Xác định hàm lượng protein hòa tan bằng phương pháp Lowry

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HÓA SINH Bài 2 Xác định hàm lượng protein hòa tan bằng phương pháp Lowry I Mục đích, ứng dụng thí nghiệm + Xác định hàm lượng protein hòa tan có trong mẫu bằng phương pháp Lowry + P.

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HÓA SINH

Bài 2: Xác định hàm lượng protein hòa tan

bằng phương pháp Lowry

I Mục đích, ứng dụng thí nghiệm:

+ Xác định hàm lượng protein hòa tan có trong mẫu bằng phương pháp Lowry + Phương pháp này được dùng rộng rãi để xác định nhiều loại protein khác nhau

II.

Dụng cụ, quy trình thí nghiệm:  

2.1 Dụng cụ, hóa chất:

+ Dụng cụ:

* Bình định mức 100ml

* Cân

* Cối, chày

* Giấy lọc

* Đũa thủy tinh

* Giấy chỉ thị

* Micropipet 

* Máy đo quang

* Ống đong

* Ống nghiệm

+ Hóa chất: 

* Nước cất

* Albumin huyết thanh bò

* Dung dịch NaOH 0,1N

* Dung dịch HCl 0,1N

* Mẫu xúc xích cần phân tích

* Dung dịch C

* Dung dịch Folin

2.2 Quy trình thí nghiệm:

2.2.1 Chuẩn bị dung dịch gốc protein chuẩn:

+ Phòng thí nghiệm pha sẵn albumin huyết thanh bò (BSA) nồng độ 1mg/ml

2.2.2 Tiến hành:

Bước 1: Nghiền mẫu xúc xích để chiết protein

(1) Dùng ống đong chuẩn bị 20ml NaOH 0,1N vào trong cốc dung tích 100ml

(2) Cân khoảng 0,3g mẫu Ghi lại lượng đã cân

(3) Chuyển mẫu vào cối, cho một ít dung dịch NaOH 0,1N từ cốc vào để làm ẩm

(4) Nghiền nhuyễn mẫu; chuyển toàn bộ mẫu vào bình tam giác dung tích

100 ml

(5) Tráng sạch cối chày bằng dung dịch NaOH 0,1N còn lại

(6) Đặt bình mẫu vào nồi đun cách thuỷ để chiết protein trong 15 phút

(7) Lấy mẫu ra, làm nguội, trung hoà (tới pH 7) bằng HCl 0,1N (dùng đũa thủy tinh chấm dịch lên miếng giấy thử pH và so với dải màu chuẩn)

(8) Chuyển mẫu sang bình định mức 100 ml, định mức bằng nước cất tới vạch Trộn đều

(9) Lọc trong, thu dịch lọc protein phân tích

Bước 2: Chuẩn bị 6 ống thủy tinh thấp, sạch Đánh số thứ tự từ 1 đến 6 Bước 3: Bổ sung lần lượt các hóa chất với lượng tương ứng như bảng sau, tạo hệ nồng độ BSA (Ci)

Nồng độ dung dịch BSA

Bước 4: Trộn đều bằng vortex thu được dãy ống BSA làm việc có nồng

độ Ci

Bước 5: Chuẩn bị 7 ống thủy tính cao, sạch Đánh số thứ tự từ 7 đến 12 Cho lần lượt dung dịch từ ống 1 đến 6 vào các ống 7 đến 12.

Thể tích dung dịch BSA

Bước 6: Lấy 1 ống thủy tinh dài, đánh dấu Mẫu, cho vào 0,3ml mẫu đã chiết, và 3ml dung dịch C Để bên phải ống số 12 thành 1 hàng.

Bước 7: Trộn đều bằng vortex, sau đó để yên 10 phút.

Bước 8: Trộn dung dịch Folin, lắc tạm luôn sau khi cho dung dịch folin vào mỗi ống.

Bước 9: Trộn đều bằng vortex, để yên 20 phút.

Bước 10: Đo độ hấp thụ tại bước sóng 750nm (OD 750nm ) Đọc kỹ Hướng dẫn sử dụng máy đo quang tại PTN Ở đây, mẫu trắng là mẫu trong ống nghiệm 7 (mẫu blank).

III.Kếtquả:

Bảng số liệu thu được từ máy đo quang:

biết

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

f(x) = 0.463 x + 0.0176666666666666

R² = 0.99332392616513

Đồ thị đường chuẩn protein

Nồng độ BSA (mg/ml)

+ Thu được đồ thị có hàm số:

y=0,463 x+0,0177

Với: x là nồng độ BSA (mg/ml)

y là mật độ quang OD với ánh sáng có bước song 750nm

+ Giá trị R2 thu được là: R2 = 0,9933

+ Ở mẫu nghiên cứu, có giá trị OD là 0,176 ( nằm trong khoảng tuyến tính của đồ thị)

Suy ra, ta có: 0,176=0,463 x+0,0177

¿>x=0,3419

Vậy nồng độ protein chứa trong mẫu xúc xích là 0,3419 (mg/ml)

+ Vì mẫu xúc xích được pha loãng bằng nước cất tới thể tích 100ml

Suy ra hàm lượng protein trong 100ml mẫu là: 0,3419.100=34,19 (mg)

¿0,03419(g)

+ Vì khối lượng mẫu xúc xích là 0,3 (g)

Suy ra hàm lượng protein trong mẫu tính theo phần trăm là:

0,03419 0,3 .100%≈ 11,4 %

IV Nhận xét kết quả:

+ Từ đồ thị ta có giá trị R2 ¿0,9933 ≈ 1, tức số liệu đo được có độ tuyến tính tương đối cao

+ Để có thể thu được kết quả chính xác nhất, cần chú ý một số điểm trong quá trình thí nghiệm:

 Các dụng cụ cần phải được làm sạch trước khi tiến hành thí nghiệm

 Trong quá trình chiết protein từ mẫu xúc xích, cần đun ổn định ở

70-80oC Không được đun quá cao bởi nhiệt độ cao sẽ gây biến tính protein Cũng không nên đun ở nhiệt độ thấp quá bởi như vậy hiệu suất chiết sẽ không cao

 Trong quá trình tạo hệ nồng độ BSA, khi sử dụng micropipet để bổ sung hóa chất vào các ống nghiệm, cần phải thay đầu côn liên tục, nhằm đảm bảo nồng độ trong mỗi ống nghiệm là chính xác nhất

 Sau mỗi lần pha hóa chất, cần phải đem các ống chứa albumin đi lắc bằng vortex, giúp albumin có thể tan đều trong dung dịch

 Mẫu kiểm chứng và mẫu thí nghiệm cần phải được tiến hành đo trong cùng điều kiện: cùng một thiết bị đo, sử dụng cùng một cuvet