Tổng hợp báo cáo thí nghiệm hóa sinh bài 6 12 BF3508

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HÓA SINH Họ và tên Nguyễn Võ Hoàng Nam MSSV 20180507 Bài 6 Xác định hoạt độ enzim glucoamylase I Giới thiệu thí nghiệm + Mục đích thí nghiệm Áp dụng phương pháp DNS nhằm xác định ho.

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HÓA SINH

Họ và tên : Nguyễn Võ Hoàng Nam

Bài 6: Xác định hoạt độ enzim glucoamylase

I Giới thiệu thí nghiệm:

+ Mục đích thí nghiệm: Áp dụng phương pháp DNS nhằm xác định hoạt độ enzim glucoamylase

+ Nguyên tắc thí nghiệm:

• Enzim là những chất xúc tác sinh học có bản chất protein và tính đặc hiệu cao, có khả năng xúc tác cho các phản ứng hóa học khác nhau Mỗi enzyme có khả năng xúc tác cho một hoặc một số phản ứng nhất định

• Vì enzim có bản chất là protein nên cần tránh các yếu tố có thể gây biến tính protein như nhiệt độ cao, pH quá axit hoặc quá kiềm, muối kim loại nặng, … Ngoài ra, cần tránh tạo bọt trong hỗn hợp phản ứng vì một số enzim có thể bị kìm hãm trên bề mặt phân chia Các điều kiện phản ứng phải ở trong giới hạn enzim có thể tồn tại được và giữ được cố định trong suốt thời gian phản ứng

• Phản ứng enzyme được tiến hành trong điều kiện dư cơ chất

• Thời gian xác định hoạt độ không quá lâu, thường là 10 phút

• Khi xác định hoạt độ enzim phải làm mẫu kiểm chứng song song mẫu thí nghiệm Trong mẫu kiểm chứng enzim đã bị vô hiệu hóa trước khi cho tiếp xúc với cơ chất

• Glucoamylase là enzim có khả năng phân cắt các liên kết α 1-4 glycozit

và α 1-6 glycozit trong phân tử tinh bột, giải phóng ra glucose:

• Đơn vị hoạt độ glucoamylase: là lượng enzim cần để giải phóng được 1mg glucose trong 1 giờ, ở 30oC

II.Dụng cụ, quy trình thí nghiệm:

2.2.2 Tiến hành: Thực hiện song song mẫu thí nghiệm và mẫu kiểm

( ở 30oC) Trộn đều và để phản ứng đúng

10 phút ở 30oC Bước 2:

vô hoạt

enzyme

bằng DNS

Bổ sung 3 ml DNS, trộn đều ngay lập tức (sau đó nhanh chóng đặt ống nghiệm vào giá trong nồi cách thủy đang sôi)

0,5ml dịch enzym phân tích 3 ml DNS Trộn đều 0,5 ml dung dịch

hồ tinh bột 1% Trộn đều ngay lập tức (sau đó nhanh chóng đặt ống nghiệm vào giá trong nồi cách thủy đang sôi)

Đun sôi cách thuỷ 5 phút Làm nguội nhanh (bằng cách nhúng ống nghiệm vào khay/chậu nước lạnh hoặc nước đá)

Bước 4: Đo độ hấp thụ của dung dịch thí nghiệm ở bước sóng 540 nm với

dung dịch đối sánh với mẫu kiểm chứng

Vậy: Cứ 1 (ml) dịch lọc sẽ chứa 0,055 (mg) glucose

Trong 10 phút, 0,5 (ml) enzim sẽ tạo ra 0,055 (mg) glucose

 Trong 60 phút, 0,5 (ml) enzim sẽ tạo ra 0,055.6 = 0,33 (𝑚𝑔) glucose

 Trong 60 phút, 1 (ml) enzim sẽ tạo ra 0,33.2 = 0,66 (𝑚𝑔) glucose

Vì enzim glucoamylase đã được pha loãng 5000 lần

 Hoạt độ của enzim glucoamylase là:

0,66.5000 = 3300 (𝑈/𝑚𝑙 𝑐ℎế 𝑝ℎẩ𝑚 𝑡ℎô)

IV Nhận xét kết quả:

+ Trong quá trình thí nghiệm, để đảm bảo thu được kết quả tối ưu nhất, cần chú ý một số thao tác sau:

* Các dụng cụ cần phải được làm sạch trước khi tiến hành thí nghiệm

* Quá trình xúc tác của enzim cần phải được thực hiện trong bể ổn nhiệt

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HÓA SINH

Họ và tên : Nguyễn Võ Hoàng Nam

Bài 7: Xác định hoạt độ enzim protease

theo phương pháp Ason cải tiến

I Giới thiệu thí nghiệm:

+ Mục đích thí nghiệm: Áp dụng phương pháp Ason cải tiến nhằm xác định hoạt

độ enzim protease

+ Nguyên tắc thí nghiệm:

• Enzim là những chất xúc tác sinh học có bản chất protein và tính đặc hiệu cao, có khả năng xúc tác cho các phản ứng hóa học khác nhau Mỗi enzyme có khả năng xúc tác cho một hoặc một số phản ứng nhất định

• Vì enzim có bản chất là protein nên cần tránh các yếu tố có thể gây biến tính protein như nhiệt độ cao, pH quá axit hoặc quá kiềm, muối kim loại nặng, … Ngoài ra, cần tránh tạo bọt trong hỗn hợp phản ứng vì một số enzim có thể bị kìm hãm trên bề mặt phân chia Các điều kiện phản ứng phải ở trong giới hạn enzim có thể tồn tại được và giữ được cố định trong suốt thời gian phản ứng

• Phản ứng enzyme được tiến hành trong điều kiện dư cơ chất

• Thời gian xác định hoạt độ không quá lâu, thường là 10 phút

• Khi xác định hoạt độ enzim phải làm mẫu kiểm chứng song song mẫu thí nghiệm Trong mẫu kiểm chứng enzim đã bị vô hiệu hóa trước khi cho tiếp xúc với cơ chất

• Phương pháp trải qua 3 bước chính:

(1) Thủy phân protein caseinat natri ( hoặc hemoglobin ) bằng cách sử dụng chế phẩm enzyme có trong dung dịch nghiên cứu

(2) Làm vô hoạt enzyme, và làm kết tủa lượng protein chưa bị thủy phân bằng axit tricloaxetic

(3) Định lượng sản phẩm tạo thành bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin Xây dựng đường chuẩn của Tyrosine để có thể tính lượng sản phẩm do enzyme xúc tác tạo nên

• Hoạt độ protease đặc trưng cho khả năng xúc tác của enzyme trong quá trình phân giải protein và peptit Hoạt độ protease được biểu thị bằng số

đơn vị hoạt độ protease/ 1 đơn vị chế phẩm enzyme Còn hoạt độ riêng

của chế phẩm: là số đơn vị hoạt độ protease/ 1 mg protein của chế phẩm

• Trong đó, đơn vị hoạt độ protease: là lượng enzyme cần để xúc tác 1μmol

cơ chất ( caseinat natri tương đương tyrosine ) ở điều kiện tối thích ( điều kiên hoạt động của enzyme, tức 30oC )

• Với các protease có nguồn gốc từ nấm mốc, vi khuẩn: đơn vị hoạt độ có giá trị xác định tại các chỉ số pH:

pH = 2,5 ± 0,2 đối với protease axit

pH = 5,6 ± 0,2 đối với protease axit

pH = 7,2 ± 0,2 đối với protease trung tính

pH = 9,5 ± 0,2 đối với protease kiềm

II.Dụng cụ, quy trình thí nghiệm:

* Dung dịch casein 1%, pha trong dung dịch đệm photphat pH = 7

* Dung dịch enzyme, pha loãng enzyme gốc trong dung dịch đệm pH = 7

2.2 Quy trình thí nghiệm: gồm 2 phần chính:

2.2.1 Chuẩn bị:

+ Đặt bình ổn nhiệt ở 30 o C, để lọ dung dịch cơ chất và dung dịch enzyme trong bể ổn nhiệt 30 o C, nhằm làm các dung dịch ổn định nhiệt độ trước khi thực hiện phản ứng

2.2.2 Tiến hành: Thực hiện song song mẫu thí nghiệm và mẫu kiểm

2 ml dịch enzym

4 ml TCA 0,3M

2 ml dung dịch cơ chất Trộn đều ngay lập tức, để yên hỗn hợp trong 20 phút

Lọc, thu được dịch lọc kiểm chứng

0,3 ml dịch lọc kiểm chứng 1,5 ml Na2CO3 0,5M

Trộn đều, để 10 phút Thêm 0,3 ml dung dịch Folin Trộn đều, để 30 phút

Bước 4: Đo độ hấp thụ của dung dịch thí nghiệm ở bước sóng 750 nm với

dung dịch đối sánh với mẫu kiểm chứng

Vậy: Cứ 1 (ml) dịch lọc sẽ chứa 0,286 (μmol) tyrosine

 4 (ml) dịch lọc sẽ chứa 1,144 (μmol) tyrosine

Vậy: Trong 10 phút, 2 (ml) enzim sẽ tạo ra 1,144 (μmol) tyrosine

Trong 1 phút, 2 (ml) enzim sẽ tạo ra 0,1144 (μmol) tyrosine

 Trong 1 phút, 1 (ml) enzim sẽ tạo ra 0,1144: 2 = 0,0572 (μmol) tyrosine

Vì enzim protease đã được pha loãng 2000 lần

 Hoạt độ của enzim protease là:

0,0572.2000 = 114,4 (𝑈/𝑚𝑙 𝑐ℎế 𝑝ℎẩ𝑚 𝑡ℎô)

IV Nhận xét kết quả:

+ Trong quá trình thí nghiệm, để đảm bảo thu được kết quả tối ưu nhất, cần chú ý một số thao tác sau:

* Các dụng cụ cần phải được làm sạch trước khi tiến hành thí nghiệm

* Quá trình xúc tác của enzim cần phải được thực hiện trong bể ổn nhiệt

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HÓA SINH

Họ và tên : Nguyễn Võ Hoàng Nam

Bài 8: Xác định hàm lượng vitamin C

I Giới thiệu thí nghiệm:

+ Mục đích thí nghiệm: Sử dụng 2,6-DCIP để xác định hàm lượng vitamin C có

trong mẫu

+ Nguyên tắc thí nghiệm:

• Vitamin C ( axit ascorbic ) là hợp chất hữu cơ không no, chứa 2 nhóm

enol ( tức nhóm OH gắn vào C có liên kết đôi ), và chứa 2 nhóm

hidroxyl

• Vitamin C tan trong nước và tồn tại ở 2 dạng:

• Vitamin C bị phá hủy rất nhanh bởi các chất oxi hóa, nhưng bền trong

môi trường axit Do đó, có thể chiết được vitamin C trong mẫu bằng cách

sử dụng dung dịch axit axetic 5%

• Vitamin C có phản ứng thuận nghịch với chất chỉ thị 2,6-DCIP ( 2,6

diclophenolindophenol )

• 2,6-DCIP chỉ phản ứng với vitamin C, không tác dụng với các chất khác

trong dung dịch 2,6-DCIP vừa đóng vai trò là chất chỉ thị, vừa đóng vai

trò là thuốc thử, do đó giúp đơn giản hóa quá trình chuẩn độ

• 2,6-DCIP tồn tại ở 2 dạng: dạng khử ( không màu ), và dạng oxi hóa ( sẽ

có màu xanh trong môi trường pH>5, có màu tím khi 4<pH<5, và có màu hồng khi pH<4)

II.Dụng cụ, quy trình thí nghiệm:

* Dịch vitamin C tinh khiết * Hồ tinh bột

* Oxalatamon bão hòa * KIO3 0,001N

* 2,6 DCIP * Mẫu cần phân tích

* Tinh thể KI * Dung dịch HCl 1%

2.2 Quy trình thí nghiệm: gồm 2 phần chính:

2.2.1 Chuẩn bị:

+ Chuẩn bị dung dịch 2,6 DCIP (PTN chuẩn bị sẵn)

+ Xác định hệ số hiệu chỉnh nồng độ của dung dịch 2,6 DCIP:

* Bình tam giác 1 (cỡ 50 ml):

5 ml dịch vitamin C tinh khiết (PTN pha sẵn)

2,5 ml Oxalatamon bão hoà

Chuẩn bằng 2,6 DCIP (phân tích) cho đến khi xuất hiện màu hồng bền trong

Lắc đều, lọc và thu dịch lọc vitamin C cần phân tích

2.2.2 Tiến hành: Thực hiện song song mẫu thí nghiệm và mẫu kiểm

chứng

+ Mẫu thí nghiệm:

Cho vào bình tam giác 3 (cỡ 50 ml):

10 ml dịch lọc vitamin C phân tích (dùng micropipet)

5 ml dung dịch oxalatamon bão hoà (dùng micropipet)

Chuẩn bằng 2,6 DCIP (phân tích) cho đến khi xuất hiện màu hồng bền trong

1 phút

+ Mẫu kiểm chứng:

Cho vào bình tam giác 4 (cỡ 50 ml):

10 ml HCl 1% (dùng pipet)

5 ml Oxalatamon bão hoà

Chuẩn bằng 2,6 DCIP (phân tích) cho đến khi xuất hiện màu hồng bền trong

1 phút

III Kết quả:

+ Các số liệu thu được là:

Khối lượng mẫu chanh 𝑚 = 10 (𝑔)

Lượng 2,6 DCIP tiêu tốn ở mẫu kiểm chứng là 𝑏 = 0,25 (𝑚𝑙)

+ Ta có công thức xác định hàm lượng vitamin C:

𝑋 = (𝑎−𝑏).0,088.𝑓.𝑉.100

5.𝑚 =(1,4−0,25).0,088.1,06.100.100

5.10 = 21,4544 𝑚g%

Với: a là lượng 2,6 DCIP tiêu tốn ở mẫu thí nghiệm (ml)

b là lượng 2,6 DCIP tiêu tốn ở mẫu kiểm chứng (ml)

f là hệ số của dung dịch 2,6 DCIP dùng trong phân tích 𝑓 = 1,06

* Lúc nghiền mẫu phải để mẫu ngập trong axit và phải làm nhanh để tránh vitamin C tác dụng với O2 trong không khí, lúc đó vitamin C sẽ bị oxi hóa Vì vậy, chúng ta cần chuẩn bị 1 cốc đựng axit từ trước

* Tránh những dụng cụ bằng kim loại khi cắt, nghiền mẫu, thay vào đó chúng ta có thể sử dụng các dụng cụ bằng inox, sứ Vì Fe, Cu là cofactor của nhiều enzim có trong mẫu, nếu dùng dụng cụ bằng Fe hoặc Cu thì sẽ kích hoạt các enzim

đó oxi hóa vitamin C và kết quả là dẫn đến sai số

* Với những thực phẩm có màu thì chúng ta phải tẩy màu để công đoạn chuẩn độ được dễ dàng hơn khi xác định điểm tương đương, chúng ta có thể sử dụng axit metaphotphoric

* Phải đi xác định lại nồng độ của 2,6 DCIP vì 2,6 DCIP là một chất không bền, nồng độ của nó thay đổi theo thời gian (xác định hệ số hiệu chỉnh f )

* Ở công đoạn chuẩn độ, chúng ta phải dùng buret nhỏ (vì lượng vitamin C rất nhỏ), chúng ta phải chuẩn độ nhanh để tránh vitamin C bị oxi hóa bởi oxy trong không khí

* Cần phải chiết vitamin C ở nhiệt độ phòng vì vitamin C bị phân hủy ở nhiệt độ cao

* Vitamin C bị phân hủy dưới ánh sáng nên phải bảo quản trong bình tối màu

+ Có thể xác định hàm lượng vitamin C bằng phương pháp sử dụng iot:

* Nguyên tắc: Vitamin C có thể khử dung dịch iot Dựa vào lượng iot bị khử bởi Vitamin C có trong mẫu, có thể suy ra được hàm lượng vitamin C

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HÓA SINH

Họ và tên : Nguyễn Võ Hoàng Nam

Bài 9-12: Xác định các chỉ số của dầu thực vật

Bài 9: Xác định chỉ số axit

I Giới thiệu thí nghiệm:

+ Xác định chỉ số axit của dầu thực vật, qua đó đánh giá được độ tươi hay mức độ phân hủy của mẫu chất béo

+ Nguyên tắc thí nghiệm:

• Chất béo là este của glycerol và các axit béo

• Trong thành phần của chất béo, ngoài các este ra, còn chứa các axit béo

tự do

• Để xác định chỉ số axit, đem chuẩn độ chất béo bằng dung dịch KOH, khi

đó giữa KOH và các axit béo tự do có trong chất béo xảy ra phản ứng:

RCOOH + KOH → RCOOK + H2O

=> Dựa vào lượng KOH dùng để trung hòa các axit béo tự do, tính được

chỉ số axit: Chỉ số axit là số (mg) KOH cần để trung hòa các axit béo

tự do có trong 1 gam chất béo.

II.Dụng cụ, quy trình thí nghiệm:

* Ete etylic * Rượu etylic 96o

* Dung dịch KOH 0,1N * Dung dịch phenolphthalein 1%

* Mẫu dầu cần phân tích * H2O

2.2 Quy trình thí nghiệm:

+ Cân 3-5 (g) mẫu dầu cần phân tích vào bình tam giác 250 ml có nút nhám

+ Bổ sung 30 ml hỗn hợp ete – rượu (lấy trong tủ hút, trong quá trình làm thí nghiệm luôn đóng nút bình tam giác)

+ Lắc cẩn thận cho tan chất béo

+ Cho 5 giọt phenolphthalein

+ Định phân hỗn hợp bằng KOH 0,1N (pha trong cồn tuyệt đối) đến khi xuất hiện màu hồng tươi

+ Thực hiện song song tương tự với mẫu kiểm chứng, nhưng thay mẫu dầu bằng nước cất

III Kết quả:

+ Các số liệu thu được là:

Khối lượng mẫu dầu 𝑚 = 3,12 (𝑔)

* Nếu chất béo đang ở thể rắn, phải đem đun cách thủy để làm tan chất béo

* Nồng độ KOH sử dụng ở đây thấp hơn trong thí nghiệm xà phòng để tránh phản ứng thủy phân

* Dụng cụ lấy mẫu phải khô

Bài 10: Xác định chỉ số xà phòng

I Giới thiệu thí nghiệm:

+ Xác định chỉ số xà phòng của dầu thực vật, qua đó dự đoán được phân tử lượng trung bình của các axit béo có trong mẫu (chỉ số xà phòng lớn thì khối lượng trung bình của các axit béo nhỏ)

+ Nguyên tắc thí nghiệm:

• Đem đun sôi chất béo với một lượng dư KOH, xảy ra 2 phản ứng sau:

(1) Phản ứng trung hòa axit béo tự do:

RCOOH + KOH → RCOOK + H2O

(2) Phản ứng thủy phân chất béo trong môi trường kiềm:

=> Dựa vào lượng KOH đã tiêu tốn, tính được chỉ số xà phòng hóa: Chỉ

số xà phòng hóa là số (mg) KOH cần để vừa thủy phân triglixerit và

để vừa trung hòa các axit béo tự do có trong 1 gam chất béo

II.Dụng cụ, quy trình thí nghiệm:

* KOH tinh khiết * Rượu etylic

* Dung dịch HCl 0,5N * Dung dịch phenolphthalein 1%

* Mẫu dầu cần phân tích * H2O

2.2 Quy trình thí nghiệm:

+ Pha dung dịch KOH 0,5N trong rượu: cho 30 (g) KOH tinh khiết hòa tan trong 1 lít rượu etylic tinh khiết, đun nóng có lắp ống sinh hàn thu hồi, để yên dung dịch trong 1 đêm, sau đó lọc và bảo quản dung dịch trong bình đựng tối màu (tránh ánh sáng, do nó rất nhạy cảm với ánh sáng, dễ oxi hóa, phân hủy, không ổn định) + Cân 2-3 (g) chất béo vào bình tam giác 250 ml

+ Bổ sung 20 ml KOH 0,5N pha trong cồn tuyệt đối (dùng mcropipet hoặc buret) + Đậy bình bằng nút cao su gắn với sinh hàn khí

+ Đun sôi cách thủy trong 1 giờ (xà phòng hóa)

+ Làm nguội

+ Thêm 5 giọt phenolphthalein

+ Định phân bằng HCl 0,5N đến khi hết màu hồng

+ Làm song song mẫu kiểm chứng, nhưng thay mẫu dầu bằng nước cất

III Kết quả:

+ Các số liệu thu được là:

Khối lượng mẫu dầu 𝑚 = 2,14 (𝑔)

Thể tích HCl 0,5N tiêu tốn ở mẫu kiểm chứng 𝑎 = 21 (𝑚𝑙)

Thể tích HCl 0,5N tiêu tốn ở mẫu thí nghiệm 𝑏 = 6,65 (𝑚𝑙)

* Khi đun sôi cách thủy, phải đậy kín bình bằng nút có ống sinh hàn khí

* Nếu xà phòng hóa các chất khó tan, có thể them 20 (ml) dung môi có nhiệt

độ sôi cao ( toluene, rượu propylic, rượu butylic, … )

* Cần làm mẫu kiểm chứng song song với mẫu thí nghiệm vì nồng độ kiềm

có thể thay đổi

* Khi chuẩn độ cần lắc đều và mạnh

Bài 11: Xác định chỉ số peroxit

I Giới thiệu thí nghiệm:

+ Xác định chỉ số peroxit của dầu thực vật, qua đó biết được mức độ ôi hóa của mẫu cần phân tích

+ Nguyên tắc thí nghiệm:

• Chỉ số peroxit là số gam iot được giải phóng ra khi cho dung dịch KI

tác dụng với 100 (g) chất béo nhờ tác dụng của các peroxit có trong chất béo

• Chỉ số peroxit được xác định dựa trên nguyên tắc: các peroxit của chất béo ( hình thành trong quá trình ôi hóa chất béo ) có khả năng phản ứng với KI trong môi trường axit, tạo ra iot theo phản ứng:

• Chuẩn độ lượng iot được tạo thành bằng dung dịch tiosunfat:

2Na2S2O3 + I2 2NaI + Na2S4O6

=> Dựa vào lượng tiosunfat đã tiêu tốn, tính được chỉ số peroxit

II.Dụng cụ, quy trình thí nghiệm:

* Axit axetic băng * Na2S2O3 0,01N

* Dung dịch KI bão hòa * Dung dịch hồ tinh bột 1%

* Mẫu dầu cần phân tích * H2O