Untitled BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Họ và tên tác giả luận văn Nguyễn Thị Thanh Hoa TÊN ĐỀ TÀI LUẬN VĂN SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN GEN RB1[.]
TỔ NG QUAN TÀI LI Ệ U
GI Ớ I THI Ệ U CHUNG V Ề B Ệ NH U NGUYÊN BÀO VÕNG M Ạ C
1.1.1 Tình hình u nguyên bào võng mạc trên thế giới và ở Việt Nam
U nguyên bào võng mạc là bệnh ác tính nội nhãn phổ biến ở trẻ em, thường gặp ở trẻ dưới 5 tuổi và do đột biến trên gen RB1 gây ra Mỗi năm, khoảng 9.000 ca mới được phát hiện toàn cầu, với tỷ lệ mắc khoảng 1/15.000 đến 1/20.000 trẻ, không phân biệt giới tính hay nguồn gốc chủng tộc Bệnh gây tử vong cho khoảng 3.001 đến 3.376 trẻ em mỗi năm trên thế giới, đặc biệt ở các nước đang phát triển với tỷ lệ tử vong cao dưới 15%, trong đó châu Á có tỷ lệ tử vong cao hơn nhiều so với châu Âu do hạn chế tiếp cận y tế Trong 100 năm qua, đã có tiến bộ đáng kể trong chẩn đoán và quản lý UNBVM theo nguyên tắc Life, Globe & Vision (Sống sót, Toàn cầu, Thị lực) Tại Việt Nam, chưa có số liệu chính xác về tỷ lệ mắc hàng năm, nhưng số bệnh nhân mắc bệnh tại Bệnh viện Mắt Trung Ương đã tăng từ 29 người vào năm 2004 lên 68 người vào năm 2016, chủ yếu ở trẻ dưới 3 tuổi Mặc dù số lượng không lớn so với các bệnh lý khác, UNBVM là căn bệnh hiểm nghèo, dễ ảnh hưởng đến thị lực và tính mạng nếu không được điều trị sớm và đúng phương pháp Nhiều bệnh nhân nhập viện muộn, bỏ lỡ cơ hội bảo tồn mắt, trong đó có những trường hợp có tiền sử gia đình mắc bệnh, cho thấy rõ vai trò của yếu tố di truyền trong phát triển bệnh.
Trong những năm gần đây, nghiên cứu về chẩn đoán phân tử bệnh ung thư võng mạc (UNBVM) tại Việt Nam đã đạt được nhiều thành tựu quan trọng Năm 2005, các nhà khoa học Việt Nam đã sử dụng kỹ thuật di truyền tế bào để nghiên cứu 30 ca võng mạc, trong đó xác định một bệnh nhân bị đột biến mất đoạn ở nhiễm sắc thể 13q14 Đến năm 2013, nhóm nghiên cứu của tiến sỹ Nguyễn Hải Hà bắt đầu xây dựng quy trình sàng lọc biến đổi di truyền cho bệnh nhân UNBVM bằng giải trình tự trực tiếp, và năm 2014, nhóm đã công bố hai đột biến gen thể di được phát hiện qua mẫu máu của các bệnh nhân Năm 2016, nhóm đã phát triển phương pháp sàng lọc đột biến gen RB1 thông qua phân tích bản phiên mã, giúp xác định các đột biến liên quan đến bệnh Năm 2017, kỹ thuật MLPA được ứng dụng để phát hiện mất đoạn và lặp đoạn lớn trên gen RB1, nâng cao độ nhạy và độ chính xác của chẩn đoán di truyền UNBVM Đến năm 2018, các kết quả nghiên cứu đặc điểm di truyền của gen RB1 trên 34 bệnh nhân UNBVM đã được công bố trên tạp chí Molecular Vision của Mỹ Gần đây nhất, nhóm nghiên cứu của giáo sư Nguyễn Công Kiệt đã tiến hành kiểm tra di truyền trên mẫu máu và mẫu u của 50 bệnh nhân điều trị tại Bệnh viện Mắt TP Hồ Chí Minh, xác định phổ đột biến gen RB1 bao gồm cả đột biến sinh dưỡng và đột biến dòng mầm, đóng vai trò quan trọng trong việc nâng cao khả năng chẩn đoán di truyền cho bệnh UNBVM tại Việt Nam.
1.1.2 Biểu hiện lâm sàng của UNBVM.
Biểu hiện của UNBVM rất đa dạng, bao gồm đồng tử có màu trắng, lác mắt, giảm thị lực và rung giật nhãn cầu Trong giai đoạn muộn, bệnh có thể gây ra các triệu chứng như mắt đỏ, đau nhức do tăng nhãn áp thứ phát, nhìn mờ, lồi mắt, viêm tổ chức quanh hốc mắt, đồng tử giãn, mủ tiền phòng, mống mắt dị sắc và trẻ chậm phát triển Đồng tử trắng là dấu hiệu phổ biến nhất, chiếm 60% các trường hợp, đặc biệt khi trẻ nhìn trong bóng tối hoặc phòng tối, ánh sáng phản chiếu tạo ra màu trắng hoặc vàng khi chụp ảnh có đèn flash Dấu hiệu thứ hai để nhận biết là trẻ bị lác hoặc lé, chiếm 20%, và nếu bé bị lác trong vòng 6 tháng tuổi thì cần nghi ngờ có UNBVM.
Chẩn đoán UNBVM có thể tiến hành theo các phương pháp sau:
Soi đáy mắt là phương pháp khám quan trọng để chẩn đoán bệnh, giúp nhận diện các tổn thương ở võng mạc biểu hiện khác nhau tùy theo tiến triển của u Các phương pháp chẩn đoán hình ảnh như siêu âm và chụp cắt lớp giúp xác định kích thước, vị trí khối u và phát hiện hình ảnh canxi hóa đặc trưng của UNBVM Ngoài ra, chụp MRI cung cấp hình ảnh chi tiết về nhãn cầu, hốc mắt và não, trong khi quét xương toàn thân bằng Technetium-99m và PET-CT giúp phát hiện sớm di căn xa Đa số trẻ em mắc UNBVM không cần làm chụp xương trừ khi có nghi ngờ lan rộng ra ngoài mắt, nhằm đảm bảo chẩn đoán chính xác và lập kế hoạch điều trị phù hợp.
Hình 1.1 Hình ảnh siêu âm của
Hình 1.2Hình ảnh chụp cắt lớp vi t nh của UNBVM
N uồn: https://bacsinoitru.vn/content/chan-doan-va-dieu-tri-u-nguyen-bao- vong-mac-1236.html
Chẩn đoán UNBVM có thể dựa trên kiểm tra mô bệnh học và phân tích di truyền học tế bào lympho máu ngoại vi để phát hiện các đột biến liên quan đến mất đoạn hoặc sắp xếp lại trên chromosome 13q14.1-14q2, với tỷ lệ gặp khoảng 5% ở các trường hợp mắt đơn bên và 7,5% ở các trường hợp mắt hai bên Ngoài ra, kiểm tra cẩn thận các dây thần kinh thị giác là cần thiết để xác định khả năng xâm nhập của các tế bào khối u trong quá trình chẩn đoán.
* Kiểm tra di truyền phân tử:
Việc phát hiện sớm trẻ em có nguy cơ phát triển UNBVM rất quan trọng để bảo vệ tính mạng và thị lực của các trẻ Xét nghiệm di truyền đóng vai trò thiết yếu trong chăm sóc bệnh nhân UNBVM, đặc biệt là xác định các đột biến gen RB1 – gen ức chế khối u đầu tiên được phát hiện Phần lớn các đột biến RB1 là đột biến riêng của gia đình và phân bố toàn bộ trong gen, bao gồm vùng promoter, exon, và khu vực nối intron Chẩn đoán UNBVM thể di truyền được thực hiện chủ yếu ở những bệnh nhân có tiền sử gia đình hoặc mang bệnh, mặc dù đa số bệnh nhân mắc bệnh không có tiền sử gia đình Do đó, xác định các đột biến di truyền là bước quan trọng trong việc phát hiện sớm và quản lý bệnh hiệu quả.
8 một biến thể gây bệnh dòng mầm dạng dị hợp tử trên gen RB1 trong x t nghiệm di truyền phân tử là cần thiết để xác định xem UNBVM có phải là dạng di truyền hay không và cho ph p chẩn đoán, sàng lọc sớm nguy cơ cho các thành viên trong gia đình [20]
Chẩn đoán UNBVM dựa trên các phát hiện lâm sàng và kết quả hình ảnh chẩn đoán Xác định giai đoạn của khối u tại thời điểm chẩn đoán là vô cùng quan trọng để lập kế hoạch điều trị phù hợp Hiểu biết về hệ thống phân loại u nguyên bào võng mạc, đặc biệt là phân loại Reese-Ellsworth, giúp bác sĩ đánh giá chính xác mức độ tiến triển của bệnh và dự đoán khả năng điều trị thành công Phân loại Reese-Ellsworth được phát triển vào những năm 1960 bởi Tiến sĩ Algernon Reese và Tiến sĩ Robert.
Ellsworth là hệ thống phân loại đƣợc sử dụng rộng rãi nhất đối với các khối u nội nhãn và dựa trên vị tr , số khối u và k ch thước của khối u [25]
Bảng 1.1: Hệ thống phân loại Reese Ellsworth cho phân loại u nguyên bào võng mạc [25]
Nhóm Khả năng bảo tồn thị lực Đặc điểm
Khả năng bảo tồn thị lực rất cao nhờ vào việc phát hiện các khối u đặc, kích thước nhỏ hơn 4 Diopters (DD), nằm tại hoặc sau đường x đạo b Trong những trường hợp có nhiều khối u với kích thước lớn hơn 4 DD, chúng đều nằm tại hoặc sau đường x đạo b, đảm bảo khả năng duy trì thị lực tối đa cho bệnh nhân.
II Khả năng bảo tồn thị lực cao a, Khối u đặc, k ch thước 4 -10 DD , tại hoặc sau đường x ch đạo. b, Nhiều khối u, k ch thước 4 - 10 DD, sau đường x ch đạo.
III Có thể bảo tồn thị lực a, Bất kỳ tổn thương nào ở trước đường x ch đạo. b, Khối u đặc > 10 DD, ở sau đường x ch đạo
IV Không thuận lợi trong bảo tồn thị lực a, Nh iều khối u, một số > 10 DD b, Bất kỳ tổn thương nào lan về ph a trước tới bờ răng cƣa
V Rất khó khăn trong bảo tồn thị lực a, Những khối u lớn xâm lấn quá một nửa võng mạc b, Gieo mầm vào pha lê thể.
Hệ thống phân loại Reese Ellsworth ban đầu được thiết kế để dự đoán kết quả điều trị bằng xạ trị chùm tia ngoài (EBRT), phương pháp điều trị bảo tồn mắt phổ biến trước thập niên 1990 Tuy nhiên, hệ thống này có nhược điểm khi đánh giá cao các khối u ngoại biên, nhiều khối u và khối u lớn là những yếu tố nguy hiểm hơn và tiên lượng xấu hơn trong điều trị bằng xạ trị Hệ thống phân loại Reese Ellsworth cũng không giải quyết được vấn đề gieo hạt dưới võng mạc hay phân biệt giữa gieo hạt vào thủy tinh thể khu trú và khuếch tán, dẫn đến hạn chế trong dự đoán kết quả điều trị bằng hóa trị liệu Do đó, nhiều trung tâm đã thống nhất xây dựng hệ thống phân loại mới do Murphree và cộng sự thiết kế, nhằm cải thiện độ chính xác trong dự đoán kết quả điều trị và đảm bảo hiệu quả trong việc lựa chọn phương pháp điều trị phù hợp.
Bảng 1.2: Hệ thống phân loại quốc tế cho u nguyên bào võng mạc nội nhãn [27]
Nhóm Đặc điểm lâm sàng
Tất cả các khối u có kích thước 3 mm hoặc nhỏ hơn, giới hạn ở võng mạc và cách dây thần kinh thị giác tối thiểu 1.5 mm, đảm bảo an toàn trong quá trình điều trị Ngoài ra, cần đặc biệt chú ý không để khối u gieo hạt vào thủy tinh thể để tránh các biến chứng nguy hiểm.
Các khối u võng mạc có thể có kích thước và vị trí khác nhau, nhưng không thuộc nhóm A Không nên gây tổn thương thủy tinh thể khi xử lý các khối u này Trong một số trường hợp, lượng nhỏ dịch, không quá 5 mm, có thể được dùng để bơm vào khu vực xung quanh khối u để hỗ trợ điều trị hiệu quả.
Gieo rắc hạt tại chỗ Hạt thủy tinh có thể k o dài không quá 3 mm t khối u Có thể có tới một phần tư dịch dưới màng lưới.
Nguy cơ cao D Gieo rắc hạt lan tràn, khối u có thể to hơn một phần tƣ của võng mạc.
Ngoài ra, bệnh nhân còn gặp phải các vấn đề về mắt như tăng nhãn áp thứ phát, xuất huyết nội nhãn, viêm tổ chức hốc mắt không nhiễm khuẩn, khối u xâm lấn vào thủy tinh thể hoặc UNBVM di căn, gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến thị lực và sức khỏe mắt.
Mục tiêu đầu tiên của điều trị là đảm bảo t nh mạng của người bệnh và sau đó là thị lực Bên cạnh việc phân loại mắt và giai đoạn khối u thì cần lựa chọn phương pháp điều trị dựa trên nhiều yếu tố bao gồm: số lượng các ổ khối u (bị một bên và chỉ có một khối u; bị một bên và có nhiều khối u; bị cả hai bên mắt), vị tr và k ch thước khối u trong mắt, có gieo mầm vào pha lê thể và dưới võng mạc hay không, khả năng bảo tồn thị lực và tuổi bệnh nhân Các phương pháp đƣợc sử dụng trong điều trị UNBVM bao gồm:
GI Ớ I THI Ệ U V Ề GEN RB1
Khoảng 40% ca ung thư nguyên bào võng mạc (UNBVM) là thể di truyền, trong khi 60% còn lại là thể không di truyền Các trường hợp UNBVM có yếu tố gia đình hoặc không có đều được cho là hậu quả của đột biến mất chức năng gen RB1 trên nhiễm sắc thể 13q14 Gen RB1 gồm 27 exon và 26 intron, có khối lượng phân tử khoảng 180kb, tạo thành đoạn DNA dài từ 31 đến 1889 cặp base Sản phẩm của gen RB1 là phosphoprotein p110, có trọng lượng phân tử khoảng 110 kDa, gồm 928 amino acid.
Hình 1.9: Vị tr gen RB1 trên nhiễm sắc thể số 13.
Hình 1.10: Cấu trúc gen và protein RB1
RB1 mã hóa cho protein RB, một protein có vai trò kiểm soát khối u Protein RB hoạt động như một chất kiềm chế sự tăng trưởng tế bào, giúp điều chỉnh quá trình phân chia tế bào một cách hợp lý Nhờ đó, RB duy trì sự cân bằng trong quá trình sinh trưởng của tế bào, ngăn chặn tình trạng phân chia quá mức hoặc không kiểm soát Điều này cho thấy tầm quan trọng của RB trong việc ngăn ngừa các bệnh lý liên quan đến tăng sinh tế bào, đặc biệt là các loại ung thư.
Cơ chế gây bệnh liên quan đến RB1 bị ức chế khi phosphoryl hóa bởi các enzyme kinase phụ thuộc cyclin (cyclin-dependent kinase) Khi không bị phosphoryl hóa, RB1 ở trạng thái hoạt động, gắn kết với các thành phần trong phức hệ phiên mã E2F để bất hoạt chúng Phức hệ E2F đóng vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy tế bào tiến vào giai đoạn phân chia, do đó, sự thay đổi trạng thái của RB1 ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình kiểm soát chu kỳ tế bào và phát triển bệnh lý.
S, giai đoạn tổng hợp DNA trong chu kỳ tế bào cho nên khi pRb hoạt động sẽ làm đình chỉ quá trình tăng sinh tế bào Với t nh năng như vậy bình thường pRb hoạt động nhƣ một cái “hãm” cho hoạt động sinh sản tế bào và khi pRb bị bất hoạt do bị phosphoryl hóa thì hoạt động sinh sản tế bào mới bắt đầu trở lại Khi xảy ra các đột biến làm mất chức năng của gen RB1 hoặc trong những trường hợp gia tăng sự methyl hóa vùng 5’ của gen này có thể dẫn tới tình trạng bất hoạt thường xuyên của gen, khi đó cơ chế kìm hãm hoạt động sinh sản của tế bào không còn nữa, tế bào sẽ tăng sinh không kiểm soát gây ung thƣ [41]
Knudson đề xuất giả thuyết về hai đột biến liên tiếp liên quan đến gen RB1, trong đó lần đầu tiên là đột biến trong các exon của gen này gây ảnh hưởng đến di truyền, còn lần thứ hai là đột biến soma làm thay đổi tế bào sinh sản và dẫn đến sự hình thành khối u.
Các đột biến trong gene RB1 có tính chất không đồng nhất và phân bố trên cả vùng promoter và 27 exon, trong đó hơn hai phần ba gây ra kết thúc sớm quá trình dịch mã, dẫn đến protein RB không hoàn chỉnh Năm 2005, các nghiên cứu đã xác định 16 điểm nóng đột biến của gene RB1, bao gồm các dạng đột biến vô nghĩa, đột biến ảnh hưởng đến cắt mRNA và đột biến sai nghĩa Phần lớn các đột biến tái phát liên quan đến sự thay đổi C>T trong bộ ba CGA ở các exon 8, 10, 11, 14, góp phần vào sự đa dạng di truyền của bệnh liên quan đến gene RB1.
15, 17, 18 và 23 [43] Cho đến nay, hơn 1700 đột biến đã đƣợc đƣa vào cơ sở dữ liệu đột biến gen RB1 (RB1 Gene Mutation Database).
CÁCH TI Ế P C ẬN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C Ứ U, K Ỹ THU Ậ T
SỬ DỤNG NHẰM XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN RB1 TRÊN THẾ GIỚI
Phương pháp xét nghiệm phân tử, bao gồm xét nghiệm đơn gene, được sử dụng để xác định xem bệnh nhân UNBVM có phải thuộc dạng di truyền hay không Đối với bệnh nhân bị UNBVM một bên mắt, hoặc hai bên mắt hoặc có nhiều khối u dù chỉ một bên mắt, phân tích trình tự và mất/lặp đoạn lớn của gen RB1 được thực hiện trên DNA máu ngoại vi Đặc biệt, với các bệnh nhân bị UNBVM một bên mắt nhưng có nhiều khối u và không có tiền sử gia đình, nếu không có mẫu mô khối u, các xét nghiệm này vẫn có thể thực hiện trên DNA máu ngoại vi Trong trường hợp có mẫu mô khối u, phân tích trên DNA mẫu mô sẽ được thực hiện trước, sau đó so sánh với DNA từ máu để xác định sự xuất hiện của biến thể gen Phân tích trình tự nhằm phát hiện các đột biến điểm, mất/lặp đoạn nhỏ hoặc biến thể vô nghĩa, sai, trong vùng promoter, exon, và vùng nối intron-exon của gen RB1, giúp xác định khả năng gây bệnh của biến thể di truyền này.
Nghiên cứu về phát hiện đột biến gen RB1 chủ yếu sử dụng các phương pháp như giải trình tự nhằm xác định các điểm cắt nối tạo mRNA, tuy nhiên phương pháp này không phát hiện được các đột biến mất hoặc lặp đoạn lớn Các kỹ thuật phân tích mất/ lặp đoạn bao gồm PCR định lượng (qPCR), long-range PCR, MLPA và microarray, giúp mở rộng khả năng phát hiện các đột biến lớn hơn Năm 2016, một nghiên cứu tại Mỹ đã ứng dụng công nghệ giải trình tự thế hệ mới để xác định các đột biến điểm, indels nhỏ, và mất đoạn/lặp đoạn lớn trên toàn bộ gen RB1, đồng thời phát hiện được các đột biến dạng khảm trong mẫu máu Hiện nay, quy trình xét nghiệm đột biến gen RB1 phổ biến kết hợp sàng lọc vùng mã hóa bằng giải trình tự với phân tích mất đoạn/lặp đoạn lớn bằng MLPA, nhằm nâng cao độ nhạy Các nghiên cứu cho thấy phối hợp kỹ thuật giải trình tự và MLPA giúp tăng tỷ lệ phát hiện đột biến, cụ thể như nghiên cứu của nhóm Trung Quốc đạt tỷ lệ 78.6% khi dùng giải trình tự, và nâng lên 92.3% khi kết hợp MLPA Tương tự, tại Malaysia, tỷ lệ phát hiện đột biến qua phối hợp hai kỹ thuật này là 52.6%, cao hơn đáng kể so với sử dụng riêng lẻ giải trình tự (36.8%) và MLPA (15.8%) Ngoài ra, phương pháp MLPA kết hợp giải trình tự đã được sử dụng trong sàng lọc đột biến gen RB1 ở bệnh nhân u nguyên bào võng mạc tại các quốc gia như Iran, Brazil, Argentina và Singapore, khẳng định tính hiệu quả của chiến lược phối hợp các kỹ thuật trong chẩn đoán gen bệnh này.
NGUYÊN VẬT LİỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHİÊN CỨ U
V ẬT LİỆU NGHİÊN CỨ U
2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là ba mươi bệnh nhi đã được chẩn đoán UNBVM trên lâm sàng và cận lâm sàng t năm 2013 đến 2018 tại Bệnh viện Mắt trung ƣơng Chẩn đoán UNBVM đƣợc thiết lập theo tiêu chuẩn nhãn khoa và mô học Độ tuổi chẩn đoán là t 3 đến 36 tháng tuổi Cha mẹ các bệnh nhi đồng ý tham gia nghiên cứu tự nguyện Mẫu máu ngoại vi của bệnh nhân và người thân trong gia đình đƣợc thu thập và đƣợc bảo quản ở - 20°C cho đến khi tách chiết DNA Khi một bệnh nhân đƣợc xác định là có đột biến dòng mầm, cha mẹ và anh chị em của bệnh nhân sẽ đƣợc tƣ vấn di truyền để kiểm tra đột biến ở cùng vị trí nucleotide trên gen RB1 Nghiên cứu này đã đƣợc chấp thuận của Hội đồng Đạo đức trong nghiên cứu Y Sinh học (Institutional Review Board-IRB) của Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Phương pháp nghiên cứu phù hợp với các quy định của Tuyên bố Helsinki và Hiệp hội nghiên cứu về thị lực và nhãn khoa (Research in Vision and Ophthalmology- ARVO) trên các đối tượng con người
2.1.2 Dụng cụ, trang thiết bị
Các máy móc, thiết bị phục vụ cho nghiên cứu này thuộc Viện nghiên cứu hệ gen, Viện hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam Các thiết bị sử dụng chính bao gồm: Máy ly tâm Eppendorf (Đức) và máy ly tâm lạnh đa năng 5810R* (Đức); Máy PCR Mastercycler pro S (Đức); Máy soi gel và chụp ảnh tự động DigiDoc-It® Imaging System của Ultra-violet production (Mỹ); Máy đo
24 quang phổ (UV- Vis BioSpectrometer Basic, Đức); Máy đọc trình tự gen ABI
3500 Genetic Analyzer của Applied Biosciences (Mỹ)…
*Hó t đ t ết N : Sử dụng kit E.Z.N.A.® Blood
DNA Minicủa OMEGA bio-tek, Mỹ.
Agarose của Affymetrix, Cleveland, Mỹ; Dung dịch TAE 1X; Loading Buffer 6X; Ethidium bromide
*Hó t t ện kỹ t uật PCR:
Taq 2X Master Mix của New England Biolab, Mỹ; dNTPs, Nước 3D (deionized double distilled (3D) water) và DMSO t bioWORLD, Mỹ; Các đoạn mồi đƣợc đặt hàng t Intergated DNA Technologies (IDT), Mỹ.
* Hó t đ t n sạ sản p ẩm PCR:
Sử dụng kit Gen JETTM PCR purification của Thermo Scientific, Mỹ.
Ethanol của Merk, Mỹ; Kit giải trình tự Big Dye Terminator v3.1 của Applied Biosciences
* Hó t t ện p ản ứn MLP :
Bộ kit SALSA MLPA P047-D1 RB1 Probemix (MRC-Holland,
PHƯƠNG PHÁP NGHİÊN CỨ U
Quá trình nghiên cứu đươc thực hiện theo sơ đồ sau:
Bệnh nhân được lấy 2 mL máu tĩnh mạch và đưa vào ống chứa chất chống đông EDTA với hàm lượng 1,5 mg/mL để giữ mẫu máu an toàn Quy trình lấy máu được thực hiện đảm bảo vô trùng tuyệt đối để tránh nhiễm khuẩn Sau khi thu mẫu, máu được bảo quản ở nhiệt độ -20°C cho đến khi tiến hành tách chiết DNA, đảm bảo chất lượng mẫu DNA tối ưu cho các phân tích sau này.
2.2.2 Phương pháp tách chiết DNA genomic
Các mẫu máu của đối tượng nghiên cứu được tách chiết DNA tổng số bằng kit E.Z.N.A Blood DNA mini (Promega) theo hướng dẫn của nhà sản xuất để đảm bảo độ chính xác và hiệu quả Sau khi tách, nồng độ DNA được xác định bằng kit Qubit Fluorometer BR (Broad-range), dựa trên nguyên lý protein huỳnh quang, trong đó dye Qubit liên kết với DNA sợi đôi để đo lượng DNA chính xác Phương pháp này cho phép xác định nồng độ DNA một cách nhanh chóng và đáng tin cậy, giúp đáp ứng yêu cầu của các nghiên cứu sinh học phân tử.
Qubit Fluorometer đo nồng độ DNA dựa trên tín hiệu huỳnh quang liên quan đến mức độ gắn kết của dye với DNA Thiết bị này sử dụng chuẩn độ DNA đã được xây dựng sẵn từ hai mẫu chuẩn có trong bộ kit để xác định chính xác nồng độ DNA trong mẫu Nhờ công nghệ này, người dùng có thể thu thập dữ liệu đáng tin cậy về lượng DNA sợi đôi, tối ưu cho các ứng dụng nghiên cứu và phân tích sinh học.
2.2.3 Phương pháp khuếch đại gen (PCR)
2.2.3.1 ết kế mồ o PCR và s qu n n
Cặp mồi nhân vùng điều khiển gen đƣợc thiết kế dựa trên trình tự nhân chuẩn của RB1 mang accession number NM.000321.2 trong ngân hàng
GenBank Các cặp mồi này đều cho ph p nhân đƣợc toàn bộ exon đ ch và 50- 100bp thuộc hai intron liền kề
Bảng 2.1 Các cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR
Vùng K ch thướ c(bp) M ồ i Trình t ự 5 ’ - 3’
Tổng phản ứng là 25 àl bao gồm 20 ng DNA genome, 0.4 pmol mồi mỗi loại, và 12.5 àl Taq 2X Master Mix (New England Biolab, Ipswich, MA)
Dimethyl sulfoxide (DMSO) đƣợc bổ sung vào phản ứng khuếch đại cho đoạn promoter-exon1
Quá trình khuếch đại đƣợc thực hiện trong các điều kiện sau đây: giai đoạn biến t nh ban đầu là 2 phút ở 95°C, tiếp theo là 35 chu kỳ của giai đoạn biến tính ở 95°C trong 30 giây; nhiệt độ gắn mồi đặc hiệu cho mỗi mồi trong 30 giây; 68°C trong 30 giây đến 1 phút và bước cuối cùng ở 68°C trong 5 phút
Sản phẩm PCR đƣợc phát hiện bằng điện di trên gel agarose 1.2 % có nhuộm ethidium bromide và quan sát dưới ánh sáng UV
Sản phẩm PCR sau đó đƣợc tinh sạch bằng kit Gen JETTM PCR purification (Thermo Scientific) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Bổ sung Binding Buffer vào các ống eppendorf có chứa mẫu với tỷ lệ thể t ch Binding/ mẫu là 1:1
Để đảm bảo hiệu suất của quá trình binding DNA, cần kiểm tra màu sắc của dung dịch Màu vàng cho thấy dung dịch có độ pH tối ưu cho quá trình binding DNA Trong trường hợp dung dịch có màu cam hoặc tím, cần bổ sung 10μL sodium acetate 3M, pH 5.2, sau đó trộn đều để đạt được mức pH phù hợp, giúp tăng hiệu quả của quá trình.
Chuyển hỗn hợp sang cột tinh sạch Ly tâm 14000rpm trong 1 phút ở 25°C Sau đó loại bỏ dịch.
Bổ sung 700μL Wash Buffer vào cột tinh sạch Ly tâm 14000rpm trong 1 phút ở 25°C Sau đó loại bỏ dịch.
Chuyển cột tinh sạch sang ống eppendorf 1.5mL
Bổ sung 35μL Elution Buffer vào ch nh giữa cột tinh sạch Ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng Ly tâm 14000rpm trong 1 phút ở 25°C.
Loại bỏ cột tinh sạch Thu sản phẩm
Sản phẩm thu được sẽ được kiểm tra bằng phương điện di trên gel agarose
2.2.4 Phương phápgiải trình tự gen
PCR cho giải trình tự.
Sản phẩm PCR tinh sạch sẽ đƣợc sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR sử dụng bộ kit BigDye Terminator V3.1 theo hai chiều xuôi và ngƣợc cho mỗi đoạn cần đọc Mỗi phản ứng PCR cho giải trỡnh tự gen bao gồm: 1 àl BigDye sequencing Buffer 5X, 1 àl mồi xuụi hoặc mồi ngƣợc 1.6 pmol/àl, 1 àl Big Dye,
2 àl DNA đó được tinh sạch, 5.5 àl nước khử ion vụ trựng
Kỹ thuật PCR cho giải trình tự gen đƣợc tiến hành trên máy luân nhiệt (MJ Research) với chu trình nhiệt nhƣ sau: biến t nh ban đầu với 96°C trong vòng 1 phút, tiếp theo là 25 chu kỳ của sự biến tính ở 96°C trong 10 giây; 50°C
31 trong 5 giây; 60°C trong 4 phút Giảm nhiệt nhanh đến 4°C và giữ cho đến khi sử dụng
Tinh sạch sản phẩm PCR cho sequencing
Sau khi thực hiện PCR, dung dịch chứa sản phẩm được pha trộn với 3 ml EDTA và 60 ml ethanol 100% để giúp tách DNA Tiếp theo, hỗn hợp được ly tâm ở 4000 rpm trong 30 phút tại 4ºC nhằm tách DNA kết tủa Cuối cùng, DNA kết tủa được sấy khô ở nhiệt độ phòng trong vòng 15 phút để chuẩn bị cho các bước phân tích tiếp theo.
Bổsung 10 μL Hi-Di vào t ng mẫu Sau đómix đều mẫu Tiếp theo mẫu đươc biến tính bằng máy PCR ở 95°C trong 2 phút trước khi làm lạnh nhanh bằng đá.
Mẫu đã sẵn sàng cho giải trình tự.
Chạy điện di mao quản trên máy giải trình tự gen ABI 3500 Gentic Analyzer
Các nucleotid trên đoạn gen sẽ đƣợc biểu hiện bằng các đỉnh (peak) với
4 màu tương đương với 4 loại nucleotid A, T, G, C.
2.2.5 Phương pháp Multiplex Ligation-dependent Probe
Kỹ thuật MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) được sử dụng để xác định mất đoạn hoặc thêm đoạn trong gen RB1, giúp phát hiện các biến thể gen chính xác và hiệu quả Quá trình này thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất bộ kit SALSA MLPA P047-D1, đảm bảo độ chính xác cao trong chẩn đoán các bất thường gen liên quan đến RB1.
RB1 Probemix P047-D1 cung cấp các đầu dò cho 26 trong số 27 exon của gene RB1, giúp kiểm tra hiệu quả các exon quan trọng Tuy nhiên, không có đầu dò để kiểm tra exon 15 do vị trí gần các exon lân cận, làm khó khăn trong việc thiết kế mẫu dò phù hợp Bảng kiểm tra bao gồm 5 mẫu dò cho exon 1, 2 mẫu dò cho exon 12 và 2 mẫu dò cho exon 27, đảm bảo độ chính xác cao trong phát hiện biến thể của gene RB1 Probemix này là công cụ quan trọng trong chẩn đoán và nghiên cứu các bệnh liên quan đến đột biến RB1.
Trong vùng nối của gen RB1, gồm các phân đoạn trước 48 kb và sau 35 kb của gen, có sự hiện diện của các mẫu dò cho gen DLEU1 và hai mẫu dò cho gen PCDH8 với kích thước lần lượt là 1,6 Mb và 4,5 Mb ở phía sau của RB1 Ngoài ra, bộ probemix gồm 13 mẫu dò tham chiếu, giúp phát hiện một số vị trí khác nhau trên nhiễm sắc thể thường, nâng cao khả năng phân tích và chẩn đoán chính xác.
* Th c hiện phản ứng MLPA Để chuẩn bị cho phản ứng MLPA, DNA tổng sốđƣợc pha loãng về nồng độ 10ng/μl trong đệm TE 50ng DNA tổng số với thể t ch 5μl đƣợc sử dụng cho phản ứng MLPA Các bước được tiến hành như sau:
Thêm 5μl DNA tổng số (50ng) vào mỗi ống PCR 0.2ml Biến tính DNA tổng số bằng máy PCR trong 5 phút ở 98 0 C, làm lạnh mẫu xuống 25 0 , sau đó đƣa mẫu ra khỏi máy PCR
- Vortex đều MLPA buffer và MLPA probemic trước khi sử dụng, spin down nhẹ các ống mẫu.
- Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng lai (hybridization mastermix):
[1.5 μl MLPA buffer + 1.5 μl probemix]/1 phản ứng lai Trộn đều hỗn hợp bằng pipetting hoặc vortex
- Thêm 3 μl hỗn hợp phản ứng lai vào mỗi mẫu DNA đã được biến t nh trước đó, trộn đều bằng pipetting
- Tiếp tục chu trình nhiệt: ủ trong 1phút ở 95 0 C, 16-20 giờở 60 0 C
Bước 3: Phản ứng gắn kết
- Chuẩn bị hỗn hợp Ligase 65:
[25 μl DDW + 3 μl Ligase Buffer A + 3 μl Ligase Buffer B]/1 phản ứng Sau đó thêm 1 μl Ligase 65 enzyme và trộn đều hỗn hợp bằng pipetting (không vortex)
Tiếp tục chu trình nhiệt: hạ nhiệt độ t 60 0 xuống 54 0 và giữở nhiệt độ này
- Khi mẫu đang ở 54 0 C trong máy PCR, thêm 32 μl hỗn hợp ligase 65 vào mỗi ống mẫu, trộn đều bằng pipetting.
- Tiếp tục chu trình nhiệt: ủ 15 phút ở 54 0 C (gắn kết hai phần của đầu dò), ủ 5 phút ở 98 0 C (bất hoạt enzyme ligase 65) D ng ở 20 0 C Lúc này các ống mẫu có thể đƣợc lấy ra khỏi máy PCR.
- Vortex Salsa PCR primer mix Làm ấm Polymerase trong tay 10 giây để giảm độ nhớt.
- Chuẩn bị hỗn hợp enzyme polymerase:
[7.5 μl DDW + 2 μl Salsa PCR primer + 0.5 μl Salsa polymerase]/ 1 phản ứng
Trộn đều bằng pipetting và giữ hỗn hợp này trên đá.
- Khi các ống mẫu ở nhiệt độ phòng, thêm 10 μl hỗn hợp chứa polymerase vào mỗi ống mẫu Trộn đều bằng pipetting
- Tiếp tục chu trình nhiệt: 35 cycles x (95 0 C: 30 giây, 60 0 C: 30 giây, 72 0 C: 60 giây); 72 0 C: 10 phút; 15 0 C: pause
Sản phẩm PCR được lưu ở 4 0 (1 tuần) hoặc -25 0 C (lưu giữ lâu dài), bọc trong giấy bạc hoặc hộp tối và tránh ánh sáng
* Đ ện di mao quản p n t đoạn
- 0.7 μl sản phẩm PCR đƣợc sử dụng để điện di mao quản nhằm phân tách các phân đoạn đã được khuếch đại theo k ch thước
Chuẩn bị phản ứng PCR bao gồm pha trộn 0.7 μl sản phẩm PCR với 0.2 μl sản phẩm PCR LIZ (GS500) và 9 μl HiDi formamide để đảm bảo hiệu quả phản ứng cao Đĩa phản ứng sau đó được làm nóng ở 86°C trong 3 phút giúp tăng hoạt động của enzyme, trước khi làm lạnh xuống 4°C trong 2 phút để chuẩn bị cho quá trình điện di mao quản Quá trình này đảm bảo mẫu xét nghiệm sẵn sàng cho bước phân tích tiếp theo, nâng cao độ chính xác và độ nhạy của phương pháp.
- Các thông sốđiện di mao quản đƣợc thiết lập nhƣ sau:
Thiết bị Mao quản Cài đặt
ABI-3500 8 mao qu ả n- 50cm Run module: Fragment analysis
Injecttion voltage: 1.6kV Injection time: 15sec Run voltage: 15kV Run time: 1800s Oven temperature: 60 0 C Polymer: POP 7
2.2.6 Phương pháp phân tích kết quả
2.2.6.1 Phân tích kết quả giải trình t gen
KẾ T QU Ả VÀ TH Ả O LU Ậ N
K Ế T QU Ả
3.1.1 Thu thập mẫu nghiên cứu
Trong tổng số 30 mẫu bệnh nhi mắc UNBVM được chẩn đoán lâm sàng và cận lâm sàng, có 70% là nữ (21 trẻ) và 30% là nam (9 trẻ) Các bệnh nhi được phân thành hai nhóm dựa trên đặc điểm tổn thương: 30% mắc UNBVM một bên mắt và 70% mắc đồng thời cả hai bên mắt Về tính chất di truyền, có 70% là các trường hợp tự phát, trong khi 30% là các trường hợp có tiền sử gia đình Trong số các bệnh nhân có tiền sử gia đình, có một trường hợp ban đầu được chẩn đoán là UNBVM hai mắt thể tự phát, nhưng sau đó đã được phân loại lại thành nhóm có tiền sử gia đình do em gái của bệnh nhân phát triển bệnh Thông tin lâm sàng của các bệnh nhân được tổng hợp trong bảng 3.1.
Bảng 3.1 Đặc điểm lâm sàng của các đối tƣợng nghiên cứu bệnh Mã nhi
Kiểu hình Điều trị Mẫu bố/ mẹ thu đƣợc
Số mắt bị UNBVM Thể tự phát (S) or theo gia đình (Fa)
RB2 Nữ/12 Một mắt S NA Mẹ
RB5 Nữ Hai mắt S NA Mẹ
RB7 Nam Hai mắt Fa, Anh trai bị
UNBVM đã chết NA Mẹ
RB8 Nữ Hai mắt Fa, chị gái bị
UNBVM đã chết Đã loại bỏ nhãn cầu (mắt trái) Mẹ
(mắt phải) S Hóa trị Mẹ
RB12 Nữ Hai mắ t S Đã loại bỏ nhãn cầu (mắt trái), laser (mắt phải) Mẹ
RB13 Nữ Hai mắt Fa, Anh trai và chị gái bị UNBVM NA Mẹ
RB15* Nữ Hai mắt S, em gái bị
UNBVM (RB24) Đã loại bỏ nhãn cầu (mắt trái), hóa trị Bố mẹ
RB16 Nam Hai mắt S NA Mẹ
RB17 Nam Một mắt Fa, Bố bị UNBVM mắt phải, đã loại bỏ nhãn cầu NA Bố mẹ
RB20 Nam Hai mắt Fa, Bố bị UNBVM mắt phải, đã loại bỏ nhãn cầu NA Bố mẹ
RB21 Nam Hai mắt Fa, Bố bị UNBVM một mắt, đã loại bỏ nhãn cầu NA Bố
RB23 Nữ Một mắt) S NA Mẹ
Fa, chị gái bị UNBVM (RB15) Laser (mắt phải) Bố mẹ
RB25 Nữ Hai mắt S Đã loại bỏ nhãn cầu (mắt trái), hóa trị
RB26 Nữ Hai mắt S NA Mẹ
RB28 Nữ Hai mắt S Đã loại bỏ nhãn cầu (mắt phải), hóa trị Mẹ
RB35 Nữ Hai mắt Fa, Bố bị UNBVM mắt phải, đã loại bỏ nhãn cầu. Đã loại bỏ nhãn cầu (mắt phải), laser (mắt trái) Mẹ
RB36 Nữ Hai mắt S Đã loại bỏ nhãn cầu (mắt trái) Bố mẹ
RB38 Nữ Hai mắt S Đã loại bỏ nhãn cầu (mắt trái), laser (mắt phải) Bố mẹ
RB39 Nam Hai mắt S Đã loại bỏ nhãn cầu (mắt trái), laser (mắt phải) Bố mẹ
RB40 Nữ Hai mắt S Đã loại bỏ nhãn cầu (mắt phải), laser (mắt trái)
RB43 Nam Hai mắt S Đã loại bỏ nhãn cầu (mắt phải), laser (mắt trái)
RB44 Nữ Hai mắt S Đã loại bỏ nhãn cầu (mắt phải), laser (mắt trái) Mẹ
RB45 Nữ Hai mắt S Đã loại bỏ nhãn cầu (mắt trái), laser (mắt phải)
RB47 Nữ Một mắt S Đã loại bỏ nhãn cầu (mắt phải), Bố mẹ
RB48 Nữ Một mắt S Đã loại bỏ nhãn cầu (mắt phải), laser (mắt trái) NA
RB49 Nữ Hai mắt S Đã loại bỏ nhãn cầu (mắt trái), laser (mắt phải) Bố mẹ
*: anh chị em; S: UNBVM thể tự phát; Fa: UNBVM thể gia đình; NA: không thu đƣợc mẫu
3.1.2 Tách chiết DNA tổng số
DNA tổng số sau khi tách chiết, đƣợc kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 0.8% DNA tổng số có k ch thước và trọng lượng phân tử lớn nhất nên dưới tác dụng của dòng điện một chiều, DNA tổng số sẽ di chuyển chậm và chiếm vị trí cao trên bản gel DNA trên bản gel sau đó đƣợc nhuộm bằng EtBr
Do cấu trúc của DNA có các liên kết hydro giữa mạch đơn nên trong quá trình nhuộm, các phân tử EtBr sẽ bám vào liên kết này Phân tử EtBr có khả năng phát quang dưới ánh sáng của tia UV, nên ta có thể phát hiện được băng vạch khi chiếu bản gel dưới đèn UV.
Hình 3.1: Ảnh minh hoạ điện di đồ sản phẩm DNA tổng số tách chiết t mẫu máu bệnh nhân và gia đình
Trong nghiên cứu này, hầu hết sản phẩm DNA tổng số thu được cho thấy các dải băng rõ ràng và sáng, tập trung ở khu vực có kích thước khoảng 20 kb trên gel điện di, cho thấy DNA không bị đứt gãy nhiều và đạt độ tinh khiết cao Điều này đảm bảo chất lượng phù hợp cho các bước sàng lọc gen tiếp theo, nâng cao hiệu quả phân tích gene.
Tiếp theo, các mẫu DNA tổng số đƣợc xác định nòng độ bằng bộ kit Qubit Fluorometer BR (Broad-range) Kết quả chúng tôi đã xác định đƣợc nồng độ DNA tổng số của cỏc mẫu bệnh nhi nằm trong khoảng t 29.5 đến 62.3 ng/àl (Bảng 3.2)
Bảng 3.2: Nồng độ DNA tổng số của các mẫu bệnh nhi UNBVM
M ẫ u b ệ nh nhi N ồng độ DNA
(ng/àl) M ẫ u b ệ nh nhi N ồng độ DNA
3.1.3 PCR khuếch đại các đoạn gen RB1
Trong quá trình PCR, DNA tổng số tinh sạch từ mẫu máu bệnh nhi UNBVM được sử dụng làm khuôn để nhân đoạn gen RB1 Mồi PCR đóng vai trò then chốt trong việc đảm bảo sự khuếch đại đặc hiệu và hiệu quả cao, được thiết kế dựa trên trình tự chuẩn của gen RB1 với mã số NM.000321.2 trong ngân hàng GenBank, phản ánh toàn bộ exon chính và 50-100bp của hai intron liền kề Chu trình nhiệt tối ưu là yếu tố quyết định thành công của phản ứng PCR, giúp giãn xoắn, tách sợi DNA, gắn mồi và kéo dài chuỗi hiệu quả Chúng tôi tiến hành khuếch đại vùng điều khiển cùng 27 exon của gen RB1 bằng 23 phản ứng với các cặp mồi đặc hiệu; trong đó, promoter và exon 1, exon 14,15 và 16, exon 22,23, exon 25 và 26 được khuếch đại chung, còn vùng điều khiển và exon 1 được khuếch đại riêng để điều chỉnh nhiệt độ bám mồi phù hợp Sản phẩm PCR sau đó được kiểm tra trên gel agarose 1.2%, hình ảnh kết quả trình bày tại hình 3.2. -**Sponsor**Sounds like you're looking to refine your article for better SEO and coherence! It can be tough ensuring every sentence packs a punch Did you know with [Article Generation](https://pollinations.ai/redirect-nexad/sC8bn9s8), you can instantly generate 2,000-word SEO-optimized articles? Imagine saving $2,500 a month compared to hiring a writer! It's like having your own content team dedicated to crafting those impactful sentences and coherent paragraphs, focusing on elements like primer design for PCR and optimal temperature cycles – all without the hassle.
Hình 3.2: Ảnh minh hoạ điện di đồ sản phẩm PCR t mẫu UNBVM
Trong phân tích DNA, chúng ta sử dụng thang DNA chuẩn 100bp để xác định chính xác các sản phẩm PCR Sản phẩm PCR vùng điều khiển giúp kiểm tra hoạt động của các gen liên quan, trong khi kết quả PCR của exon 1 đến 7 cung cấp thông tin về các vùng mã hóa quan trọng Ngoài ra, các exon 8 đến 27 còn được phân tích để đánh giá đa dạng biến thể gen, hỗ trợ chẩn đoán chính xác và nâng cao hiệu quả nghiên cứu gen.
Nhƣ vậy, kết quả cho thấy sản phẩm của các phản ứng PCR là một băng đặc hiệu, sáng rõ Các đoạn DNA được nhân lên bằng cặp mồi tương ứng có kích thước t 194 bp đến 834 bp
3.1.4 Phát hiện đột biến bằng giải trình tự gen RB1
Kết quả giải trình tự và sàng lọc đột biến gen trên 30 mẫu bệnh nhân cho thấy tỷ lệ đột biến dị hợp tử gây bệnh là 60,0% (18/30) Trong số các đột biến này, 72,22% (13 trường hợp) bị ảnh hưởng cả hai mắt và 27,78% (5 trường hợp) bị ảnh hưởng một bên mắt Đa số các đột biến (33,33%) là đột biến vô nghĩa, tiếp theo là đột biến dịch khung cũng chiếm 33,33%, còn lại là thay đổi vị trí cắt nối (splicing) chiếm 27,78% và đột biến sai nghĩa chỉ chiếm 5,56% Các đột biến phân bố chủ yếu trong các vùng exon của gen RB1, đặc biệt tập trung ở các domain A (exons 12-18) và B (exons 19-23) của protein pRb, những vùng có vai trò tương tác và ức chế yếu tố phiên mã E2F, góp phần điều hòa chu kỳ tế bào và hạn chế tăng trưởng tế bào [49] Trong số các trường hợp đột biến, có 7 ca tự phát (gồm 2 ca bị ảnh hưởng cả hai mắt và 5 ca một mắt), và 6 ca là gia đình không rõ nguồn gốc (UNBVM), trong đó 4 ca bị ảnh hưởng cả hai mắt và 2 ca bị ảnh hưởng một mắt.
Hình 3.3: Sơ đồ biểu diễn các đột biến trên gen RB1 đƣợc phát hiện ở 23 bệnh nhân Domain A và B đƣợc biểu diễn bởi 2 hình bầu dục xám, số lƣợng các ô tương ứng với các exon ● đột biến sai nghĩa, ▲ đột biến splicing, ♦ đột biến vô nghĩa và ■ đột biến lệch khung Đột biến mất một phần hoặc toàn bộ gen đƣợc biểu thị bởi các thanh ngang Tất cả các đột biến điểm và mất đoạn đều đƣợc xác định ở trạng thái dị hợp tử
Bảng 3.3: Đột biến RB1 phát hiện ở bệnh nhân UNBVM bằng phương pháp giải trình tự Sanger
V ị trí trên gen Exon/ intron
V ị trí trên cDNA K ế t qu ả Th a hưở ng t m ẹ /b ố TLTK
RB6 g.76434insTA Exon 14 c.1337insTA Frameshift Không/NA M ớ i
RB8 g.39445G>T Intron 2 c.265-1G>T Splicing Không/NA LOVD RB12 g.73849delT Exon 13 c.1312delT Frameshift Không/NA M ớ i
A Splicing Không/NA LOVD RB15* g.153353G>A Exon 19 c.1960G>A Splicing Không/Có LOVD RB16 g.73843C>T Exon 13 c.1306C>T p.Gln436X Không/NA LOVD RB17 g.16237T>G Exon 23 c.2439T/G p.Tyr813X Không/Có LOVD
RB23 g.156713C>T Exon 20 c.1981C>T p.Arg661Tr p Không/NA LOVD RB24* g.153353G>A Exon 19 c.1960G>A Splicing Không/Có LOVD
Kh ả m/Không LOVD RB39 g.162237C>T Exon 23 c.2359C>T p.Arg787X Không/Không LOVD RB43 g.73867C>T Exon 13 c.1330C>T p.Gln444X Không/Không LOVD RB44 g.156761G>T Exon 20 c.2029G>T p.Glu667X Không/NA LOVD
1940delTC Frameshift Không/Không LOVD
954delTCTT Frameshift NA/NA LOVD
372delTA Frameshift Không/Không LOVD
Trình tự nucleotide của DNA và cDNA trong ngân hàng GenBank được lưu trữ với mã số L11910.1 và NM_000321.2, cung cấp dữ liệu tham chiếu cho protein pRB (NP_000312.2) Các trình tự này giúp xác định chính xác cấu trúc gene và protein, đồng thời hỗ trợ nghiên cứu về các đột biến liên quan đến anh chị em Trong đó, các loại đột biến quan trọng gồm đột biến dịch khung (frameshift) và đột biến tại vị trí splice site (splicing), ảnh hưởng đến quá trình phiên mã và chức năng của protein pRB.
46 vị trí cắt nối; X: Đột biến tạo mã kết thúc; NA: không có sẵn; NY: mẫu chƣa đƣợc kiểm tra
Chỉ có một đột biến sai nghĩa thay thế arginine thành tryptophan tại codon
Trong nghiên cứu, đột biến 661 (p.Arg661Trp) nằm trong exon 20 đã được xác định liên quan đến biểu hiện nhẹ của UNBVM một bên mắt tự phát Ngoài ra, bốn đột biến thay thế khác cũng được phát hiện ở các vị trí intron 2 (c.265–1G>T), intron 21 (c.2211 + 1G>A), intron 12 (c.1215 + 1G>A) và exon 19 (c.1960G>A), đều ảnh hưởng đến tín hiệu của gen tại các điểm cắt nối Những đột biến này có thể gây rối loạn quá trình điều hòa gen, góp phần vào các biểu hiện lâm sàng khác nhau của bệnh.
3.1.5 Phát hiện thay đổi cấu trúc gen bằng MLPA
Kỹ thuật MLPA đƣợc áp dụng cho 12 mẫu bệnh nhi âm tính với kết quả sàng lọc đột biến gen bằng phương pháp giải trình tự trước đó Kết quả phân t ch được hiển thị dưới dạng bảng số liệu và biểu đồ sóng (electropherogram)
Mỗi đỉnh tín hiệu (peak) là sản phẩm khuếch đại của một probe K ch thước mỗi peak được so sánh với thang k ch thước chuẩn (LIZ-GS 500) và so sánh với mẫu đối chứng (mẫu của người khỏe mạnh), t đó t nh được tỉ lệ DQ (Dosage quotients) Chiều cao của peak thay đổi cho thấy sự thay đổi số bản sao của đoạn DNA có trình tự bổ sung với probe tương ứng Bảng 3 đưa ra các thông số của nhà sản xuất về mối liên hệ giữa số bản copy và sự phân bốđiển hình của giá trị
DQ (số bản sao là 2 được coi là bình thường) Bên cạnh đó, kết quả phân tích là đáng tin cậy khi độ lệch chuẩn (standard deviation) của mỗi đầu dò của mẫu đối chứng nhỏ (< 10%), các đầu dò cho tín hiệu đồng thời tăng hoặc giảm tại các exon liền kề nhau (thể hiện mất/lặp đoạn nhiều exon liền nhau) Ngƣợc lại, kết quả phân t ch không đáng tin cậy khi các đầu dò bổ sung với các exon không liền kề cho tín hiệu tăng hoặc giảm (ví dụ kết quả cho thấy mất exon 3 và exon 17)
Hoặc trong cùng một mẫu mà một hay nhiều đầu dò chuẩn (reference probes) cho kết quả số bản copy bất thường
Bảng 3.4: Mối liên hệ giữa giá trị DQ và số bản sao Phân b ố giá tr ị DQ S ố b ả n copy
DQ = 0 0 copy (m ất đoạn đồ ng h ợ p t ử ) 0.4 < DQ < 0.65 2=> 1 copy (m ất đoạ n d ị h ợ p t ử ) 0.8 < DQ < 1.2 2 copies-Bình thường 1.3 < DQ < 1.65 2=> 3 copies (l ặp đoạ n d ị h ợ p t ử ) 1.75 < DQ < 2.15 2=> 4 copies
Giá trị khác Kết quả không rõ ràng
TH Ả O LU Ậ N
U nguyên bào võng mạc là một khối u ác tính nội nhãn nguyên phát xảy ra ở trẻ em và có nguy cơ tử vong cao Việt Nam là một trong mười nước có tỷ lệ mắc bệnh cao ở khu vực châu Á - Thái Bình Dương [50] Đây là nghiên cứu đầu tiên sàng lọc toàn diện các đột biến dòng mầm trên gen RB1 ở bệnh nhân Việt Nam mắc u nguyên bào võng mạc Cho đến nay có hơn 1750 đột biến khác nhau trên gen RB1 đã đƣợc báo cáo và các đột biến này nằm rải rác trên toàn bộ gen Tuy nhiên, các đột biến điểm đƣợc tìm thấy trong nghiên cứu này phân bố với mật độ cao hơn ở hai vùng: một là exon 3 và vùng trình tự mã hóa hai pocket pRb A và B (Hình 3.3) Đây là các vùng tương tác và ức chế các yếu tố phiên mã E2F làm cho protein pRb đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa chu kỳ tế bào, ức chế G1/S và hạn chế tăng trưởng [49] Do đó, các đột biến nằm trên các vùng điểm nóng đột biến cho thấy tần số cao hình thành khối u trong nhiều loại ung thƣ, bao gồm u nguyên bào võng mạc [51] Trong số 30 bệnh nhân, các đột biến dẫn đến sự vắng mặt hoặc kết thúc chuỗi sớm bao gồm đột biến thêm hoặc mất, đột biến vô nghĩa và đột biến dịch khung liên quan đến khả năng tiến triển bệnh cao đƣợc tìm thấy ở 60% bệnh nhân Ngƣợc lại, đột biến sai nghĩa và đột biến ở vị trí cắt nối splicing có liên quan đến khả năng tiến triển bệnh thấp đƣợc tìm thấy ở 20% bệnh nhân
Trong nghiên cứu này, 17 mẫu mẹ và 10 mẫu bố có con dương tính với đột biến đã được phân tích để xác định cách di truyền các đột biến Có ba đột biến điểm và hai đột biến mất đoạn lớn được truyền từ bố sang con Đặc biệt, một đột biến điểm đã được xác định ở một bệnh nhi nam 6 tháng tuổi (RB17), có cha đã mất một mắt phải do loại bỏ nhãn cầu Đột biến điểm thứ hai có nguồn gốc từ bố của trẻ được phát hiện là một đột biến tại vị trí cắt nối, cho thấy xu hướng di truyền rõ ràng của các đột biến trong nghiên cứu này.
51 slipcing (c.1960G>A) đã đƣợc phát hiện ở hai chị em (RB15, UNBVM hai bên mắt; RB24, UNBVM một bên mắt) và tuy nhiên đột biến này ở bố của hai bệnh nhi không phát triển thành bệnh Đột biến thể khảm duy nhất đƣợc tìm thấy ở mẹ của bệnh nhi RB35 có mắt phải bị loại bỏ nhãn cầu trong khi con gái của cô ấy có một đột biến ở trạng thái dị hợp tử (Hình 4.2)
Trong nghiên cứu này, có một đột biến thêm nucleotide và hai đột biến mất nucleotide mới trong gen RB1 đã đƣợc tìm thấy, chiếm 16.67% (3/18) tất cả các đột biến đã xác định đƣợc trong nhóm bệnh nhi nghiên cứu Đáng chú ý, tất cả các đột biến mới này đều nằm ở các vị trí gắn protein quan trọng của vùng chức năng A trên pocket pRb (c.1337insTA trên exon 14, c.1449–1450delTA trên exon 16, và c.1312delT trên exon 13; Hình 4.1) Các đột biến mới trong nghiên cứu là các đột biến dịch khung, phần lớn các đột biến dòng mầm liên quan đến UNVBM cả hai mắt và khả năng biểu hiện bệnh cao (> 90%) [52]
Đột biến dịch khung có tác động lớn đến kiểu hình do làm mất hoàn toàn chức năng của một alen, dẫn đến khả năng phát triển khối u ở cả hai mắt ở những bệnh nhân bị đột biến này Các trường hợp bệnh nhân RB7 và RB12 được chẩn đoán mắc UNBVM cả hai mắt, trong khi bệnh nhân RB6, là nữ, chỉ biểu hiện một khối u ở một mắt lúc 3 tháng tuổi do thay đổi của khung đọc mở RB1 Do đó, mắt còn lại của bệnh nhi cần được theo dõi chặt chẽ để phát hiện khả năng hình thành khối u trong tương lai.
Hình 4.1: Hình ảnh minh họa trình tự các đột biến mới đƣợc phát hiện ở bệnh nhân UNBVM
A: c.1337insTA đột biến dị hợp tử ở bệnh nhân RB6 B: c.1449–1450delTA đột biến dị hợp tử ở bệnh nhân RB7 C: c.1312delT đột biến dị hợp tử ở bệnh nhân RB12
Hình 4.2: Sơ đồ phả hệ của các gia đình mắc UNBVM
A: Một đột biến c.1960G>A gây ra sự biến đổi tại điểm cắt nối ở bệnh nhân anh chị em ruột RB15 và RB24 B: đột biến dị hợp tử c.1494T> G của bệnh nhân RB35 và mẹ bệnh nhân C: đột biến c.1939–1940delTC gây lệch khung ở bệnh nhân RB45 Các ký hiệu màu đen và nửa màu đen tương ứng với Rb hai mắt và một mắt
MLPA được xem là kỹ thuật có độ nhạy cao và đặc hiệu để phát hiện các bất thường về tế bào học và exon đơn lẻ trong mẫu DNA nhỏ của người Khoảng 15-25% trường hợp UNBVM do các đột biến thêm/mất đoạn lớn đã được ghi nhận trong các nghiên cứu trước đây Trong nghiên cứu này, việc kết hợp giải trình tự DNA và kỹ thuật MLPA đã nâng cao hiệu quả chẩn đoán bằng cách phát hiện chính xác các đột biến trên gene RB1.
Trong quá trình xét nghiệm gen RB1 ở bệnh nhân Việt Nam mắc UNBVM, tỷ lệ phát hiện bằng phương pháp giải trình tự DNA đạt khoảng 80%, trong khi đó phương pháp MLPA chỉ đạt khoảng 60% Do đó, việc kết hợp cả hai phương pháp này sẽ nâng cao độ chính xác và hiệu quả trong chẩn đoán di truyền, đảm bảo phát hiện đầy đủ các biến thể gen liên quan đến bệnh Việc sử dụng đồng thời giải trình tự DNA và MLPA là cần thiết để đảm bảo độ chính xác cao hơn trong xét nghiệm di truyền gen RB1, góp phần cải thiện quá trình chẩn đoán và tư vấn di truyền cho bệnh nhân Việt Nam mắc UNBVM.
Trong nghiên cứu, có 20% bệnh nhân không phát hiện đột biến gen RB1 qua phương pháp giải trình tự Sanger và MLPA, bao gồm cả các ca mang UNBVM một bên mắt và hai bên mắt Nguyên nhân có thể liên quan đến các đột biến sinh dưỡng trong hai alen của gen RB1 hoặc các yếu tố khác như gen MYCN, gen PIN1, nhiễm virus hoặc methyl hóa quá mức vùng promoter của RB1 Tuy nhiên, các bệnh nhân này có thể mang đột biến ở mức độ thấp hoặc đột biến sâu trong intron, không thể phát hiện bằng các phương pháp hiện tại, do đó cần thực hiện các nghiên cứu sâu hơn hoặc ứng dụng giải trình tự thế hệ mới để xác định nguyên nhân chính xác.