tổng quan về saponin và bước đầu tìm hiểu về saponin trong hạt trà lâm đồng

Theo đó, saponin là một glycosid có trọng lượng phân tử lớn gồm sapogenin-mạch đường, được thể hiện rõ trong sơ đồ sau: Steroid Triterpenoids + Hình 2.1: Thành phần của một saponin... Ng

Lời cảm ơn

Để làm được khóa luận này sau 4 năm đại học, là nhờ vào sự dạy

dỗ của thầy cô, sự giúp đỡ của người thân, bạn bè

Tôi không biết nói gì hơn ngoài lời biết ơn sâu sắc nhất gửi tới trường ĐH Kỹ Thuật Công Nghệ, ban chủ nhiệm khoa Công Nghệ

Thực Phẩm và những người đã tạo điều kiện cho tôi học tập, phấn đấu

và hoàn thành được luận án này

Xin gửi lời cám ơn chân thành nhất đến GVHD Nguyễn Thị Ngọc Yến, người hướng dẫn cho tôi thực hiện đề tài này

Tp Hồ Chí Minh Tháng 10, năm 2008

VÕ NGÔ THU VÂN

Tên đồ án: TỔNG QUAN VỀ SAPONIN VÀ BƯỚC ĐẦU TÌM HIỂU VỀ SAPONIN

TRONG HẠT TRÀ XAH LÂM ĐỒNG

Đồ án được chia ra làm 2 phần chính:

 Tổng quan về saponin

 Tìm hiểu và nghiên cứu saponin từ hạt trà xanh Lâm Đồng

I) Phần tổng quan về saponin gồm các nội dung chính sau:

 Tổng quan về saponin

 Nguyên liệu giàu saponin

 Các phương pháp định tính saponin

 Chiết suất và tinh chế saponin

 Tác dụng sinh học và ứng dụng của saponin

II) Phần tìm hiểu và nghiên cứu saponin từ hạt trà Lâm Đồng được tiến hành theo 5 bước:

Bước 1: Xử lý hạt trà

Bước 2: Nghiền mịn hạt trà

Bước 3: Định tính nguyên liệu bột hạt trà Nếu kết quả dương tính thì tiến hành tiếp bước (4)

và các bước tiếp theo Nếu kết quả không đạt, tiến hành bước (6): kết luận và đánh giá quá trình nghiên cứu

Bước 4: Nếu kết quả bước (3) là dương tính, bước (4) sẽ tiến hành nghiên cứu trích ly saponin thô từ hạt trà

Bước 5: Tiến hành định tính sơ bộ sản phẩm trích ly được từ bước (4)

Bước 6: Đánh giá kết quả bước (5) từ đó rút ra kết luận cho quá trình nghiên cứu và đề xuất kiến nghị

Kết quả đề tài:

Kết luận trong hạt trà có chứa saponin Saponin hạt trà thuộc nhóm saponin triterpen

dương tính trong các thí nghiệm định tính

Tuy nhiên sản phẩm saponin thu được trong quá trình trích ly còn lẫn nhiều tạp

Từ những kết quả trên đề xuất một số các ý định nhằm phát triển đề tài sâu và rộng hơn

Đề mục Trang

Lời cảm ơn i

Tóm tắt ii

Mục lục iv

Danh sách hình vẽ vii

Danh sách bảng biểu x

Danh sách các từ viết tắt xi

CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN VỀ SAPONIN 2

2.1 Tổng quan về saponin 2

2.2 Nguyên liệu giàu saponin 6

2.3 Cấu tạo và tính chất một số saponin 10

2.3.1 Saponin triterpen 10

a Nhóm saponin triterpen 5 vòng 11

b Nhóm saponin trierpen 4 vòng 15

2.3.2 Saponin steroid 17

2.4 Các phương pháp định tính saponin 21

2.5 Chiết suất và tinh chế saponin 25

2.5.1 Chiết suất saponin 25

2.5.2 Thủy phân tách sapogenin và đường 26

2.6 Tác dụng sinh học và ứng dụng của saponin 38

2.6.1 Tác dụng sinh học 38

2.6.2 Ứng dụng 41

3.1 Tình hình nghiên cứu saponin từ hạt trà trên thế giới 43

a) Tình hình nghiên cứu saponin từ hạt trà trên thế giới 43

b) Tính chất vật lý và hóa học của sản phẩm saponin hạt trà 44

c) Ứng dụng của saponin hạt trà 46

3.2 Phương pháp nghiên cứu 47

3.2.1 Nguyên liệu, hóa chất, dụng cụ và thiết bị 48

a Nguyên liệu 48

a.1 Mô tả nguyên liệu 48

a.2 Xử lý nguyên liệu 48

a.3 Khảo sát sơ bộ chất lượng nguyên liệu 49

a.4 Định tính sơ bộ nguyên liệu 50

a.5 Kết luận về nguyên liệu 55

b Hóa chất 55

c Dụng cụ và thiết bị 56

3.2.2 Xây dựng quy trình trích ly saponin thô từ bột hạt chè 56

a) Quy trình dự kiến 56

b) Thuyết minh quy trình 58

c) Giải thích cơ sở lý thuyết chính của quy trình dự kiến 58

d) Giải thích hướng lựa chọn quy trình 59

3.2.3 Khảo sát một số thông số của quá trình 59

a) Khảo sát ảnh hưởng của thông số nhiệt độ đến quá trình trích ly 60

b) Khảo sát ảnh hưởng của thông số thời gian đến quá trình trích ly 62

c) Khảo sát ảnh hưởng của thông số dung môi đến quá trình trích ly 63

a) Kết quả thu được 64

b) Định tính saponin thô 65

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ KIẾN NGHỊ 72

4.1 Kết luận về quá trình nghiên cứu về saponin trong hạt trà 72

4.2 Kiến nghị 72

Đề mục hình Trang

Hình 2.1: Thành phần của một saponin 2

Hình 2.2: Phân loại các saponin 5

Hình 2.3: Cây nhân sâm 6

Hình 2.4: Cấu trúc nhóm 1 7

Hình 2.5: Cấu trúc nhóm 2 8

Hình 2.6: Cây tam thất 10

Hình 2.7: Phần aglycon của saponin triterpen 11

Hình 2.8: Khung oleanan 11

Hình 2.9: β-amyrin 11

Hình 2.10: Acid oleananolic 12

Hình 2.11: Acid cincholic 12

Hình 2.12: Hederagenin 12

Hình 2.13: Gypsogenin 12

Hình 2.14: Khung Ursan 13

Hình 2.15: -amyrin = 3β-hydroxy Ursan-12 en 13

Hình 2.16: Acid Quinovic 13

Hình 2.17: Cinchonin glycosid B 13

Hình 2.18: Asiatic acid 13

Hình 2.19: Acid Madecassic 13

Hình 2.20: Khung Lupan 14

Hình 2.21: Lupeol 14

Hình 2.22: Betulin 14

Hình 2.24: Khung Hopan 15

Hình 2.25: Mollugogenol-B 15

Hình 2.26: Khung Dammaran 15

Hình 2.27: Khung Lanostan 15

Hình 2.28: Khung Cucurbitan 15

Hình 2.29: Proto-panaxadiol (R=H); Proto-panaxtriol (R=OH) 16

Hình 2.30: Panaxadiol (R=H); Panaxatriol (R=OH) 16

Hình 2.31: Khung Cucurbitan 17

Hình 2.32: Diosgenin 18

Hình 2.33: Hecogenin 18

Hình 2.34: Khung Furostan 18

Hình 2.35: Sapogenin của Sarsa-parillosid 19

Hình 2.36: Solasodin 20

Hình 2.37: Tomatidin 20

Hình 2.38: Solanidan 20

Hình 2.39: Quy trình trích ly saponin 29

Hình 2.40: Quy trình chiết tách saponin triterpenoid 30

Hình 2.41: Quy trình chiết tách sapogenin triterpenoid 31

Hình 2.42: Phương pháp chiết datiscacin, một chất thuộc nhóm cucurbitacin 32

Hình 2.43: Phương pháp chiết tách saponin steroid nhóm spirostan 33

Hình 2.44: Phương pháp chiết diosgenin 34

Hình 2.45: Phương pháp chiết tách 2 nhóm saponin spirostan và furostan 35

Hình 3.1: Các sản phẩm saponin hạt trà dạng bột của Shanghai Youngsun Food 43

Hình 3.3: Sản phẩm saponin hạt trà dạng bột trên trang web ECVV.com 44

Hình 3.4: Sản phẩm saponin hạt trà của công ty Choisun 44

Hình 3.5: Công thức cấu tạo saponin hạt trà 46

Hình 3.6: Sơ đồ các bước nghiên cứu 47

Hình 3.7: Ống nghiệm chứa dịch chiết cồn sau khi lắc 51

Hình 3.8: Kết quả các ống nghiệm sau khi lắc 52

Hình 3.9: Kết quả các ống nghiệm sau khi lắc 15 phút 52

Hình 3.10: Đáy ống nghiệm chuẩn 53

Hình 3.11: Đáy ống nghiệm có dung dịch A 53

Hình 3.12: Bình tam giác sau khi đã nhỏ acid 54

Hình 3.13: Quy trình trích ly saponin dự kiến 57

Hình 3.14: Ảnh túi bột trà được đặt vào bộ soxhlet 58

Hình 3.15: Kết quả thí nghiệm 64

Hình 3.16: Cắn saponin thô toàn phần 65

Hình 3.17: Cột bọt ngay sau khi lắc 66

Hình 3.18: Cột bọt sau khi lắc 15 phút 66

Hình 3.19: Chiều cao hai cột bọt sau khi lắc 66

Hình 3.20: Kết quả khi acid sulfuric chảy xuống đáy ống nghiệm 68

Hình 3.21: Kết quả khi nhỏ acid sulfuric 68

Hình 3.22: Đĩa petri chứa dd saponin đã nhỏ acid sulfuric 69

Hình 3.23: Kéo loãng đốm màu để nhận xét màu 69

Hình 3.24: Cá chết trong mẫu thí nghiệm 69

Hình 3.25: Cá vẫn còn sống trong mẫu chuẩn 69

Đề mục bảng Trang

Bảng 2.1: Các saponin thuộc nhóm cấu trúc 1 trong rễ sâm 7

Bảng 2.2: Các saponin thuộc nhóm cấu trúc 2 trong rễ sâm 8

Bảng 3.1: Mô tả chỉ tiêu saponin hạt trà dạng bột 45

Bảng 3.2: Kết quả thí nghiệm phân tích độ ẩm 49

Bảng 3.3: Qúa trình thực nghiệm 51

Bảng 3.4: Tóm tắt kết quả định tính saponin trong bột hạt trà 55

Bảng 3.5: Kết quả khảo sát nhiệt độ quá trình loại chất béo bằng ether 60

Bảng 3.6: Kết quả khảo sát nhiệt độ quá trình trích ly saponin bằng methanol 61

Bảng 3.7: Kết quả khảo sát thời gian trong quá trình loại dầu bằng ether 62

Bảng 3.8: Kết quả khảo sát thời gian tối ưu nhất trong quá trình loại dầu bằng ether 62

Bảng 3.9: Kết quả khảo sát thời gian trong quá trình trích ly saponin bằng methanol 63

Bảng 3.10: Kết quả khảo sát thời gian tối ưu nhất trong quá trình chiết saponin bằng methanol 63

Bảng 3.11: Tóm tắt kết quả định tính saponin trong cắn thu được 71

rCHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong xã hội hiện đại ngày nay, khi mà cuộc sống con người ngày một nâng cao, môi trường

ngày một ô nhiễm thì các sản phẩm, hoạt chất có nguồn gốc sinh học, có lợi cho sức khỏe luôn

được quan tâm và phát triển

Một trong số những hoạt chất sinh học được quan tâm, nghiên cứu và ứng dụng rất nhiều

trong y học hiện nay là nhóm hợp chất saponin

Vậy saponin là gì? Nguồn thu nhận saponin từ đâu?

Có thể nói, nguồn thu nhận saponin là rất phong phú và đa dạng, thế nhưng hiện nay nếu chú

ý, chúng ta có thể nhận thấy rằng, trên các trang web của thế giới đặc biệt là Trung Quốc đang

rao bán rất sôi nổi các sản phẩm saponin trích ly từ hạt trà

Vậy tại sao, nước chúng ta - một nước trồng và xuất khẩu trà nổi tiếng thế giới - lại không

nghiên cứu, khai thác sản phẩm này

Saponin trích ly từ hạt trà đã được nhiều nước công nhận là có ứng dụng nhiều trong ngành

thực phẩm, nhất là trong lĩnh vực đồ uống về khả năng tạo nhũ, tạo bọt rất tốt

Hơn nữa, hiện nay, chúng ta đều biết rằng, các hạt trà gần như là một phế phẩm trong ngành

công nghiệp trồng trà Kĩ thuật trồng trà bằng hạt dần đang được thay thế bằng các kỹ thuật trồng

trà vô tính Do đó hạt trà hiện nay chỉ là một thứ phế phẩm, không được sử dụng

Thời gian gần đây có công ty TNHH XD TM Huỳnh Gia, 37 Gò Công, phường 13, quận 5 tp

HCM, đang rao bán sản phẩm saponin từ trà nhưng theo sự tìm hiểu thì đây đơn giản chỉ là bột

được xây từ một loại hạt trà có nguồn gốc từ Trung Quốc, không phải là saponin trích ly từ hạt

trà

Vậy tại sao các nhà khoa học Việt Nam lại không quan tâm đến saponin trích ly từ hạt trà

Phải chăng do điều kiện thổ nhưỡng mà hạt trà Việt Nam không chứa saponin hoặc saponin trong

hạt trà Việt Nam không có những tác dụng sinh học tốt như saponin trích ly từ hạt trà ở các nước

khác

Với những lí do đó, tôi quyết định thực hiện đề tài này nhằm giải đáp phần nào những thắc

mắc trên Cụ thể đề tài : - Tìm hiểu về nhóm hợp chất sinh học saponin

- Tìm hiểu và nghiên cứu saponin từ hạt trà xanh Lâm Đồng

CHƯƠNG 2:

TỔNG QUAN VỀ SAPONIN

2.1 Tổng quan về saponin [7], [13], [18], [15], [26]

Saponin là một thuật ngữ do L.Kofler, một nhà hóa học người Áo, đề xuất từ năm 1927 trong

cuốn ”Die Saponin”, dùng để chỉ một nhóm hợp chất tự nhiên lớn thường gặp trong thực vật

Tiền tố sapo có nghĩa là xà phòng; và thực tế thường gặp từ “saponification” có nghĩa là sự xà

phòng hóa trong cả tiếng Anh và tiếng Pháp

Theo đó, saponin là một glycosid có trọng lượng phân tử lớn (gồm sapogenin-mạch đường),

được thể hiện rõ trong sơ đồ sau:

Steroid Triterpenoids +

Hình 2.1: Thành phần của một saponin

a Một số tính chất cơ bản của saponin:

Tạo nhiều bọt và bền khi lắc với nước: vì có hoạt tính bề mặt cao do phân tử saponin có

một đầu ưa nước và một đầu kỵ nước Tính chất này làm cho saponin giống xà phòng: có tính

nhũ hóa và tẩy sạch

Tính phá huyết: làm vỡ hồng cầu ngay ở nồng độ rất loãng Người ta cho rằng tính phá

huyết có liên quan đến sự tạo phức giữa saponin với cholesterol và các este của cholesterol trong

màng hồng cầu, nhưng có nhiều trường hợp chỉ số phá huyết và khả năng tạo phức với

cholesterol không tỷ lệ thuận với nhau nên phải xét đến ảnh hưởng của saponin trên các thành

phần khác của màng hồng cầu Qua việc theo dõi tính phá huyết, người ta thấy rằng cấu trúc của

phần aglycone có tác dụng trực tiếp đến tính phá huyết còn phần đường có ảnh hưởng đến mức

độ phá huyết Hồng cầu của các động vật khác nhau cũng bị ảnh hưởng khác nhau đối với 1 loại

saponin Hồng cầu cừu dễ bị phá huyết nhất nên dùng tốt để tính chỉ số phá huyết, nếu không có

máu cừu thì dùng máu của động vật có sừng khác

Tính độc với cá và một số động vật máu lạnh, động vật thân mềm: Tính chất này được

giải thích do saponin làm tăng tính thấm của biểu mô đường hô hấp làm mất các chất điện giải

cần thiết

Tính tạo phức với cholesterol hoặc với các chất 3-β-hydroxysteroid khác: Đôi khi người

ta lợi dụng tính chất này để tách saponin hoặc ngược lại, dùng saponin để tách hoặc tinh chế

Các ginsenosid trong Nhân sâm Panax ginseng, Glycyrrhizin trong Cam thảo, các

soya-saponin có trong đậu nành lại không có tính phá huyết hoặc tính phá huyết rất kém

Sarsaparillosid trong loài Kim cang Smilax aristolochiaefolia hoặc Jurubin trong loài cà

Solanum paniculatum lại không có tính phá huyết cũng không có tính tạo phức với Cholesterol

Vì vậy, ngày nay để xác định chắc chắn là Saponin người ta dựa vào cấu trúc hóa học của

chúng (Các tính chất vừa nêu trên chỉ có tính chất sơ bộ xác định)

Saponin khó bị thẩm tích vì có phân tử lớn

Các saponin đều là các chất quang hoạt, phần lớn các sapogenin steroid thì tả truyền,

sapogenin triterpenoid thì hữu truyền Điểm chảy của các sapogenin thường cao, từ 200oC trở lên

Saponin tan được trong dung môi có nước

Saponin tan khá chuyên biệt trong n-butanol bão hòa nước

Saponin kém tan trong các dung môi hữu cơ kém phân cực

Saponin có thể bị tủa bởi dung dịch acetat chì kiềm, một số saponin cũng có thể bị tủa bởi

dung dịch acetat chì trung tính

Các saponin triterpen polycarboxylic còn có thể tủa trong môi trường acid vô cơ mạnh (HCl,

H2SO4…) hoặc môi trường amoni sulfat

d Phân loại saponin

* Trước đây, dựa vào khả năng tạo tủa trong các môi trường khác nhau, người ta chia saponin

thành 2 loại là saponin trung tính và saponin acid Theo cách chia này thì:

Saponin trung tính: cho tủa với dung dịch Ba(OH) 2 và chì acetat kiềm

Saponin acid: tan trong dung dịch kiềm, cho tủa với dung dịch chì acetat, ammonium

sulfat

* Ngoài ra người ta cũng có thể chia saponin thành 3 loại:

Saponin acid: trong phân tử có nhóm –COOH

Saponin kiềm: trong phân tử có N, không có nhóm –COOH

Saponin trung tính

* Hiện nay, dựa vào cấu trúc hóa học, người ta chia saponin thành 2 loại chính: saponin

triterpen và saponin steroid

e Sự phân bố saponin trong tự nhiên

* Saponin phân bố rất rộng trong thực vật (#500 loài/90 họ)

Saponin triterpen thường gặp ở cây thuộc lớp 2 lá mầm

Saponin steroid thường gặp ở cây thuộc lớp một lá mầm

– Các họ cây thường chứa saponin triterpen:

+ Họ Nhân sâm (Araliaceae)

Spirosolan Solanidan Aminofurostan

Hình 2.2: Phân loại các saponin

+ Họ Dứa dại (Agavaceae)

* Bên cạnh đó Saponin còn có ở một số động vật như các loài:

Hải sâm (Actinopyga agassizi, Holothuria vagabunda, H.polii, H scabra, H

leucospilota, H librica, Stichopus japonicus, S chloronotus…)

Sao biển, Hải quỳ (Acanthaster planci, Asterina pectinifera, A.forbesi, Patiria

miniata, Pisaster ochraceus, P brevispinus, Pycnopodia helianthoides…)

Mật của vài loài Bò cũng có chứa saponin

2.2 Nguyên liệu giàu saponin [14], [10]

Hình 2.3: Cây nhân sâm

saponin Sự khác biệt lớn này là do điều kiện địa hình, khí hậu đặc trưng của Hàn Quốc, cùng với

thời gian trồng sâm Sâm Hàn Quốc nhờ vậy mà có kết cấu tinh vi, giàu mùi vị và đậm hương

Hiện nay, trong rễ nhân sâm các nhà khoa học đã xác định và biết được gần 30 saponin thuộc

hai nhóm cấu trúc sau:

Cấu trúc nhóm 1:

Cấu trúc phần đường và tên các saponin thuộc cấu trúc nhóm 1 có trong rễ sâm:

Bảng 2.1: Các saponin thuộc nhóm cấu trúc 1 trong rễ sâm

1 Gingsenosid-Ra1 -glc2-glc -glc6-ara(p)4-xyl

2 Gingsenosid- Ra2 -glc2-glc -glc6-ara(f)2-xyl

10 Malonyl-Gingsenosid -glc2-glc6-Ma -glc6-ara(p)

11 Malonyl-Gingsenosid -glc2-glc6-Ma -glc6-ara(f)

Hình 2.4: Cấu trúc nhóm 1

12 Malonyl-Gingsenosid -glc2-glc6-Ma -glc

13 Gingsenosid-Rg3 (20 S) -glc2-glc -H

14 Gingsenosid-Rg3 (20 R) -glc2-glc -H

16 Gingsenosid-Rs1 -glc2-glc6-Ac -glc6-ara(p)

17 Gingsenosid-Rs2 -glc2-glc6-Ac -glc6-ara(f)

18 Gingsenosid-R1 -glc2-glc6-Ac -glc6-glc

19 Gingsenosid-R4 -glc2-glc -glc6-glc6-xyl

(Ghi chú: glc: glucopyranosyl; Rha: rhamnopyranosyl; Xyl: xylopyranosyl;

ara: arabinopyranosyl; Ac: acetyl; Ma: malonyl) Cấu trúc nhóm 2:

Cấu trúc phần đường và tên các saponin thuộc cấu trúc nhóm 1 có trong rễ sâm:

Bảng 2.2: Các saponin nhóm cấu trúc 2 trong rễ sâm

(Ghi chú: glc :glucopyranosyl; Rha: rhamnopyranosyl; Xyl: xylopyranosyl)

Saponin là thành phần chính tạo nên giá trị của sâm Sự khác biệt về mặt giá trị giữa hồng

sâm và bạch sâm cũng do chính hàm lượng và tính chất của saponin chứa trong chúng quyết định

Hồng sâm có giá trị hơn bạch sâm là do hồng sâm chứa rất nhiều loại saponin mới, thêm nữa,

hoạt tính dược học của nó rất tích cực

Thế giới đã chứng minh được rằng chính nhờ các thành phần saponin chứa trong chúng mà

sâm có những tác dụng sinh học:

- Tăng cường hoạt động của não

- Chữa lành và phòng bệnh tiểu đường

- Chữa lành và phòng bệnh ung thư máu

- Chữa lành và phòng bệnh xơ cứng động mạch

b) Bồ kết

Hiện nay, saponin thường được chiết từ quả bồ kết vì quả bồ kết cũng là nguồn nguyên liệu

rất giàu saponin

Năm 1961 Đỗ Tất Lợi, G Herman và I Ciulei chiết saponin từ bồ kết với hiệu suất 10%

Năm 1966 các tác giả trên công bố đặc điểm của một saponin như sau: Chỉ số phá huyết là

35.000; Sau khi thủy phân thì thu được aglycon có điểm chảy 291-298oC, xác định thuộc dẫn

chất β-amyrin

Năm 1967, Nguyễn Đăng Tâm phân lập saponin của bồ kết đặt tên là boketosid đã xác định

một saponin có aglycon là acid oleanolic có phần đường là glucose + arabinose + xylose Một

aglycon của saponin thứ hai là acid echynocystic

Năm 1973, Ngô Thị Bích Hải tách được một saponin đặt tên là australosid có phần aglycon là

acid echynocystic, phần đường có hai mạch: một mạch nối vào OH- ở C-3 gồm có D-xylose,

L-arabinose, glucose theo tỉ lệ 2:1:1 Còn mạch ở C-28 theo dây nối ester gồm xylose,

D-galactose theo tỉ lệ 1:1

c) Tam thất

Ngoài ra, Tam thất cũng là một nguồn nguyên liệu rất giàu saponin, thành phần chính của tam thất là các saponin thuộc nhóm dammaran mà phần aglycon cũng là 2 chất protopanaxadiol và protopanaxatriol như ở nhân sâm Sau đây

Trong số các saponin trên, G-Rb1 có hàm lượng 1,8% và G-Rg1 là 1,9% còn G-Rb2 và G-Rc

thì rất thấp

(Chú thích: G= Gingsenosid, Gy: gypenosid, N=notoginsenosid)

Các bộ phận khác của cây như rễ con, lá hoa đều có saponin nhóm dammaran đã được nghiên

cứu

2.3 Cấu tạo và tính chất một số saponin [18], [13], [7]

2.3.1 Saponin triterpen

Phần aglycon của các saponin triterpenoid có một khung hydrocarbon với 30 carbon Khung

hydrocarbon có thể chia thành 6 nhóm hemiterpen xắp xếp theo qui tắc đầu đuôi (trừ vòng C đối

với phân nhóm Oleanan; trừ vòng C và E đối với phân nhóm Ursan…)

Hình 2.6: Cây tam thất

Saponin triterpen chiếm đa số trong các saponin đã gặp trong tự nhiên; Đến nay đã biết

khoảng 360 sapogenin và 750 saponin triterpen tương ứng

Saponin triterpen được chia thành 2 nhóm :

- Saponin triterpenoid pentacyclic (5 vòng)

- Saponin triterpenoid tetracylic (4 vòng)

a Nhóm saponin triterpen 5 vòng

Phần aglycon này có cấu trúc 5 vòng và được phân thành 4 phân nhóm chính: Oleanan,

Ursan, Lupan, Hopan

a.1 Phân nhóm Oleanan (Olean)

Chiếm đa số trong nhóm saponin triterpen

Phần sapogenin thường là β-amyrin (3- β-hydroxy olean-12-en)

Nhóm Oleanan có thể có một mạch đường (monodesmosid), hoặc hai mạch đường

(bidesmosid)

Vài saponin có 3 mạch đường (tridesmosid)

Hình 2.8: Khung oleanan Hình 2.9: β-amyrin

Hình 2.7: Phần aglycon của saponin triterpen

Nếu là monodesmosid thì mạch đường thường gắn vào nhóm –OH ở C-3 theo nối acetal

Nếu là bidesmosid thì mạch đường thứ hai thường gắn vào nhóm –COOH ở C-28 theo đường

nối ester (tạo pseudo-glycosid)

Trong một mạch đường thường có từ 1 đến 6 phân tử đường Các đường thường gặp là

glucose, galactose, rhamnose, xylose, arabinose, acid glucuronic, acid galacturonic…

Những sapogenin thường gặp

Trong phân nhóm Oleanan thì acid Oleanolic là sapogenin phổ biến nhất

a.2 Phân nhóm Ursan

Ít gặp hơn phân nhóm Oleanan Phần sapogenin của chúng thường là dẫn chất từ -amyrin =

3β-hydroxy Ursan-12en (Cấu trúc cũng tương tự nhóm oleanan chỉ khác là nhóm methyl ở C30

không đính vào C20 mà dính vào C19) Ở C-28 thường là nhóm -COOH Đôi khi, nhóm -COOH

còn có ở C-27

Các sapogenin thường gặp:

Hình 2.10: Acid oleanolic Hình 2.11: Acid cincholic

Hình 2.12: Hederagenin Hình 2.13: Gypsogenin

Acid quinovic (có trong vỏ thân Canhkina)

Acid asiatic, acid Madecassic, acid Madasiatic (là các sapogenin của saponin có trong lá rau

má Centella asiatica) thuộc phân nhóm này

Hình 1.14: Khung Ursan Hình 1.15: -amyrin=3

β-hydroxy Ursan-12en

Hình 2.16: Acid Quinovic Hình 2.17: Cinchonin glycosid B

Hình 2.18: Asiatic acid Hình 2.19: Acid Madecassic

Hình 2.20: Khung Lupan Hình 2.21: Lupeol

Hình 2.22: Betulin Hình 2.23: Acid Betulinic

a.3 Phân nhóm Lupan (Lupeol)

Phân nhóm này ít gặp trong tự nhiên…

Đa số các sapogenin thuộc phân nhóm Lupan đều có:

 Vòng E là vòng 5 cạnh

 Δ20-29 (ngoài vòng E), không có Δ12: đây là điểm khác với Oleanan

 Nhóm β-OH ở C-3, nhóm β-COOH ở C-28, giống như ở Oleanan

Chú ý: Như đa số triterpen khác, phân nhóm Lupan cũng có gem-dimethyl ở C-4

a.4 Phân nhóm Hopan:

Phân nhóm này cũng hiếm gặp Trong cấu trúc thường có nhóm β-OH ở C-3

Đây cũng là vị trí thường tạo O-glycosid với đường (Vòng E là vòng 5 cạnh, C22 ở ngoài

vòng, nhóm methyl gắn vào C18 thay vì gắn vào C17)

Hình 2.25: Mollugogenol-B Hình 2.24: Khung Hopan

b Nhóm saponin triterpen 4 vòng

Các saponin loại này cũng có 30 carbon Cấu trúc gồm 4 vòng A, B, C và D Trong đó D là

vòng 5 cạnh Phía ngoài vòng D là 1 mạch nhánh có 8 carbon (từ C-20 đến C-27)

Các saponin nhóm Dammaran thường gặp ở các cây thuộc chi Panax (họ Araliaceae) Đáng

chú ý nhất là saponin của cây nhân sâm (Panax ginseng) chúng được gọi chung là các Ginsenosid

hoặc Panaxosid

Các saponin này có thể có 1 hoặc 2 mạch đường Các mạch đường này thường gắn vào các

nhóm –OH (ở C-3 và C-6 hoặc C-3 và C-20) để tạo O-glycosid

Nhóm Dammaran còn gặp trong hạt Táo ta (Ziziphus jujuba Mill, họ Rhamnaceae)

Hình 2.27: Khung Lanostan Hình 2.26: Khung Dammaran Hình 2.28: Khung Cucurbitan

Hình 2.29: Proto-panaxadiol (R=H)

Proto-panaxtriol (R=OH)

Hình 2.30: Panaxadiol (R=H) Panaxatriol (R=OH) Hình 1.30 Panaxadiol (R=H) Panaxtriol (R=OH)

b.2 Phân nhóm Lanostan

Đại diện cho nhóm này là các saponin gặp trong nhiều loài hải sâm (Holothuria sp.)

Cho đến nay đã biết được khoảng 50 chất thuộc nhóm này, một số saponin điển hình

Holothurin A, B; Holotoxin A, B

Sapogenin phân nhóm này thường có

Một nhóm β-OH ở C-3 (mạch đường thường gắn vào đây)

Một gem-dimethyl ở C-4, một nối đôi ở C-9 đến C-11

Một nhóm Oxo (ceton) ở C-16

Các saponin nhóm này có tính phá huyết rất mạnh và rất độc với cá ( Nồng độ khoảng 10ppm

cũng đủ giết chết cá trong vài phút)

b.3 Phân nhóm Cucurbitan

Các saponin có khung Cucurbitan được gọi chung là các Cucurbitacin Cucurbitacin là những

chất có vị đắng, thường gặp ở họ Cucurbitaceae trong các chi Citrullus, Coccinia, Cucumis , có

cấu trúc khung khá gần với phân nhóm Lanostan, Dammaran

Trong tự nhiên, các Cucurbitacin thường ở dạng glycosid (thường là β-O-glucosid, hay gặp ở

-OH/C-2) Nếu trong cây có sẵn enzym β-glucosidase, thì khi phân lập chỉ thu được dạng

sapogenin

Trong cấu trúc Cucurbitacin thường có:

o Nhóm oxo (ceton, >C=O) ở C-1, C-11 và C-22

o Các nhóm –OH ở C-2, C-3, C-6, C-16 , C-20β, C-25

o Nối đôi ở C-5 đến C-6, gem-dimethyl ở C-4

o Nhóm methyl gắn vào C9 thay vì C10 như ở các nhóm khác

Một số chất điển hình: Cucurbitacin A, B, C, đến R, S, T (khoảng 30 chất)

b.4 Các phân nhóm đặc biệt khác:

Một vài saponin triterpen pentacyclic chỉ có 29C (nor-triterpen) hoặc 28C (bisnor- triterpen)

Các nhóm này ít được chú ý

2.3.2 Saponin steroid (SS)

Có phân bố hẹp hơn saponin triterpen Các sapogenin loại này gồm 27C thường có 4 vòng

chính A, B, C, D cấu tạo theo kiểu steroid

Thường thì mạch nhánh 8C (C-20  C-27) tạo thành 2 dị vòng nữa (vòng E và vòng F)

Chú ý:

Vị trí 2 vòng C/D luôn là trans (còn ở glycosid trợ tim thì C/D luôn là cis)

So với saponin triterpen, saponin steroid luôn có di-β-methyl ở C-10 và C-13, ở vòng A

không có nhóm gem-dimethyl

Hình 2.31: Khung Cucurbitan

Hình 2.34: Khung Furostan

a) Nhóm Spirostan (nhóm spirostanol)

Chiếm đa số trong saponin steroid, đến nay đã biết được khoảng 100 aglycon và hơn 150

saponin tương ứng Vòng E là vòng epoxy 5 cạnh (hydrofuran), vòng F là vòng epoxy 6 cạnh

(hydropyran) Hai vòng E và F có chung 1 carbon C-22 Do vậy mạch nhánh 8C này được gọi là

mạch nhánh spiroacetal (spiroketal = xoắn)

Ở C-3 thường có nhóm β-OH, vài trường hợp là -OH Mạch đường thường phân nhánh phức

tạp, mạch đường này thường tạo nối glycosid với nhóm -OH ở C-3 (đôi khi ở C-1)

Trong nhóm spirostan đáng chú ý có Diosgenin là 1 sapogenin chiết xuất chủ yếu từ các loài

có thân thuộc chi Dioscorea họ Dioscoreaceae Diosgenin còn gặp ở cây Mía dò Costus

speciosus Diosgenin là nguyên liệu chính để tổng hợp các dẫn chất steroid dùng làm thuốc

Ngoài ra còn có Tigogenin, Hecogenin có chủ yếu trong các chi Yucca, Agave (Hecogenin có

cấu trúc như Tigogenin nhưng thêm nhóm Oxo ở C-12)

b) Nhóm Furostan (Nhóm Furostanol)

Cấu trúc cũng giống nhóm Spirostan, chỉ khác là vòng F mở

Hình 2.32: Diosgenin

Hình 2.33: Hecogenin

Hình 2.35: Sapogenin của Sarsa-parillosid

Vị trí tạo O-glycosid: -OH ở C3 hay –OH ở C-26

Những chất furostan kiểu Sarsa-parillosid dưới tác dụng của acid (do sử dụng trong quá trình

chiết xuất, thủy phân ) hoặc tác dụng của enzym (do có sẵn trong dược liệu) thì sẽ xảy ra hiện

tượng:

- Mạch đường ở C-26 bị cắt, xuất hiện lại nhóm –CH2OH

- Loại bỏ 1 phân tử H2O, đóng vòng F (vòng hydropyran): trở thành nhóm spirostan

Điều này được ứng dụng trong thực tế: hiệu suất chiết nhóm spirostan sẽ tăng nếu ta thái

mỏng dược liệu rồi ủ vài ngày ở 37oC (do enzym trong cây sẽ biến nhóm furostan thành

spirostan)

c) Nhóm Glyco-alkaloid (glycosid alkaloid steroid)

Thường gặp trong họ Cà (Solanaceae) Nhóm glyco-alkaloid cũng có tính phá huyết, tạo phức

với cholesterol Saponin thuộc nhóm này còn được gọi là saponin kiềm Cấu trúc của chúng gồm

27 carbon, chia thành 6 vòng, trong đó E và F là 2 dị vòng Dựa vào cấu trúc, có thể chia nhóm

này thành 2 phân nhóm spirosolan và Solanidan

c.1 Phân nhóm Spirosolan

Có cấu trúc tương tự nhóm Spirostan nhưng ở vòng F nguyên tử -O- thay bằng -NH-

Thường gặp trong họ Cà (Solanaceae) như cà chua, cà lá xẻ, khoai tây

Hai sapogenin điển hình của phân nhóm này là Solasodin (22 N) và Tomatidin (22β N)

Hình 2.38: Solanidan

Solasodin cũng là một nguyên liệu để tổng hợp Progesterol (làm thuốc ngừa thai), Cortison và

một số thuốc steroid khác

c.2 Phân nhóm Solanidan:

Hai vòng E và F chung nhau 1 carbon và 1 nitơ Điển hình của phân nhóm này là Solanidin (1

genin của Solanin có trong mầm khoai tây)

Solanidin cũng là 1 nguyên liệu dùng để bán tổng hợp các thuốc steroid

c.3 Nhóm aminofurostan:

Nó tương tự như nhóm furostan nhưng ở vị trí C-3 đính nhóm NH2 Đại diện cho nhóm này là

hợp chất jurubin có trong Solanum paniculatum

d) Các nhóm đặc biệt khác

Ít gặp trong tự nhiên, ví dụ Protometeogenin, Aminofurostan, Avenacosid, Kryptogenin,

-spinasterol, Polypodo-saponin

Hình 2.36: Solasodin Hình 2.37: Tomatidin

Các saponin steroid có trong sao biển (starfish) và hải quỳ (brittle star) gọi là các

Astero-saponin hiện cũng được chú ý nghiên cứu vì nhiều chất trong số này có tác dụng kháng khối u,

kháng tế bào ung thư trên các mô hình thực nghiệm

2.4 Các phương pháp định tính saponin [18], [14], [4], [8]

a) Xác định sơ bộ:

- Nhỏ vài giọt dịch chiết cồn vào 1 ống nghiệm chứa sẵn một ít nước

- Lắc mạnh rồi để yên Xác định là dương tính khi bọt nhiều và bền sau 15 phút

b) Phân biệt saponin triterpen và saponin steroid (Trắc nghiệm Fontan-Kaudel)

Vài giọt dịch chiết cồn được cho vào 2 ống nghiệm, 1 ống chứa 5ml HCl 0,1N (có pH=1) và

1 ống chứa 5ml NaOH 0,1N (có pH =13) Lắc mạnh 1 phút, để yên rồi quan sát cột bọt

- Saponin triterpen: cột bọt ở ống có pH=13 cao bằng cột bọt ở ống có pH=1

- Saponin steroid: cột bọt ở ống có pH=13 cao hơn cột bọt ở ống có pH=1

Đây chỉ là nhận định sơ bộ, kết quả không thật sự chắc chắn

c) Sự phá huyết:

* Hiện tượng

Khi cho hồng cầu vào một dung dịch saponin loãng thì màng hồng cầu dễ bị vỡ, hemoglobin

khuếch tán ra, làm dung dịch có màu hồng đỏ Đây là hiện tượng phá huyết (R Kobert, 1887)

Sự phá huyết gọi là hoàn toàn khi để yên một thời gian, màu hồng đỏ này vẫn còn, không có

hồng cầu lắng đọng

* Cách quan sát

Trên lame, soi kính hiển vi: Nhỏ trực tiếp 1 giọt máu lên lame, quan sát hồng cầu trước và sau

khi thêm 1 giọt dung dịch saponin

Trong ống nghiệm: Cho vào ống nghiệm vài ml dịch treo máu (không có Fibrin, đã được pha

loãng với dung dịch đệm sinh lý) Nhỏ dung dịch chứa saponin vào ống nghiệm này, lắc nhẹ và

đều Để yên 6 giờ ở nhiệt độ phòng, dung dịch của ống bị phá huyết sẽ đỏ hồng đều và trong

Nếu phá huyết hoàn toàn: không có hồng cầu lắng đọng

Trên đĩa thạch - máu: Rót dung dịch saponin vào các lỗ đục trên mặt thạch hoặc thả những

đĩa giấy tẩm dung dịch saponin lên mặt thạch - máu, quan sát vòng phá huyết (không còn màu đỏ

hồng) ở quanh lỗ hoặc quanh đĩa giấy

Trên bản mỏng: Phun dung dịch máu loãng lên bản mỏng, vết saponin nếu có sẽ tạo thành

những vệt trắng trên nền đỏ hồng

d) Tính độc với cá, côn trùng

Ở những nồng độ rất thấp, saponin có thể làm chết cá (và một số động vật máu lạnh, một số

côn trùng khác như ốc sên, mối…)

Độc tính trên cá của saponin được giải thích là do saponin làm tăng tính thấm của biểu mô

đường hô hấp, làm mất những chất điện giải cần thiết của cá, làm cá chết rất nhanh

Có thể dựa vào độc tính trên cá để định tính hoặc định lượng saponin

e) Các phản ứng màu của saponin

* Saponin nói chung:

Phản ứng Salkowski (thực hiện trong ống nghiệm)

Saponin/CHCl3 + H2SO4 5-10%EtOH  màu vàng, hồng, đỏ, xanh lá đến tím

Phản ứng Carr-Price (trong ống nghiệm hoặc bản mỏng sấy nóng)

Saponin/CHCl3 + SbCl3/CHCl3  màu hồng hoặc đỏ (soi UV: saponin triterpen cho huỳnh

quang xanh, saponin steroid cho huỳnh quang vàng)

Phản ứng Liebermann-Burchard (trong ống nghiệm)

Trong môi trường có Ac2O + H2SO4, các triterpen có nối đôi, các triterpen có nhóm –OH và

các steroid sẽ cho màu khác nhau Vì các saponin triterpen tạo màu hồng đến đỏ tím trong khi các

saponin steroid cho màu xanh đến xanh lá nên phản ứng Liebermann-Burchard có thể dùng để

phân biệt saponin triterpen và saponin steroid

Ghi chú:

Để thực hiện phản ứng Liebermann-Burchard dễ dàng, mẫu thử được hòa trong hỗn hợp gồm

1V CHCl3 + 1V Ac2O, lọc lấy phần dung dịch, cho vào một ống nghiệm thật khô sao cho chiều

cao lớp dịch lọc này khoảng 2-3 cm Đặt ống nghiệm nằm nghiêng và cố định (tuyệt đối không

cầm trên tay) sau đó nhẹ nhàng nhỏ acid sulfuric đậm đặc (d = 1,84) chảy theo thành ống nghiệm

và chìm xuống đáy Quan sát thấy (a): vòng ngăn cách có màu nâu, đỏ, tím hoặc (b): màu xanh

dương, xanh lá từ từ khuếch tán lên lớp dung dịch phía trên

Phản ứng với các aldehyd thơm (thường thực hiện trên bản mỏng)

Anisaldehyd, vanillin (và một số aldehyd thơm khác) trong môi trường acid vô cơ mạnh (acid

sulfuric, phosphoric, perchloric…) sẽ tạo màu khác nhau với các sapogenin khác nhau Cực đại

hấp thu của các sản phẩm này thường nằm trong vùng nhìn thấy, khoảng 510 - 620nm Đó là do

các sapogenin bị khử nước, tạo các nối đôi và tác dụng với các aldehyd tạo nên những sản phẩm

ngưng tụ có màu Với thuốc thử là vanillin - acid sulfuric thì

- Các saponin spirostan sẽ cho 2 cực đại hấp thu trong vùng 445 - 460 nm

- Các saponin triterpen có nhóm –OH/C-23 sẽ cho 1 cực đại hấp thu khoảng 460 -

Phản ứng với thuốc thử Sannié (Sannié-Heitz-Lapin, dùng cho SKLM)

Phun dung dịch vanillin 1% EtOH lên bản mỏng, sấy 120oC / 3 phút, phun tiếp hỗn hợp Ac2O

- H2SO4 (12:1); vết saponin steroid cho màu vàng

f) Sắc ký lớp mỏng

Chất hấp phụ

Thông dụng nhất là lớp mỏng silicagel, thường dùng loại bản tráng sẵn trên nền nhôm, nền

chất dẻo hay nền kính, sillicagel đặc biệt thích hợp đối với các sapogenin

Mẫu thử

Chuẩn bị dịch chấm sắc ký lớp mỏng chứa sapogenin:

Bột dược liệu (hoặc saponin toàn phần) được đun hồi lưu với H2SO4 0,5M Để nguội lọc cả

cặn và bã dược liệu đem sấy khô Sau đó chiết sapogenin bằng dung môi hữu cơ nóng (Hồi lưu

hoặc soxhlet với dung môi là CHCl3) Dịch chiết được làm khan với bột Na2SO4 khan Cô dịch

CHCl3 đến cắn khô, hòa cắn này với một ít CHCl3-MeOH (1:1), lọc thu lấy dịch trong chứa

sapogenin dùng để chấm sắc ký

Dung môi khai triển

Đối với saponin nói chung, thông dụng nhất là hệ

- CHCl3 - MeOH-H2O (65: 35:10) Đối với các saponin phân cực, người ta hay dùng hệ

- nBuOH - AcOH-nước (4: 1: 5) hoặc

- CHCl3 - MeOH-AcOH băng-nước (15: 8: 3: 2) hoặc

- CHCl3 - MeOH-AcOH băng-nước (16: 3: 8: 2) Đối với các ginsenosid, người ta hay dùng hệ

- nBuOH - EtOAc-nước (4: 1: 2) Thuốc thử hiện màu

- Thuốc thử Liebermann - Burchard

- Thuốc thử Anisaldehyd - sulfuric

- Thuốc thử Vanillin - sulfuric

- Thuốc thử Carr - Price (Sannié)

Tóm lại, trong kỹ thuật phân tích saponin bằng sắc ký lớp mỏng, chất hấp phụ thông dụng

nhất là silicagel Dung môi khai triển và thuốc thử phát hiện thì rất nhiều, ở đây chỉ giới thiệu

một số dung môi, thuốc thử thông dụng và tổng quát Khi cần nghiên cứu một dược liệu cụ thể,

có thể tham khảo các tài liệu chuyên đề tương ứng

g) Phổ hồng ngoại

Giúp biện giải cấu trúc

h) Phổ tử ngoại

Đa số các saponin đều không có nhóm mang màu (chromophore) nên không cho đỉnh hấp thu

trong vùng UV Ngoại trừ một số trường hợp chất có dây nối đôi cho băng hấp thu trong vùng

205-120 nm Tuy vậy

Khi cho tác dụng với 1 tác nhân khử nước mạnh (H2SO4 đđ), trong cấu trúc saponin sẽ xuất

hiện những nối đôi Khi đó chúng sẽ tạo màu; do vậy có thể đo phổ hấp thu UV được

Có thể căn cứ vào phổ UV để phân biệt saponin triterpen với saponin steroid vì saponin

triterpen trong H2SO4 đậm đặc luôn luôn có λmax = 310 nm

Phổ tử ngoại cũng còn được dùng để định lượng saponin

2.5 Chiết xuất và tinh chế saponin [13], [18]

2.5.1 Chiết xuất saponin

Cũng như một số lớn các hoạt chất khác có trong thực vật, muốn chiết xuất được saponin thực

sự có trong tự nhiên thì nguyên liệu cần phải làm khô nhanh, bảo quản cẩn thận Tuy nhiên cũng

có trường hợp trong sản xuất người ta lại ủ nguyên liệu để enzym có sẵn trong thực vật hoạt động

nhầm tăng hoạt chất mong muốn Trường hợp diosgenin là một ví dụ Blunden và Hardman (J

Phar Pharmacol 1963, 15, 273) bằng phương pháp ủ đã tăng sapogenin steroid trong củ tươi

Dioscorea belizensis lên 5 đến 15% Hardman và Brain (Phytochem, 1971, 10, 519) cũng đã dùng

phương pháp ủ củ Dioscorea deltoidea và hạt của Trigonella foenumgrccum với indol-3-acetic

axit và gilberelic axit đã tăng hiệu xuất sapogenin đến 35% Shag, Bhavsar và Seth cũng áp dụng

phương pháp ủ thân rễ mía dò - Costus speciosus thu hoạch ở những cây 60 ngày tuổi thấy hàm

lượng diosgenin tăng lên hết sức cao Tác giả đã thái thân rễ tươi cây mía dò rồi ủ ở 37oC với

nước có thêm những dung dịch điều hòa tăng trưởng trong 24 giờ rồi sau đó định lượng bằng

phương pháp đo màu Kết quả cho thấy hàm lượng diosgenin là 1,3% trong mẫu đối chứng tăng

lên đến 3,5% khi ủ với nước Mức tăng tối đa tính theo hiệu xuất là 270% Có thể nói đây là một

phương pháp làm tăng hoạt chất rất đáng chú ý

Trước khi chiết rút saponin thường nguyên liệu được loại chất béo kỹ hoặc với ether dầu hỏa

hoặc CHCl3 bằng dụng cụ Soxhlet Sau đó chiết nóng bằng methanol hay ethanol Có khi người ta

thêm một ít pyridin để tránh sự ảnh hưởng của axit có sẵn trong cây Sau khi cất thu hồi cồn để có

cao đặc (nên cất thu hồi cồn dưới áp suất giảm) thường người ta tiếp tục loại chất béo lần 2 bằng

ether Có tác giả thì loại kỷ các tạp chất lần lượt bằng ether dầu, ether, tetrachlorur carbon,

aceton Tiếp đến là hòa tan saponin trong cao bằng butanol Cất thu hồi butanol rồi tinh chế Giai

đoạn đầu của việc tinh chế có thể ứng dụng phương pháp kết tủa bằng một dung môi mà saponin

ít hòa tan, ví dụ saponin trong butanol thì thêm hexan hoặc saponin trong etanol thì thêm ether

hoặc aceton Nếu cần thiết, lặp lại việc kết tủa vài lần Để làm sạch saponin chúng ta có thể tiến

hành thẩm tích vì phân tử saponin lớn khó đi qua được màng bán thấm Muốn vậy, hòa tan

saponin vào nước rồi cho vào túi cellophan (có thể thay túi cellophan bằng bong bóng lợn), đặt

túi cellophan vào dòng nước chảy trong 1 tuần sau đó chuyển sang giai đoạn tách các saponin

Trong một loài thực vật, saponin thường tồn tại một hỗn hợp nhiều chất khác nhau Rất nhiều

trường hợp các saponin này chỉ khác nhau do cấu trúc mạch đường, do đó việc tách các saponin

riêng biệt thường khó Phương pháp chủ yếu để tách saponin là sắc ký cột dùng các chất nạp cột

như silicagel, bột cellulosa, các tác giả người Nhật (Yahara, S.Tanaka, O.và Komori, T (1976)

Chem Pharm Bull Jpn 24, 2204) đã dùng polyamid để tách các saponin của Nhân sâm thấy cho

kết quả tốt Đối với saponin phương pháp sắc ký qua gel (gelchromatography) hay được ứng

dụng còn được gọi là lọc qua gel (gelfiltration) Nguyên tắc của phương pháp là tách các cấu tử

có phân tử lượng khác nhau ra khỏi hỗn hợp bằng cách lọc phân tử qua cột gel Đối với các chất

saponin, một số flavonoid và alcaloid, người ta thường dùng gel dextran, trên thị trường thường

mang tên là Sephadex

2.5.2 Thủy phân tách sapogenin và đường

Sapogenin thì thường dễ kết tinh hơn, việc phân tích cấu trúc phần đường cũng khó, do đó có

nhiều công trình người ta chỉ công bố phần sapogenin Ngoài ra trong quá trình phân tích cấu trúc

của sapogenin cũng cần phải tách sapogenin để xác định nó

Nếu phần aglycon (sapogenin) bền vững với các tác nhân thủy phân thì có thể dùng acid

mạnh, ví dụ HCl 5%, có trường hợp dùng đến 18% Thời gian thủy phân có khi đến 5-6 giờ ở

100oC Trường hợp mạch đường có acid glucuronic là đơn vị nối với aglycon thì rất khó thủy

phân, trong dịch thủy phân thường còn sót lại glucuronosid Người ta cũng có thể dùng H2SO4

10% trong cồn

Để thu được những kết quả thủy phân tốt, có tác giả dùng H2SO4 72%

Một số tác giả đã dùng acid perchloric để thủy phân saponin và cũng thu được kết quả khả

quan Người ta đun saponin với HClO4 70% trong methanol (1:10)

Thủy phân bằng hỗn hợp Kiliani được ứng dụng để thủy phân các glycosid trong đó có cả

saponin để xác định phần đường Hỗn hợp Kiliani gồm HCl đậm đặc -CH3COOH- nước

10:35:35

Người ta còn thủy phân trong điều kiện nhẹ nhàng để cắt bớt một vài đơn vị đường trong các

glycosid có mạch đường dài với mục đích xác định cấu trúc mạch đường Cách thủy phân như

vậy gọi là thủy phân bậc thang Muốn vậy người ta hòa tan saponin, ví dụ 40mg trong 10ml

methanol, thêm 20ml HCl 5%, quậy trong 9 giờ, các thành phần sau khi thủy phân (các saponin

có đơn vị đường ít hơn saponin ban đầu) được tách bằng sắc ký qua cột silicagel rồi đem phân

tích

Chú ý rằng trường hợp nếu aglycon (sapogenin) rất dễ bị biến đổi trong quá trình thủy phân,

cần phải chọn điều kiện nhẹ nhàng, ví dụ thủy phân bằng acid acetic 50% ở nhiệt độ 70o

C trong 6 giờ (phương pháp của Shoj Shibata) hoặc thủy phân bằng enzym Các enzym hay dùng là β-

glucosidase (emulsin từ hạnh nhân) và β-glucuronidase (enzym từ con sên Helix pomatia)

Một số nhà khoa học đã dùng phương pháp quang phân bằng ánh sáng tử ngoại Một số

sapogenin nhóm olean sau khi hòa tan trong methanol rồi tiến hành chiếu tia UV Điều kiện cần

thiết là phần đường phải nối với phần aglycon qua một đơn vị acid uronic

Để cắt mạch đường nối theo dây nối este mà người ta hay gặp trong các saponin nhóm olean

và ursan thì thực hiện thủy phân bằng kiềm Ví dụ 500mg saponin đun với 50ml KOH 5% trong

nước hoặc trong cồn nước khoảng 4-5 giờ trên nồi cách thủy Sau khi thủy phân, nếu saponin ban

đầu có 2 mạch đường thì trong dung dịch sẽ còn lại saponin thứ cấp (chỉ còn mạch theo dây nối

acetal) có thể chiết ra bằng butanol Khi thủy phân bằng kiềm thì các dây nối este khác nếu có

trong phân tử saponin cũng bị cắt

Nếu mạch đường nối theo dây nối este có nhiều đơn vị đường khi thủy phân bằng kiềm ta thu

được chủ yếu là một oligosaccharid, do đó muốn nghiên cứu thành phần của các đơn vị đường

trong mạch này thì dịch sau khi thủy phân phải trung hòa, bốc hơi rồi tinh chế qua sắc ký cột để

loại hết saponin còn sót rồi thủy phân tiếp bằng acid mới xác định được thành phần của mạch

đường này Cần chú ý rằng có trường hợp sau khi thủy phân các saponin chiết xuất từ một bộ

phận của cây, chúng ta chỉ thu được một sapogenin mà thôi vì các saponin đó đều có một aglycon

giống nhau Ví dụ khi thủy phân saponin của rễ Ngưu tất thì ta chỉ thu được acid oleanolic

Nhưng có trường hợp sau khi thủy phân thì thu được một hỗn hợp với các thủ thuật sắc ký mới

tách được các sapogenin đơn tinh khiết

Một số sơ đồ chiết xuất saponin và sapogenin:

1 Phương pháp chiết xuất saponin [18]

MeOH EtOH 50-80%

Dung môi kém phân cực Loại tạp (Nếu cần)