Báo cáo thí nghiệm kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật

Báo cáo thí nghiệm kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật BÀI 1. PHÒNG THÍ NGHIỆM NUÔI CẤY MÔ – TẾ BÀO THỰC VẬT BÀI 2. NUÔI CẤY MÔ SẸO HOA CÚC BÀI 3. NUÔI CẤY HẠT PHẤN HOA LILY BÀI 4. NUÔI CẤY TẾ BÀO LỚP MỎNG LAN DENDROBIUM. BÀI 5. NUÔI CẤY ĐỈNH SINH TRƯỞNG CÂY DỨA

BÁO CÁO

THÍ NGHIỆM KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ VÀ

TẾ BÀO THỰC VẬT

MÃ MÔN: 607040

Giảng viên hướng dẫn: ĐOÀN THIÊN THANH

Sinh viên thực hiện: NHÓM S4 – N2

Phạm Thị Hoài Thương – 61900567 Huỳnh Thị Mỹ Tiên - 61900577 Trần Thanh Trà My - 61900455 Trương Hoàng Minh Thư – 61703209

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022

MỤC LỤC

MỤC LỤC……… ii

DANH MỤC BẢNG……….……….iii

DANH MỤC HÌNH ẢNH……….iv

BÀI 1 PHÒNG THÍ NGHIỆM NUÔI CẤY MÔ – TẾ BÀO THỰC VẬT 1 I TÍNH TOÁN 1

1.1 Pha môi trường MS 1

1.2 Pha vitamin 4

1.3 Pha chất điều hòa sinh trường bổ sung vào môi trường MS 5

1.4 Pha môi trường MS từ các dung dịch stock Skoog I, II, III; vitamin; chất điều hòa sinh trưởng 6

II TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM 8

III KẾT QUẢ 14

BÀI 2 NUÔI CẤY MÔ SẸO HOA CÚC 15

I QUY TRÌNH NUÔI CẤY MÔ SẸO HOA CÚC 15

1.1 Quy trình nuôi cấy mô sẹo hoa cúc 15

1.1.1 Sơ đồ quy trình nuôi cấy mô sẹo hoa cúc 15

II KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 20

2.1 Từ ngày 16/11/2022 đến ngày 23/11/2022 20

2.2 Từ ngày 23/11/2022 đến ngày 30/12/2022 20

BÀI 3 NUÔI CẤY HẠT PHẤN HOA LILY 22

I LÝ THUYẾT 22

1.1 Sơ đồ quy trình nuôi cấy hạt phấn hoa Lily 23

1.2 Các bước thực hiện 23

II KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 27

BÀI 4 NUÔI CẤY TẾ BÀO LỚP MỎNG LAN DENDROBIUM 29

I LÝ THUYẾT 29

II QUY TRÌNH NUÔI CẤY TẾ BÀO LỚP MỎNG LAN DENDROBIUM 30

2.1 Sơ đồ quy trình nuôi cấy tế bào lớp mỏng lan dendrobium 30

2.2 Các bước thực hiện 30

III KẾT QUẢ 34

BÀI 5 NUÔI CẤY ĐỈNH SINH TRƯỞNG CÂY DỨA 36

I GIỚI THIỆU 36

II CÁCH TIẾN HÀNH 37

2.1 Quy trình nuôi cấy đỉnh sinh trưởng cây dứa 37

2.2 Các bước thực hiện 37

III KẾT QUẢ 40

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần môi trường Skoog I 1

Bảng 1.2 Thành phần môi trường Skoog II 2

Bảng 1.3 Thành phần môi trường Skoog III 2

Bảng 1.4 Thành phần vitamins của Morel (Morel's Vitamin) sử dụng trong môi trường MS 4

Bảng 1.5 Chất điều hòa sinh trường bổ sung vào môi trường MS 5

Bảng 1.6 Thành phần môi trường MS với nồng độ 1X trong 1400 ml 6

Bảng 2.1 Các bước thực hiện thí nghiệm 16

Bảng 3.1 Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp nuôi cấy hạt phấn 22

Bảng 3.2 Các bước thực hiện thí nghiệm 23

Bảng 4.1 Các bước thực hiện thí nghiệm 30

Bảng 5.1 Các bước thực hiện thí nghiệm 37

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Các hóa chất dùng để pha vitamin 9

Hình 1.2 Mesoinositol 10

Hình 1.3 Pirydoxine (B6) 10

Hình 1.4 Nicotinic acid (P.P) 11

Hình 1.5 Thiamin HCl (B1) 11

Hình 1.6 Pantotate Calci 12

Hình 1.7 Chất điều hòa sinh trưởng BAP 12

Hình 1.8 Chất điều hòa sinh trưởng NAA 13

Hình 1.9 Chỉnh pH về 5,7 - 5,8 13

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình nuôi cấy mô sẹo hóa cúc 15

Hình 2.2 Hoa cúc 16

Hình 2.3 Các mẫu sau khi được rửa với nước 16

Hình 2.4 Các mẫu được ngâm trong cồn 70% 16

Hình 2.5 Bộ dụng cụ cấy đã được hấp khử trùng 17

Hình 2.6 Khử trùng bề mặt tủ cấy và bật đèn UV 18

Hình 2.7 Mẫu nuôi cấy được kiểm tra vào ngày 7/12/22 21

Hình 3.1 Sơ đồ quy trình nuôi cấy hạt phấn hoa Lily 23

Hình 3.2 Nụ hoa Lily 23

Hình 3.3 Khử trùng mẫu bằng ethanol 70% 24

Hình 3.4 Khử trùng mẫu bằng NaOCl 20% 24

Hình 3.5 Khử trùng bề mặt tủ cấy và bật tia UV 25

Hình 3.6 Bộ dụng cụ hấp khử trùng 25

Hình 3.7 Thao tác nuôi cấy trong tủ vô trùng 26

Hình 3.8 Hạt phấn sau khi cấy 27

Hình 3.9 Hạt phấn được kiểm tra vào ngày 7/12/22 28

Hình 4.1 Sơ đồ quy trình nuôi cấy tế bào lớp mỏng lan dendrobium 30

Hình 4.2 Lan in vitro 30

Hình 4.3 Khử trùng bề mặt bằng đèn UV 31

Hình 4.4 Chuẩn bị tủ cấy và dụng cụ cấy 31

Hình 4.5 Cắt mẫu 32

Hình 4.6 Cấy mẫu vào môi trường 32

Hình 4.7 Mẫu lan vừa được cấy vào môi trường 34

Hình 4.8 Mẫu lan được nuôi tối sau 1 tuần 34

Hình 5.1 Cấu tạo của mô phân sinh đỉnh 36

Hình 5.2 Sơ đồ quy cấy đỉnh sinh trưởng cây trình nuôi dứa 37

Hình 5.3 Mẫu dứa 37

Hình 5.4 Tách bớt lá 38

Hình 5.5 Quan sát dưới kính hiển vi 38

Hình 5.6 Đặt mẫu lên đĩa petri 39

Hình 5.7 Dùng dao tách đỉnh sinh trưởng 39

Hình 5.8 Quan sát đỉnh sinh trưởng 39

Hình 5.9 Đỉnh sinh trưởng dứa 40

BÀI 1 PHÒNG THÍ NGHIỆM NUÔI CẤY MÔ – TẾ BÀO THỰC VẬT

I TÍNH TOÁN

1.1 Pha môi trường MS

Bảng 1.1 Thành phần môi trường Skoog I

𝑚𝐾𝑁𝑂3 = 1900 × 10 × 1 = 19000 (𝑚𝑔) Khối lượng KH2PO4 trong môi trường Skoog I 10X – 1 L:

𝑚𝐾𝐻2𝑃𝑂4 = 170 × 10 × 1 = 1700 (𝑚𝑔) Khối lượng MgSO4.7H2O trong môi trường Skoog I 10X – 1 L:

𝑚𝑀𝑔𝑆𝑂4.7𝐻2𝑂 = 370 × 10 × 1 = 3700 (𝑚𝑔) Khối lượng CaCl2.2H2O trong môi trường Skoog I 10X – 1 L:

𝑚𝐶𝑎𝐶𝑙2.2𝐻2𝑂 = 440 × 10 × 1 = 4400 (𝑚𝑔)

Bảng 1.2 Thành phần môi trường Skoog II

Hàm lượng 200X – 200 mL FeSO 4 7H 2 O 27,8 mg/L 1112 g

Cách tính toán:

Khối lượng FeSO4.7H2O trong môi trường Skoog II 200X – 200 mL:

𝑚𝐹𝑒𝑆𝑂4.7𝐻2𝑂 = 27,8 × 200 × 0,2 = 1112 (𝑚𝑔) Khối lượng Na2EDTA trong môi trường Skoog II 200X – 200 mL:

𝑚𝑁𝑎2𝐸𝐷𝑇𝐴 = 37,3 × 200 × 0,2 = 1429 (𝑚𝑔) Bảng 1.3 Thành phần môi trường Skoog III

Thành phần Hàm lượng 1X

Hàm lượng 1000X – 100 mL

Hàm lượng 200X – 200 mL

Cách tính toán:

Nồng độ Skoog III 1000X – 100 mL:

Khối lượng KI trong môi trường Skoog III 1000X – 100 mL:

𝑚𝐾𝐼 = 0,83 × 1000 × 0,1 = 83 (𝑚𝑔) Khối lượng Na2MoO4.2H2O trong môi trường Skoog III 1000X – 100 mL:

𝑚𝑁𝑎2𝑀𝑜𝑂4.2𝐻2𝑂 = 0,25 × 1000 × 0,1 = 25 (𝑚𝑔) Khối lượng CuSO4.5H2O trong môi trường Skoog III 1000X – 100 mL:

𝑚𝐶𝑢𝑆𝑂4.2𝐻2𝑂 = 0,025 × 1000 × 0,1 = 2,5 (𝑚𝑔) Khối lượng CoC12.6H2O trong môi trường Skoog III 1000X – 100 mL:

𝑚𝐶𝑜𝐶12.6𝐻2𝑂 = 0,025 × 1000 × 0,1 = 2,5 (𝑚𝑔) Khối lượng MnSO4.4H2O trong môi trường Skoog III 1000X – 100 mL:

𝑚𝑀𝑛𝑆𝑂4.4𝐻2𝑂 = 22,3 × 1000 × 0,1 = 2230 (𝑚𝑔) Khối lượng H3BO3 trong môi trường Skoog III 1000X – 100 mL:

𝑚𝐻3𝐵𝑂3 = 6,2 × 1000 × 0,1 = 620 (𝑚𝑔) Khối lượng ZnSO4.7H2O trong môi trường Skoog III 1000X – 100 mL:

𝑚𝑍𝑛𝑆𝑂4.7𝐻2𝑂 = 8,6 × 1000 × 0,1 = 860 (𝑚𝑔) Nồng độ Skoog III 200X – 200 mL:

Khối lượng KI trong môi trường Skoog III 200X – 200 mL:

𝑚𝐾𝐼 = 0,83 × 200 × 0,2 = 33,2 (𝑚𝑔) Khối lượng Na2MoO4.2H2O trong môi trường Skoog III 200X – 200 mL:

𝑚𝑁𝑎2𝑀𝑜𝑂4.2𝐻2𝑂 = 0,25 × 200 × 0,2 = 10 (𝑚𝑔)

Khối lượng CuSO4.5H2O trong môi trường Skoog III 200X – 200 mL:

𝑚𝐶𝑢𝑆𝑂4.2𝐻2𝑂 = 0,025 × 200 × 0,2 = 1 (𝑚𝑔) Khối lượng CoC12.6H2O trong môi trường Skoog III 200X – 200 mL:

𝑚𝐶𝑜𝐶12.6𝐻2𝑂 = 0,025 × 200 × 0,2 = 1 (𝑚𝑔) Khối lượng MnSO4.4H2O trong môi trường Skoog III 200X – 200 mL:

𝑚𝑀𝑛𝑆𝑂4.4𝐻2𝑂 = 22,3 × 200 × 0,2 = 892 (𝑚𝑔) Khối lượng H3BO3 trong môi trường Skoog III 200X – 200 mL:

𝑚𝐻3𝐵𝑂3 = 6,2 × 200 × 0,2 = 248 (𝑚𝑔) Khối lượng ZnSO4.7H2O trong môi trường Skoog III 200X – 200 mL:

𝑚𝑍𝑛𝑆𝑂4.7𝐻2𝑂 = 8,6 × 200 × 0,2 = 334 (𝑚𝑔)

Lưu ý: Đối với SKOOG III vì khi tính ra thì khối lượng quá nhỏ nên cần pha

dung dịch stock lớn (1000X – 100mL) rồi dùng pipet hút ra theo nồng độ cần yêu cầu (200X – 200 mL)

Thiamin HCl (B1)

Pantotate Calci

1 mg/L 0,01mg/L 100 mg/L 1 mg/L 1 mg/L 1 mg/L

100 mg 1 mg 10000 mg 100 mg 100 mg 100 mg

Cách tính toán:

Khối lượng Pirydoxine trong stock vitamin 1000X – 100 mL:

𝑚𝑃𝑖𝑟𝑦𝑑𝑜𝑥𝑖𝑛𝑒 = 1 × 1000 × 0,1 = 100 (𝑚𝑔) Khối lượng Biotin trong stock vitamin 1000X – 100 mL:

𝑚𝐵𝑖𝑜𝑡𝑖𝑛 = 0,01 × 1000 × 0,1 = 1 (𝑚𝑔) Khối lượng Mesoinositol trong stock vitamin 1000X – 100 mL:

𝑚𝑀𝑒𝑠𝑜𝑖𝑛𝑜𝑠𝑖𝑡𝑜𝑙 = 100 × 1000 × 0,1 = 10000 (𝑚𝑔) Khối lượng Nicotinic acid trong stock vitamin 1000X – 100 mL:

𝑚𝑁𝑖𝑐𝑜𝑡𝑖𝑛𝑖𝑐 𝑎𝑐𝑖𝑑 = 1 × 1000 × 0,1 = 100 (𝑚𝑔) Khối lượng Thiamin HCl trong stock vitamin 1000X – 100 mL:

𝑚𝑇ℎ𝑖𝑎𝑚𝑖𝑛 𝐻𝐶𝑙 = 1 × 1000 × 0,1 = 100 (𝑚𝑔) Khối lượng Pantotate Calci trong stock vitamin 1000X – 100 mL:

𝑚𝑃𝑎𝑛𝑡𝑜𝑡𝑎𝑡𝑒 𝐶𝑎𝑙𝑐𝑖 = 1 × 1000 × 0,1 = 100 (𝑚𝑔)

1.3 Pha chất điều hòa sinh trường bổ sung vào môi trường MS

Bảng 1.5 Chất điều hòa sinh trường bổ sung vào môi trường MS

Chất điều hòa sinh

Hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng trong

𝑚𝐵𝐴𝑃 = 10 × 1 ÷ 1 = 10 (𝑚𝑔)

1.4 Pha môi trường MS từ các dung dịch stock Skoog I, II, III; vitamin; chất điều hòa sinh trưởng

Bảng 1.6 Thành phần môi trường MS với nồng độ 1X trong 1400 ml

𝑉𝑀𝑆2 =1 × 1400

200 = 7 (𝑚𝐿) Thể tích MS3 cần hút trong môi trường MS 1X – 1400 mL:

𝑉𝑀𝑆3 =1 × 1400

200 = 7 (𝑚𝐿) Thể tích Vitamin cần hút trong môi trường MS 1X – 1400 mL:

𝑉𝑉𝑖𝑡𝑎𝑚𝑖𝑛 =1 × 1400

1000 = 1,4 (𝑚𝐿) Thể tích NAA cần hút trong môi trường MS 1X – 1400 mL:

𝑉𝑁𝐴𝐴 =1 × 1400

1000 = 1,4 (𝑚𝐿)

Thể tích BAP cần hút trong môi trường MS 1X – 1400 mL:

𝑉𝐵𝐴𝑃 =0,5 × 1400

1000 = 0,7 (𝑚𝐿) Thể tích agar cần hút trong môi trường MS 1X – 1400 mL:

𝑉𝐵𝐴𝑃 =8 × 1400

1000 = 11,2 (𝑚𝐿)

II TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM

Bảng 1.7 Các bước thực hiện trong quá trình thí nghiệm

500 mL nước cất vào khuấy tan

Na2EDTA và ống đong rồi cho

từ từ dung dịch FeSO4.7H2O vào, vừa cho vào vừa khuấy đều

Lưu ý: Nếu làm ngược lại

dung dịch sẽ bị kết tủa Dùng giấy bạc bọc lại và bảo quản ở điều kiến mát

Hình 1.1 Các hóa chất dùng

để pha vitamin

hoàn toàn Định mức lên 100 mL

Hình 1.2 Mesoinositol

Hình 1.3 Pirydoxine (B6)

Hình 1.4 Nicotinic acid (P.P)

Hình 1.5 Thiamin HCl (B1)

Cân chính xác 10 mg BAP và thêm 3 mL NaOH 1 N (<5 mL), khuấy đều cho đến khi BAP tan hoàn toàn trong dung dịch Định mức lên 10 mL bằng nước cất

Hình 1.7 Chất điều hòa sinh

trưởng BAP

Hình 1.8 Chất điều hòa sinh

trưởng NAA

Agar

Cân chính xác 11,2 g agar và thêm

500 mL nước cất Sau đó đun cách thủy đến khi agar tan hoàn toàn

Môi trường

MS

Cho lần lượt các dung dịch stock I,

II, III vào bình, bổ sung thêm vitamin, chất điều hòa sinh trưởng

và đường Điều chỉnh pH 5,7 – 5,8 bằng máy đo pH Cuối cùng bổ sung thêm agar, rót chai, đậy kín

và đem hấp khử trùng

Hình 1.9 Chỉnh pH về 5,7 -

5,8

BÀI 2 NUÔI CẤY MÔ SẸO HOA CÚC

I QUY TRÌNH NUÔI CẤY MÔ SẸO HOA CÚC

1.1 Quy trình nuôi cấy mô sẹo hoa cúc

1.1.1 Sơ đồ quy trình nuôi cấy mô sẹo hoa cúc

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình nuôi cấy mô sẹo hóa cúc

- Thân: được cắt thành từng khúc ngắn từ 2 – 3 cm Ngoài ra có thể cắt đoạn thân có chứa chồi nách nếu muốn phát triển chồi nách

- Lá: chọn những lá khỏe, tươi, không bị sâu bệnh

- Tràng hoa: chọn những hóa to, khỏe, cánh đều, không bị bệnh

Tách từng tràng hoa ra

Chọn ra 3 mẫu cho vào 3 erlen riêng biệt, sau đó rửa 3 mẫu bằng nước sạch rồi đem rửa lại bằng cồn 70 ° Tiếp theo cho một lượng cồn vừa đủ để ngâm mẫu trong 1 phút và lặp lại 3 lần

trong 10 phút Cuối cùng, dùng nước cất rửa lại mẫu lần nữa (3 –

5 lần)

Lưu ý: Khi sử dung javen cần

xem nồng độ trên chai javen

Trong quá trình ngâm javen, nếu ngâm quá lâu thì mẫu sẽ bị tổn thương nhiều, nếu ngâm thời gian quá ít thì mẫu dễ bị nhiễm

Lưu ý: Khi bật đèn UV thì phải

lấy màn trùm lại và không có người nào ở xung quanh

- Chuẩn bị khay, kẹp, cán dao, khăn đã được khử trùng và các vật dụng cần thiết Xịt cồn vào tay và

Hình 2.5 Bộ dụng cụ cấy

đã được hấp khử trùng

các vật dụng để khử trùng bề mặt

trước khi cho vào tủ cấy

- Gắn lưỡi dao vào cán nhúng vào

cồn 90 °, làm tương tự với kẹp

Dùng kẹp cho ít cồn vào khay, hơ

kẹp trên ngọn lửa đèn cồn, khi kẹp

bị bắt lửa thì hơ lửa qua khay và

dao để khử trùng bộ dùng cụ cấy

Các bước cấy mẫu:

- Dùng kẹp gấp mẫu đã chuẩn bị

từ trước ra khay, khi mở miệng

bình chứa mẫu cần hơ lửa miệng

bình để tránh nhiễm

- Cắt mẫu:

+ Lá: Cắt bỏ rìa lá và giữ lại phần

giữa lá với kích thước 1 cm × 1

cm Cẩn thận cho vào môi trường

nuôi cấy mô sẹo

+ Hoa: Cắt bỏ phần đầu cánh hoa

và phần gốc cánh hoa, giữ lại phần

có màu nhạt gần cuối cánh hoa

Cẩn thận đặt vào môi trường nuôi

cấy mô sẹo

+ Thân: Cắt lấy phần thân có

khoặc không có chứa chồi nách

(tùy vào mục đích nuôi cấy) có độ

Hình 2.6 Khử trùng bề mặt

tủ cấy và bật đèn UV

dài 2 – 3 mm Cẩn thận đặt vào môi trường nuôi cấy mô sẹo, đặt vào sao cho chồi nách hướng lên trên để chồi nách có thể phát triển

Lưu ý: Khi cấy tránh để kẹp quá

nóng gây tổn thương mẫu Tránh huơ tay qua lại trên ngọn lửa đèn cồn

II KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN

2.1 Từ ngày 16/11/2022 đến ngày 23/11/2022

Hình 2.7 Kết quả nuôi cấy sau một tuần

- Sau một tuần vẫn chưa có dấu hiệu xuất callus nhưng tất cả đều không nhiễm nấm mốc Tuy nhiên, một số môi trường đã chuyển sang màu nâu cánh gián, có thể do hóa chất được sử dụng để pha môi trường bị hỏng

- Ta tiếp tục nuôi cấy tối ở nhiệt độ 25 ℃

Qua đó, ta có thể thấy được các điều kiện ảnh hưởng đến mẫu nuôi cấy hoa cúc bị nhiễm bao gồm:

- Thao tác cấy cần nắm rõ hơn để tránh nhiễm mẫu như: xử lý mẫu cấy, tránh dập mẫu, …

- Điều kiện vô trùng của mẫu chưa đảm bảo cần xử lý kỹ ở bước này

2.3 Từ ngày 30/12/2022 đến ngày 7/12/2022

Hình 2.7 Mẫu nuôi cấy được kiểm tra vào ngày 7/12/22

- Sau 3 tuần, mẫu bị lên mốc, qua đó, ta có thể thấy được các điều kiện ảnh hưởng đến mẫu nuôi cấy hoa cúc bị nhiễm bao gồm:

+ Thao tác cấy

+ Điều kiện vô trùng của mẫu chưa được đảm bảo

BÀI 3 NUÔI CẤY HẠT PHẤN HOA LILY

I LÝ THUYẾT

Bảng 3.1 Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp nuôi cấy hạt phấn

Ưu điểm của phương pháp Nhược điểm của phương pháp

‒ Kỹ thuật khá đơn giản

‒ Ở một số loài sự phân chia tế bào dễ

dàng ngay cả khi những tế bào hạt

phấn chưa thực sự chín

‒ Tỷ lệ hạt phấn có phản ứng tốt với

môi trường nuôi cấy cao (tần suất

cảm ứng môi trường cao)

‒ Có thể sản xuất thể đơn bội với số

‒ Dễ vất bỏ đi những bao phấn có thể tạo được thể đơn bội

‒ Để đạt được những kết quả mong muốn cần thiết phải có những định hướng cụ thể

1.1 Sơ đồ quy trình nuôi cấy hạt phấn hoa Lily

Hình 3.1 Sơ đồ quy trình nuôi cấy hạt phấn hoa Lily

1.2 Các bước thực hiện

Bảng 3.2 Các bước thực hiện thí nghiệm Các bước thực hiện Giải thích Hình minh họa Chuẩn bị mẫu ‒ Chọn những nụ chưa

nở có kích thước khoảng 17 - 22mm

Không sử dụng các nụ đang bắt đầu nở hoặc

đã nở Trong khi chọn

nụ hoa, kích thước của cánh hoa bằng kích thước của đài lá là lý tưởng cho nuôi cấy bao phấn

Hình 3.2 Nụ hoa Lily

Hình 3.3 Khử trùng mẫu bằng ethanol 70%

Hình 3.4 Khử trùng mẫu bằng NaOCl 20%

Chuẩn bị tủ cấy vô trùng ‒ Khử trùng bề mặt tủ

cấy bằng cồn, sau đó bật tia UV trong 45 phút Sau khi tắt đen

UV thì phải bật quạt thông gió để từ 10 -15 phút

‒ Lưu ý: Khi bật đèn UV

thì phải lấy màn trùm lại và không có người nào ở xung quanh

‒ Chuẩn bị khay, kẹp, cán dao, khăn đã được khử trùng và các vật dụng cần thiết Xịt cồn vào tay và các vật dụng để khử trùng bề mặt trước khi cho vào

tủ cấy

‒ Gắn lưỡi dao vào cán nhúng vào cồn 96°, làm tương tự với kẹp

Dùng kẹp cho ít cồn vào khay, hơ kẹp trên ngọn lửa đèn cồn, khi kẹp bị bắt lửa thì hơ lửa qua khay và dao để khử trùng bộ dùng cụ

Hình 3.5 Khử trùng bề mặt

tủ cấy và bật tia UV

Hình 3.6 Bộ dụng cụ hấp

khử trùng

cấy

Nuôi cấy mẫu ‒ Tất cả thao tác đều

phải thực hiện dưới ngọn lửa đèn cồn

‒ Dùng kẹp và dao mổ cắt nụ hoa và tách nhị hoa ra khỏi nụ

‒ Loại bỏ các day tóc từ bao phẩn

‒ Chuyển một bao phấn lên môi trường dinh dưỡng MS

Quan sát sự phát triển của

Hình 3.7 Thao tác nuôi cấy trong tủ vô trùng