bước đầu thiết lập quy trình sản xuất nước chấm bằng protease

Về cơ sở sinh hóa tất cả các loại nước chấm đều là sản phNm thủy phân nguyên liệu giàu protit từ động vật hay thực vật, dưới tác dụng của các chất như: acid hay bazơ mạnh hoặc enzym.. Nư

MỤC LỤC

Trang Lời cảm ơn

1.2.1 Quá trình thủy phân trong thực phẩm 11 1.2.2 Cơ sở khoa học của phương pháp sản xuất nước chấm 13 1.2.3 Một số phương pháp sản xuất nước chấm 13

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

SVTH: Nguyễn Hoàng Nhật Quang

2.2.1 Xác định hoạt tính protease theo phương pháp Anson 18 2.2.2 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry 20 2.2.3 Định hàm lượng đạm tổng số theo Kjeldahl 21 2.2.4 Xác định đạm formol theo phương pháp Sorensen 24

2.2.7 Phương pháp xác định hàm lượng đường khử 29

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

3.1 Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến hoạt tính của Alcalase 31 3.1.1 Đường chẩn để xác định hàm lượng Tyrosin 31 3.1.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ 32

3.2 Chỉ tiêu hóa học của nguyên liệu đậu nành 33

3.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân đậu nành 38 3.3.1 Khảo sát sự ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân 38 3.3.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ enzyme

3.3.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của thể tích nước

3.4 Chỉ tiêu hóa học của đậu nành sau thủy phân 42

3.4.4 Xác định hàm lượng protein của đậu nành

3.5 Chỉ tiêu hóa học của dung dịch sau thủy phân 44

3.6.1 Hiệu suất thủy phân của protein trong đậu nành 47

3.7 Chỉ tiêu hóa học của nước chấm thành phẩm 48

SVTH: Nguyễn Hoàng Nhật Quang

3.8 Chỉ tiêu vi sinh của nước chấm thành phẩm 49 3.9 Một số chỉ tiêu hóa học của nước chấm ngoài thị trường 50

Chương 4: KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ

4.1.1 Khảo sát hoạt tính của enzym protease 52

4.1.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình

4.1.4 Chỉ tiêu hóa học của đậu nành sau thủy phân 53 4.1.5 Chỉ tiêu hóa học của dung dịch sau thủy phân 53 4.1.6 Chỉ tiêu hóa học của nước chấm thành phẩm 54 4.1.7 Chỉ tiêu vi sinh của nước chấm thành phẩm 54 4.1.8 Bước đầu thiết lập quy trình sản xuất nước chấm bằng protease 55

Chương 1: TỔNG QUAN

1.1 GIỚI THIỆU CHUNG

1.1.1 Tổng quan về sản phm nước chấm

Nước chấm vừa là thực phNm giàu chất dinh dưỡng vì có chứa các acid amin, vừa

có tính chất gia vị giúp ta ăn ngon miệng rất cần trong chế biến thực phNm, cũng như chế biến thức ăn ở gia đình Về cơ sở sinh hóa tất cả các loại nước chấm đều là sản phNm thủy phân nguyên liệu giàu protit từ động vật hay thực vật, dưới tác dụng của các chất như: acid hay bazơ mạnh hoặc enzym Do vậy thành phần chính của nước chấm là acid amin, muối ăn, nước và một ít peptit Đây là sản phNm cung cấp chất đạm cho cơ thể [11]

1.1.1.1.

Khi đánh giá chất lượng nước chấm về phương diện hóa học, trước hết người ta chú ý đến lượng đạm toàn phần vì đây chính là chất dinh dưỡng có giá trị nhất của nước chấm, tiếp theo cần xem xét lượng đạm amin Từ hàm lượng đạm của hai loại đạm này suy ra tỷ lệ đạm amin đối với đạm toàn phần cho biết mức độ thủy phân protein trong nước chấm, tỷ lệ này càng cao càng tốt Trung bình tỉ lệ này trong nước chấm lên men khoảng 50 - 60% Hàm lượng đạm amin cao làm giá trị mùi vị nước chấm được nâng lên.[8]

1.1.1.2. Thành phần hóa học của nước chấm

Chất lượng nước chấm thay đổi tùy theo nguyên liệu, tỷ lệ phối chế, phương pháp chế biến… Trong nước chấm lên men còn chứa khá nhiều đường do tác dụng của men amylase của mốc lên tinh bột Nước chấm còn chứa một lượng chất béo, một số vitamin, muối ăn và các nguyên tố vi lượng khác Vì vậy, các loại nước chấm nếu được sản xuất theo đúng quy trình kỹ thuật và được bảo quản tốt sẽ có màu sắc đẹp, hương vị thơm và

Bảng 1.1: Chỉ tiêu hóa lý của nước chấm hiện nay của Việt Nam [11]

di, tri, tetra - peptid làm cho nước chấm có vị ngọt của đạm và mùi thơm của thịt

Nước chấm sản xuất theo phương pháp lên men hầu như giữ được tất cả các acid amin có trong đậu nành, còn nước chấm sản xuất theo phương pháp hóa giải thì có tỷ lệ đạm amin trên đạm toàn phần cao hơn nước chấm lên men nên mùi vị ngon hơn Tuy

nhiên, trong nước chấm hóa giải một số acid amin bị phân hủy, trước hết là tryptophan sau đó đến lysin, cystein, arginin Nếu phân hủy bằng acid quá độ thì một số acid amin bị phân hủy thành các chất có mùi hôi như phenol, NH3, H2S…[8]

1.1.1.4. Đường

Trong nước chấm có các loại đường glucoza, fructoza, maltoza, pentoza, dextrin Đường có vai trò quan trọng trong việc hình thành màu sắc nước chấm [8]

1.1.1.5. Acid hữu cơ

Các acid hữu cơ có trong nước chấm quan hệ mật thiết với nhau tạo hương vị đặc trưng của nước chấm Trong đó, acid lactic chiếm hàm lượng nhiều nhất (chiếm khoảng 1,6%) Acid lactic tác dụng với nước tương tạo hợp chất lactat như lactat phenol Ngoài ra còn có acid acetic 0,2%, acid sucinic 0,087 – 0,16%, acid formic 0,05% Muối của các acid này tham gia tạo vị cho nước chấm [8]

1.1.1.6. Chất màu

Màu của nước chấm chủ yếu do đường kết hợp với acid amin tạo nên Màu của nước chấm lên men được hình thành dần dần từ màu vàng đến màu nâu nhạt, cuối cùng là nâu đậm

Sự hình thành màu của nước chấm phụ thuộc vào nồng độ đường, acid amin và nhiệt độ Nếu tăng cường phản ứng giữa acid amin với đường thì không có lợi vì tạo ra melanoid Melanoid là chất mà cơ thể khó hấp thu và khi nồng độ của nó cao sẽ làm giảm hương vị của sản phNm Mặt khác, quá trình hình thành sản phNm màu này gây tổn thất lớn acid amin Để hạn chế quá trình này, ta chọn nguyên liệu có hàm lượng đường thấp, tránh nâng cao nhiệt độ và kéo dài thời gian thủy phân [8]

1.1.1.7. Thành phần hương thơm

Mùi của nước chấm là do tổng hợp của rất nhiều chất khác nhau tạo thành Mùi của nước chấm có thể phân ra acid hữu cơ, rượu, aldehyde, thành phần hương thơm có

butaldehyde, valeraldehyde, allyl mecaptan, methyel mecaptan, isobutan aldehyde, dimelthyl capmetan, etyloleat , rượu ethylic, acid acetic, acid petanoic, acid propionic, acid benzoic, benzaldehyde… có hương thơm ngũ cốc rang [8]

1.1.2 Nguyên liệu sản xuất nước chấm

Nguyên liệu dùng trong sản xuất nước tương thường rất giàu đạm

- Nguyên liệu có nguồn gốc từ thực vật: đậu nành, bã đậu nành, đậu phộng, bã đậu phộng…

- Nguyên liệu có nguồn gốc động vật: xương bò, xương heo, lông, móng

1.1.2.1 Nguyên liệu chính

Đậu nành

Đậu nành là một loại hạt giàu chất dinh dưỡng như protein, lipid, glucid, muối khoáng và vitamin Trong công nghiệp thực phNm, đậu nành được xem là một nguyên liệu quan trọng để sản xuất dầu thực vật và để sản xuất các sản phNm lên men

Đậu nành có tên khoa học là Glycine max merrill hay còn gọi là đậu tương là loại hạt giàu protein và lipid Phần lớn hạt đậu nành được dùng cho sản xuất dầu thực vật và các sản phNm giàu protein Protein của đậu nành có hoạt tính sinh học cao và có thể hỗ trợ khi thiếu protein của động vật [2]

Đậu nành là loại cây thân cỏ một năm, hoa tập trung trên những nách lá, kiểu bào nang Mỗi quả có 2 - 3 hạt hình oval, có vỏ bao bọc, vỏ chiếm khoảng 5 - 10% khối lượng hạt Khối lượng 1000 hạt khô là 140 - 200g Đậu nành có nhiều màu sắc khác nhau Trong

đó, màu vàng là loại tốt nhất, nên được trồng và sử dụng nhiều [2]

a Cây b Trái c Hạt

Hình 1.1: Cây, trái và hạt đậu nành

Thành phần hóa học và dinh dưỡng của hạt đậu nành

Bảng 1.2: Thành phần hóa học và cấu tạo trong hạt đậu nành [7]

Thành phần Tỷ lệ Protein (%) Lipid (%) Carbohydrate (%) Tro (%)

 Protein đậu nành: Protein đậu nành được tạo bởi các acid amin, trong đó có

đủ các loại acid amin không thay thế (ngoại trừ hàm lượng methionin thấp) Có thể nói protein đậu nành gần giống protein của trứng và được xem như một trong những nguyên

liệu chế biến các sản phNm thay thế protein động vật Hàm lượng protein tổng dao động trong hạt đậu nành: 29,6 – 50,5%, trung bình là 36 – 40%

• Các nhóm protein đơn giản (% so với tổng số protein):

o Albumin: 6 - 8%

o Globulin: 25 - 34%

o Glutelin: 13 - 14%

o Prolamin: chiếm lượng nhỏ không đáng kể

Bảng 1.3: Thành phần các acid amin trong protein của đậu nành [7]

Acid amin Hàm lượng (%) Acid amin Hàm lượng (%)

Phenylalanin Threonin Tryptophan Valin Histidin

5,0 4,3 1,3 5,4 2,6

 Chất béo đậu nành: Chất béo chiếm khoảng 20% trọng lượng khô của hạt

đậu nành, nằm chủ yếu trong phần tử điệp của hạt Chất béo chứa hai thành phần chủ yếu

là triglycerid (chiếm 96% lượng chất béo thô) và lecithine (chiếm 2% chất béo thô) Ngoài ra, còn có khoảng 0,5% acid béo tự do và một lượng nhỏ carotenoid

 Carbohydrates: Chiếm khoảng 34% trọng lượng hạt đậu nành, gồm hai

nhóm: đường tan (lớn hơn 10%) và đường không tan (20%)

Rafinose Saccharose Các loại đường khác

1,1 5,0 5,1

 Khoáng: chiếm tỷ lệ thấp (khoảng 5% trọng lượng hạt khô)

Bảng 1.5: Thành phần khoáng trong đậu nành [7]

Khoáng Hàm lượng Khoáng Hàm lượng Canxi

Photpho Mangan

0,16 – 0,47%

0,41 – 0,82%

0,22 – 0,24%

Kẽm Sắt

37 ppm

90 – 150 o/oo

 Vitamin: các vitamin chứa rất ít trong đậu nành và hầu như bị biến tính trong khi chế biến

Bảng1.6: Một số vitamin trong hạt đậu nành [7]

Vitamin Hàm lượng (ppm) Vitamin Hàm lượng (ppm) Thiamin

Inoxton Acid folic Vitamin A Vitamin E Vitamin K

1,9

2300 0,18 – 2,43 1,4 1,9

 Các enzyme: trong đậu nành chủ yếu là Urease, Lipoxygenase Amilase

Ngoài ra còn có một số thành phần gây mùi do sự oxy hóa chất béo Đặc biệt là acid béo

không no dưới tác dụng của Lipoxygenase

Nước giữ vai trò quan trọng trong việc hình thành vị của sản phNm Vì thế, nước đưa vào sản xuất nước chấm luôn được kiểm tra chất lượng, thành phần hoá học của nước phải ổn định và không bị ô nhiễm

Muối (NaCl)

Muối cũng là một nguyên liệu cho sản xuất nước chấm Ngoài việc đảm bảo độ mặn cho nước chấm muối còn có tác dụng hạn chế hoạt động của vi sinh vật gây chua và gây mốc giúp cho nước chấm có thể bảo quản lâu

Muối dùng trong sản xuất là muối hạt Thành phần chủ yếu của muối hạt là NaCl, nước, chất tan và chất không tan

Chất phụ gia

Caramen

Nước chấm sau khi lọc đã có màu nâu nhạt Muốn cho sản phNm có màu đẹp, hấp dẫn người ta dùng caramen Caramen là sản phNm thu được từ saccharose khi đun tới 180 – 1900C, là chất lỏng màu tối, hơi đắng, gọi là keo đắng

Chất điều vị (621 - natri glutamate)

Natri glutamate hay bột ngọt là sản phNm được dùng làm chất tạo vị trong sản xuất nước chấm Natri glutamate là muối của acid glutamic, nó là một trong các acid amin cần thiết cho cơ thể con người Ngoài ra nó còn có trong cơ thể động vật và một số loài thực vật Nó có vị đặc trưng của rau và thịt

Công thức cấu tạo: HOOC – CH2 – CH2 – CH (NH2) – COONa

Là tinh thể màu trắng có vị ngọt, hơi mặn, tan nhiều trong nước, được sản xuất chủ yếu từ khoai mì Việc sử dụng natri glutamate làm tăng thêm giá trị dinh dưỡng cho sản phNm Tuỳ theo độ đạm mà cho hàm lượng bột ngọt khác nhau

Đường

Đường cho vào nước chấm nhằm tăng độ ngọt cho sản phNm, vì khi sản phNm hoàn tất có độ mặn nên ta cho thêm một ít đường để điều hoà vị của nước chấm Đường cho vào sản phNm phải tinh khiết Đường lẫn nhiều cặn bNn sẽ làm cho nước chấm bị chua và mốc

1.1.3 Khái quát về protease

Hiện nay, việc sản xuất chế phNm enzyme các loại đã và đang phát triển mạnh mẽ trên quy mô công nghiệp, đã có nhiều chế phNm enzyme bán trên thị trường thế giới Các chế phNm này đã được sản xuất và tinh chế có mức độ tinh khiết theo tiêu chuNn công

nghiệp và ứng dụng Các chế phNm enzyme phổ biến như: amylase, protease, catalase, cellulase, lipase…

Chế phNm enzyme không chỉ được ứng dụng trong Y học mà còn được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau, trong công nghiệp, hóa học, thực phNm…

Việc sử dụng enzyme trong công nghiệp thực phNm ngày càng được ứng dụng rộng rãi Với protease được dùng trong công nghệ chế thịt, công nghệ chế biến cá… Với amylase đã được dùng trong sản xuất bánh mì, rượu, bánh kẹo, sản xuất bia, sản xuất mật, sản xuất các sản phNm rau…

Phân loại protease: [10]

 Dựa vào sự phân bố có thể chia protease thành hai nhóm:

• Protease nội bào

• Protease ngoại bào

 Dựa vào tính đặc hiệu với cơ chất, có thể chia ra:

• Endopeptidase: là enzyme thủy phân các liên kết pepsin ở giữa mạch;

• Exopeptidase: là enzyme thủy phân các liên kết peptide ở đầu mạch

 Dựa vào pH hoạt động có thể chia ra:

• Protease acid

• Protease kiềm

• Protease trung tính

 Dựa vào các nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzyme có thể chia ra:

• Protease serin (OH): trypsin, substilopeptidase;

• Protease tiol (SH): papain, bromelin,…;

• Protease aspartic (COOH): pepsin, renin,…;

• Protease kim loại: cacboxylpeptidase A

 Dựa vào nguồn thu enzyme có thể chia ra:

• Protease động vật

• Protease thực vật

• Protease vi sinh vật

1.2 KỸ THUẬT SẢN XUẤT NƯỚC CHẤM

1.2.1 Quá trình thủy phân trong thực phm

Phản ứng thủy phân là phản ứng phân giải các chất có sự tham gia của nước Đây

là phản ứng phổ biến và quan trọng trong công nghiệp thực phNm Người ta đã ứng dụng phản ứng thủy phân để sản xuất ra hàng loạt sản phNm mới có tính chất khác xa với tính chất của nguyên liệu ban đầu Ví dụ như sản xuất nước mắm, tương, chao, nước chấm lên men… từ protid của động vật và thực vật Sau phản ứng thủy phân tính chất cảm quan, dinh dưỡng của thực phNm có thể tăng lên Trong đa số trường hợp phản ứng thủy phân

có lợi, tuy nhiên cũng có trường hợp phản ứng thủy phân cũng gây sự hư hỏng thực phNm khi bảo quản như trong bảo quản thị, cá, trứng, dầu, mỡ…[11]

Phản ứng thủy phân thường là phản ứng mở đầu cho hàng loạt các phản ứng tiếp diễn Ví dụ: protid sau khi thủy phân thành acid amin, acid amin sẽ bị phân giải sâu xa hơn như dezamin hóa, decarboxyl hóa… Cuối cùng tạo ra những sản phNm có hại về mặt cảm quan và dinh dưỡng cho thực phNm Polysaccharid sau khi thủy phân tạo monosaccharid (monose), các monose tiếp tục bi oxy hóa sâu xa hơn tạo một loạt sản phNm trung gian và sản phNm cuối cùng là CO2 và H2O Lipid bị thủy phân tạo acid béo

và glicerin, acid béo tiếp tục bi oxy hóa tạo sản phNm có mùi vị khó chịu (sự ôi của chất béo)…[11]

Trong những trường hợp có hại trên, ta phải tạo điều kiện hạn chế phản ứng thủy phân như bảo quản lạnh, sấy khô, vô hoạt enzyme thủy phân…

Còn trong trường hợp phản ứng thủy phân có lợi, ta phải tạo điều kiện kỹ thuật để tốc độ phản ứng xảy ra tối đa và tìm cách ứng dụng chúng trong mọi lĩnh vực tạo ra các sản phNm tốt, có ích lợi trong cuộc sống Ngày nay, phản ứng thủy phân ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực sản xuất - đặc biệt là công nghiệp thực phNm Trong công nhiệp thực phNm, thông thường tác nhân thủy phân có thể là acid, kiềm hay enzyme, trong đó được sử dụng rộng rãi và hiệu quả là enzyme thủy phân từ vi sinh vật.[11]

Nhóm enzyme thủy phân gọi tên chung là hydrolase - có thể được tách ra từ thực vật, động vật, vi sinh vật

Phương trình tổng quát phản ứng thủy phân: R1R2 + H2O R1OH + R2H

Hydrolase được chia thành bốn nhóm tùy theo bản chất cơ chất nó tác Esterase, glucosidase, peptidase

dụng-Ứng với bốn phương trình phản ứng sau [11]

1) R1-COO-R2 + H2O R1-COOH + R2-OH

Các ester

2) R-O-R3 + H2O ROH + R3OH

Glucid, peptid

R = glucid

R3 = glucid hoặc phi-glucid

3) R4 -CO-NH-R5 + H2O R4COOH + R5NH2

1.2.2 Cơ sở khoa học của phương pháp sản xuất nước chấm

Ngành công nghiệp chế biến thực phNm nước ta ngày càng phát triển mạnh nhờ vào các tiến bộ khoa học kỹ thuật và sự phát triển kinh tế Để tối ưu hóa công nghệ chế biến thực phNm nói chung và sản xuất nước chấm nói riêng, chúng ta sử dụng các chế phNm enzyme như là một trong những biện pháp hữu hiệu Ứng dụng enzym và các chế phNm enzyme vào công nghệ sản xuất nước chấm là một trong những công nghệ mới Cơ

sở khoa học của nó là sử dụng các chế phNm enzyme (alcalase, novozym, flavourzym…) thủy phân protid trong nguyên liệu thành nước chấm [11]

Đối với phương pháp hóa giải, cơ sở của phương pháp này là thủy phân protid thực vật hay động vật thành các acid amin dưới tác nhân xúc tác là acid mạnh (HCl, H2SO4) hay kiềm mạnh (NaOH) Sau thủy phân trung hòa dung dịch bằng kiềm (hay acid) tùy thuộc vào tác nhân xúc tác là acid hay kiềm đưa pH về 6,7 – 7 Bổ sung NaCl đạt 23 – 25% [11]

Đối với phương pháp lên men, cơ sở của phương pháp này là thủy phân protid nhờ xúc tác là enzyme vi sinh vật Enzyme này có thể tạo ra bằng cách nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường riêng rồi đưa vào nguyên liệu giàu đạm – như trong sản xuất nước chấm lên men (nước tương) hoặc tận dụng enzyme vi sinh vật có sẵn trong nguyên liệu ban đầu như trong sản xuất nước mắm Dưới tác dụng của enzyme vi sinh vật, thành phần nước chấm thu được chủ yếu là acid amin, pepton, peptid trọng lượng phân tử nhỏ, dễ đồng hóa, dễ hấp thu cho người, lượng NaCl cho vào đạt 20 – 25% [11]

1.2.3 Một số phương pháp sản xuất nước chấm

1.2.3.1 Phương pháp hóa giải [4]

Nguyên liệu

1.2.3.2 Phương pháp lên men [4]

Nguyên liệu Nghiền

Hấp Đánh tơi, làm nguội Trộn mốc giống Lên mốc

Thủy phân Lọc Pha đấu Thanh trùng Nước chấm

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Alcalase là một chế phNm enzyme được sản xuất từ chủng Bacillus licheniformis, ở

dạng lỏng, có màu nâu và tan rất tốt trong nước

Ưu điểm của Alcalase trong quá trình thủy phân protein thực vật:

 Sau khi thủy phân vị của sản phNm tinh khiết và dịu

 Không tạo các phản ứng có hại: khác với quy trình dùng acid, phương pháp thủy phân dùng enzyme không tạo ra chất 3 - MCPD

Các thông số hoạt động của Alcalase:

 Nhiệt độ 550C – 700C

 pH là 6,5 – 8,5

Xử lý sơ bộ:

Xử lý nhiệt protein trước khi thủy phân sẽ làm biến tính protein, giúp enzyme dễ dàng thủy phân hơn và cũng sẽ giúp hạn chế sự nhiễm khuNn trong giai đoạn thủy phân Cần xay hay nghiền nhỏ trước khi qua giai đoạn thủy phân

Hình 2.1: Protein bị thủy phân

Lắc mạnh, sau 10 phút đo OD ở bước sóng 660nm

Ống số 1 là ống thử không (TK), các ống còn lại là ống thí nghiệm (TT) Vẽ đường chuNn Tyrosine tương quan giữa lượng Tyrosine (γM) và ∆OD (∆OD = ODTT – ODTK)

o Xác định lượng Tyrosine trong dung dịch nghiên cứu

Để yên 10 phút, lọc lấy dịch bên dưới

Lấy 6 ống nghiệm mới, sạch, chia thành hai lô, mỗi lô ba ống để lấy trung bình đánh dấu A và B Cho vào ống A 5ml dịch lọc từ ống nghiệm 1 và cho vào ống B 5ml dịch lọc từ ống nghiệm 2

Thêm vào mỗi ống 5 ml NaOH 0,5N và 0,6ml thuốc thử Folin, lắc mạnh, sau 10 phút, đo OD ở bước sóng 660nm Tính ∆OD = ODTT – ODTK, dựa vào đồ thị chuNn suy ra được µM Tyrosine

2.2.1.3 Cách tính

Định nghĩa đơn vị Anson: một đơn vị Anson là lượng enzyme tối thiểu trong điều kiện chuNn (35,50C, pH 7,6) thủy phân casein trong 1 phút tạo thành sản phNm hòa tan trong TCA, phản ứng với thuốc thử Folin cho ta độ hấp thu OD ở bước sóng 660nm tương ứng với 1µM Tyrosine trong đường chuNn

,

M T yrosin e V L

t v v µ

=

Với: Hđ P : Hoạt độ enzyme protease

V : Tổng thể tích hỗn hợp trong ống nghiệm 1 hoặc 2 (ml)

v : Thể tích dung dịch lọc đem phân tích (ml)

t : Thời gian thủy phân (phút)

v’ : Thể tích mẫu enzyme đem xác định hoạt tính (ml)

L : Độ pha loãng mẫu enzyme

µM Tyrosine : Lượng µM Tyrosine trong v (ml) suy ra từ đường chuNn

2.2.2 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry [5]

2.2.2.1 Nguyên tắc:

Hầu hết các protein đều chứa Tyrosine và Tryptophan Hàm lượng của những amino acid này tùy thuộc vào loại protein, vì vậy những protein cùng một loại với nhau

có hàm lượng các amine này giống nhau

Khi cho protein tác dụng với thuốc thử Folin sẽ tạo thành một phức chất có màu Cường độ màu của phức này tỉ lệ với hàm lượng Tyrosine và Tryptophan (cũng là hàm lượng Protein), vì vậy ta có thể dùng phương pháp so màu để xác định hàm lượng protein

2.2.2.2 Cách tiến hành

Dựng đường chuNn ta thực hiện đường chuNn với một loại protein tinh khiết sau đó

để có được các dung dịch albumin chuNn có nồng độ protein từ 0 đến 250 µg /ml

Dung dịch albumin 0,1% (ml) 0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5

Hút 0,4ml dung dịch protein có nồng độ khác nhau từ các ống nghiệm vừa pha ở trên theo thứ tự từ 0 đến 5 vào bảy ống nghiệm sạch khác (gồm hai ống thử không và năm ống từ 1 đến 5) Thêm vào đó 2ml dung dịch C Lắc đều và để yên ở nhiệt độ phòng trong

5 phút Sau đó thêm vào 0,2ml thuốc thử Folin, lắc đều trong 5 - 10 phút, thêm nước cất cho đủ 5ml Đem đo mật độ quang ở bước sóng 500nm

Vẽ biểu đồ biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang (∆OD) theo nồng độ protein chuNn (µg/ml)

 Xác định hàm lượng protein trong mẫu

Hút 0,4ml dung dịch protein cần xác định cho vào một ống nghiệm sạch sấy khô Thêm vào đó 2ml dung dịch C Lắc đều và để yên ở nhiệt độ phòng trong 5 phút Sau đó thêm vào 0,2ml thuốc thử Folin, lắc đều trong 5-10 phút, thêm nước cất cho đủ 5ml Đem

đo mật độ quang ở bước sóng 500nm (nên làm 3 ống nghiệm để lấy giá trị trung bình)

2.2.2.3 Cách tính

Từ đường chuNn so sánh mật độ quang của ống nghiệm chứa mẫu protein Từ đó suy ra hàm lượng protein của nguyên liệu là a (µg/ml)

Lượng protein (M) có trong 1 ml nguyên liệu a.10-3 (mg/ml)

Hoạt tính riêng của enzyme (HTR) = Hoạt tính enzyme (UI/ml)/Hàm lượng protein (mg/ml)

2.2.3 Định hàm lượng đạm tổng số theo Kjeldahl [3]

đây cho phép chúng ta xác định được lượng ammoniac phóng thích ra, có nghĩa là xác định hàm lượng đạm trong mẫu nguyên liệu

2NH4OH + H2SO4 (NH4)2SO4 + H2O

2.2.3.2 Cách tiến hành

 Vô cơ hóa

Lấy 6 bình Kjeldahl, thực hiện ba sự thử thật và ba sự thử không Hút chính xác vào ba bình thử thật mỗi bình 1ml nếu là nguyên liệu lỏng (hoặc 0,1g nguyên liệu khô nghiền nát), 3 bình thử không mỗi bình 1ml nước cất Tiếp theo cho vào 6 bình Kjeldahl mỗi bình 5ml H2SO4 đậm đặc và khoảng 0,5g chất xúc tác (hỗn hợp K2SO4 : CuSO4= 9:1) Đem để vào tủ Hoffer đun cho đến khi dung dịch thành trong suốt ( khoảng 2-3 giờ)

Thực hiện ba sự thử thật, ba sự thử không để lấy trị số trung bình Phải xác định hệ

số hiệu chỉnh x của dung dịch NaOH N/100 bằng dung dịch (COOH)2 N/100

2.2.3.3 Cách tính

Tính lượng Nitơ tổng số có trong 1 lít nguyên liệu

Gọi V0 là thể tích dung dịch NaOH x.N/100 (trị số trung bình của ba lần thử không) Gọi V1 là thể tích dung dịch NaOH x.N/100 (trị số trung bình của ba lần thử thật Vậy ∆V = V0 – V1 là lượng NaOH tương đương với lượng đạm ammoniac phóng thích bởi 10ml dịch vô cơ loãng 1 mol ammoniac tương đương với 1 mol NaOH

Do đó số mol ammoniac phóng thích bởi 10 ml dung dịch vô cơ hóa đã pha loãng là:

V.x 1/100

mol = V.x 10 mol1000

2.2.4 Xác định đạm formol theo phương pháp Sorensen [3]

2.2.4.2 Cách tiến hành

Trung hòa formol ½ : lấy 50ml formol ½, thêm vào đó vài giọt phenolphtalein 3%, cho NaOH N/10 từng giọt cho tới khi dung dịch chuyển sang màu hồng nhạt, ta được formol ½ đã trung hòa

Hút 5ml dung dịch nguyên liệu thêm vào đó 5ml dung dịch formol ½ đã trung hòa

và vài giọt phenophtalein 3%, lắc đều để phản ứng xảy ra hoàn toàn, sau đó định phân bằng NaOH x N/10 cho đến khi dung dịch chuyển màu hồng

Thực hiện ba lần thử thật và ba lần thử không (thay dung dịch đạm bằng nước cất) lấy trị số trung bình

2.2.4.3 Cách tính

Gọi V0 là thể tích NaOH N/10 trung bình của 3 lần thử không

Gọi Vt là thể tích NaOH N/10 trung bình của 3 lần thử thật

Như thế, hiệu số ∆Vml = (Vt –V0) ml là lượng NaOH cần để trung hòa nhóm –COOH Số mol NaOH chính là số mol của amino acid, amine, ammonium…

Số mol NaOH có trong ∆Vml dung dịch NaOH N/10

V.x 1/10

= V.x 10 (mol) 1000

∆

∆

(x là hệ số hiệu chỉnh của dung dịch NaOH N/10)

Số mol NaOH tương đương với số mol hợp chất có nhóm –NH2 là:

Những loại đạm này thường có tính chất kiềm yếu, vì vậy khi cho tác dụng với magne (MgO) thì những loại đạm kể trên sẽ bị đuổi ra khỏi dung dịch, nên chúng sẽ được lôi cuốn theo hơi nước qua một bình tam giác đựng lượng thừa axit Sau đó đem định

- Dung dịch NaOH N/10 - Dung dịch H2SO4 N/10

- Thuốc thử Tashiro - MgO

- Thuốc thử phenolphtalein

2.2.5.3 Tiến hành

Lấy 50 ml nước chấm đã pha loãng 20 lần cho vào bình cầu 500ml, thêm tiếp vào

đó 150ml nước cất và vài giọt phenolphtalein, tiếp tục thêm vào bình cầu 5g MgO, dung dịch phải có màu hồng nhạt, đậy nút ngay để tránh amoniac bay ra, lắc đều và đun sôi và hơi nước được chưng cất sang một bình tam giác có chứa sẵn 10ml H2SO4 N/10 và vài giọt thuốc thử Tashiro, đầu nhọn của ống sinh hàn nhúng chìm trong dung dịch H2SO4 N/10 Chưng cất trong 15 – 20 phút kể từ khi dung dịch trong bình cầu sôi Sau 15 – 20 phút chất đạm amoniac sẽ được hấp thụ vào dung dịch H2SO4 Lấy bình tam giác ra, rửa đầu ống sinh hàn, nước được cho vào bình tam giác luôn

Định phân lượng axit dư bằng NaOH có chuNn độ là x.N/10 từ màu xanh tím sang màu xanh xám, nếu dư NaOH thì chuyển thành màu xanh ve chai Thực hiện ba sự thử thật và ba sự thử không

Gọi V0 là thể tích NaOH N/10 trung bình của ba lần thử không

VT là thể tích NaOH N/10 trung bình của ba lần thử thật

Hiệu số ∆V= V0 - VT là lượng NaOH tương đương với đạm phóng thích đã được hấp thụ trong H2 SO4

Số mol NaOH chính là số mol đạm amoniac phóng thích:

2.2.6 Xác định hàm lượng lipid thô [3]

Người ta thường xác định chất béo (lipid) ở dạng thô hay hỗn hợp bao gồm cả mỡ nguyên và các loại giống với mỡ như phosphatide, steroid…Tùy theo yêu cầu phân tích,

có thể dùng nhiều phương pháp khác nhau (phương pháp ép, phương pháp nước nóng, phương pháp hữu cơ…) Phương pháp thông dụng ở phòng thí nghiệm là phương pháp hữu cơ, xác định hàm lượng lipid bằng máy Soxhlet ( dùng cho đối tượng động vật và thực vật)