khai thác và phát triển nguồn gen quý hiếm cây thuốc lá

Các giống được sắp xếp và phân loại theo một số tiêu chí như theo mục đích sử dụng thuốc lá vàng sấy, thuốc lá nâu phơi..., theo năng suất, phẩm cấp, hàm lượng nicotin, đường khử hoặc đặ

CÔNG TY TRÁCH NHIỆM HỮU HẠN MỘT THÀNH VIÊN

VIỆN KINH TẾ KỸ THUẬT THUỐC LÁ

BÁO CÁO TỔNG KẾT NHIỆM VỤ

KHAI THÁC VÀ PHÁT TRIỂN NGUỒN GEN

QUÝ HIẾM CÂY THUỐC LÁ

Chủ trì nhiệm vụ: KS Trần Thị Thanh Hảo

7722

26/02/2010

HÀ NỘI, THÁNG 12 NĂM 2009

CÔNG TY TRÁCH NHIỆM HỮU HẠN MỘT THÀNH VIÊN

VIỆN KINH TẾ KỸ THUẬT THUỐC LÁ

BÁO CÁO TỔNG KẾT NHIỆM VỤ

KHAI THÁC VÀ PHÁT TRIỂN NGUỒN GEN

QUÝ HIẾM CÂY THUỐC LÁ

Thực hiện theo Hợp đồng đặt hàng sản xuất và cung cấp dịch vụ sự nghiệp công nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ số 04B/HDD-KHCN ngày 28 tháng 5 năm 2009 giữa Bộ Công Thương

và Công ty TNHH một thành viên Viện Kinh tế Kỹ thuật Thuốc lá

Chủ trì nhiệm vụ: KS Trần Thị Thanh Hảo Những người thực hiện chính: TS Chu Hoàng Hà

CN Phạm Thị Vân

KS Nguyễn Hồng Thái KTV Nguyễn Hoàng Việt

KTV Nguyễn Thị Mai Hoa

HÀ NỘI, THÁNG 12 NĂM 2009

Trước thực trạng tài nguyên di truyền thực vật suy giảm, các nhà khoa học khẳng định đã đến lúc cần chú trọng công tác bảo tồn, phát triển nguồn gen tại cộng đồng bên cạnh bảo quản tại ngân hàng gen

Tuy nhiên, do nhu cầu cuộc sống, người nông dân chỉ trồng những loại cây mang lại lợi ích kinh tế hoặc có giá trị sử dụng Vì thế, mà những nguồn gen địa phương có chất lượng cao, thích nghi với điều kiện thổ nhưỡng, có khả năng chống chịu tốt, nhưng giá trị kinh tế thấp nên đã không được gieo trồng,

có nguy cơ biến mất Bảo tồn thông qua sử dụng được coi là giải pháp tối ưu để thúc đẩy sử dụng bền vững nguồn tài nguyên di truyền

Khai thác, thương mại hóa các sản phẩm bản địa chính là tạo điều kiện cho người dân bảo tồn, song muốn bảo tồn bền vững phải gắn với phát triển Theo GS Nguyễn Ngọc Kính- Phó chủ tịch Hội giống cây trồng Việt Nam thì chúng ta không chỉ khai thác mà còn phải nhân tức là giữ lại cái giống đó, tìm cách phục tráng, chọn lọc lại để nhân lên sản xuất có quy mô

Cây thuốc lá là một trong những cây công nghiệp ngắn ngày có hiệu quả kinh tế cao Cũng như các cây trồng khác, hiện tượng xói mòn nguồn gen thuốc

lá cũng đang diễn ra, chính vì vậy công tác thu thập và lưu giữ các giống thuốc

lá được nhiều nước tiến hành như Trung Quốc (hiện có trên 1000 mẫu giống thuốc lá), Zimbabue

Cũng như các loại cây trồng khác, những giống thuốc lá mới ở Việt Nam với những ưu thế nổi trội về năng suất, chất lượng cao đang dần dần thay thế các giống thuốc lá cũ và các giống địa phương Chính vì vậy việc khai thác và phát triển nguồn gen quý hiếm thuốc lá là một trong những việc cần tiến hành thường xuyên nhằm hạn chế sự xói mòn và mất mát nguồn gen thuốc lá đồng thời để có nguồn vật liệu khởi đầu phong phú phục vụ cho công tác chọn tạo giống thuốc lá mới

MỤC LỤC

Trang

TÓM TẮT NHIỆM VỤ 4

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

Chương 2 THỰC NGHIỆM 7

1 Mục tiêu 2009 7

2 Nội dung nghiên cứu 7

3 Phương pháp nghiên cứu 7

4 Vật liệu 8

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BÌNH LUẬN 9

1 Nhân nhanh 04 giống thuốc lá (SG8, SG9, BS4, ChinKB) mang các đặc tính chống chịu bệnh hại để sản xuất hạt giống 9

1.1 Chọn lọc những dòng/giống có đặc tính quý về tính chống chịu bệnh hại 9

1.2 Một số đặc điểm chính của các dòng/giống thuốc lá 10

1.2.1 Thời gian sinh trưởng của các dòng/giống 10

1.2.2 Một số chỉ tiêu sinh học của các dòng/giống 11

1.2.3 Mức độ nhiễm một số bệnh hại chính 11

1.2.4 Một số yếu tố cấu thành năng suất và năng suất của các dòng/giống 12

1.2.5 Một số chỉ tiêu hoá học chính thuốc lá nguyên liệu 13

1.2.6 Chất lượng giống dựa vào tính chất hút 13

1.3 Kết quả sản xuất hạt của các dòng/giống 14

2 Ứng dụng công nghệ sinh học để chọn tạo giống chống chịu sâu 14

2.1 Tạo dịch huyền phù vi khuẩn để biến nạp 15

2.2 Chọn lọc invitro sau biến nạp 15

2.3 Giai đoạn ra cây vào giá thể trấu : cát (tỷ lệ 1:1) 17

2.4 Giai đoạn trồng ra bầu đất 17

2.5 Kiểm tra và theo dõi kết quả chuyển gen 17

3 Bảo tồn an toàn nguồn gen quý hiếm trong ống nghiệm 18

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 19

1 Kết luận 19

2 Kiến nghị 20

TÀI LIỆU THAM KHẢO 21

PHỤ LỤC 22

TÓM TẮT NHIỆM VỤ

Mục tiêu chính của nhiệm vụ là khai thác và phát triển những giống thuốc

lá mang nguồn gen quý hiếm

Hàng năm, Viện Kinh tế Kỹ thuật Thuốc lá đều tiến hành thu thập, khảo sát và đánh giá các giống thuốc lá mới được bổ sung từ nhiều nguồn khác nhau Các giống được sắp xếp và phân loại theo một số tiêu chí như theo mục đích sử dụng (thuốc lá vàng sấy, thuốc lá nâu phơi ), theo năng suất, phẩm cấp, hàm lượng nicotin, đường khử hoặc đặc tính chống chịu sâu bệnh hại chính

Từ những đặc điểm mô tả ban đầu và nhu cầu của người sản xuất chúng tôi tiến hành chọn lọc những dòng/giống thích hợp và sử dụng các phương pháp tiêu chuẩn để nhân giống invitro hoặc phục tráng giống để thu được nguồn hạt giống thuần có chất lượng cao nhằm lưu giữ những giống thuốc lá mang đặc tính quý hiếm đồng thời cung cấp hạt giống cho các vùng sản xuất khi có nhu cầu

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Thuốc lá là cây công nghiệp ngắn ngày có giá trị kinh tế cao Cũng như các cây trồng nông nghiệp khác bệnh và sâu hại luôn là mối đe dọa đến năng suất và chất lượng nguyên liệu thuốc lá Mức độ thiệt hại hàng năm tuỳ thuộc vào từng vùng, từng bệnh mà biến động từ 0-100%, trung bình từ 20-30% Theo tổng kết của Shew và Luca, 1991 thiệt hại do sâu bệnh hại thuốc lá tại Mỹ lên tới 20%

Nghiên cứu chọn tạo giống thuốc lá theo các hướng khác nhau được quan tâm ở các quốc gia lớn như Mỹ, Brazil, Trung Quốc, Zimbawe…Chọn tạo giống theo hướng chống chịu sâu bệnh là một trong những hướng chọn tạo giống thuốc lá, chính vì vậy những nguồn vật liệu khởi đầu mang những đặc tính chống chịu sâu bệnh cần được bảo tồn, khai thác và phát triển

Biện pháp chọn tạo giống chống chịu sâu bệnh truyền thống gặp một số khó khăn nhất định do tính trạng qui định đặc tính chống chịu sâu bệnh thường

do nhiều gen qui định hoặc gắn với một số tính trạng không tốt Để nâng cao hiệu quả trong chọn tạo giống chống chịu sâu bệnh, việc ứng dụng công nghệ biến đổi di truyền để chọn tạo giống kháng sâu bệnh hại chính đã và đang được

quan tâm nghiên cứu [1] Gần đây các nhà khoa học đã phát hiện các gen vip

(vegetative insecticidal protein-protein sinh dưỡng diệt côn trùng) mã hóa cho

các protein Vip trong pha dinh dưỡng của chu trình phát triển vi khuẩn Bt, có hoạt lực và phổ tác dụng diệt côn trùng cao Gen vip3 mã hoá các protein hoạt

động trong ruột giữa của côn trùng (gắn với chất nhận đặc hiệu, tạo thành các kênh trao đổi ion gây nên sự mất cân bằng trao đổi chất, làm tê liệt bộ máy tiêu hóa của côn trùng), có hoạt tính kháng sâu xám cao gấp 260 lần so với protein

cry IA và có phổ hoạt động rộng như diệt được sâu xanh hại ngô, sâu xanh hại

thuốc lá [4], [5], [6]

Ở Việt Nam, cây thuốc lá là một trong những cây công nghiệp ngắn ngày

có giá trị kinh tế cao Vấn đề sâu bệnh hại trong sản xuất là một trong những nguyên nhân gây giảm năng suất và chất lượng của nguyên liệu Căn cứ vào chiến lược phát triển ngành thuốc lá từ nay đến năm 2020 ngành thuốc lá tăng cường tạo giống trong nước, tạo giống có khả năng kháng sâu bệnh cao và cho chất lượng tốt phục vụ sản xuất nguyên liệu trong nước và xuất khẩu [3] Để đáp ứng được chiến lược của ngành thuốc lá, việc khai thác và phát triển những giống thuốc lá có những nguồn gen quý hiếm để phục vụ ngành thuốc lá nói riêng và ngành công nghiệp nói chung là rất cần thiết

Ứng dụng công nghệ biến đổi di truyền để biến nạp gen kháng sâu bệnh hại quan tâm vào cây trồng cũng là một trong những hướng đi được quan tâm để

giải quyết vấn đề đó Trong những năm gần đây, Viện Công nghệ sinh học Việt Nam đã đi sâu vào nghiên cứu phân lập các gen mã hoá cho các protein gây độc với côn trùng và bước đầu xây dựng quy trình chuyển gen thích hợp vào một số

đối tượng cây trồng như ngô, bông, thuốc lá [2] Gen vip3A được các nhà khoa

học phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học phân lập, đánh giá hoạt tính, phổ tác dụng và công bố trình tự gen tại ngân hàng gen quốc tế

(mã số AJ971413 - phụ lục 3) là một trong những kết quả nghiên cứu mới nhất

về gen kháng sâu thế hệ mới có tác dụng diệt sâu hại thuộc bộ cánh vảy (trong

đó có sâu xanh, sâu xám, sâu khoang hại thuốc lá)

Chương 2 THỰC NGHIỆM

1 Mục tiêu 2009

- Sản xuất hạt của một số dòng/giống thuốc lá mang đặc tính chống chịu bệnh hại

- Ứng dụng kĩ nghệ di truyền (công nghệ sinh học) để tạo giống mang gen

chống chịu sâu (vip3A) trên cây thuốc lá

- Bảo tồn an toàn nguồn gen quý hiếm nhờ lưu giữ trong ống nghiệm

2 Nội dung nghiên cứu

2.1 Nhân nhanh 04 dòng/giống thuốc lá (SG8, SG9, BS4, ChinKB) mang các đặc tính chống chịu bệnh hại để sản xuất hạt đầu dòng

2.2 Ứng dụng công nghệ sinh học để chọn tạo giống chống chịu sâu:

- Chuyển cấu trúc mang gen vip3A vào cây thuốc lá (giống K326) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (A.tumerfaciens )

- Bước đầu kiểm tra sự có mặt của gen chuyển vào thông qua phản ứng PCR với cặp mổi đặc hiệu

2.3 Bảo tồn an toàn nguồn gen quý hiếm nhờ lưu giữ trong ống nghiệm

3 Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp nuôi cấy cây trong ống nghiệm theo Murashige & Skoog

1962

- Bố trí thí nghiệm ngoài đồng ruộng theo phương pháp khối ngẫu nhiên hoàn chỉnh, nhắc lại 3 lần

- Số liệu được xử lý theo IRRISTART 5.0, phần mềm excel

- Phương pháp đánh giá chất lượng giống qua phân tích thành phần hoá học nguyên liệu thuốc lá: đường khử (TCVN 7102:2002), đạm tổng số (TCVN 7252:2003), nicotin (TCVN 6679:2000), clo (TCVN 7251:2003)

- Đánh giá chất lượng giống qua bình hút cảm quan nguyên liệu theo TC 01-2000

- Phân cấp thuốc lá nguyên liệu vàng sấy theo tiêu chuẩn TCN 26 -1 -02

- Kỹ thuật trồng và hái sấy thuốc lá theo tiêu chuẩn ngành 10TCN

618-2005

- Một số chỉ tiêu theo dõi chính về sinh trưởng phát triển, mức độ nhiễm sâu bệnh hại, năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất, chất lượng của các

giống được đánh giá theo 10 TCN 426-2000 “Quy phạm khảo nghiệm giống

thuốc lá”, phần khảo nghiệm cơ bản

- Chuyển gen vào mảnh lá thông qua vi khuẩn A.tumerfaciens (Topping

1998 - phụ lục 4)

- Gen sàng lọc cây sau biến nạp là gen kháng kháng sinh Kanamycine

- Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển vào trong cây bằng phương pháp PCR với cặp mồi 35S Fs/Fr (promotor 35S có trong cấu trúc gen chuyển vào cây)

4 Vật liệu

- Vật liệu thực vật:

+ Dòng/ giống thuốc lá: 3 dòng SG8, SG9 và BS4, giống ChinKB được chọn lọc để đánh giá và sản xuất hạt đầu dòng, giống K326 được dùng làm

giống đối chứng và để chuyển gen kháng sâu vip3A

- Vật liệu vi sinh: Vi khuẩn A tumerfaciens chủng C58 mang vector pBI121 chứa gen vip3A (phụ lục 2, 3)

- Hoá chất: thang marker chuẩn, agarose, phenol, chloroform, kanamycine và các hoá chất thông dụng khác

- Thiết bị máy móc, dụng cụ: Bộ kit tinh sạch DNA, pipetman, máy soi Gel (Bio - Rad), máy chụp ảnh, máy ly tâm, máy đo pH, bộ điện di, máy PCR,

bể ổn nhiệt, máy cấy vô trùng, tủ lạnh sâu

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BÌNH LUẬN

1 Nhân nhanh 04 giống thuốc lá (SG8, SG9, BS4, ChinKB) mang các đặc tính chống chịu bệnh hại để sản xuất hạt giống

1.1 Chọn lọc những dòng/giống có đặc tính quý về tính chống chịu bệnh hại

Hàng năm Viện KTKT Thuốc lá đều tiến hành thu thập bổ sung các giống thuốc lá vào trong tập đoàn quỹ gen Trong quá trình thu thập, khảo sát và đánh giá bước đầu thu được một số đặc tính quý của một số giống Trên cơ sở những đặc tính mô tả ban đầu chúng tôi sắp xếp theo nhóm giống, lựa chọn một số giống có những đặc tính tốt để tiếp tục đánh giá vào vụ sau

Năm 2009, chúng tôi chọn lọc và đánh giá một số dòng, giống mang một số đặc tính quý về tính chống chịu bệnh hại chính là dòng SG8, SG9, BS4 và giống ChinKB

Bảng 1 Một số đặc điểm quý của các dòng/giống thuốc lá

TT Dòng/giống Địa điểm /năm thu thập Đặc tính quý

Dòng BS4 là dòng thuốc lá được chọn lọc trong nước, qua nhiều năm khảo sát đã cho thấy khả năng kháng cao với bệnh virus khảm lá thuốc lá (TMV) và khảm lá dưa chuột (CMV)

Giống ChinKB là giống thuốc lá do cán bộ Viện sưu tập trong khi đi công tác tại Vân Nam - Trung Quốc với đặc điểm mô tả ban đầu cho thấy có năng suất cao và khả năng kháng bệnh đen thân tốt, năm 2008 chúng tôi nhân nhanh và khảo sát đặc tính của giống trong điều kiện Việt Nam và có những kết quả bước đầu cho thấy giống có tiềm năng năng suất cao (năng suất thực thu trên 22 tạ/ha), kháng bệnh đen thân và nhiễm bệnh virus nhẹ Tuy nhiên khả năng đậu quả không tốt

Từ những mẫu cây invitro, chúng tôi tiến hành nhân cây của các dòng/giống

để khảo sát trong vụ Xuân 2009

Sơ đồ 1 Sơ đồ nhân invitro các dòng/giống

Lá của cây invitro Cắt các mảnh lá có kích thước 0,5 - 1cm2

Môi trường khởi động (3 - 5tuần) Chọn các mảnh lá phân hóa mạnh, sạch

quý và chọn cá thể tốt để thu hạt Một số đặc điểm chính của các dòng/giống được

thu thập thể hiện trong các bảng biểu dưới đây

1.2 Một số đặc điểm chính của các dòng/giống thuốc lá

1.2.1 Thời gian sinh trưởng của các dòng/giống

Thời gian sinh trưởng của các giống giúp người sản xuất chủ động bố trí

sắp xếp thời gian trồng và bố trí thời vụ hợp lý

Bảng 2 Thời gian sinh trưởng của các dòng/giống

ĐVT:ngày

TT Tên dòng/

giống

Từ trồng - 10% số cây

ra nụ

Từ trồng - 90% số cây

Kết quả cho thấy đa số các dòng/giống có thời gian sinh trưởng xuất hiện 10% số cây ra nụ từ 54-58 ngày, thời gian ra nụ 90% khoảng 58 đến 60 ngày Tất cả các giống khảo sát đều có thời gian sinh trưởng dao động trên dưới 110 ngày, phù hợp với cơ cấu cây trồng

1.2.2 Một số chỉ tiêu sinh học của các dòng/giống

Chiều cao cây, đường kính thân và độ dài lóng liên quan tới khả năng chống chịu với điều kiện ngoại cảnh như mưa, gió… Những giống có chiều cao trung bình và đường kính thân lớn có khả năng chống chịu khá tốt với điều kiện thời tiết bất lợi như gió mạnh, mưa lớn và thường những cây khoẻ sẽ có tiềm năng về năng suất và phẩm chất tốt Độ dài lóng còn liên quan đến sự phân bố của lá trên cây cũng như độ thông thoáng của tán cây trên đồng ruộng

Số lá và kích thước lá là những yếu tố liên quan chặt chẽ đến tiềm năng năng suất của các giống Những giống có số lá sinh học cao (SLSH), kích thước

lá lớn sẽ cho tiềm năng năng suất cao

Bảng 3 Một số chỉ tiêu sinh học về thân và lá của các dòng/giống

Dòng SG9 và BS4 có tổng số lá tương đương giống đ/c, dòng SG 8 và

giống Chin KB có tổng số lá thấp hơn đ/c Số lá kinh tế đạt từ 17 - 19 lá Kích thước lá của giống Chin KB lớn hơn các giống còn lại, thể hiện tiềm năng năng suất tốt

1.2.3 Mức độ nhiễm một số bệnh hại chính

Mức độ nhiễm một số bệnh hại chính của các dòng/giống được thể trong bảng 4 Giống Chin KB, dòng SG 8 và SG 9 bị nhiễm bệnh khảm lá nhẹ giai đoạn sau trồng, dòng BS4 hầu như không bị nhiễm các bệnh hại phổ biến trên

đồng ruộng, thể hiện sức chống chịu khá tốt Như vậy các dòng/giống đều thể

hiện được những ưu thế về đặc tính chống chịu bệnh hại chính theo mô tả ban

Ghi chú: - Không bị bệnh +: Nhiễm bệnh nhẹ (TLB<10% )

++: Nhiễm bệnh trung bình (TLB: 10 - 20%) ; +++: Nhiễm bệnh nặng (TLB >20% )

1.2.4 Một số yếu tố cấu thành năng suất và năng suất của các dòng/giống

Một số yếu tố cấu thành năng suất và năng suất của các giống được thể

Tỷ lệ cấp 1+2

(%)

Tỷ lệ cọng

(%)

NS thực thu

Ghi chú: KLTB: Khối lượng trung bình; NS: năng suất

Giống Chin KB có khối lượng lá tươi cao, có tỷ lệ tươi/khô trung bình,

năng suất tương đương giống đối chứng Dòng SG8 và SG9 có năng suất thực

thu tương đương nhau và thấp hơn giống đối chứng Riêng dòng BS4 có tỷ lệ

tươi/khô cao, tỷ lệ cấp 1+2 thấp, có tỷ lệ cọng cao và năng suất thấp hơn so với

đ/c

1.2.5 Một số chỉ tiêu hoá học chính thuốc lá nguyên liệu

Chất lượng nguyên liệu của các giống được chúng tôi đánh giá thông qua

một số chỉ tiêu hoá học chính Kết quả thu được thể hiện trong bảng 6

Bảng 6 Thành phần hoá học của lá sấy các dòng/giống

Dòng BS4 có hàm lượng đường khử khá thấp (11,8%), các dòng/giống

còn lại có hàm lượng đường khử trung bình (từ 16 -21%)

Tất cả các giống đều có hàm lượng clo dao động xung quanh giá trị 0,5

không ảnh hưởng nhiều đến chất lượng thuốc lá nguyên liệu

1.2.6 Chất lượng giống dựa vào tính chất hút

Kết quả đánh giá chất lượng dòng/giống dựa vào tính chất hút được thể

Các dòng/giống đều có hương và vị khá (9,2 - 9,6 điểm), độ nặng vừa

phải (6,4 - 7 điểm), độ cháy khá (6 điểm), màu sắc từ vàng cam tới vàng sáng,

tổng điểm bình hút khá (37 - 38 điểm), đáp ứng chất lượng nguyên liệu trong

nước

1.3 Kết quả sản xuất hạt của các dòng/giống

Tiến hành chọn những cá thể có kiểu hình tương đối đồng đều trong suốt quá trình sinh trưởng phát triển của cây ngoài đồng ruộng, bao hoa và thu hạt giống của các dòng/giống Kết quả được thể hiện trong bảng 8

Bảng 8 Kết quả chọn lọc và lượng hạt của các dòng/giống

619 - 2005: khối lượng 1000 hạt trên 0,08 g và tỷ lệ nảy mầm trên 85%) Lượng hạt thu được từ 100 - 150g/giống, đủ để cung cấp cho 5 -7 ha trồng trong những năm tiếp theo

2 Ứng dụng công nghệ sinh học để chọn tạo giống chống chịu sâu

Gen vip thuộc nhóm gen mã hoá protein Vip (vegetative insecticidal

protein) Protein có trọng lượng phân tử 80 - 90 kDa, xuất hiện trong pha sinh

trưởng sinh dưỡng và sinh sản của chu trình phát triển của vi khuẩn Bt, gây độc với hầu hết côn trùng bộ cánh vảy (Lepidoptea), ngoài ra còn gây độc đối với một số côn trùng bộ cánh cứng (Coleoptera) và hai cánh (Diptera)

Trong nhóm gen vip thì gen vip3A được đặc biệt quan tâm nghiên cứu vì gen mã hoá cho protein Vip3A có hoạt lực diệt sâu mạnh, phổ hoạt động rộng Protein Vip3A có thể kháng cả một số côn trùng thuộc bộ cánh vảy (Lepidoptea) như sâu xanh hại thuốc lá, sâu khoang, sâu xám mà protein Cry hầu như không

có tác dụng

Gen vip3A sử dụng trong thí nghiệm là kết quả phân lập của nhóm nghiên

cứu thuộc Phòng công nghệ tế bào thực vật - Viện công nghệ sinh học Gen được chèn vào vector chuyển gen thực vật pBI121 dưới sự điều khiển của

promotor 35S và được biến nạp vào vi khuẩn A.tumerfaciens chủng C58

Sơ đồ 2 Quá trình biến nạp gen vip3A vào thuốc lá và sàng lọc cây sau biến nạp

2.1 Tạo dịch huyền phù vi khuẩn để biến nạp

Dòng khuẩn lạc A.tumerfaciens chủng C58 mang gen vip3A được nuôi hồi

phục trên môi trường LB đặc có chứa kháng sinh chọn lọc Sau đó chọn một dòng khuẩn lạc tròn, độc lập trên LB đặc cấy chuyển sang môi trường LB lỏng có chứa kháng sinh chọn lọc để để thu dịch huyền phù phục vụ cho nội dung chuyển gen Dịch huyền phù vi khuẩn đươc đo bằng phương pháp đo giá trị mật độ quang (Optical Density- OD) ở bước sóng 600 nm, có giá trị đạt 0,75, đủ điều kiện để biến nạp vào mảnh lá thuốc lá theo phương pháp đĩa lá

2.2 Chọn lọc invitro sau biến nạp

Sau biến nạp, các mảnh lá được đồng nuôi cấy hai ngày trên môi trường tái sinh chồi (GM), sau đó chuyển sang môi trường tái sinh chứa kháng sinh chọn lọc Kanamycine nồng độ 30 mg/l (GM Kan 30) Sau 3 tuần các cụm chồi được tách và cấy chuyển sang môi trường chọn lọc Kanamycine nồng độ 50 mg/l (GM Kan 50) Những chồi phát triển tốt sẽ được tách ra và cấy chuyển sang môi trường GM Kan

50 lần 2 Sau đó chồi được cấy chuyển sang môi trường ra rễ tạo cây hoàn chỉnh có chứa Kanamycine nồng độ 50 mg/l (RM Kan 50)

Kết quả theo dõi quá trình tái sinh của các dòng qua các giai đoạn khác nhau thể hiện trong bảng 9

Ra rễ Tái sinh đa chồi

Mảnh lá ngâm trong dung dịch huyền phù vi khuẩn Biến nạp

Bảng 9 Tỷ lệ tái sinh của các mẫu qua các giai đoạn chọn lọc invitro

ĐVT:(%)

Giai đoạn Công thức

Ghi chú: CTTN: công thức thí nghiệm; Đ/C1: mẫu không chuyển gen trên môi trường

có chứa kháng sinh chọn lọc Kan; Đ/C2: mẫu không chuyển gen trên môi trường không chứa

kháng sinh chọn lọc Kan

Giai đoạn chọn lọc mảnh lá tái sinh đa chồi

Ở CTTN, số mảnh lá tái sinh đa chồi trên môi trường chọn lọc GM Kan

30 khá cao (77,7%) Theo lý thuyết những dòng tái sinh được trên môi trường

có kháng sinh Kan là do trong genom của chúng có mang gen kháng Kan nên

có thể kết luận đây là những mẫu đã biến nạp thành công, trong khi ở Đ/C1 các

mảnh lá không tái sinh đa chồi, vàng dần và chết chứng tỏ trong tế bào của các

mảnh lá không biến nạp không chứa gen kháng Kan nên chúng không thể tái

sinh trên môi trường có kháng sinh này Đ/C 2 có tỷ lệ mẫu phân hóa thành

cụm chồi trên môi trường GM là 93,3%

Giai đoạn chọn lọc cụm chồi sau biến nạp:

Những cụm chồi ở CTTN được cắt nhỏ và chuyển sang môi trường tái

sinh đa chồi GM Kan 50 để tiếp tục chọn lọc, những cụm chồi ở Đ/C2 được

dùng làm vật liệu cho Đ/C 1 và Đ/C 2 ở giai đoạn chọn lọc cụm chồi

Số cụm chồi tiếp tục phân hoá trên môi trường chọn lọc (GM Kan 50) đạt

82,3%, các cụm chồi còn lại phân hoá chậm và vàng dần, trong khi Đ/C1 100%

các cụm chồi phân hóa chậm hoặc ngừng phân hoá ,vàng dần và chết, Đ/C2 có

tỷ lệ mẫu tái sinh trên môi trường là 96,7%

Giai đoạn chọn lọc cây tái sinh hoàn chỉnh:

Những chồi khỏe sẽ được tách ra và chuyển dang môi trường ra rễ (RM

Kan 50) để tạo cây hoàn chỉnh

Số chồi tái sinh thành cây hoàn chỉnh và sinh trưởng tốt trên môi trường

RM chọn lọc lần 1 (Kan 50) đạt 73,3%, trên môi trường RM chọn lọc lần 2 (Kan

50) đạt 81,8%, phần còn lại không ra rễ, sinh trưởng chậm hoặc ngừng sinh

trưởng trong khi Đ/C1 có 100% chồi không ra rễ, vàng dần và chết còn Đ/C2 có

96,55% chồi tái sinh thành cây hoàn chỉnh

Như vậy có thể quá trình chuyển gen và sàng lọc cây sau chuyển gen invitro đã được hoàn thành

2.3 Giai đoạn ra cây vào giá thể trấu : cát (tỷ lệ 1:1)

Từ những dòng chọn lọc trên môi trường RM (Kan 50), chọn 16 dòng thuốc lá chuyển gen sinh trưởng phát triển tốt nhất và đủ điều kiện (có 4-5 lá thật, có bộ rễ phát triển đầy đủ, cao từ 4-6cm ) để ra cây vào giá thể trấu : cát (tỉ lệ 1: 1)

Đây là bước chuyển cây từ giai đoạn cung cấp các điều kiện sống tối ưu trong phòng sang giai đoạn cây tự tổng hợp, đồng hóa và dị hóa các chất từ điều kiện tự nhiên để phục vụ cho các hoạt động sống của mình Bước chuyển cây ra giá thể được coi như bước trung gian để cây cây thích nghi từ từ với điều kiện ngoại cảnh và ra rễ mới.Với đặc điểm hệ rễ phụ của cây thuốc lá phát triển mạnh, có thể phát triển những đốt thân gần gốc nên tỷ lệ sống của các dòng khi vào giá thể khá cao (91,3%), hệ rễ mới phát triển mạnh, chứng tỏ sự thích nghi của cây với điều kiện ngoại cảnh khá tốt, là tiền đề để có những cây khỏe mạnh khi cây sống trong điều kiện ngoại cảnh mới

2.4 Giai đoạn trồng ra bầu đất

Giai đoạn trồng ra bầu đất là giai đoạn cây được chuyển sang điều kiện tự dưỡng Sau 14 ngày chuyển các dòng sống trên giá thể trấu : cát vào chậu đất đặt trong nhà lưới Tỷ lệ sống của các dòng khi trồng ra chậu vại đất đạt 90 % (tương đương với Đ/C) chứng tỏ cây thích nghi tốt với điều kiện ngoại cảnh

Như vậy quá trình chuyển gen vào cây thuốc lá, chọn lọc sau biến nạp, tái sinh cây hoàn chỉnh trên môi trường chọn lọc và trồng cây ra bầu đất đã hoàn thành

2.5 Kiểm tra và theo dõi kết quả chuyển gen

Vào giai đoạn 30 ngày sau trồng, khi cây đã mọc ra lá mới và phát triển bình thường thì tiến hành thu mẫu lá non của 16 dòng thuốc lá chuyển gen để tách chiết DNA tổng số Các mẫu DNA được kiểm tra với cặp mồi 35S Fs/Rs để xác định xem gen được chuyển vào có tiếp tục phiên mã và hoạt động trong cây hay không bằng phản ứng PCR PCR cho phép nhân bản một số lượng lớn nguyên bản một đoạn DNA trong một thời gian ngắn Đây là phương pháp thường được dùng trong phân tích dòng cây chuyển gen vì độ tin cậy cao Theo

lý thuyết nếu ta cung cấp cặp mồi đặc hiệu thì sẽ nhân chính xác được đoạn gen nằm giữa hai mồi đó Khi tiến hành PCR trên DNA tách từ cây đã được chuyển gen, nếu cho kết quả đặc hiệu với cặp mồi đó thì ta có thể kết luận rằng cây đó

đã mang đoạn gen cần chuyển [1], [2]

Promotor 35S được thiết kế trong cấu trúc vector pBI121, nằm trong phần

bờ trái và bờ phải của cấu trúc chứa đoạn gen chuyển vào cây, có tác dụng tăng cường quá trình phiên mã của gen được chuyển vào Cặp mồi 35S Fs/Rs được