Nghiên cứu thu nhận Enzyme xylanase từ chủng nấm Aspergillus niger trên môi trường lá mía - cám gạo

Nghiên cứu thu nhận Enzyme xylanase từ chủng nấm Aspergillus niger trên môi trường lá mía - cám gạo

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy hướng dẫn ThS Huỳnh Quang Phước đã định hướng ý tưởng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và làm luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn thầy Minh, thầy Thái và tập thể cán bộ Phòng

thí nghiệm Hoá lý Khoa Công nghệ thực phẩm đã tận tình h ư ớ n g dẫn thí nghiệm, thường xuyên chỉ bảo kiến thức chuyên môn và tạo mọi điều kiện

về hóa chất cũng như trang thiết bị nghiên cứu để tôi hoàn thành luận văn

Và cảm ơn Ban chủ nhiệm Khoa Công nghệ Thực phẩm, Phòng Đào tạo, cùng các thầy cô giáo đã nhiệt tình giảng dạy và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khoá học

Bên cạnh đó, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và những người thân đã động viên giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập để tôi có được kết quả như ngày hôm nay

Với tấm lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quí báu đó !

TP.HCM, tháng 05 năm 2011 Sinh viên thực hiện

Võ Lê Phương Thảo

Chương 1.

MỞ ĐẦU

Nhiều vi sinh vật bao gồm vi khuẩn, nấm men và nấm sợi được báo cáo có khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase, trong đó nấm mốc có tiềm năng nhất

Xylanase được sinh ra chủ yếu bởi giống Aspergillus trong môi trường lên men

chìm và trên môi trường lên men bán rắn với các nguồn cơ chất là xylan tinh khiết,

lá mía, cám gạo, Trước đây, xylanase được sử dụng phối hợp với cellulase để chuyển hóa lignocellulose thành năng lượng các chất trao đổi Các ứng dụng khác của enzym xylanase cũng được quan tâm như: làm trong nước trái cây và rượu vang, tách chiết dầu thực vật, sản xuất oligosaccharide nhằm cải thiện giá trị dinh dưỡng của thức ăn gia súc Trong những năm gần đây, enzyme xylanase rất được quan tâm ứng dụng trong công nghiệp giấy và bột giấy, công nghệ thực phẩm, công nghệ sản xuất thức ăn chăn nuôi….từ phế thải nông nghiệp Ở nước ta, nhu cầu sử dụng các chế phẩm enzyme ngày càng nhiều, trong đó có enzyme xylanase Nhưng việc nghiên cứu sản xuất enzyme này chưa được quan tâm nhiều

Ở Việt Nam, nguồn lá mía rất dồi dào, có chứa cellulose nên được sử dụng làm nguồn carbon hoặc sử dụng kết hợp với cám gạo (là nguồn cung cấp Nitơ- các

khoáng chất và vitamin) để cảm ứng Aspergillus niger sinh tổng hợp enzyme

xylanase trong lên men bán rắn Ngoài ra, ở nước ta hầu hết lá mía sau khi thu hoạch không sử dụng cho nhu cầu nào mà đem đốt bỏ đi và đây cũng là nguồn nguyên liệu rẻ tiền và ổn định dễ dàng đáp ứng cho sản xuất enzyme xylanase ở quy mô lớn

Dựa trên những đặc tính trên nên đã hướng chúng tôi đến việc thực hiện đề

tài : ‘‘ Nghiên cứu thu nhận enzyme xylanase từ chủng nấm Aspergillus niger trên môi trường lá mía - cám gạo’’ nhằm mục đích tận dụng lá mía kết hợp với cám gạo làm môi trường nuôi cấy để thu nhận enzyme từ canh trường nuôi cấy đó

Yêu cầu của đề tài:

 Khảo sát một số thành phần hóa học có trong lá mía và cám gạo

 Khảo sát các tỷ lệ giữa lá mía và cám gạo khi tạo môi trường nuôi cấy

 Khảo sát điều kiện nuôi cấy (pH, độ ẩm và thời gian nuôi cấy)

 Thu nhận dịch chiết enzyme xylanase

Chương 2.

TỔNG QUAN

2.1 Tổng quan về nấm mốc Aspergillus niger

Giống Aspergillus có khoảng 200 loài phân bố khắp nơi trong tự nhiên, trong đó có các loài Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae,… có

giá trị sử dụng trong sản xuất enzyme, rượu, acid hữu cơ,…

Aspergillus niger là một loại nấm và là một trong những loài phổ biến nhất của các chi Aspergillus Nó gây ra mốc đen trên một số loại trái cây và rau quả như

nho, hành tây và đậu phộng; một chất gây ô nhiễm phổ biến của thực phẩm Nó có thể được tìm thấy trong đất và các môi trường trong nhà [28]

Van Tieghem là người đầu tiên phát hiện và phân lập chủng nấm mốc

Aspergillus niger từ hạt chứa nhiều dầu như: hạt đậu nành, đậu phộng, hạt ngũ cốc, bắp (ngô); Aspergillus niger cũng được phân lập từ các sản phẩm lên men cổ

truyền [2]

Hình 2.1 Nấm mốc Aspergillus niger trong môi trường PGA [29]

2.1.1 Vị trí phân loại của Aspergillus niger

Giống Aspergillus do Michelli mô tả lần đầu vào năm 1729 Năm 1901

Wehmer đã cho ra đời một chuyên luận phân loại giống nấm bất toàn này Raper và

Fennell (1965) chỉ dùng một tên Aspergillus cho tất cả các loài tạo thành bào tử trần Như vậy, Aspergillus niger có vị trí phân loại theo bảng 2.1.

Bảng 2.1 Phân loại khoa học của Aspergillus niger [30]

Khuẩn ty phân nhánh, có vách ngăn, bào tử đính không nằm trong bọc bào

tử, cuống sinh thể bình phình ra rõ rệt ở đầu tạo thành bọng lớn hình cầu 5 – 6 x 20 – 30 µm, đôi khi 6 – 10 x 60 – 70 µm, màu nâu đen

Thể bình gồm hai lớp, lớp thứ nhất hình tam giác cân ngược, lớp thứ hai hình chai; bào tử đính xòe ra, có hình cầu xù xì, có gai nhọn, có màu nâu đen đến đen than, đường kính 4 – 5µm [1], [3]

2.1.2 Đặc điểm sinh học của Aspergillus niger

Aspergillus niger sinh trưởng được ở nhiệt độ tối thiểu là 6-8oC và tối đa 45-47oC, tối ưu ở 28-35oC, trong môi trường có độ ẩm tối thiểu là 23% Độ ẩm môi

trường thích hợp để lên men bán rắn Aspergillus niger là 60-65%, nó chỉ sinh

trưởng và phát triển khi có mặt O2 ở pH tối ưu là 4-6,5 Tuy nhiên, theo Patt (1981)

cũng có những chủng Aspergillus niger sinh trưởng được ở pH 2 Sự thay đổi pH môi trường nuôi cấy từ 3 đến 6,5 làm thay đổi đáng kể hình thái của Aspergillus niger.

Trên môi trường thạch Czapek, Aspergillus niger mọc thưa, đường kính

khuẩn lạc khoảng 40 mm Bổ sung 0,5% cao nấm men vào môi trường làm khuẩn

lạc Aspergillus niger mọc tốt và to hơn, đạt đường kính trung bình khoảng 60mm.

Trên môi trường thạch malt (MEA), hệ enzym mọc tốt, nhưng không to như trên trên môi trường thạch Czapek- cao nấm men (CYA) [3]

2.1.3 Đặc điểm sinh hóa

2.1.3.1 Khả năng lên men đường

Aspergillus niger có khả năng đồng hóa tốt các loại đường đơn và đường đôi như glucose, fructose, maltose, xylose, manose, saccharose Aspergillus niger

đồng hóa được galactose, sorbose và lactose ở mức độ kém hơn

2.1.3.2 Khả năng tổng hợp enzyme

- α-amylase (1,4 glucan- glucanhydrolase): Aspergillus niger có khả năng tổng

hợp α-amylase ngoại bào để thủy phân nhanh tinh bột tạo dextrin và một ít maltose và glucose

Tinh bột α-amylase Dextrin (nhiều) + maltose (ít) + glucose (ít)

α-amylase của Aspergillus niger hoạt động tối ưu ở pH từ 4,5 – 4,7, trong

khi để đường hóa tinh bột, pH thích hợp nhất là 5 – 5,5, ở 50oC Enzym bị mất hoạt tính sau 30 phút ở pH = 2,5

Aspergillus niger có khả năng tạo glucoamylase nhiều hơn α-amylase (Lê

Văn Nhương, 1978) để thủy phân tinh bột thành dextrin và sau đó thành glucose ở pH và nhiệt độ tối thích tương ứng là 4 và 50oC Park Y.K (1970) đã

sử dụng Aspergillus niger để sản xuất sirô glucose từ khoai mì.

- Protease: Theo Lương Đức Phẩm, Aspergillus niger có khả năng tạo hai loại

protease Protease thứ nhất phân giải protein thành polypeptid, pepton, còn protease thứ hai tiếp tục chuyển hóa các sản phẩm trên thành acid amin PH

và nhiệt độ tối thích cho hoạt động của chúng tương ứng là 3 – 4 và 50oC

- Cellulase: Cellulase là một phức hợp nhiều enzym, chủ yếu là cellulase Cl,

cellulase Cx và β-glucosidase hay cellobiase Cellulase có tác dụng thủy phân cellulose thành cellobiose rồi thành glucose theo trình tự như sau:

Cellulose cellulas Cellobiose cellobiase Glucose

Cellulase của Aspergillus niger có pH và nhiệt độ hoạt động tối thích tương

ứng là 4-5 và 40oC trên cơ chất là giấy lọc hoặc CMC (carboxyl methyl cellulose)

- Pectinase: Aspergillus niger có khả năng tạo pectinase ở nhiệt độ tối thích

25oC và pH 5,6 Tuy nhiên enzym thể hiện hoạt tính trong khoảng pH 2,5-6,8

- Xylanase: Aspergillus niger có khả năng tạo xylanase ở nhiệt độ và pH tối

thích là 25oC và 5,6

Ngoài ra, Aspergillus niger còn có khả năng tổng hợp hàng loạt enzyme

khác như: lipase, mananase, α- galactosidase, carboxypeptidase, α- mannosidase, β- glucanase,… [1], [2]

2.1.3.3 Lên men rượu

Theo Menezes (1978), loài Aspergillus niger có khả năng lên men rượu

trong điều kiện kỵ khí và tác giả đã tiến hành nghiên cứu sử dụng bã khoai mì để sản xuất rượu ethanol

2.1.4 Tác hại của Aspergillus niger

Aspergillus niger được xếp vào loại an toàn thực phẩm không chứa độc tố

aflatoxin, thường được sử dụng để sản xuất các chế phẩm sinh học phục vụ các ngành thực phẩm, dược phẩm, chăn nuôi

Tuy nhiên Aspergillus niger cũng là nguyên nhân làm hư hại trái cây tươi

sau thu hoạch như táo, lê, đào, chanh, nho, dâu, xoài, lựu,…Ngoài ra, nó còn làm

hư hại trái sake, cà chua, hạt điều và gây nhiễm pho mát Aspergillus niger cũng

sống bám trên đồ gỗ, đồ da

Bệnh nấm ở cây cũng do Aspergillus niger gây ra như bệnh thối rửa chồi

cây bong vải, thối rửa thân cây dứa sợi [30]

Aspergillus niger ít có khả năng gây bệnh cho con người so với một số loài Aspergillus khác Nhưng nếu hít vào số lượng bào tử lớn, có thể sẽ gây bệnh phổi nghiêm trọng Ngoài ra, Aspergillus niger là một trong những nguyên nhân phổ

biến nhất của bệnh otomycosis (nhiễm trùng tai do nấm), có thể gây đau, tạm thời

không nghe được và trong trường hợp nghiêm trọng dẫn đến hư ống tai và màng nhĩ [28]

2.1.5 Các ứng dụng của Aspergillus niger

Từ lâu đời người ta biết sử dụng Aspergillus niger để sản xuất các chế phẩm

sinh học như acid hữu cơ, các loại enzyme, các chế phẩm giàu protein,… phục vụ phát triển công nghệ thực phẩm, dược phẩm, chăn nuôi…

Aspergillus niger được nuôi để sản xuất trong công nghiệp Nhiều chủng Aspergillus niger được sử dụng trong các chế phẩm công nghiệp của acid citric

(E330) và acid gluconic (E574) và đã được đánh giá là chấp nhận được đối với lượng hàng ngày của Tổ chức Y tế Thế giới

Nhiều enzym hữu ích được sản xuất bằng cách sử dụng lên men công

nghiệp của Aspergillus niger Ví dụ, Aspergillus niger enzym glucoamylase được

sử dụng trong sản sirô bắp cao fructose, và pectinaza được sử dụng trong rượu táo

và rượu vang α-galactosidase, một loại enzyme mà phá vỡ một số loại đường phức tạp, là một thành phần của Beano và các thuốc khác mà các nhà sản xuất khẳng định có thể làm giảm chứng đầy hơi [30]

2.2 Xylanase

2.2.1 Các đặc tính cấu trúc của xylan

Xylan là một polysaccharide hỗn tạp có chứa các nhóm phụ là các gốc acetyl, methyl-D-glucuronosyl và α-arabinofuranosyl liên kết với bộ khung được tạo bởi các gốc xylopyranose Bộ khung này được liên kết với nhau theo kiểu β-1,4- glycozit Lignin bao quanh xylan, liên kết với xylan bằng liên kết este bằng các gốc của axit 4-O-methyl-D-glucuronic

4-O-Hình 2.2 Cấu trúc của arabinoxylan của cỏ Graminiae [32]

Xylan, một trong những thành phần cơ bản của hemicellulose được tìm thấy trong thành tế bào thực vật là polysaccharide cơ bản thứ hai sau cellulose, chiếm gần một phần ba carbon hữu cơ có thể phục hồi trên trái đất Xylan là thành phần chính của hemicelulose, một phức hợp polysaccharide gồm: xylan, xylanglucan, glucomannan, galactoglucomannan và arabinogalactan Phức hợp này cùng với cellulose và lignin hình thành nên thành phần polymer của vách tế bào thực vật Xylan được tìm thấy lượng lớn trong gỗ cứng từ thực vật hạt kín (15-30%), trong gỗ mềm từ thực vật hạt trần (7- 10%) và trong cây hàng năm (30%) [15]

Hình 2.3 Sơ đồ cấu trúc vách tế bào thực vật [33]

Ba thành phần chính trong cấu trúc vách tế bào thực vật, tương tác với nhau nhờ các liên kết cộng hóa trị và không cộng hóa trị Xylan là ranh giới giữa ligin và cellulose, đây là vị trí quan trọng cho sự kết dính chất xơ và tính toàn vẹn của vách tế bào thực vật

Hemicellulose là polysaccharide trong màng tế bào tan trong dung dịch kiềm và có liên kết chặt chẽ với cellulose, là một trong ba sinh khối tự nhiên chính Cùng với cellulose và lignin, hemicellulose tạo nên thành tế bào vững chắc ở thực vật Về cấu trúc, hemicellulose có thành phần chính là D-glucose, D-galactose, D-mannose, D-xylose và L-arabinose liên kết với các thành phần khác và nằm trong liên kết glycoside Hemicellulose còn chứa cả axit 4-O-methylglucuronic, axit D-galacturonic và axit glucuronic Trong đó, đường D-xylose, L-arabinose, D-glucose và D-galactose là phổ biến ở thực vật thân cỏ và ngũ cốc Tuy nhiên, khác với hemicellulose thân gỗ, hemicellulose ở thực vật thân cỏ lại có lượng lớn các dạng liên kết và phân nhánh phụ thuộc vào các loài và từng loại mô trong cùng một loài cũng như phụ thuộc vào độ tuổi của mô đó.

Tùy theo trong thành phần của hemicellulose có chứa monosaccharide nào

mà nó sẽ có những tên tương ứng như manan, galactan, glucan và xylan Các polysaccharide như manan, galactan, glucan hay xylan đều là các chất phổ biến trong thực vật, chủ yếu ở các thành phần của màng tế bào của các cơ quan khác nhau như gỗ, rơm rạ,…

Trong các loại hemicellulose, xylan là một polymer chính của thành tế bào thực vật trong đó các gốc D-xylopyranose kết hợp với nhau qua liên kết β-1,4-D-xylopyranose, là nguồn năng lượng dồi dào thứ hai trên trái đất Đa số phân tử xylan chứa nhiều nhóm ở trục chính và chuỗi bên Các gốc thay thế chủ yếu trên khung chính của xylan là các gốc acetyl, arabinosyl và glucuronosyl Các nhóm này có đặc tính liên kết tương tác cộng hóa trị và không hóa trị với lignin, cellulose

và các polymer khác

Cấu tạo, số lượng và vị trí của xylan ở các loài thực vật khác nhau là khác nhau Xylan tồn tại ở dạng O-acetyl-4-O-methylglucuronoxylan ở cây gỗ cứng (Hình 2.4), hay arabino-4-O-methylglucuronoxylan ở cây gỗ mềm (Hình 2.5), hay thành phần cấu tạo xylan là axit D-glucuronic, có hoặc không có liên kết ete 4-O-methyl và arabinose ở các loài ngũ cốc [31]

Hình 2.4 O-acetyl-4-O-methylglucuronoxylan ở cây gỗ cứng [31]

Hình 2.5 Arabino-4-O-methylglucuronoxylan ở cây gỗ mềm [31]

2.2.2 Khái niệm và phân loại xylanase

2.2.2.1 Khái niệm về xylanase

Xylanase là một hydrolase xúc tác thủy phân của các loại đường phức tạp (chủ yếu là xylan và một số hợp chất liên quan) đến đường đơn giản (các sản phẩm chính được xylose)

 Tên hệ thống: 4-β-D-xylan xylanohydrolase;

 Tên được công nhận là: endo-β-1,4-xylanase;

 Phản ứng: thủy phân phía trong của các liên kết β-1,4-D-xylosidic trong xylan;

 Các tên khác gồm có: endo-β-1,4-xylan 4-xylanohydrolase; endo-1,4-xylanase; xylanase; β-1,4-xylanase; endo-1,4-xylanase; endo-β-1,4- xylanase; endo-1,4-β-D-xylanase; 1,4-β-xylan xylanohydrolase; β- xylanase; β-1,4-xylan xylanohydrolase; endo-1,4-β-xylanase; β-D- xylanase [34], [16]

2.2.2.2 Phân loại xylanase

Xylanase được phân loại thành hai nhóm dựa vào đặc tính lý hóa của chúng như là khối lượng phân tử và điểm đẳng điện và trên các đặc tính xúc tác khác nhau của chúng Endo-xylanase có khối lượng phân tử cao với giá trị pI thấp thuộc về glycanase họ 10 (trước đây gọi là họ F), trong khi đó các endoxylanse khối lượng phân tử thấp với giá trị pI cao được phân loại thành glycanase họ 11 (trước đây là họ G)

Biely và các cộng sự sau khi mở rộng phạm vi nghiên cứu trên sự khác biệt trong các đặc tính xúc tác giữa các họ xylanase kết luận rằng endo-xylanase của họ 10 khác với các thành viên của họ 11 là khả năng có thể tấn công các liên kết glycozit cạnh các điểm nhánh và hướng về đầu không khử Trong khi, endo- xylanase của họ 10 cần hai gốc xylopyranosyl không thay thế giữa các nhánh, endo- xylanase của họ 11 cần có ba gốc xylopyranosyl liên tiếp không thay thế Theo đó, các endo-xylanase của họ 10 có nhiều các hoạt động xúc tác, cái mà tương ứng với β-xylosidase Các endo-xylanase của họ 10 giải phóng các xylopyranosyl ở đầu tận cùng gắn với một gốc xylopyranosyl thay thế, nhưng chúng cũng thể hiện hoạt độ aryl-β-D-xylosidase

Sau khi kiểm tra một nghiên cứu phân tích tác nhân rộng rãi, Sapag và các cộng sự

đã ứng dụng một phương pháp mới mà không liên quan tới phân tích trình tự trước đó cho việc phân loại xylanase họ 11, để chia xylanase thành 6 nhóm chính Nhóm I, II và III chứa chủ yếu các enzym của nấm Các enzym nhóm I và II thường là các enzym có khối lượng

khoảng 20 kDa được sinh tổng hợp từ các họ Ascomyceta và Basidiomyceta Các enzym

nhóm I có giá trị pI bazơ trong khi đó nhóm II có giá trị pI ở phía acidt Các enzym của nhóm III chủ yếu được tạo ra bởi các nấm yếm khí Trong khi đó, các xylanase của vi khuẩn được chia thành ba nhóm là A, B và C Nhóm A là các xylanase được sinh tổng hợp

bởi họ Actinomycetaceae và Acillaceae, hoàn toàn là những vi khuẩn hiếu khí gram dương

Nhóm B và C thì chứa các enzym chủ yếu từ các vi khuẩn yếm khí gram dương, những loài thường sống trong dạ cỏ [4], [34]

2.2.3 Nguồn thu nhận xylanase

Xylanase được sinh tổng hợp chủ yếu bởi các vi sinh vật Nhiều loại vi khuẩn và nấm được công bố là có khả năng sản xuất xylanase Tuy nhiên, có nhiều nghiên cứu về xylanase có nguồn gốc từ thực vật, ví dụ, sự sinh tổng hợp endo- xylanase trong quả lê Nhật Bản trong suốt giai đoạn chín của quả Cleemput và các cộng sự đã tinh chế được một loại endo-xylanase với khối lượng phân tử là 55 kDa từ bột mì của cây lúa mì châu Âu Một

số loài động vật thân mềm dưới nước cũng có khả năng sinh tổng hợp xylanase [17], [18]

2.2.3.1 Sinh tổng hợp xylanase từ vi khuẩn

Vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp nhiều các enzym sử dụng cho các quá trình công nghiệp Trong đó, có xylanase vì đặc tính bền nhiệt của nó Một số loài sinh tổng hợp

xylanase với hoạt độ cao ở pH kiềm và nhiệt độ cao là Bacillus sp, Bacillus ssp-34 có khả

năng sinh tổng hợp xylanase với hoạt độ 506 U/ml trong môi trường tối ưu Trước đó, thì

Ratto và các cộng sự đã công bố Bacillus circulans tổng hợp lên xylanase có hoạt độ 400 U/ml Nó hoạt động tối ưu ở pH 7 và 40% hoạt độ được duy trì ở pH 9,2 Streptomyces cuspidosporus sinh tổng hợp được xylanase có hoạt độ 49 U/ml trong môi trường xylan Bacillus sp NCL 87-6-10 tổng hợp được xylanase với hoạt độ 93 U/ml trong môi trường có cảm ứng zeolit và có hiệu quả hơn khi sử dụng Tween 80 Một chủng khác là Bacillus circulans AB16 tổng hợp xylanase có hoạt độ 19,28 U/ml khi sinh trưởng trên môi trường rơm gạo Streptomyces sp qg-11-3 có khả năng sinh enzym xylanase có hoạt độ 96 U/ml

Các sinh vật khác sinh tổng hợp xylanase được đưa ra ở bảng 2.2

Bảng 2.2 Các vi sinh vật sinh tổng hợp xylanase [19]

Các enzym xylanase được sinh tổng hợp từ nấm mốc thường có pH tối ưu thấp hơn

so với các xylanase có nguồn gốc từ vi khuẩn Giá trị pH tối ưu của xylanase từ nấm mốc thủy phân xylan thì thường dao động từ pH 3 - 8 và ổn định ở pH 5 (bảng 2.3)

Giá trị pH tối ưu của xylanase vi khuẩn nhìn chung cao hơn so với pH tối ưu của xylanase từ nấm Trong công nghệ sản xuất giấy và bột giấy, để sử dụng xylanase từ nấm mốc cần phải hạ pH xuống thấp do đó mà xylanase từ nấm mốc ít được dùng hơn so với vi khuẩn Tuy nhiên trong nhiều ngành công nghiệp khác, như công nghiệp sản xuất đồ uống, công nghiệp sản xuất cồn nhiên liệu, thì đây lại là một ưu thế rất lớn của xylanase nấm mốc

vì môi trường cho enzym hoạt động là môi trường axit Gomes và các cộng sự đã công bố

thu được hoạt độ xylanase là 188,1 U/ml với pH tối ưu 4,5 từ Trichoderma viride Tương tự với Trichoderma viride, Trichoderma reesei cũng được biết đến với khả năng sinh tổng hợp xylanase cao với hoạt độ 960 U/ml Giống như Trichoderma sp, Schizophillum commune

cũng là một trong những loài tổng hợp xylanase cao với hoạt độ xylanase là 1244 U/ml Nằm trong nhóm nấm màu trắng, một loài nấm phá hủy thành tế bào thực vật có tiềm năng là

Phanerochaete chrysosporium sản xuất xylanase có hoạt độ 15-20 U/ml trong môi trường nuôi cấy Aspergillus niger có hoạt độ xylanase là 76,6 U/ml sau 5,5 ngày lên men Nấm

sinh tổng hợp xylanase có một số các hạn chế đó là khi sản xuất enzym trên môi trường lỏng

ở quy mô công nghiệp thì hoạt độ thu được thường thấp hơn thực tế Điều này là do khi tiến hành lên men trong môi trường lỏng các sợi nấm kết lại thành các pellet làm cản trở quả trình tiếp xúc với chất dinh dưỡng và đặc biệt là các ứng suất xảy ra trong thiết bị lên men làm sinh khối của nấm dễ bị phá vỡ dẫn đến việc làm giảm lượng enzym thu được [13], [17]

Bảng 2.3 Đặc tính của của một số xylanase từ vi sinh vật [19]

Vi sinh vật

KLPT (KDa)

Điều kiện tối

pI

Km (mg/

ml)

Vmax (µmol/ phút)

pH Nhiệt

độ

pH (giờ)

Nhiệt

độ

(giờ) Nấm mốc

2.2.4 Cơ chế hoạt động của xylanase

Hàng loạt các mô hình đã được đưa ra để giải thích cơ chế hoạt động của xylanase Hoạt động của xylanase dẫn đến sự thủy phân xylan Sự thủy phân nhìn chung có thể là kết quả của sự duy trì hay nghịch chuyển của trung tâm anomeric của các monomer đường khử của cacbohydrat Đề xuất này bao gồm một hoặc hai trạng thái chuyển tiếp hóa học Sự dịch chuyển glycosyl thường dẫn đến trong sự thay thế tính ái nhân ở cacbon bão hòa của trung tâm anomeric và diễn ra với sự duy trì hoặc nghịch chuyển của cấu hình anomeric Hầu hết các enzym thủy phân polysaccharide kiểu như cellulase và xylanase được biết đến với sự

thủy phân các cơ chất của chúng với sự duy trì của cấu hình anomeric của C1 Có sự liên quan của cơ chế dịch chuyển kép cho sự duy trì anomeric của sản phẩm Cơ chế dịch chuyển kép bao gồm các đặc điểm:

- Xúc tác acid với việc thêm một proton vào cơ chất

- Một nhóm carboxyl của enzym ở trạng thái hoạt động

- Một liên kết trung gian cộng hóa trị glycosyl xuất hiện giữa enzym với

cacbonhydrat này trong đó cấu hình anomeric của đường tham gia liên kết

này đối lập với đường của cơ chất

- Các tương tác không phải là cộng hóa trị được tạo ra với tỷ lệ tăng lên

(hình 2.6) [4]

Hình 2.6 Cơ chế phản ứng thủy phân của xylan bởi xylanase của Bacillus circulans [20]

(a) Cấu trúc xylan xoắn là phù hợp với dạng lõm giữa Tyr 65 và Tyr 69 Glu 172 là tác nhân xúc tác axit/bazo và Glu 78 là ái nhân (b) Glycone liên kết với Glu 78 Chất trung gian này được giữ lại trong suốt phản ứng chuyển glycosyl (c) Nước chiếm chỗ của nucleophile (d)

Sự tách và khuếch tán của glycone (xylobiose) cho phép sự di chuyển của enzym tới một vị trí mới trên cơ chất Xylanase của họ 11 biểu lộ một cơ chế endo và ngẫu nhiên hơn trong quá trình phân cắt Điều này là bởi vì aglycone được giải phóng ở bước (b) và glycone ở bước (d)

Leggio và các cộng sự đề xuất rằng cơ chế xúc tác của xylanase là:

1 Xylanase nhận biết và liên kết với xylan

2 Gốc xylosyl ở vị trí-1 bị làm biến dạng và được thả xuống hướng về phía gốc xúc tác, liên kết glycosidic bị cong và phá vỡ để tạo thành dạng liên kết cộng hóa trị enzym- cơ chất trung gian

3 Chất trung gian bị tấn công bởi một phân tử nước hoạt động, tiếp theo đó cơ chế thủy phân glycosyl cổ điển tiếp tục diễn ra và sản phẩm được giải phóng [35]

2.2.5 Ứng dụng của Xylanase

2.2.5.1 Ứng dụng trong sản xuất thức ăn gia súc

Xylanase thường được bổ sung trong thức ăn cho gia súc cùng với glucanase, pectinase, cellulose, protease, amylase, phytase, galactosidase và lipase Những enzyme này phá vỡ cấu trúc của arabinoxylan trong thành phần thức ăn làm giảm độ nhớt của nguyên liệu tươi (Twomey et al.,2003) Bổ sung xylanase vào thức ăn gia súc làm tăng khả năng hấp thu dưỡng chất của hệ tiêu hóa, giúp quá trình sử dụng thức ăn hiệu quả hơn

Sản phẩm đa enzyme gồm glucoamylase 100 UG/g, protease 100 UP/g và

xylanase 100 UX/g được sản xuất bởi chủng Aspergillus niger trên cơ chất cám mì

bằng phương pháp lên men bán rắn, được ứng dụng trong sản xuất ethanol và thức

ăn gia súc [5]

2.2.5.2 Ứng dụng trong sản xuất bánh mì, thực phẩm và ăn uống

Xylanase bổ sung vào bột bánh mì cùng với amylase, glucose oxidase,

protease Cũng giống như các hemicellulase khác, xylanse phá vỡ cấu trúc hemicellulose trong bột mì, giúp tái sắp xếp lại các cấu tử nước làm cho bột nhào mềm hơn và dễ dàng nhào trộn hơn Việc bổ sung xylanase vào bột làm bánh mì còn giúp cho bánh mì nở to hơn và xốp hơn Bổ sung xylanase trong quá trình làm bánh quy giúp bề mặt bánh nhẵn hơn và làm gia tăng vị ngon của bánh.

Ngoài ra, xylanase còn đóng vai trò khá quan trọng trong công nghiệp sản xuất nước ép trái cây Sử dụng kết hợp với cellulose, pectinase, amylase trong công nghệ nước ép trái cây giúp giá tăng hiệu suất hóa lỏng của trái cây và rau củ, tận thu được hương vị, tinh dầu, vitamin, khoáng chất, màu sắc… giảm độ nhớt, độ đục của nước ép, giúp cho việc lọc trong của nước ép dễ dàng hơn

Trong công nghiệp sản xuất bia, xylanase được sử dụng để thủy phân arabinoxlanan trong lúa mạch làm giảm độ nhớt và độ đục của bia [21]

2.2.5.3 Ứng dụng trong công nghiệp dệt

Ở Trung Quốc, người ta ủ sợi gai với xylanase để tạo ra những sợi cellulose nguyên vẹn và đồng đều Sau khi tẩy sợi bằng enzyme, người ta không cần phải thực hiện bước tẩy hóa chất tiếp theo [21]

2.2.5.4 Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất bột cellulose và giấy

Ứng dụng chính của xylanase trong công nghiệp sản xuất bột cellulose và giấy là tẩy bột cellulose và tẩy trắng Trước đây, để loại bỏ lignin và giữ lại cellulose, người ta dùng hỗn hợp chlorine- bazơ để tẩy bột giấy Ngày nay, dựa vào khả năng xylanase có hoạt tính phá vỡ cấu trúc hemicellulose kết dính lignin trong mạng cellulose, người ta có xu thể sử dụng xylanase trong tẩy bột giấy để thay thế cholorin gây ô nhiễm môi trường [21]

2.2.5.5 Ủ xilo thức ăn gia súc

Mục đích của việc ủ cỏ xanh là để bảo quản nguồn cỏ hoặc các chế phẩm nông nghiệp khác (cây bắp và cây họ đậu) duy trì được giá trị dinh dưỡng của chúng giống như lúc mới thu hoạch, giảm thất thoát sau thu hoach và cung cấp đủ nguồn thức ăn chất lượng cao cho vật nuôi sau khi kết thúc vụ mùa hoặc khi nguồn

thức ăn tự nhiên cạn kiệt do thời tiết xấu.

Ủ thức ăn gia súc là một quá trình động học bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố Trong đó, có yếu tố bổ sung phụ gia từ bên ngoài như: tác nhân kích thích lên men (vi sinh vật, các loại enzyme, cơ chất có thể lên men), chất ức chế lên men (các loại acid, các chất bảo quản khác), chất dinh dưỡng (ammonia và urea)

Hiện nay, việc sử dụng các loại enzyme trong ủ thức ăn chăn nuôi rất được quan tâm, vì giá thành có thể chấp nhận đượckhi sử dụng enzyme với liều lượng cao Các sản phẩm enzym trên thị trường dùng cho ủ cỏ thường chứa cellulase, hemicellulase, xylanasse, amylase và pectinase là enzyme thủy phân phần xơ của nguyên liệu ủ, amylase thủy phân tinh bột Mỗi loại enzyme được kết hợp với vi sinh vật khởi động (Hiyama, 1986)

Hãng Huls AG (Đức) sản xuất tế bào L plantarum làm nguồn vi sinh vật khởi động cho quá trình ủ cỏ Chế phẩm vi sinh vật khởi động được thương mại hóa chứa 2,5×1011 tế bào/g và được cấy với tỉ lệ 10-20g/tấn nguyên liệu, tương ứng với mật độ ủ 2,5×106 tế bào/g nguyên liệu thực vật

Để sản xuất silage chất lượng cao, các yêu cầu sau phải được thỏa mãn:

- Cỏ chất lượng cao (ra hoa 10%), thân bắp có độ ẩm <70%, cây ngũ cốc giai đoạn có bột xốp đến cứng Giai đoạn sinh trưởng thực vật ảnh hưởng đến số lượng protein và năng lượng để tiêu hóa

- Độ ẩm cỏ thích lợp từ 55-70%, nếu thu hoạch ở giai đoạn trưởng thành, cỏ nên được làm héo trước khi ủ Cây ngũ cốc ở giai đoạn bột xốp đến cứng không cần làm héo, độ ẩm tốt nhất là 55 đến 65% Cây bắp nên thu hoạch ở độ

ẩm 62- 70% tốt nhất giữa 65- 68% Độ ẩm trên 70% hoặc mất ẩm do rỉ nước dẫn đến sự lên men không chính xác Độ ẩm thấp dẫn đến tăng nhiệt qua mức,

vì khó đóng chặt để lọai khí

- Chặt cỏ thành các đoạn có kích thước ngắn đồng nhất: trung bình 1- 2 cm, nếu

độ ẩm thấp hơn 55% hoặc cỏ quá già thì kích thước cắt nên ngắn hơn

- Hạn chế không khí xâm nhập vào khối ủ [21], [22]

2.2.6 Phương pháp bảo quản enzyme xylanase

Enzyme có bản chất là protein nên chúng thường bị biến tính khi ở điều kiện nhiệt độ, pH, nồng độ dung dịch đệm không thích hợp Điều kiện bảo quản tối

ưu mỗi loại protein là khác nhau Tuy nhiên, có một vài nguyên tắc chung để bảo quản protein được tóm tắt và so sánh ở bảng 2.4

Bảng 2.4 Các điều kiện bảo quản enzyme

ở -20oC

Lạnh đông ở -20oC đến -80oC trong nitrogen lỏng (to= -196oC)

Đông khô (thường là lạnh đông)

Một lần, không thể đông khô nhiều lần.Nhìn chung, các protein được bảo quản tốt nhất ở 4oC nhưng chỉ giữ được hoạt tính trong vài ngày hoặc vài tuần Việc bảo quản ở nhiệt độ phòng sẽ làm

giảm hay mất hoạt tính, thường là do bị nhiễm vi khuẩn.

Phương pháp đông khô cho phép kéo dài thời gian bảo quản mà gần như không bị biến tính, nhưng protein có thể bị hư hỏng một phần trong quá trình đông khô Để giảm khả năng bất hoạt và mất hoạt tính nêu trên, đặc biệt là khi đông khô dịch có nồng độ protein loãng (1 mg/ml) Người ta thường bổ sung thêm protein chất mang như huyết thanh bò tinh khiết (BSA) nồng độ từ 1- 5mg/ml (0,1-0,5%), vào dung dịch protein loãng [23]

Bên cạnh đó, nhiều chất phụ gia sau cũng thường được bổ sung vào dịch protein để kéo dài hoạt tính khi bảo quản:

- Glycerol hay ethylene glycol với nồng độ không đổi 25- 50% giúp ổn định protein, ngăn chặn sự tinh thể hóa làm phá hủy cấu trúc protein ở -20oC

- Chất ức chế protease ngăn chặn sự phân hủy protein

- Tác nhân chống vi khuẩn như sodium azide (NaN3) ở nồng độ 0,02- 0,05% (w/v) hay thimerosal

- Cấu tạo phức càng cua như EDTA ở nồng độ 1- 5 mM, tránh gây ra sự oxi hóa nhóm –SH và giúp protein duy trì trạng thái khử

- Tác nhân khử như dithiothreitol (DTT) và 2-mercaptoethanol (2-ME) ở nồng

độ 1-5mM giúp ngăn chặn trạng thái oxi hoa nhóm cysteine, duy trì trạng thái khử của protein

Hãng Kerry Bio-Science, Kerry Food Ingredient (Cork)-Ireland, sản xuất sản phẩm Biogalatosidase có thành phần như sau:

Tỷ trọng 1,11- 1,15

Hãng Pierce Biotechnology, Inc (2005), sản xuất sản phẩm Natugrain® Wheat + dạng lỏng và rắn chứa endo-xylanase (E.C.3.2.1.8) sản xuất từ chủng

Aspergillus niger tái tổ hợp có thành phần như sau:

- Natugrain® Wheat + dạng lỏng chứa enzyme (1- 4%), sorbitol (14%), glycerol (25%), sodium benzoate (1,3- 1,7 g/kg) và nước thành 100%;

- Natugrain® Wheat + dạng rắn: enzyme (1- 4%), protein từ nước sữa (5%), tinh bột (79- 93%), polyvinylalcohol (0,2), polyethylene glycol (4%), magnesium sulphate (1%) và độ ẩm (6- 7%) Được cơ quan an toàn thực phẩm Châu Âu (EFSA) đánh giá là an toàn cho gà và môi trường [24], [25]

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu

3.1.1 Lá mía, cám gạo

Lá mía được sử dụng từ giống mía K84/200 được cung cấp từ trại mía cung cấp mía cho Nhà máy đường Bourbon ở Tây Ninh Trạng thái nguyên liệu khi lấy

về ở dạng lá mía khô và xay nhỏ Có thể bảo quản nơi khô ráo

Cám gạo được mua từ chợ, tránh mốc, mọt Bảo quản ở nơi khô ráo

3.1.2 Nấm mốc

Chủng nấm mốc Aspergillus niger có nguồn gốc từ phòng thí nghiệm Vi

sinh - Viện nghiên cứu công nghệ sinh học và môi trường, Trường đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh; được nuôi cấy trong ống nghiệm thạch nghiêng chứa môi trường PGA ở 30oC trong thời gian 5-7 ngày, khi bào tử được hình thành đem bảo quản ở nhiệt độ 4oC

quả cao nhất để tiệt trùng môi trường và các dụng cụ khác.

- Tủ sấy: hiệu Memmert, được sử dụng để sấy khô, khử trùng các dụng cụ thí nghiệm chịu được sức nóng khô (chủ yếu là dụng cụ thủy tinh) sau khi rửa sạch

- Bể điều nhiệt: hiệu HH Sy11 – NI4, dùng để ổn định về nhiệt độ

- Bút đo pH: hiệu Trans, được sử dụng để xác định nhanh độ pH của dung dịch hay môi trường nuôi cấy vi sinh vật

- Máy đo quang: hiệu Uviline 9400, dùng để đo độ hấp thụ

- Máy lắc: hiệu GFL, dùng để tăng sinh khối vi sinh vật

- Bếp điện: hiệu Midea, dùng để đun nóng và chuẩn bị môi trường nuôi cấy

vi sinh vật

- Bộ chưng cất đạm Kjeldahl

- Máy sấy ẩm : hiệu Axis, dùng để đo độ ẩm

3.1.4 Môi trường nuôi cấy nấm mốc

 Môi trường giữ giống PGA: khoai tây 200g, glucose 20g, agar 20g, nước cất 1000ml Chia môi trường vào các ống nghiệm để làm thạch nghiêng, khử trùng ở 1atm/20 phút

 Môi trường định lượng khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase

+ Lá mía và cám gạo được trộn theo tỉ lệ khác nhau

+ Cách pha môi trường: Cho lá mía và cám gạo vào trong bình erlen, thêm dung dịch đệm đã được chọn vào để đạt độ ẩm môi trường là 50-60% Hấp khử trùng ở 121oC trong 30 phút

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Quy trình thu nhận enzym xylanase

Hình 3.1 Quy trình thu nhận enzym xylanase

3.2.2 Mục đích và nội dung nghiên cứu

- Mục đích nghiên cứu : thu nhận enzyme xylanase từ chủng nấm mốc Aspergillus

niger trên môi trường cám - lá mía.

- Nội dung nghiên cứu: Khảo sát khả năng sinh tổng hợp hệ enzyme xylanase trên môi trường lá mía - cám gạo, đồng thời khảo sát một số điều kiện nuôi cấy tối ưu nhằm thu nhận dịch chiết enzyme xylanase có họat độ cao nhất Sơ đồ nghiên cứu

Lá mía

Điều chỉnh ẩm

dd đệm

được trình bày trong hình 3.2.

Hình 3.2 Sơ đồ nghiên cứu

3.2.3 Khảo sát một số chỉ tiêu hóa lý của nguyên liệu

3.2.3.1 Xác định hàm lượng N tổng số

Hàm lượng Nitơ được xác định theo phương pháp Micro- Kjeldahl

Nguyên tắc: Dưới tác dụng của H2SO4 đậm đặc ở nhiệt độ cao, các hợp chất chứa hữu cơ bị phân huỷ và bị oxy hoá đến CO2 và H2O còn nitơ chuyển thành NH3 và tiếp tục kết hợp với H2SO4 tạo thành muối amoni sufat

Lượng đạm tổng X(%) tính theo công thức:

Trong đó:

0,0014.( V NaOH 0,1Ntr – V NaOH 0,1Nth ) f.Vm.100

v m.mX(%) =

Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình nuôi cấyẢnh hưởng của độ ẩm đến quá trình nuôi cấy

Ảnh hưởng của pH đến quá trình nuôi cấy

Khảo sát các điều kiện

f : hệ số hiệu chỉnh nồng độ NaOH

VNaOH 0,1Ntr (trắng) : thể tích NaOH 0,1N để chuẩn bị mẫu trắng (ml)

VNaOH 0,1Nth (thật) : thể tích NaOH 0,1N để chuẩn bị mẫu thật (ml)

vm : thể tích mẫu đưa vào cất (10ml)

Độ ẩm được tính bằng công thức :

Trong đó :

W : Độ ẩm của mẫu (%)

a : Trọng lượng mẫu trước khi sấy (g)

b : Trọng lượng mẫu sau khi sấy (g)

3.2.3.3 Xác định hàm lượng cellulose

Nguyên tắc: Cellulose là hợp chất bền không tan trong môi trường acid và kiềm yếu Người ta xác định hàm lượng này bằng trọng lượng còn lại sau khi hoà tan mẫu bằng acid và kiềm

Hàm lượng cellulose (X) tính bằng %:

3.2.3.4 Xác định hàm lượng C tổng số

Nguyên tắc: Oxy hoá chất hữu cơ trong mẫu bằng dung dịch K2Cr2O7 0,4N pha trong acid sunfuric 18N, thời gian đun 5 phút kể từ khi bắt đầu sôi Lượng kali bicromat dư được xác định theo phép chuẩn độ ngược bằng dung dịch muối Mo FeSO4 (NH4)2SO4.6H2O

Hàm lượng Carbon (C) được tính theo công thức :

X( %) =

(Trọng lượng sau khi sấy – Trọng lượng giấy).100

Trọng lượng mẫuW(%) = (a- b) 100

a

,72403.100.K.1b).V.N.0,0

(a

C= −

Với :

V : thể tích dung dịch K2Cr2O7 dùng để oxy hoá (ml)

A : thể tích dung dịch muối Mo chuẩn độ trắng (ml)

b : thể tích dung dịch muối Mo chuẩn độ lượng dư (ml)

N : nồng độ đương lượng dung dịch K2Cr2O7

G : khối lượng mẫu cần để xác định (g)

0,003 : mili đương lượng gam carbon (g)

3.3.1 Khảo sát nguyên liệu

 Khảo sát độ ẩm của lá mía và cám gạo

Đo độ ẩm của lá mía và cám gạo bằng máy sấy ẩm hiệu //Axis

 Khảo sát hàm lượng nitơ tổng của lá mía và cám gạo

Xác định đạm tổng bằng phương pháp Kjeidahl

 Khảo sát hàm lượng cacbon trong nguyên liệu lá mía và cám gạo

Theo tiêu chuẩn VN 405085

 Khảo sát hàm lượng cellulose trong lá mía và cám gạo

Theo Aoac 973.18c1990

3.3.2 Khảo sát hoạt độ của enzym xylanase

Để nhằm mục đích tạo điều kiện nuôi cấy tốt chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ môi trường lá mía - cám gạo, pH, độ ẩm và thời gian Từ số liệu khảo sát được ta sẽ lựa chọn hoạt độ enzyme cao nhất và từ đó sẽ chọn ra được ở điều kiện môi trường nào thì nuôi cấy tốt nhất cho sự phát triển của nấm

mốc Aspergillus niger.

3.3.2.1 Ảnh hưởng của tỉ lệ môi trường lá mía (LM) và cám gạo (CG)

- Thông số khảo sát – LM:CG: 1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5

- Thông số cố định: độ ẩm 60%; thời gian nuôi cấy 72 giờ; dung dịch đệm pH 5,3

- Hàm mục tiêu: hoạt độ enzyme