở ARMS-PCR
Về nguyên nhân PCR bị hỏng:
- Do DNA khuôn: lý do này bị loại bỏ ngay vì tổ 2 cũng sử dụng mẫu DNA T108 và cho kết
quả PCR đẹp Băng IC chứng tỏ trong mẫu DNA T108 có sự hiện diện của gen beta-globin.