nghiên cứu ứng dụng công nghệ bioreactor công nghệ lớp mỏng tế bào, và phân phối vô tính phục vụ nhân nhanh một số giống cây trồng có giá trị ở quy mô công nghiệp

Công nghệ lớp mỏng tế bào hoa hoàng lan 147 Bảng 2.1: Ảnh hưởng của mẫu đến nuôi cấy lớp mỏng tế bào Bảng 2.2: Ảnh hưởng BA và 2iP đến sự hình thành chồi mẫu vùng corm đỉnh sinh trưởn

Trang 1

BỘ CƠ QUAN CHỦ QUẢN

KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƯỚC KC04/06-10

ĐỀ TÀI CẤP NHÀ NƯỚC

BÁO CÁO TỔNG HỢP ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ BIOREACTOR, CÔNG NGHỆ TẾ BÀO LỚP MỎNG, VÀ PHÔI VÔ TÍNH PHỤC VỤ NHÂN NHANH MỘT SỐ GIỐNG CÂY TRỒNG CÓ GIÁ TRỊ Ở QUY MÔ

Trang 2

DANH SÁCH CÁN BỘ THAM GIA ĐỀ TÀI

Trần Văn Minh PGS.TS Viện Sinh học nhiệt đới

Bùi Thị Tường Thu CN Viện Sinh học nhiệt đới

Nguyễn Trung Hậu KS Viện Sinh học nhiệt đới

Nguyễn Phi Viễn Phương KS Viện Sinh học nhiệt đới

Mai Thị Phương Hoa KS Viện Sinh học nhiệt đới

Nguyễn Văn Nam KS Viện Sinh học nhiệt đới

Nguyễn Thị Ngọc Tú KS Viện Sinh học nhiệt đới

Nguyễn Thị Thanh TS Viện Sinh học nhiệt đới

Đỗ Năng Vịnh PGS.TS Viện Di truyền nông nghiệp

Hà Thị Thúy TS Viện Di truyền nông nghiệp Đoàn Duy Thanh TS Viện Di truyền nông nghiệp

ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

Phòng thí nghiệm trọng điểm phía Nam về

Công nghệ tế bào thực vật Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Phòng thí nghiệm trọng điểm (phía Bắc) về

Công nghệ tế bào thực vật Viện Di truyền nông nghiệp, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam

Trang 3

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Viết tắt Diễn giải

WPM Lloyd & McCown, 1981

IAA β-indolacetic acid

IBA β-indolbutyric acid

NAA α-naphthaleneacetic acid

2,4D 2,4-dichlorophenoxy acetic acid

CW nước dừa (coconut water)

Malt Dịch chiết mầm lúa cô đặc

Casein hydrolysate Dịch chiết sữa

Peptone Dịch chiết canh thịt

Phôi soma Còn được gọi là phôi vô tính

PLB Protocorm like body (thể giống phôi)

Corm Vùng nhu mô đỉnh sinh trưởng đã tách lá

dhp Dịch huyền phù

Humic acid Acid hữu cơ tự nhiên

Activated charcoal Than họat tính

RH (%) Relative humidity (%) – độ ẩm tương đối

Rhizogen Chất kích ra rễ dùng trong môi trường cấy mô, nhập nội

từ Hà Lan PPM Chất chống nhiễm dùng trong môi trường lỏng, nhập nội

từ Hà Lan

Tỷ lệ chiếu sáng 60% Chiếu sáng 60% che sáng 40%

Hình Lat 1.1 Hình lát hoa 1.1

Hình Caf 1.1 Hình cà phê 1.1

Hình Den 1.1 Hình hoa hoàng lan 1.1

Hình Cym 1.1 Hình hoa địa lan 1.1

Hình Pha 1.1 Hình hoa lan hồ điệp 1.1

Hình Rhy 1.1 Hình hoa lan ngọc điểm 1.1

Trang 4

Danh mục ký hiệu và chữ viết tắt viDanh mục các bảng vii

Mở đầu 1Tóm tắt 4

Tồng quan tài liệu 11

I Các phương pháp vi nhân giống 11

II Giới thiệu công nghệ 16 III Ứng dụng công nghệ 46

II Những vấn đề tồn tại 74

I Thu thập giống 76

V Công nghệ vườn ươm hiện đại 95

VI Mô hình pilot sản xuất giống 99

Kết quả và thảo luận 100 Chương I Thu thập giống 101

1 Công nghệ lớp mỏng tế bào lát hoa, cà phê 126

2 Công nghệ lớp mỏng tế bào hoa hòang lan, địa lan 147

3 Công nghệ lớp mỏng tế bào hoa lan hồ điệp, ngọc điểm 165

Trang 5

4 Công nghệ phôi vô tính hoa hòang lan 182

5 Công nghệ phôi vô tính hoa địa lan 195

6 Công nghệ phôi vô tính hoa lan hồ điệp 208

7 Công nghệ phôi vô tính hoa lan ngọc điểm 222

10 Công nghệ bioreactor hoa hòang lan 271

11 Công nghệ bioreactor hoa địa lan 286

12 Công nghệ bioreactor hoa lan hồ điệp 302

13 Công nghệ bioreactor hoa lan ngọc điểm 319

Chương V Công nghệ vườn ươm hiện đại 371

17 Công nghệ vườn ươm hoa hòang lan 373

19 Công nghệ vườn ươm hoa lan hồ điệp 391

20 Công nghệ vườn ươm hoa lan ngọc điểm 399

Chương VI Mô hình pilot sản xuất giống 420 Chương VII Chuyển giao công nghệ 428Kết luận 431 Chương I Thu thập giống

Chương II Công nghệ nuôi cấy lớp mỏng tế bào

Chương III Công nghệ phôi vô tính

Chương IV Công nghệ bioreactor

Chương V Công nghệ vườn ươm hiện đại

Chương VI Mô hình pilot sản xuất giống

Chương VII Chuyển giao công nghệ

Các kết quả đạt được 449Kiến nghị 453Tài liệu tham khảo 454

Trang 6

DANH MỤC CÁC BẢNG

Danh mục các bảng trang

Bảng 1.1: Ảnh hưởng của hypo-Na và HgCl 2 đến vô trùng mẫu nuôi cấy

Bảng 1.2: Ảnh hưởng của môi trường cơ bản đến khả năng nuôi cấy lát hoa

Bảng 1.3: Ảnh hưởng của khoáng đa lượng MS và BA đến khả năng nhân nhanh

chồi lát hoa

Bảng 1.4: Ảnh hưởng của BA đến nuôi cấy chồi non (cắt dọc thân)

Bảng 1.5: Ảnh hưởng của mẫu nuôi cấy và kiểu gen đến phát sinh chồi

Bảng 1.6: Nhân chồi in vitro

Bảng 1.7: Tạo rễ cây lát hoa in vitro

Bảng 1a1: Nội dung các bước, thời gian và môi trường nuôi cấy lớp mỏng tế bào

lát hoa

Bảng 1a2: Quy trình công nghệ nuôi cấy lớp mỏng tế bào cây lát hoa

1b Công nghệ lớp mỏng tế bào cây cà phê vối 136 Bảng 1.8: Ảnh hưởng của nồng độ Na-hypo và thời gian khử trùng đến khả năng

Bảng 1.11: Ảnh hưởng của BA đến phát sinh chồi lớp mỏng tế bào

Bảng 1.12: Ảnh hưởng của nước dừa (CW) đến khả năng sinh trưởng của cây

cà phê in vitro

Bảng 1.13: Ảnh hưởng của IBA đến quá trình phát sinh rễ cây cà phê in vitro

Bảng 1b1: Nội dung các bước, thời gian và môi trường nuôi cấy lớp mỏng tế bào

cà phê

Bảng 1b2: Quy trình công nghệ nuôi cấy lớp mỏng tế bào cây cà phê

2a Công nghệ lớp mỏng tế bào hoa hoàng lan 147 Bảng 2.1: Ảnh hưởng của mẫu đến nuôi cấy lớp mỏng tế bào

Bảng 2.2: Ảnh hưởng BA và 2iP đến sự hình thành chồi (mẫu vùng corm đỉnh

sinh trưởng)

Bảng 2.3: Ảnh hưởng BA và 2iP đến sự hình thành protocorm in vitro qua nuôi

cấy bẹ lá non

Bảng 2.4: Ảnh hưởng BA và IBA đến nhân protocorm của mẫu lớp mỏng tế bào

Bảng 2.5: Ảnh hưởng của IBA đến sự hình thành rễ (sau 30 ngày)

hoàng lan

Bảng 2a2: Công nghệ nuôi cấy lớp mỏng tế bào hoa hoàng lan

Bảng 2.6: Ảnh hưởng của mẫu nuôi cấy đến sự hình thành protocorm in vitro

Bảng 2.7: Ảnh hưởng của auxin đến sự hình thành protocorm in vitro với mẫu

nuôi cấy là vùng corm đỉnh sinh trưởng

Bảng 2.8: Ảnh hưởng của cytokinin đến sự hình thành protocorm in vitro với mẫu

Trang 7

nuôi cấy là vùng corm đỉnh sinh trưởng

Bảng 2.9: Ảnh hưởng của cytokinin đến sự hình thành protocorm in vitro với mẫu

nuôi cấy là bẹ lá non

Bảng 2.10: Ảnh hưởng của BA và NAA đến sự hình thành protocorm in vitro

Bảng 2.11: Ảnh hưởng của BA, NAA và rhizogen đến sự ra rễ chồi in vitro

Bảng 2b1: Nội dung các bước, thời gian và môi trường nuôi cấy lớp mỏng tế bào

địa lan

Bảng 2b2: Quy trình công nghệ nuôi cấy lớp mỏng tế bào hoa địa lan

3a Công nghệ lớp mỏng tế bào hoa lan hồ điệp 165 Bảng 3.1: Ảnh hưởng của mẫu nuôi cấy lớp mỏng tế bào đến tạo protocorm in

Bảng 3.3: Ảnh hưởng của BA và NAA đến nhân protocorm in vitro

Bảng 3.4: Ảnh hưởng của BA và NAA đến tái sinh protocorm in vitro

hồ điệp

Bảng 3a2: Quy trình công nghệ nuôi cấy lớp mỏng tế bào hoa lan hồ điệp

3b Công nghệ lớp mỏng tế bào hoa lan ngọc điểm 172 Bảng 3.5: Ảnh hưởng của mẫu nuôi cấy đến tái sinh lớp mỏng tế bào in vitro

Bảng 3.6: Ảnh hưởng của BA và 2iP đến tái sinh lớp mỏng tế bào vùng corm đỉnh

sinh trưởng in vitro

Bảng 3.7: Ảnh hưởng của BA và 2iP đến tái sinh lớp mỏng tế bào vùng bẹ lá non

in vitro

Bảng 3.8: Ảnh hưởng của BA và 2iP đến nhân chồi in vitro

Bảng 3b1: Nội dung các bước, thời gian và môi trường nuôi cấy lớp mỏng tế bào ngọc điểm

Bảng 3b2: Quy trình công nghệ nuôi cấy lớp mỏng tế bào hoa lan ngọc điểm

Bảng 4.1: Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến nuôi cấy bẹ lá non tạo

PLB

Bảng 4.2: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy và 2,4D đến tạo mô sẹo

Bảng 4.3: Ảnh hưởng của NAA và 2,4D đến tăng sinh mô sẹo

Bảng 4.4: Ảnh hưởng của NAA và BA đến tái sinh mô sẹo

Bảng 4.5: Ảnh hưởng của mẫu nuôi cấy đến tái sinh mô sẹo

Bảng 4.6: Ảnh hưởng của kiểu gen nuôi cấy đến tái sinh mô sẹo

Bảng 4.7: Ảnh hưởng của NAA và 2,4D đến tạo dịch huyền phù tế bào mô sẹo

Bảng 4.8: Ảnh hưởng của NAA và 2,4D đến tăng sinh dịch huyền phù tế bào mô

sẹo

Bảng 4.9: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy, mật độ tế bào đến kích thích tạo dịch

huyền phù phôi vô tính

Bảng 4.10: Ảnh hưởng của NAA, BA và TDZ đến tái sinh phôi vô tính

Bảng 4.11: Nội dung các bước, thời gian và môi trường nuôi cấy phôi vô tính hoa

hòang lan

Bảng 4.12: Quy trình công nghệ phôi vô tính hoa hòang lan

Trang 8

Bảng 5.1: Ảnh hưởng của TDZ và NAA đến tạo PLB

Bảng 5.2: Ảnh hưởng của 2,4D và NAA đến tạo mô sẹo

Bảng 5.3: Ảnh hưởng của 2,4D và NAA đến tăng sinh mô sẹo

Bảng 5.4: Ảnh hưởng của BA và NAA đến tái sinh mô sẹo

Bảng 5.5: Ảnh hưởng của nguồn gốc mô sẹo đến tái sinh mô sẹo

Bảng 5.6: Ảnh hưởng của kiểu gen đến tái sinh mô sẹo

Bảng 5.7: Ảnh hưởng của 2,4D và NAA đến tạo dịch huyền phù tế bào mô sẹo

Bảng 5.8: Ảnh hưởng của NAA đến tăng dịch huyền phù tế bào mô sẹo

Bảng 5.9: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến kích thích tạo dịch huyền phù

Bảng 5.12: Quy trình công nghệ phôi vô tính hoa địa lan

Bảng 6.1: Ảnh hưởng của TDZ và NAA đến tạo phôi PLB

Bảng 6.2: Ảnh hưởng của 2,4D và NAA đến tạo mô sẹo

Bảng 6.3: Ảnh hưởng của 2,4D và NAA đến tăng sinh mô sẹo

Bảng 6.4: Ảnh hưởng của môi trường, BA và NAA đến tái sinh mô sẹo

Bảng 6.5: Ảnh hưởng của nguồn gốc mô sẹo đến tái sinh mô sẹo

Bảng 6.8: Ảnh hưởng của NAA đến tăng sinh dịch huyền phù tế bào mô sẹo

Bảng 6.9: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến kích thích tạo dịch huyền phù

phôi vô tính

Bảng 6.10: Ảnh hưởng của BA và NAA đến tái sinh dịch huyền phù tế bào phôi

vô tính

Bảng 6.11:

Bảng 6.12: Quy trình công nghệ phôi vô tính hoa lan hồ điệp

7 Công nghệ phôi vô tính hoa lan ngọc điểm 222 Bảng 7.1: Ảnh hưởng của khoáng đa lượng đến tạo PLB

Bảng 7.2: Ảnh hưởng của TDZ và NAA đến tạo PLB

Bảng 7.3: Ảnh hưởng của IAA đến tạo mô sẹo

Bảng 7.4: Ảnh hưởng của IAA và kinetin đến tăng sinh mô sẹo

Bảng 7.5: Ảnh hưởng của NAA và BA đến tái sinh tế bào mô sẹo

Bảng 7.8: Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến tạo dịch huyền phù tế bào

Trang 9

Bảng 7.13: Quy trình công nghệ phôi vô tính hoa lan ngọc điểm

Bảng 8.1.1: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến tạo mô sẹo ở các mẫu nuôi cấy

Bảng 8.1.2: Ảnh hưởng của mẫu cấy và 2,4D đến tỷ lệ tạo mô sẹo

Bảng 8.2: Ảnh hưởng của môi trường, 2,4D và BA đến nhân sinh khối tế bào mô

sẹo trên môi trường bán rắn

Bảng 8.3: Ảnh hưởng môi trường, BA và kinetin đến tái sinh mô sẹo

Bảng 8.4 Ảnh hưởng của nguồn gốc mô sẹo đến tái sinh mô sẹo

Bảng 8.6: Ảnh hưởng của 2,4D và BA đến tăng sinh dịch huyền phù tế bào mô sẹo

Bảng 8.7: Ảnh hưởng của mật độ tế bào ban đầu đến tăng sinh dịch huyền phù tế

bào mô sẹo

Bảng 8.8: Ảnh hưởng của sucrose đến kích thích tạo phôi vô tính

Bảng 8.9: Ảnh hưởng của TDZ đến tạo phôi vô tính

Bảng 8.10: Ảnh hưởng của BA và kinetin đến tái sinh phôi vô tính (chưa qua nuôi

cấy kích thích tạo phôi vô tính)

Bảng 8.11: Ảnh hưởng của BA và kinetin đến tái sinh phôi vô tính

Bảng 8.12: Ảnh hưởng của IAA, kinetin và nước dừa đến nhân chồi lát hoa tái sinh từ

phôi vô tính

Bảng 8.13: Nội dung các bước, thời gian và môi trường nuôi cấy phôi vô tính lát

hoa

Bảng 8.14: Quy trình công nghệ phôi vô tính lát hoa

Bảng 9.1.1: Ảnh hưởng của môi trường khoáng cơ bản và các chất điều hòa sinh

trưởng đến tạo mô sẹo

trưởng đến tạo mô sẹo xốp vàng chanh

trưởng đến sinh trưởng mô sẹo xốp vàng chanh

Bảng 9.2: Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tăng sinh

mô sẹo xốp vàng chanh

Bảng 9.3: Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến tái sinh tế bào mô sẹo

Bảng 9.6: Ảnh hưởng của khối lượng tế bào mô sẹo đưa vào nuôi cấy ban đầu đến

tạo dịch huyền phù tế bào (sau 14 ngày nuôi cấy)

Bảng 9.7: Động thái sinh trưởng dịch huyền phù tế bào (sau 6 tuần nuôi cấy)

Bảng 9.8: Ảnh hưởng của các chất điều hoà sinh trưởng đến tăng sinh dịch huyền

phù tế bào mô sẹo (sau 14 ngày nuôi cấy)

Bảng 9.9: Ảnh hưởng của đường sucrose đến tăng sinh dịch huyền phù tế bào mô

sẹo (sau 14 ngày nuôi cấy)

Bảng 9.10: Ảnh hưởng của lần cấy truyền mô sẹo đến kích thích tạo phôi vô tính

Bảng 9.11: Ảnh hưởng của khối lượng tế bào nuôi cấy ban đầu đến kích thích tạo

phôi vô tính

Bảng 9.12: Ảnh hưởng của nồng độ đường sucrose kích thích tạo phôi vô tính

Bảng 9.13: Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến nuôi cấy kích thích tạo

phôi vô tính

Bảng 9.14: Ảnh hưởng của thời gian kích thích đến tái sinh dịch huyền phù tế bào

Trang 10

phôi vô tính

Bảng 9.15: Ảnh hưởng của thể tích trải tế bào đến tái sinh dịch huyền phù tế bào

phôi vô tính

Bảng 9.16: Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến tái sinh dịch huyền phù

tế bào phôi vô tính

Bảng 9.17: Nội dung các bước, thời gian và môi trường nuôi cấy phôi vô tính cà

phê vối

Bảng 9.18: Quy trình công nghệ phôi vô tính cây cà phê

Bảng 10.1: Ảnh hưởng BA và IBA đến nhân chồi và protocorm

Bảng 10.2: Ảnh hưởng BA và IBA đến nhân chồi và protocorm

Bảng 10.3: Chọn dòng mô sẹo sinh trưởng nhanh qua các chu kỳ nuôi cấy

trong bioreactor

Bảng 10.5: Ảnh hưởng của 2,4D và NAA đến tăng sinh dịch huyền phù tế bào mô

sẹo trong bioreactor

Bảng 10.6: Ảnh hưởng của ánh sáng đến tăng sinh dịch huyền phù tế bào mô sẹo

Bảng 10.9: Ảnh hưởng của NAA và BA đến kích thích tạo dịch huyền phù tế bào

phôi vô tính trong bioreactor

Bảng 10.10: Ảnh hưởng của NAA và BA đến tái sinh dịch huyền phù tế bào phôi

vô tính trong bioreactor

Bảng 10.11: Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng khoáng đến nhân nhanh

protocorm trên môi trường agar

Bảng 10.12: Ảnh hưởng của nhịp điệu nuôi cấy đến nhân protocorm và phát triển

chồi

Bảng 10.13: Nội dung các bước, thời gian và môi trường nuôi cấy nhân nhanh hoa

hoàng lan bằng công nghệ bioreactor

Bảng 10.14: Quy trình công nghệ bioreactor hoa hoàng lan

Bảng 11.1: Ảnh hưởng của BA và NAA đến tạo protocorm

Bảng 11.2: Ảnh hưởng của BA và NAA đến tạo protocorm

Bảng 11.4: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy và NAA đến tạo dịch huyền phù

tế bào mô sẹo trong bioreactor

Bảng 11.5: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy và NAA đến tăng sinh dịch huyền

phù tế bào mô sẹo trong bioreactor

Bảng 11.6: Ảnh hưởng của ánh sáng đến tăng sinh dịch huyền phù tế bào mô sẹo và

Trang 11

vô tính trong bioreactor

chồi

địa lan bằng công nghệ bioreactor

Bảng 11.14: Quy trình công nghệ bioreactor hoa địa lan

Bảng 12.1: Ảnh hưởng của BA và NAA đến nuôi cấy tạo protocorm

Bảng 12.2: Ảnh hưởng của BA và NAA đến nuôi cấy tạo protocorm

Bảng 12.4: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy và NAA đến tạo dịch huyền phù

tế bào mô sẹo trong bioreactor

Bảng 12.5: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy và NAA đến tăng sinh dịch huyền

phù tế bào mô sẹo trong bioreactor

vô tính

chồi

lan hồ điệp bằng công nghệ bioreactor

Bảng: Quy trình công nghệ bioreactor hoa lan hồ điệp

13 Công nghệ bioreactor hoa lan ngọc điểm 319 Bảng 13.1: Ảnh hưởng trạng thái nuôi cấy đến tạo protocorm

Bảng 13.3: Ảnh hưởng của NAA và 2,4D đến tạo dịch huyền phù tế bào mô sẹo

trong bioreactor

Bảng 13.4: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến tăng sinh dịch huyền phù tế

bào mô sẹo trong bioreactor

Trang 12

phôi soma trong bioreactor

soma trong bioreactor

chồi Ngọc điểm

lan ngọc điểm bằng công nghệ bioreactor

Bảng: Quy trình công nghệ bioreactor hoa lan ngọc điểm

14 Công nghệ bioreactor cây lát hoa 335

Bảng 14.2: Ảnh hưởng của BA và 2,4D đến tạo dịch huyền phù tế bào mô sẹo

phôi hóa trong bioreactor

Bảng 14.3: Ảnh hưởng của BA và 2,4D đến tăng sinh dịch huyền phù tế bào mô

sẹo trong bioreactor

Bảng 14.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tăng sinh dịch huyền phù tế bào mô sẹo

Bảng 14.6: Ảnh hưởng của tốc độ cánh khuấy đến tăng sinh dịch huyền phù tế bào

mô sẹo

Bảng 14.7: Ảnh hưởng của TDZ đến tạo phôi vô tính

Bảng 14.8: Ảnh hưởng của sucrose đến kích thích tạo phôi vô tính

Bảng 14.9 Ảnh hưởng của BA và KI đến tái sinh phôi vô tính (chưa qua nuôi cấy

kích thích tạo phôi)

Bảng 14.10 Ảnh hưởng BA và KI đến tái sinh phôi vô tính

Bảng 14.11: Ảnh hưởng của nhịp điệu nuôi cấy đến sinh trưởng và phát triển chồi

Bảng 14.12: Nội dung các bước, thời gian và môi trường nuôi cấy nhân nhanh lát

hoa bằng công nghệ bioreactor

Bảng 14.13: Quy trình công nghệ bioreactor cây lát hoa

Bảng 15.2: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy và 2,4D đến tạo dịch huyền phù tế

bào mô sẹo trong bioreactor

Bảng 15.3: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy và 2,4D đến tăng sinh dịch huyền

phù tế bao mô sẹo trong bioreactor

Bảng 15.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tăng sinh dịch huyền phù tế bào mô sẹo

Bảng 15.6: Ảnh hưởng của tốc độ cánh khuấy đến tăng sinh dịch huyền phù tế bào mô

sẹo

Bảng 15.7: Ảnh hưởng của KI, BA, 2iP đến kích thích tạo dịch huyền phù tế bào

Bảng 15.8: Ảnh hưởng của KI, BA, 2iP đến tái sinh dịch huyền phù phôi vô tính

trong bioreactor

Bảng 15.9: Ảnh hưởng của nhịp điệu nuôi cấy đến sinh trưởng và phát triển chồi

cà phê trong bioreactor bán chìm nổi

Bảng 15.10: Nội dung các bước, thời gian và môi trường nuôi cấy nhân nhanh cà

phê bằng công nghệ bioreactor

Trang 13

Bảng 15.11: Quy trình công nghệ bioreactor cây cà phê vối

Bảng 16.1: Chọn lựa công nghệ

Bảng 16.2: Ảnh hưởng của PPM đến quá trình chống nhiễm (Hoàng lan)

Bảng: Thuần hóa cây cấy mô (30 ngày)

Bảng 17.1: Ảnh hưởng của kích thước cây cấy mô đến sinh trưởng cây con in vivo

(giai đoạn 0-6 tháng)

Bảng 17.2: Ảnh hưởng của giá thể đến sinh trưởng cây con in vivo (giai đoạn

0-6tháng)

Bảng 17.3: Ảnh hưởng của dinh dưỡng hữu cơ (acid humic) đến sinh trưởng cây

con in vivo (giai đoạn 0-6tháng)

Bảng 17.4: Ảnh hưởng của dinh dưỡng khoáng vô cơ tổng hợp (N:P:K) đến sinh

trưởng và phát triển cây con in vivo (giai đoạn 0-6tháng)

Bảng 17.5: Ảnh hưởng của số lần phun dinh dưỡng khoáng vô cơ tổng hợp đến

sinh trưởng và phát triển cây con in vivo (giai đoạn 0-6tháng)

Bảng 17.6: Ảnh hưởng của dinh dưỡng hữu cơ đến sinh trưởng cây con in vivo

(giai đoạn 6-12tháng)

Bảng 17.7: Ảnh hưởng của dinh dưỡng khoáng vô cơ tổng hợp (N:P:K) và có bổ

sung acid humic đến sinh trưởng cây con in vivo (giai đoạn 6-12tháng)

Bảng 17.8: Ảnh hưởng của khoáng vô cơ tổng hợp đến sinh trưởng cây con in vivo (giai đoạn 12-18tháng)

Bảng 17.9: Ảnh hưởng của tỷ lệ chiếu sáng đến sinh trưởng cây con in vivo (giai

đoạn 0-6tháng)

Bảng 17.10: Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến sinh trưởng và phát

triển cây con in vivo (giai đoạn 0-6tháng)

đoạn 6-12tháng)

Bảng 17.12: Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến sinh trưởng cây con in vivo (giai đoạn 6-12tháng)

Bảng: Quy trình công nghệ vườn ươm hoa hoàng lan

Bảng 18.2: Ảnh hưởng của cơ chất (xơ dừa và dớn) đến sinh trưởng và phát triển

cây con in vivo (giai đoạn 0-6tháng)

Bảng 18.3: Ảnh hưởng của dinh dưỡng hữu cơ (acid humic) đến sinh trưởng cây

con in vivo (giai đoạn 0-6tháng)

trưởng và phát triển cây con in vivo (giai đoạn 0-6tháng)

Bảng 18.6: Anh hưởng của dinh dưỡng hữu cơ đến sinh trưởng cây con in vivo

Bảng 18.7: Ảnh hưởng của dinh dưỡng khoáng vô cơ tổng hợp (N:P:K) và có bổ

sung acid humic đến sinh trưởng cây con in vivo (giai đoạn 6-12tháng)

Bảng 18.8: Ảnh hưởng của khoáng vô cơ tổng hợp đến sinh trưởng cây con in vivo

Trang 14

Bảng: Quy trình công nghệ vườn ươm hoa địa lan

trưởng cây con in vivo (giai đoạn 0-6tháng)

Bảng 19.7: Ảnh hưởng của dinh dưỡng khoáng vô cơ tổng hợp và có bổ sung acid

humic đến sinh trưởng cây con in vivo (giai đoạn 6-12tháng)

Bảng 19.8: Ảnh hưởng của khoáng vô cơ tổng hợp đến sinh trưởng cây con in vivo (giai đoạn 12-18tháng)

Bảng: Quy trình công nghệ vườn ươm hoa lan hồ điệp

Bảng 20.1: Ảnh hưởng của kích thước cây cấy mô đến sinh trưởng và phát triển

0-6tháng)

Bảng 20.4: Ảnh hưởng của dinh dưỡng khoáng vô cơ tổng hợp đến sinh trưởng

Trang 15

Bảng 20.7: Ảnh hưởng của dinh dưỡng khoáng vô cơ tổng hợp và có bổ sung acid

humic đến sinh trưởng cây con in vivo (giai đoạn 6-12tháng)

Bảng 20.8: Ảnh hưởng của khoáng vô cơ tổng hợp đến sinh trưởng cây con in vivo

đoạn 0-6tháng)

Bảng 20.10: Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến sinh trưởng cây con in

vivo (giai đoạn 0-6tháng)

đoạn 6-12tháng)

Bảng: Quy trình công nghệ vườn ươm hoa lan ngọc điểm

21 Công nghệ vườn ươm cây lát hoa 408

Bảng 21.4: Ảnh hưởng của dinh dưỡng khoáng vô cơ tổng đến sinh trưởng cây con

in vivo (giai đoạn 0-6tháng)

sinh trưởng cây con in vivo (giai đoạn 0-6tháng)

đoạn 0-6tháng)

Bảng: Quy trình công nghệ vườn ươm cây lát hoa

0-6tháng)

Bảng 22.3: Ảnh hưởng của dinh dưỡng hữu cơ (acid humic) đến sinh trưởng và

phát triển cây con in vivo (giai đoạn 0-6tháng)

Bảng 22.4: Ảnh hưởng của dinh dưỡng khoáng vô cơ tổng hợp đến sinh trưởng

đoạn 0-6tháng)

Trang 16

Bảng: Quy trình công nghệ vườn ươm cây cà phê

Mô hình nhân giống hoa hoàng lan bằng công nghệ bioreactor

Mô hình nhân giống hoa địa lan bằng công nghệ bioreactor

Mô hình nhân giống hoa lan hồ điệp bằng công nghệ bioreactor

Mô hình nhân giống hoa lan ngọc điểm bằng công nghệ bioreactor

Mô hình nhân giống cây lát hoa bằng công nghệ bioreactor

Mô hình nhân giống cây cà phê vối bằng công nghệ bioreactor

Trang 17

DANH MỤC CÁC HÌNH

Danh mục trang Thu thập giống

Hình giống cà phê vối ( Coffea robusta) 117

Hình Lat 0 Mẫu nuôi cấy in vitro – Lát hoa 134

Hình Lat 1.1 Nuôi cấy mảnh lá non (lá chồi in vitro 20 ngày tuổi)

Hình Lat 1.2 Chồi tái sinh trực tiếp qua nuôi cấy mảnh lá non (sau 30 ngày nuôi

cấy)

Hình Lat 1.3 Nuôi cấy chồi đỉnh (dài 1cm) được cắt dọc thân thành hai mảnh

Hình Lat 1.4 Chồi tái sinh trực tiếp qua nuôi cấy mảnh thân cắt dọc (sau 30 ngày

nuôi cấy)

Hình Lat 2.1 Nuôi cấy lá tạo mô sẹo, có một số chồi tái sinh trực tiếp từ mô lá (sau

20 ngày nuôi cấy)

247 Hình Lat 2.2 Nuôi cấy truyền mô sẹo từ lá trong tối (sau 30 ngày nuôi cấy)

Hình Lát 2.3 Nuôi cấy thân tạo mô sẹo vàng ngà (trái) mô sẹo xuất hiện trên vết

cắt dọc thân (phải) (sau 20 ngày nuôi cấy)

Hình Lát 2.4 Cấy truyền mô sẹo vàng ngà từ thân trong tối (sau 30 ngày nuôi cấy)

Hình Lat 3.1 Nuôi cấy tạo dịch huyền phù tế bào mô sẹo (sau 30 ngày nuôi cấy)

Hình Lat 3.2 Trải dịch huyền phù tế bào mô sẹo (sau 4 ngày nuôi cấy)

Hình Lat 3.3 Tái sinh tế bào dịch huyền phù (sau 10 ngày nuôi cấy)

Hình Lat 3.4 Tế bào phân hóa phôi mầm (sau 15 ngày nuôi cấy)

Hình Lat 4.1 Sự phân hóa phôi mầm (sau 15 ngày nuôi cấy)

Hình Lat 4.2 Sự phân hóa chồi mầm (sau 20 ngày nuôi cấy)

Hình Lat 4.3 Sự tái sinh chồi (sau 20 ngày nuôi cấy)

Hình Lát 4.4 Sự tái sinh dịch huyền phù tế bào mô sẹo (sau 30 ngày nuôi cấy)

Hình Lat 4.5 Sự hình thành cụm chồi (sau 45 ngày nuôi cấy)

Hình 5.1 Động thái sinh trưởng dịch huền phụ trong bioreactor (sau 30 ngày nuôi

cấy)

345 Hình Lat 5.2 Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào trong bioreactyor (sau 20 ngày nuôi

cấy)

Hình Lat 5.3 Trải dịch huyền phù tế bào (sau 10 ngày nuôi cấy)

Hình Lat 5.4 Tái sinh tế bào dịch huyền phù (sau 20 ngày nuôi cấy

Hình Lat 6.1 Các hình dạng khác nhau của tế bào dịch huyền phù chủ yếu là hình

que (sau 4 ngày nuôi cấy)

Hình Lat 6.2 Tế bào dịch huyền phù phân chia (sau 7 ngày nuôi cấy)

Hình Lat 6.3 Tế bào dịch huyền phù phân chia và kết cụm (sau 15 ngày nuôi cấy)

Hình Lat 6.4 Tế bào dịch huyền phù hình ovan tách rời và phân chia (sau 10 ngày

Trang 18

nuôi cấy)

Hình Lat 7.1 Cụm tế bào dịch huyền phù phân chia tăng sinh khối, tế bào chuyển

dạng hình cầu (sau 14 ngày nuôi cấy)

Hình Lat 7.2 Cụm tế bào bắt đầu đi vào giai đoạn phân hóa cơ quan, sự phân hóa

xuất phát từ những tế bào bên ngoài có màu trắng (sau 15 ngày nuôi cấy)

Hình Lat 7.3 Cụm tế bào dịch huyền phù phân hóa phôi cầu có màu xanh (sau 10

ngày nuôi cấy)

Hình Lat 7.4 Tế bào phôi cầu phân hóa phôi mầm (sau 15 ngày nuôi cấy)

Hình Lat 8.1 Tế bào phôi cầu phân hóa phôi mầm (sau 20 ngày nuôi cấy)

Hình Lat 8.2 Tế bào dịch huyền phù phân hóa phôi mầm (sau 20 ngày nuôi cấy)

Hình Lat 8.3 Tế bào dịch huyền phù phân hóa chồi mầm (sau 25 ngày nuôi cấy)

Hình Lat 8.4 Tế bào dịch huyền phù phân hóa chồi mầm (sau 30 ngày nuôi cấy)

Hình Lat 9.1 Tái sinh tế bào dịch huyền phù (sau 15 ngày nuôi cấy)

Hình Lat 9.2 Tái sinh tế bào dịch huyền phù (sau 30 ngày nuôi cấy

Hình Lat 9.3 Nuôi cấy tăng cường sinh trưởng trong bioreactor bán chìm/nổi (1

phút / 4 giờ) (sau 30 ngày nuôi cấy)

Hình Lat 9.4 Lát hoa sinh trưởng nhanh trong bioreactor bán chìm nổi

Hình Lat 10.1 Nuôi cấy tăng cường sinh trưởng trong bioreactor bán chìm nổi (sau

Hình Lat 10.2 Lát hoa trong giai đoạn thuần hóa

Hình Lat 10.3 Lát hoa trên khay sau giai đọan thuần hóa (2 tháng tuổi)

Hình Lat 10.4 Cây lát hoa 8 tháng tuổi (trái) 2 năm tuổi (phải)

Cây Cà phê

Hình Caf 0 Mẫu nuôi cấy in vitro – Cà phê 145 Hình Caf 1.1 Nuôi cấy chồi đỉnh cà phê

Hình Caf 1.2 Nuôi cấy mẫu lá non (0,5cm2)

Hình Caf 1.3 Phôi cà phê xuất hiện trên vết cắt mô lá (sau 30 ngày)

Hình Caf 1.4 Chồi cà phê tái sinh trực tiếp từ mô lá (sau 45 ngày nuôi cấy

Hình Caf 1.5 Chồi cà phê tái sinh từ mẫu chồi đỉnh (sau 45 ngày nuôi cấy)

Hình Caf 2.1 Nguyên liệu được nhân giống in vitro Lá được sử dụng trong nuôi

Hình Caf 2.2 Mô sẹo hình thành trên vết cắt mô lá (0,5cm2)

Hình Caf 2.3 Mô sẹo vàng chanh hình thành trên vết cắt mô lá (sau 45 ngày nuôi

cấy)

Hình Caf 2.4 Mô sẹo vàng chanh chọn dòng và cấy truyền (sau 45 ngày nuôi cấy)

Hình Caf 3.1 Mô sẹo vàng chanh hình thành trên vết cắt (sau 10 ngày nuôi cấy)

Hình Caf 3.2 Mô sẹo vàng chanh hình thành trên vết cắt (sau 20 ngày nuôi cấy)

Hình Caf 3.3 Cấy truyền mô sẹo vàng chanh (sau 20 ngày nuôi cấy)

Hình Caf 3.4 Cấy truyền mô sẹo vàng chanh, tế bào có cấu trúc khối tròn giống

phôi (sau 45 ngày nuôi cấy)

Hình Caf 4.1 Nuôi cấy tạo dịch huyền phù tế bào mô sẹo (sau 30 ngày nuôi cấy)

Hình Caf 4.2 Nuôi cấy tăng sinh dịch huyền phù tế bào mô sẹo (sau 30 ngày nuôi

cấy)

Hình Caf 4.3 Nuôi cấy tăng sinh dịch huyền phù tế bào mô sẹo, tế bào kết cụm

thành khối nhỏ tròn giống phôi (sau 45 ngày nuôi cấy)

Hình Caf 4.4 Trải dịch huyền phù tế bào mô sẹo (sau 20 ngày nuôi cấy)

Hình Caf 5.1 Tế bào phôi khối tròn kéo dài ra hai phía (trái) và phân thành lưỡng

Trang 19

cực (phải) (sau 20 ngày nuôi cấy)

Hình Caf 5.2 Xuất hiện thể phôi thủy lôi (sau 25 ngày nuôi cấy)

Hình Caf 5.3 Xuất hiện thể phôi thủy lôi cao nhất sau 30 ngày nuôi cấy (hiệu suất

kích thích phôi đạt 75%)

Hình Caf 5.4 Xuất hiện thể phôi mầm (sau 45 ngày nuôi cấy)

Hình Caf 5.5 Xuất hiện lá tiền sinh và phân hóa rễ (sau 50 ngày nuôi cấy)

Hình Caf 6.1 Tái sinh dịch huyền phù tế bào (sau 20 ngày nuôi cấy)

Hình Caf 6.5 Chồi cà phê hình thành rễ trụ (sau 30 ngày nuôi cấy)

Hình Caf 7.1 Động thái sinh trưởng dịch huyền phù tế bào cà phê trong bioreactor 362 Hình Caf 7.2 Dịch huyền phù tế bào cà phê được nuôi cấy trong bioreactor, dịch tế

bào đậm đặc (sau 20 ngày nuôi cấy)

Hình Caf 7.3 Tế bào dịch huyền phù nuôi cấy trong bioreactor có hình dạng que

dài, chiều dài có thể khác nhau (sau 4 ngày nuôi cấy)

Hình Caf 7.4 Tế bào dịch huyền phù bắt đầu đi vào giai đoạn phân chia (sau 5

ngày nuôi cấy)

Hình Caf 8.1 Tế bào đơn (hình que) trong bioreactor đi vào phân chia, hình thành

tế bào tiền phôi (sau 10 ngày)

Hình Caf 8.2 Cụm tế bào que phân chia, quá trình phân chia bắt đầu từ một phía tế

bào hình thành tế bào tiền phôi, sau đó phân chia phần còn lại, tế bào tiền phôi kết

cụm nhau ở giữa (sau 10 ngày nuôi cấy)

Hình Caf 8.3 Tế bào phôi thứ cấp (tiền phôi) phân chia và tách rời, phôi là một

đơn vị nhân giống (sau 10 ngày nuôi cấy)

Hình Caf 8.4 Tế bào tiền phôi phân chia liên tục tăng sinh khối, có dạng hình cầu,

kích thước đều nhau và đồng dạng (sau 20 ngày nuôi cấy)

Hình Caf 9.1 Trải dịch huyền phù tế bào trên môi trường bán rắn, có một số ít phôi

đã phân hóa chồi (sau 7 ngày nuôi cấy)

Hình Caf 9.2 Khối tế phôi bào liên kết nhau, tiếp tục phân chia, kéo dài, phân

thành lưỡng cực (sau 10 ngày nuôi cấy)

Hình Caf 9.3 Khối tế bào phôi đi vào quá trình phân hóa (sau 15 ngày nuôi cấy)

Hình Caf 9.4 Tế bào đơn phôi phân hóa thành phôi cầu, phôi tim, có cấu trúc chặt,

có màu xanh (sau 15 ngày nuôi cấy)

Hình Caf 9.5 Tế bào phôi đi vào phân hóa phôi thủy lôi (sau 20 ngày nuôi cấy)

Hình Caf 10.1 Tế bào phôi phân hóa mầm, một đầu xanh phân hóa mầm, một đầu

trắng phân hóa rễ (sau 20 ngày nuôi cấy)

Hình Caf 10.2 Phôi mầm xuất hiện (trái) với lá tiền sinh (phải) (sau 25 ngày nuôi

cấy)

Hình Caf 10.3 Các dạng phôi mầm hình thành lưỡng cực (sau 30 ngày nuôi cấy)

Hình Caf 10.4 Phôi được tái sinh hoàn chỉnh, lưỡng cực, có lá tiền sinh, và phân

hóa rễ (sau 45 ngày nuôi cấy)

Hình Caf 11.1 Tái sinh tế bào dịch huyền phù (sau 25 ngày nuôi cấy)

Hình Caf 11.3 Cây cà phê hoàn chỉnh chuẩn bị chuyển ra vườn thuần hóa (sau 60

ngày nuôi cấy)

Hình Caf 11.4 Nuôi cấy tăng cường sinh trưởng trong bioreactor bán chìm nổi

Hình Caf 11.5 Sinh trưởng cà phê mầm (sau 40 ngày nuôi cấy)

Trang 20

Hình Caf 12.1 Sinh trưởng cây cà phê trên khay (3 tháng tuổi) 419 Hình Caf 12.2 Sinh trưởng cây cá phê 8 tháng tuổi

Hoa Hoàng lan

Hình Den 0: Mẫu nuôi cấy in vitro – Hoàng lan 153 Hình Den 1.1 Nuôi cấy bẹ lá non tạo PLB

Hìnhh Den 1.2 Nuôi cấy bẹ lá non tạo PLB (sau 45 ngày nuôi cấy)

Hình Den 1.3 Nuôi cấy corm đỉnh sinh trưởng tạo PLB

Hình Den 1.4 Nuôi cấy corm đỉnh sinh trưởng tạo PLB (sau 45 ngày nuôi cấy)

Hình Den 1.5 Nuôi cấy lát mỏng PLB tạo PLB trên mặt cắt (sau 20 ngày nuôi cấy)

Hình Den 1.6 Nuôi cấy PLB lát mỏng tạo PLB (sau 45 ngày nuôi cấy)

Hình Den 2.1 Nuôi cấy bẹ lá non tạo mô sẹo (sau 30 ngày nuôi cấy) 191 Hình Den 2.2 Nuôi cấy PLB lát mỏng tạo mô sẹo (sau 30 ngày nuôi cấy)

Hình Den 2.3 Nuôi cấy corm đỉnh sinh trưởng tạo mô sẹo (sau 30 ngày nuôi cấy)

Hình Den 2.4 Nhân sinh khối mô sẹo (sau 30 ngày nuôi cấy)

Hình Den 3.1 Nuôi cấy tạo và tăng sinh dịch huyền phù tế bào mô sẹo

Hình Den 3.2 Trải và tái sinh tế bào dịch huyền phù (sau 20 ngày nuôi cấy)

Hình Den 3.3 Tế bào dịch huyền phù phân hóa hình thành phôi cầu có màu xanh

(sau 10 ngày nuôi cấy)

Hình Den 3.4 Tế bào dịch huyền phù phân hóa tạo phôi PLB (sau 20 ngày nuôi

Hình Den 4.3 Tế bào dịch huyền phù có dạng hình que dài (trái) hay ovan (phải)

Hình Den 4.4 Tế bào dịch huyền phù hình que và ovan đang phân chia tăng sinh

khối theo hướng dồn về phía trung tâm tạo thành cụm tế bào (sau 20 ngày nuôi

cấy)

Hình Den 5.1 Tế bào dịch huyền phù phân hóa tạo phôi PLB từ cụm tế bào (sau 15

ngày nuôi cấy)

Hình Den 5.2 Tế bào dịch huyền phù phân hóa phôi mầm từ cụm tế bào (sau 20

ngày nuôi cấy)

Hình Den 5.3 Tế bào dịch huyền phù phân hóa mầm chồi từ PLB (sau 25 ngày

nuôi cấy)

Hình Den 5.4 Tế bào dịch huyền phù tái sinh tạo phôi mầm và phôi PLB (sau 30

ngày nuôi cấy)

Hình Den 6.1 Nuôi cấy tăng cường sinh trưởng trong bioreactor bán chìm nổi

Hình Den 6.2 Nuôi cấy tăng cường sinh trưởng chồi (1-2cm) trong bioreactor bán

chìm nổi (sau 10 ngày nuôi cấy)

Hình Den 7.1 Cây cấy mô từ phôi hoa hòang lan (1 tháng tuổi) 381 Hình Den 7.2 Cây cấy mô từ phôi hoa hòang lan (20 tháng tuổi)

Trang 21

Hoa Địa lan

Hình Cym 0: Mẫu nuôi cấy in vitro – Địa lan 162 Hình Cym 1.1 Nuôi cấy vùng corm đỉnh sinh trưởng

Hình Cym 1.2 Nuôi cấy vùng corm đỉnh sinh trưởng tạo PLB (sau 30 ngày nuôi

cấy)

Hình Cym 1.3 Nuôi cấy bẹ lá non (0,5cm2)

Hình Cym 1.4 Nuôi cấy bẹ lá non tạo PLB (sau 30 ngày nuôi cấy)

Hình Cym 1.5 Nuôi cấy PLB lát mỏng (dày 1mm)

Hình Cym 1.6 Nuôi cấy PLB lát mỏng (dày 1mm) tạo PLB (sau 30 ngày nuôi cấy)

Hình Cym 2.1 Nuôi cấy PLB lát mỏng tạo mô sẹo (trái), mô sẹo hình thành trên

mặt cắt dọc PLB (phải) (sau 15 ngày nuôi cấy) 205Hình Cym 2.2 Mô sẹo hình thành đi đôi với tái sinh chồi (sau 30 ngày nuôi cấy)

Hình Cym 2.3 Do hiệu suất tạo mô sẹo thấp, sau khi mô sẹo hình thành trên mặt

cắt PLB lát mỏng, PLB lát mỏng được nuôi cấy trong lỏng để tạo dịch tế bào mô

sẹo (sau 15 ngày nuôi cấy, lắc 100rpm)

Hình Cym 2.4 Dịch huyền phù tế bào mô sẹo được trải trên môi trường bán rắn tạo

mô sẹo (sau 20 ngày nuôi cấy)

Hình Cym 3.1 Nuôi cấy tăng sinh dịch huyền phù tế bào (sau 30 ngày nuôi cấy)

Hình Cym 3.2 Trải và tái sinh tế bào dịch huyền phù (sau 20 ngày nuôi cấy)

Hình Cym 3.3 Tế bào dịch huyền phù phân hóa thể phôi cầu, có màu xanh (sau 10

ngày nuôi cấy)

Hình Cym 3.3 Tế bào dịch huyền phù phân hóa PLB và phôi mầm (sau 10 ngày

nuôi cấy)

Hình Cym 3.4 Tế bào dịch huyền phù phân hóa mầm chồi với lá tiền sinh (sau 30

ngày nuôi cấy)

Hình Cym 4.1 Động thái sinh trưởng dịch huyền phù tế bào trong bioreactor (sau

297 Hình Cym 4.2 Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào trong bioreactor (sau 30 ngày nuôi

cấy)

Hình Cym 4.3 Các hình dạng tế bào dịch huyền phù, hình que dài (trái) hình ovan

(phải) (sau 5 ngày nuôi cấy)

Hình Cym 5.1 Tế bào hình que phân chia (sau 10 ngày nuôi cấy)

Hình Cym 5.2 Tế bào hình ovan phân chia (sau 10 ngày nuôi cấy)

Hình Cym 5.3 Tế bào dịch huyền phù tiếp tục phân chia hướng tâm và liên kết

nhau tạo thành cụm tế bào (sau 20 ngày nuôi cấy)

Hình Cym 5.4 Khối tế bào cuộn tròn nhau thành hình cầu do ảnh hưởng của cánh

khuấy bioreactor (sau 30 ngày nuôi cấy)

Hình Cym 6.1 Khối tế bào trong dịch huyền phù phân hóa tạo thành phôi cầu có

màu xanh (sau 10 ngày nuôi cấy)

Hình Cym 6.2 Tế bào dịch huyền phù phân hóa tạo thành phôi PLB (sau 20 ngày

nuôi cấy)

Hình Cym 6.3 Tế bào dịch huyền phù phân hóa tạo thành phôi mầm từ PLB (sau

Hình Cym 6.4 Tế bào dịch huyền phù phân hóa mầm chồi có lá tiền sinh (sau 30

ngày nuôi cấy)

Hình Cym 7.1 Tế bào dịch huyền phù trải và tái sinh (sau 45 ngày nuôi cấy)

Hình Cym 7.2 Tế bào dịch huyền phù tái sinh (sau 60 ngày nuôi cấy)

Hình Cym 7.3 Nuôi cấy tăng cường sinh trưởng trong bioreactor bán chìm nổi (sau

Trang 22

Hình Cym 7.4 Nuôi cấy trong bioreactor bán chìm nổi, chồi (1-2cm) (trái) và 45

ngày sau cấy (phải)

Hình Cym 8.1 Sinh trưởng trên vườn ươm (4 tháng tuổi) 380 Hình Cym 8.2 Sinh trưởng trên vườn ươm (8 tháng tuổi)

Hoa lan Hồ điệp

Hình Pha 0: Mẫu nuôi cấy in vitro – Hồ điệp 170 Hình Pha 1.1 Nuôi cấy corm đỉnh sinh trưởng tạo PLB (sau 30 ngày nuôi cấy)

Hình Pha 1.2 Nuôi cấy bẹ lá non tạo PLB (sau 30 ngày nuôi cấy)

Hình Pha 1.3 PLB được cắt lát mỏng và nuôi cấy trên môi trường bán rắn nhân

sinh khối

Hình Pha 1.4 PLB hình thành sau 30 ngày nuôi cấy, PLB được sử dụng làm

nguyên liệu cho nuôi cấy tạo tế bào soma

Hình Pha 2.1 Nuôi cấy bẹ lá non tạo tế bào mô sẹo (sau 30 ngày nuôi cấy) 218 Hình Pha 2.2 Nhân sinh khối tế bào mô sẹo (sau 30 ngày nuôi cấy)

Hình Pha 2.3 Nuôi cấy PLB lát mỏng tạo tế bào mô sẹo (sau 30 ngày nuôi cấy)

Hình Pha 2.4 Nhân sinh khối mô sẹo qua nuôi cấy PLB lát mỏng (sau 30 ngày

nuôi cấy)

Hình Pha 3.1 Nuôi cấy mô sẹo tạo dịch huyền phù tế bào (sau 14 ngày nuôi cấy)

Hình Pha 3.2 Nhân sinh khối dịch huyền phù tế bào sau khi lọc (sau 14 ngày nuôi

cấy)

Hình Pha 3.3 Trải dịch huyền phù tế bào mô sẹo (sau 20 ngày nuôi cấy)

Hình Pha 3.3 Tế bào dịch huyền phù mô sẹo phân hóa tái sinh (sau 30 ngày nuôi

cấy)

Hình Pha 4.1 Tế bào dịch huyền phù tái tạo mô sẹo trên agar (sau 10 ngày nuôi

cấy)

Hình Pha 4.2 Tế bào dịch huyền phù phân hóa phôi cầu xuất hiện màu xanh (sau

Hình Pha 4.3 Tế bào dịch huyền phù phân hóa phôi PLB (sau 20 ngày nuôi cấy)

Hình Pha 4.4 PLB phân hóa chồi mầm (sau 40 ngày nuôi cấy)

Hình Pha 5.1 Động thái sinh trưởng dịch huyền phù tế bào trong bioreactor (sau 30

ngày nuôi cấy)

313 Hình Pha 5.2 Nhân sinh khối dịch huyền phù tế bào mô sẹo trong bioreactor (sau

Hình Pha 5.3 Tế bào dịch huyền phù có dạng hình ovan và hình que ngắn (sau 4

ngày nuôi cấy)

Hình Pha 5.4 Tế bào hình que ngắn (trái) và hình ovan (phải) bắt đầu phân chia

Hình Pha 6.1 Tế bào hình que (trái) và hình ovan (phải) phân chia tăng sinh khối

hướng về phía trung tâm tạo thành khối tế bào (sau 20 ngày nuôi cấy)

Hình Pha 6.2 Tế bào dịch huyền phù được trải và tái sinh (sau 20 ngày nuôi cấy)

Hình Pha 6.3 Tế bào dịch huyền phù phân hóa tạo thành những khối tròn thể phôi

PLB, có màu xanh (sau 10 ngày nuôi cấy)

Hình Pha 6.4 Tế bào dịch huyền phù phân hóa kéo dài thể phôi (sau 15 ngày nuôi

cấy)

Hình Pha 7.1 Tế bào dịch huyền phù phân hóa phôi PLB (sau 30 ngày nuôi cấy)

Hình Pha 7.2 Tế bào dịch huyền phù tái sinh từ PLB (sau 30 ngày nuôi cấy)

Trang 23

Hình Pha 7.3 Tế bào dịch huyền phù tái sinh mầm chồi (sau 45 ngày nuôi cấy)

Hình Pha 7.4 Tế bào dịch huyền phù tái sinh chồi (sau 60 ngày nuôi cấy)

Hình Pha 8.1 Nuôi cấy tăng cường sinh trưởng trong bioreactor bán chìm/nổi (1

Hoa lan Ngọc điểm

Hình Pha 0: Mẫu nuôi cấy in vitro – Hồ điệp 177 Hình Rhy 1.1 Nuôi cấy bẹ lá non

Hình Rhy 1.2 Nuôi cấy bẹ lá non tạo PLB (sau 45 ngày nuôi cấy)

Hình Rhy 1.3 Nuôi cấy PLB lát mỏng

Hình Rhy 1.4 Nuôi cấy PLB lát mỏng tạo PLB, một phần nhỏ tạo mô sẹo (sau 45

ngày nuôi cấy)

Hình Rhy 2.1 Nuôi cấy bẹ lá non tạo mô sẹo (sau 30 ngày nuôi cấy) 230 Hình Rhy 2.2 Nuôi cấy PLB lát mỏng tạo mô sẹo, một phần tế bào mô sẹo tái sinh

chồi (sau 30 ngày nuôi cấy)

Hình Rhy 2.3 Nuôi cây corm đỉnh sinh trưởng tạo mô sẹo (sau 30 ngày nuôi cấy)

Hình Rhy 2.4 Nuôi cấy nhân sinh khối mô sẹo (sau 30 ngày nuôi cấy)

Hình Rhy 3.1 Nuôi cấy tạo và tăng sinh dịch huyền phù tế bào (sau 30 ngày nuôi

cấy)

Hình Rhy 3.2 Trải và tái sinh tế bào dịch huyền phù (sau 15 ngày nuôi cấy)

Hình Rhy 3.3 Tế bào dịch huyền phù phân chia và liên kết nhau tạo thành cụm tế

bào (sau 7 ngày nuôi cấy)

Hình Rhy 3.4 Tế bào dịch huyền phù phân hóa phôi PLB hình cầu có màu xanh

Hình Rhy 4.1 Tế bào dịch huyền phù phân hóa phôi PLB (sau 20 ngày nuôi cấy)

Hình Rhy 4.2 Tế bào dịch huyền phù phân hóa phôi mầm (sau 25 ngày nuôi cấy)

Hình Rhy 4.3 Tế bào dịch huyền phù phân hóa chồi, xuất hiện lá tiền sinh (sau 30

ngày nuôi cấy)

Hình Rhy 4.4 Tế bào dịch huyền phù phân hóa chồi, xuất hiện lá tiền sinh (sau 45

ngày nuôi cấy)

Hình Rhy 5.1 Động thái sinh trưởng dịch huyền phù tế bào trong bioreactor 329 Hình Rhy 5.2 Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào trong bioreactor (sau 30 ngày nuôi

cấy)

Hình Rhy 5.3 Các hình dạng tế bào dịch huyền phù: hình que (trái) hình ovan

(phải) (sau 5 ngày nuôi cấy)

Hình Rhy 5.4 Tế bào hình que (trái) và ovan (phải) phân chia (sau 10 ngày nuôi

cấy)

Hình Rhy 6.1 Tế bào dịch huyền phù phân chia tăng sinh khối liên kết hướng tâm

Hình Rhy 6.2 Tế bào dịch huyền phù được trải và tái sinh (sau 15 ngày nuôi cấy)

Trang 24

Hình Rhy 6.3 Tế bào dịch huyền phù phân hóa phôi PLB (sau 30 ngày nuôi cấy)

Hình Rhy 6.4 Tế bào dịch huyền phù phân hóa chồi với lá tiền sinh (sau 45 ngày

nuôi cấy)

Hình Rhy 7.1 Tái sinh chồi từ dịch huyền phù tế bào (sau 45 ngày nuôi cấy)

Hình Rhy 7.2 Nuôi cấy tăng cường sinh trưởng trong bioreactor bán chìm nổi

Hình Rhy 7.3 Nuôi cấy tăng cường sinh trưởng chồi (1-2cm) trong bioreactor bán

Hình Rhy 9H1.1 Hoa lan Đài châu (tím trắng) (trái) và Quả (phải) Được sử dụng

Hình Rhy 9H1.2 Nuôi cấy hạt trong bioreactor (sau 10 ngày nuôi cấy) ở nhiệt độ

Hình Rhy 9H2.1 Hạt phân hóa thành phôi PLB sau 15 ngày nuôi cấy (trái) và phôi

mầm (phải) sau 25 ngày nuôi cấy (tốc độ thổi khí 0,5 lít/phút)

Hình Rhy 9H2.2 Phôi mầm được cấy chuyển qua môi trường bán rắn sau 45 ngày

nuôi cấy trong bioreactor

Hình Rhy 9H2.3 Chồi được chăm sóc thuần hóa (sau 4 tháng nuôi cấy)

Hình Rhy 9H2.3 Chồi ngọc điểm trên vườn ươm (sau 2 năm)

Hình Rhy 8.1 Sinh trưởng trên vườn ươm (1 tháng tuổi) 407 Hình Rhy 8.2 Sinh trưởng trên vườn ươm (12 tháng tuổi)

Trang 25

Công nghệ sinh học được coi là phương tiện duy nhất để giải quyết các vấn đề khó khăn mà công tác chọn tạo giống cổ truyền không thể thực hiện được, công nghệ sinh học góp phần làm tăng năng suất và nâng cao chất lượng cây trồng Có thể nói, trong việc chọn giống và nhân giống cây trồng, thành tựu của công nghệ sinh học trong những năm qua là đã tạo ra những thay đổi kỳ diệu trong sản xuất nông nghiệp Ngày càng có nhiều quốc gia coi công nghệ sinh học là mũi nhọn được ưu tiên hàng đầu trong chiến lược phát triển kinh tế xã hội của mình

Nhân giống cây trồng bằng kỹ thuật nuôi cấy mô đã trở thành một trong những phương thức quan trọng nhất để nhân nhanh đặc biệt đối với những cây trồng khó tái sinh bằng phương thức truyền thồng Tốc độ phát triển của công nghệ cấy mô đã được thúc đẩy không ngừng nhờ thương mại hóa Hiện nay, công nghệ vi nhân giống đang được ứng dụng rộng rãi nhất là trên các đối tượng hoa cây cảnh, cùng nhiều lòai cây nông nghiệp, lâm nghiệp và dược liệu khác Hệ thống vi nhân giống đã được xây dựng thành công ở những lòai cây thực phẩm, cây công nghiệp, cây ăn quả Sự tòan cầu hóa của công nghiệp vi nhân giống đã diễn ra tích cực trong thập niên 80 thế kỷ XX Sự mở rộng công nghiệp vi nhân giống không chỉ góp phần tăng năng suất cây trồng

mà còn thúc đẩy công nghệ hóa các mặt hàng nông nghiệp

Trang 26

Công nghệ vi nhân giống dựa vào công nghệ nền của công nghệ lớp mỏng tế bào, công nghệ phôi vô tính và công nghệ bioreactor

Kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào đã được Trần Thanh Vân và cs phát triển từ những năm 70, được công bố trên tạp chí Nature 1973, và được xem như là một kỹ thuật để tái sinh các lòai cây trồng khó tái sinh và nhân nhanh một số lòai hoa như lily Đây là kỹ thuật tạo cơ quan bất định có liên quan đến tính cảm ứng và tái sinh ở thực vật

Hơn 200 lòai cây trồng đã được nhân giống bằng phôi vô tính Phôi vô

tính được tái sinh từ các tế bào mô sẹo phân hóa in vitro Phôi vô tính có hệ số nhân giống cao Các mô và tế bào sinh dưỡng nuôi cấy in vitro có thể tạo ra

phôi vô tính một cách trực tiếp hoặc thông qua giai đọan trung gian là mô sẹo

Tế bào mô sẹo có thể phân chia theo cấp số nhân và khi phân hóa thành phôi

vô tính sẽ tạo ra số lượng phôi vô tính khổng lồ trong một thời gian ngắn Với cây cà phê, người ta có thể sản xuất 600.000 phôi vô tính từ 1g sinh khối ban đầu trong vài tháng Phôi vô tính có thể nẩy mầm trực tiếp thành cây do phôi

vô tính chứa một lượng chất dinh dưỡng tương tự với phôi nội nhũ Phôi vô tính là một đơn vị nhân giống, có khả năng công nghiệp hóa và tự động hóa quá trình nhân giống quy mô lớn, đặc biệt là nhân giống bằng bioreactor

Công nghệ bioreactor đã được ứng dụng trong sản xuất tế bào quy mô lớn để chiết rút được các chất chống ung thư Các bioreactor quy mô trên 20.000 lít đã được sử dụng trong sản xuất công nghiệp Takayama và Misawa

là những người đầu tiên công bố việc sử dụng bioreactor vào nhân giống thực vật Kỹ thuật này sau đó đã được áp dụng vào các lòai hoa cảnh, khoai tây, cà phê trong các bioreactor có dung tích 1-2000 lít Bioreactor đã được sử dụng

để nhân nhanh phôi vô tính trên quy mô thương mại trên nhiều lòai cây trồng nông nghiệp, đã tạo ra sự thay đổi lớn phát triển nền hàng hóa nông nghiệp hiện đại

Trang 27

Nghiên cứu và phát triển công nghệ lớp mỏng tế bào, công nghệ phôi

vô tính và công nghệ bioreactor trên các lòai cây trồng kinh tế như hoa lan, cây cà phê và cây lát hoa; thì trong một thời gian ngắn ta có thể chủ động thay thế cơ cấu giống hiện nay bằng những giống cây trồng mới có năng suất và chất lượng cao Làm chủ được công nghệ nền của công nghệ vi nhân giống là từng bước đi đến sản xuất giống trên quy mô công nghiệp, phát triển nền sản xuất nông nghiệp bền vững và tạo ra một thị trường hàng hóa có hiệu suất lợi nhuận cao

Trang 28

TÓM TẮT

Chương I Thu thập giống

Du nhập các giống hoa lan có triển vọng cắt cành phục vụ trong nước (5 giống hoàng lan), đang được các nước trong khu vực xuất khẩu (5 giống hồ điệp, 4 giống ngọc điểm), các dòng lai mới có hương thơm (4 giống địa lan)

Chương II Công nghệ lớp mỏng tế bào:

Mẫu nuôi cấy: với bẹ lá non in vitro 0,5cm), corm chồi đỉnh in vitro 0,3cm)

(0,1 Hòang lan: Môi trường nuôi cấy phát sinh chồi: MS + Adenine (10mg/l) +

2iP (1mg/l) + IBA (0,1mg/l) Phát sinh 6-8 chồi/mẫu corm đỉnh sinh trưởng

và 4-6 PLB/mẫu bẹ lá non

- Địa lan: Môi trường nuôi cấy phát sinh PLB và chồi: MS + peptone (1g/l) +

BA (1mg/l) + NAA (0,5mg/l) Phát sinh 4-6 PLB/mẫu corm đỉnh sinh trưởng

và 3-5 PLB/mẫu bẹ lá non

- Hồ điệp: Môi trường nuôi cấy phát sinh PLB: MS + peptone (1g/l) + BA

(1mg/l) + NAA (0,1mg/l) Phát sinh 11,8 PLB/mẫu lát mỏng corm đỉnh sinh trưởng, 7,4 PLB/mẫu bẹ lá non, và 6,2 PLB/mẫu lát mỏng PLB

- Ngọc điểm: Môi trường nuôi cấy phát sinh PLB và chồi: MS + BA (1mg/l) +

IBA (0,5mg/l) Phát sinh 4,8 chồi/mẫu lát mỏng corm đỉnh sinh trưởng; và phát sinh 2,4 PLB/mẫu bẹ lá non và 3,6 chồi /mẫu bẹ lá non

- Lát hoa: Môi trường nuôi cấy phát sinh chồi: MS + BA (0,1mg/l) + CW

(10%) Phát sinh 2,2 chồi/mẫu lá và 5,8 chồi/mẫu lát mỏng chồi đỉnh

- Cà phê: Môi trường nuôi cấy phát sinh chồi: MS + Adenine (20mg/l) +

kinetin (1mg/l) + BA (3mg/l) Phát sinh 5,2 chồi/mẫu lá và 6,2 chồi/mẫu lát mỏng chồi non đỉnh

Trang 29

Chương III Công nghệ phôi vô tính:

Mẫu nuôi cấy: PLB được cắt ngang thành lát mỏng dày 1mm, bẹ lá non in vitro (0,1-0,5cm)

- Hoàng lan: PLB lát mỏng được sử dụng làm nguyên liệu nuôi cấy Nuôi cấy

phát sinh mô sẹo trên môi trường MS + CW (30%) + 2,4D (0,5mg/l) và tăng sinh mô sẹo trên môi trường MS + CW (10%) + NAA (0,5mg/l) + 2,4D (0,1mg/l) Dịch huyền phù tế bào mô sẹo được nuôi cấy phát sinh phôi trên môi trường MS + NAA (0,1mg/l) + BA (0,1mg/l) + CW (10%) Dịch huyền phù tế bào phôi vô tính được trải và nuôi cấy tái sinh trên môi trường MS +

CW (10%) + NAA (0,1mg/l) + BA (0,1mg/l) Thu nhận 4.800 chồi trên một

lít dịch huyền phù tế bào phôi vô tính

- Địa lan: PLB lát mỏng sử dụng làm nguyên liệu nuôi cấy Lát mỏng được

nuôi cấy phát sinh mô sẹo trên môi trường : MS + peptone (1g/l) + than họat tính (1g/l) + NAA (1mg/l) hay 2,4D (1mg/l) và tăng sinh trên môi trường MS + peptone (1g/l) + than họat tính (1g/l) + NAA (1mg/l) hay 2,4D (1mg/l) Dịch huyền phù tế bào mô sẹo được nuôi cấy phát sinh phôi trên môi trường

MS + peptone (1g/l) + BA (1mg/l) Dịch huyền phù tế bào phôi vô tính được trải và nuôi cấy tái sinh trên môi trường MS + peptone (1g/l) + NAA (0,1mg/l) + BA (1mg/l) Thu nhận 3.800 chồi hoa địa lan trên 1 lít dịch huyền phù tế bào phôi vô tính

- Hồ điệp: PLB lát mỏng được sử dụng làm nguyên liệu nuôi cấy Mô sẹo

phát sinh trên môi trường MS + BA (0,1mg/l) + NAA (1mg/l) hay 2,4D (1mg/l) và được nuôi cấy tăng sinh trên môi trường MS + BA (0,1mg/l) + NAA (1mg/l) Dịch huyền phù tế bào mô sẹo được nuôi cấy phát sinh phôi trên môi trường MS + BA (0,5mg/l) + NAA (0,1mg/l) Dịch huyền phù tế bào phôi vô tính được nuôi cấy trải trên môi trường bán rắn và tái sinh: MS + BA (0,5mg/l) + NAA (0,1mg/l) Thu nhận 5.800 chồi hoa lan hồ điệp trên 1 lít dịch huyền phù tế bào phôi

Trang 30

- Ngọc điểm: PLB lát mỏng được sử dụng làm nguyên liệu nuôi cấy, nuôi cấy

trên môi trường phát sinh mô sẹo MS + IAA (0,1mg/l) + CW (10%) và nuôi cấy tăng sinh trên môi trường MS + 2,4D (0,5mg/l) + kinetin (1mg/l) Dịch huyền phù tế bào mô sẹo được nuôi cấy phát sinh và tăng sinh trên môi trường MS + 2,4D (0,5mg/l) + kinetin (1mg/l) Dịch huyền phù tế bào mô sẹo được nuôi cấy phát sinh phôi vô tính trên môi trường MS + BA (0,3mg/l) và tái sinh trên môi trường MS + NAA (0,1mg/l) + BA (0,5mg/l) Thu nhận 4.400 chồi trên một lít dịch huyền phù tế bào phôi vô tính

- Lát hoa: Lá chồi in vitro được cắt ngang thành mảnh nhỏ (0,1-0,5cm) được

sử dụng làm nguyên liệu nuôi cấy Mô sẹo được nuôi cấy phát sinh và tăng sinh trên môi trường MS + BA (2mg/l) + CW (10 %) + PVP (500 mg/l) + 2,4D (2mg/l) Dịch huyền phù tế bào mô sẹo được nuôi cấy phát sinh và tăng sinh trên môi trường MS + CW (10 %) + 2,4D (2mg/l) + BA (1mg/l) Dịch huyền phù tế bào mô sẹo được nuôi cấy phát sinh phôi vô tính trên môi trường MS + 2,4D (1mg/l) + CW (10%) + sucrose (45g/l) + TDZ (0,05mg/l) Dịch huyền phù tế bào phôi vô tính được trải và tái sinh trên môi trường MS + sucrose (45 g/l) + CW (10%) + BA (0,1mg/l) Thu nhận 2.940 chồi trên một lít dịch huyền phù tế bào phôi vô tính

- Cà phê: Lá được cắt ngang thành mảnh nhỏ (0,1-0,5cm) được sử dụng làm nguyên liệu nuôi cấy chồi in vitro 20 ngày tuổi Mô sẹo phát sinh trên vết cắt

lá non trên môi trường MS + malt (400mg/l) + casein hydrolysate (100mg/l) + 2,4D (2mg/l) + 2iP (2mg/l) và tăng sinh trên môi trường MS + malt (800mg/l) + casein hydrolysate (200mg/l) + 2,4D (1mg/l) + 2iP(4mg/l) + adenine (60mg/l) Dịch huyền phù tế bào mô sẹo được nuôi cấy phát sinh và tăng sinh trên môi trường MS + malt (200mg/l) + casein hydrolysate (100mg/l) + 2,4D (1mg/l) + 2iP (2mg/l) + kinetin (1mg/l) Dịch huyền phù tế bào được nuôi cấy phát sinh phôi trên môi trường MS + casein hydrolysate (400mg/l) + Adenine (40mg/l) + BA (4mg/l) + kinetin (1mg/l) Dịch huyền phù tế bào phôi vô tính

Trang 31

được trải và tái sinh trên môi trường MS + BA (4mg/l) + kinetin (1mg/l) Thu nhận 19.400 chồi trên một lít dịch huyền phù tế bào phôi vô tính

Chương III Công nghệ bioreactor

Mẫu nuôi cấy: PLB cắt ngang thành lát mỏng dày 1mm, lá non in vitro cắt ngang thành mảnh nhỏ (0,1-0,5cm), dịch huyền phù mô sẹo được chọn dòng

- Hòang lan: Dịch huyền phù tế bào nuôi cấy phát sinh và tăng sinh trong

bioreactor là MS + NAA (0,5mg/l) + 2,4D (1mg/l) Dịch huyền phù tế bào mô sẹo được nuôi cấy phát sinh phôi trong bioreactor trên môi trường MS + BA (0,2mg/l) + NAA (0,2mg/l) Nuôi cấy trải dịch tế bào và tái sinh tế bào phôi

vô tính trên môi trường MS + BA (0,2mg/l) + NAA (0,2mg/l) Thu nhận 6.200 chồi trên một lít dịch huyền phù tế bào phôi vô tính

- Địa lan: Dịch huyền phù tế bào mô sẹo được nuôi cấy phát sinh và tăng sinh

trong bioreactor trên môi trường MS + BA (0,1mg/l) + 2,4D (1mg/l) hoặc NAA (1mg/l) Dịch huyền phù tế bào được nuôi cấy phát sinh phôi trên môi trường MS + BA (0,5mg/l) + NAA (0,1mg/l) Dịch huyền phù tế bào phôi vô tính được trải và tái sinh trên môi trường MS + BA (1mg/l) + NAA (0,1mg/l)

Thu nhận 5,600 chồi trên một lít dịch huyền phù tế bào phôi vô tính

- Hồ điệp: Dịch huyền phù tế bào được nuôi cấy phát sinh và tăng sinh trong

bioreactor trên môi trường MS + NAA (0,5mg/l) Và được nuôi cấy phát sinh phôi trên môi trường MS + BA (0,5mg/l) + NAA (0,1mg/l) Dịch huyền phù

tế bào phôi vô tính được trải và nuôi cấy tái sinh trên môi trường MS có bổ sung BA (1mg/l) + NAA (0,1mg/l) 7.580 chồi trên một lít dịch huyền phù tế bào phôi vô tính

- Ngọc điểm: Dịch huyền phù tế bào mô sẹo được nuôi cấy phát sinh và tăng

sinh trên môi trường MS + NAA (0,5mg/l) + 2,4D (1mg/l) Dịch huyền phù tế bào mô sẹo được nuôi cấy phát sinh phôi trên môi trường MS + NAA (0,3mg/l) + BA (0,3mg/l) Dịch huyền phù tế bào phôi vô tính được trải và

Trang 32

nuôi cấy tái sinh trên môi trường MS + NAA (0,1mg/l) + BA (0,5mg/l) Thu nhận 6.800 chồi trên một lít dịch huyền phù tế bào phôi vô tính

- Lát hoa: Dịch huyền phù tế bào mô sẹo được nuôi cấy phát sinh và tăng sinh

trong bioreactor trên môi trường MS + 2,4D (2mg/l) + BA (1mg/l) Dịch huyền phù tế bào được nuôi cấy phát sinh phôi trên môi trường MS + 2,4D (1mg/l) + CW (10%) + sucrose (45g/l) + TDZ (0,05mg/l) Dịch huyền phù tế bào phôi vô tính được trải và nuôi cấy tái sinh trên môi trường MS + 2,4D (1mg/l) + CW (10%) + sucrose (45g/l) + BA (0,1mg/l) Thu nhận 4.680 chồi trên một lít dịch huyền phù tế bào phôi vô tính

- Cà phê: Dịch huyền phù tế bào phôi được nuôi cấy phát sinh và tăng sinh

trong bioreactor trên môi trường MS + malt (200mg/l) + casein hydrolysate (100mg/l) + kinetin (1mg/l) + BA (0,1mg/l) + 2iP (2mg/l) + 2,4D (1mg/l) Và được nuôi cấy phát sinh phôi trên môi trường MS + kinetin (1mg/l) + BA (4mg/l) Dịch huyền phù tế bào phôi vô tính được trải và nuôi cấy tái sinh trên môi trường MS + casein hydrolysate (400mg/l) + kinetin (1mg/l) + BA (4mg/l) + Adenine (40mg/l) Thu nhận 25.260 chồi trên một lít dịch huyền phù tế bào phôi vô tính

Chương IV Công nghệ vườn ươm hiện đại

Mẫu nuôi cấy: chồi cấy mô tái sinh từ tế bào dịch huyền phù

- Hoa lan: Giá thể ra cây cấy mô là dớn, giữ ẩm 90%, chiếu sáng 50-60%,

kích thích ra rễ và sinh trưởng NAA (5mg/l) phun 1lần/tháng, dinh dưỡng hữu

cơ humic acid (1g/l – 3lần/tuần), dinh dưỡng vô cơ 30-10-10 (0-6 tháng tuổi) 20-20-20 (6-12 tháng tuổi) 6-30-30 (12-18 tháng tuổi), đạt tỷ lệ sống >95%

- Lát hoa và cà phê: Giá thể ra cây cấy mô là xơ dừa Giữ ẩm 90%, chiếu

sáng 60%, kích thích ra rễ và sinh trưởng NAA (5mg/l) phun 1 lần/tháng, Giá thể dưỡng cây bầu đất (PC) + đất + xơ dừa (1:1:1) đạt tỷ lệ sống 96% Dinh dưỡng khóang 30-10-10 nồng độ 1g/l và phun 3 lân/tuần, đạt cây xuất vườn sau 6 tháng, với chiều cao thân 40-50cm

Trang 33

Mô hình pilot sản xuất giống 1 triệu cây/năm

- Pilot Công nghệ tế bào thực vật (Phòng thí nghiệm trọng điểm phía Nam về

Công nghệ tế bào thực vật): công suất 1 triệu cây /năm Sản xuất dịch mẹ tế bào gốc và nhân dòng cung cấp tại chổ và các đơn vị pilot đưa vào sản xuất thương mại

Chuyển giao công nghệ

Đào tạo, huấn luyện, và xây dựng

- Viện KHKT Nông Lâm nghiệp Tây nguyên: Dự án giống cà phê

- Trung tâm nghiên cứu ứng dụng KHCN Hải Phòng: Dự án giống hoa

Trang 34

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI

[1] Du nhập các giống hoa lan có triển vọng: cắt cành phục vụ trong nước (5

giống hoàng lan), đang được các nước trong khu vực xuất khẩu (5 giống hồ điệp, 4 giống ngọc điểm), các dòng lai mới có hương thơm (4 giống địa lan)

[2] Quy trình công nghệ lớp mỏng tế bào trên hoa lan, lát hoa, cà phê: đã xây

dựng hòan chỉnh quy trình tái sinh qua nuôi cấy lớp mỏng tế bào Chủ động

về nguồn nguyên liệu đưa vào nuôi cấy mô và tạo protocol ban đầu cho nhân giống tế bào

- 01 Quy trình công nghệ lớp mỏng tế bào (6 đối tượng nghiên cứu)

- Đạt yêu cầu khoa học chính về công nghệ tế bào thực vật

- Đạt yêu cầu về chất lượng sản phẩm

- Công nghệ đạt trình độ khu vực

[3] Quy trình công nghệ phôi vô tính trên hoa lan, lát hoa, và phê: đã xây

dựng hòan chỉnh quy trình từ khâu chọn mẫu nuôi cấy, nuôi cấy tạo mô sẹo, nuôi cấy tạo và tăng sinh dịch huyền phù mô sẹo, và nuôi cấy tái sinh tế bào dịch huyền phù

- 01 Quy trình công nghệ phôi vô tính (6 đối tượng nghiên cứu)

[4] Quy trình công nghệ bioreactor trên hoa lan, lát hoa, cà phê: đã xây dựng

hòan chỉnh quy trình từ khâu chọn mẫu nuôi cấy, nuôi cấy tạo mô sẹo, nuôi cấy tạo và tăng sinh dịch huyền phù mô sẹo, nuôi cấy tăng sinh trong bioreactor và các yếu tố ảnh hưởng, nuôi cấy trải và tái sinh tế bào dịch huyền phù sau bioreactor

- 01 Quy trình công nghệ bioreactor (6 đối tượng nghiên cứu)

Trang 35

[5] Quy trình công nghệ vườn ươm hiện đại: đã xác định được các thông số

cơ bản vườn ươm về giá thể, kích thước cây con cấy mô, dinh dưỡng hữu cơ

và vô cơ, chế độ chiếu sáng, các chất kích thích sinh trưởng ảnh hưởng đến tỷ

lệ sống và sinh trưởng cây cấy mô tái sinh từ tế bào phù hợp với các vườn ươm tự động hóa hiện đại

- 01 Quy trình công nghệ vườn ươm (6 đối tượng nghiên cứu)

- Công nghệ đạt trình độ trong nước

[6] Xây dựng Mô hình pilot sản xuất giống: bằng công nghệ nuôi cấy tế bào

phôi vô tính và bioreactor với công suất 1 triệu cây /năm:

- PTNTĐ phía Nam về CNTBTV với công suất 1 triệu cây /năm

[7] Đã chuyển giao công nghệ và ký biên bản thỏa thuận: chuyển giao công

nghệ phôi vô tính và bioreactor cho 4 đơn vị sản xuất giống nhiều tiềm năng như:

- Viện KHKT Nông Lâm nghiệp Tây nguyên (hợp đồng chuyển giao công nghệ): Chuyển giao công nghệ phôi vô tính và bioreactor trên cây cà phê và hoa lan

- Trung tâm Nghiên cứu ứng dụng KHCN Hải Phòng: chuyển giao công nghệ phôi vô tính và bioreactor trên cây hoa lan hồ điệp và ngọc điểm

- Công ty cổ phần Thiên Phong (Khu nông nghiệp công nghệ cao) (ký thỏa thuận): Chuyển giao công nghệ phôi vô tính và bioreactor trên cây hoa lan, cây lâm nghiệp, cây công nghiệp

Trang 36

- Tập đoàn cổ phần Giấy Tân Mai (ký thỏa thuận): Dự án xây dựng trung tâm giống cây nguyên liệu giấy (keo lai, thông, lát hoa…), công suất 10-15 triệu cây/năm trên các loài cây nguyên liệu giấy…

Trang 37

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

A CÁC KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU NGÒAI NƯỚC

I CÁC PHƯƠNG PHÁP VI NHÂN GIỐNG

Hoa lan với trên 800 giống và 25.000 loài Có nhiều loài hoa đẹp được

ưa chuộng trên thị trường chiếm tỷ lệ 8% trong ngành kinh doanh hoa toàn cầu và còn tiềm năng phát triển xa hơn nữa Những nước có truyền thống xuất khẩu hoa lan cắt cành và lan chậu như: Đài Loan, Thái Lan, Anh Quốc, Ý, Nhật Bản, New Zealand và Brasil và nước nhập hoa chậu nhiều nhất là Hoa

Kỳ Ngày nay, Cymbidium, Dendrobium, Oncidium và Phalaenopsis có thị

trường toàn cầu và ngành công nghiệp hoa là một phần hỗ trợ các nền kinh tế đông nam á phát triển bền vững Thị trường Hoa Kỳ tiêu thụ hoa chậu 144 triệu USD năm 2005 khoảng 18 triệu chậu hoa lan trong đó hoa lan hồ điệp chiếm 75% Doanh thu về xuất khẩu hoa lan của Thái Lan là 30 triệu USD và Singapore là 16 triệu USD năm 2008 (USDA, 2006)

Vi nhân giống hỗ trợ sự phát triển ngành hoa lan và kỹ thuật nuôi cấy

mô tế bào đã bảo tồn các nguồn gen quý Nhân giống bằng con đường hạt dẫn đến sự đa dạng về di truyền Bảo tồn các đặc tính quý là ưu thế của kỹ thuật vi nhân giống các loài hoa lan kinh tế Tuy nhiên nhân giống bằng kỹ thuật cấy

mô vẫn còn hạn chế do có những hợp phần phenol tiết ra từ mẫu nuôi cấy,

chuyển cây từ trong in vitro ra ex vitro, biến tính tế bào soma… Các phương

pháp vi nhân giống truyền thống như:

I.1 Vi nhân giống qua nuôi cấy chồi đỉnh

PLB hay shoot bud

Vật liệu nuôi cấy in vitro /in vivo

Trang 38

Warner MS + 2.5mg/l BAP PLBs In vivo Sharma and Tandon (1992)

Dendrobium cv Sonia VW+ 1mg/l BAP +

1.5mg/l NAA Shoot buds In vivo Sheela et al (2004) 1/2 MS + 1mg/l BAP +

Vanilla planifolia Andr MS + 1mg/l BAP + 15%

CW Shoots In vivo Kalimuthu et al (2006)

I.2 Vi nhân giống qua nuôi cấy mô lá

1mg/l TDZ Shoot buds In vitro Nayak et al (1997a)

Aerides crispum L MS + 2.0µM BAP PLBs In vitro Sheelavanthmath

et al (2005)

Aerides maculosum

Lindl MS + 2mg/l BAP PLBs In vitro Murthy and Pyati (2001)

Aerides multiflora Roxb MPR + 2mg/l BAP +

0.5mg/l NAA PLBs In vitro Vij et al (2004a,b)

Ascocenda Fifth State

Beauty MPR medium+ 1mg/l BAP PLBs In vitro and in vivo Vij and Kaur (1999)

Micropera pallida Lindl 1/2 MS + 2mg/l NAA+

2mg/l BAP PLBs In vitro Bhadra Hossain (2004) and

Mokara ‘Chark Kuan’ MS + 0.5mg/l Kn PLBs In vitro Abdul Ghani and

+ 4.52µM 2,4D (pH 6.0)

Phalaenopsis ‘Taisuco

Hatarot’, P Tinny

Sunshine Annie, P

Taipei Gold ‘Golden

Star, P Tinny Galaxy

MS + 88.8µM BAP + 5.4µM NAA

PLBs In vitro Park et al

(2002a,b)

Trang 39

‘Annie’

Phalaenopsis Little Steve 1/2 MS + 4.54µM TDZ Somatic

embryos In vitro Kuo et al (2005)

PLBs In vivo Teng et al (1997)

Vanda cristata Lindl MPR + 10mg/l BAP +

5mg/l IAA with increased concentration

of CuSO4.5H2O (2.2mg/l)

PLBs In vivo Sharma and Vij

(1997)

Vanilla planifolia Andr MS + 4.52µM 2,4-D+

2.22µM BAP Callus In vivo Janarthanam Seshadri (2008) and

MS + 4.52µM 2,4-D+

2.22µM BAP

Shoots from the callus

I.3 Vi nhân giống qua nuôi cấy tược hoa

Epidendrum radicans Pav

Lindl 1/2 MS + 0.1mg/l TDZ PLBs/shoot buds In vivo Chen et al (2002)

Oncidium Sweet Sugar 1/2MS + 5mg/l BAP +

5mg/l NAA PLBs In vivo (2000) Chen and Chang

Ponerorchis graminifolia

Rchb f 1/2 MS + 4.44µM BAP + 0.54µM NAA Shoot buds In vivo Mitsukuri et al (2009)

I.4 Vi nhân giống qua nuôi cấy thân rễ

Giống / Mẫu nuôi cấy Môi trường Thể tái sinh

Tác giả

Cattleya Almakee / Root

segments MPR medium+ 1mg/l Kn + 1mg/l NAA PLBs In vitro Vij (1993)

Shoot buds In vitro

(seed derived rhizomes)

Nayak et al

(1998)

Trang 40

Cymbidium ensuifolium

var misericors / Rhizome

segments

1/2 MS + 10mg/l D+ 0.1mg/l TDZ Callus In vitro Chang Chang (1998) and

2,4-MS + 5mg/l BAP / 1mg/l TDZ

1mg/l BAP Shoots In vivo Uemoto (1991) Shimasaki and

Cymbidium Kenny ‘Wine

Color’ / Root segments MS + 1mg/l NAA+ 1mg/l BAP PLBs In vitro Yasugi et al (1994)

Doritaenopsis ‘New

Candy’ D (‘Mary Anes’

‘Ever Spring’)

/ Root segments

MS + 2.3µM TDZ PLBs In vitro Park et al (2003)

Eulophia hormusjii Duth /

Rhizome segments MPR + peptone MPR + 1mg/l NAA+

1/2 MS + 6.97µM Kn Shoots In vitro Martin (2003)

Oncidium ‘Gower Ramsey’

(O Goldiana / O Guinea

Gold)

/ Root segments

1/2 MS + 2mg/l Kn + 0.5mg/l zeatin

Somatic embryos

I.5 Vi nhân giống qua nuôi cấy lớp mỏng tế bào

Giống / Mẫu nuôi cấy Môi trường Thể tái sinh

Tác giả

Cymbidium aloifoium (L.)

Sw / PLBs

MS + 14.0µM zeatin riboside

PLBs In vitro Nayak et al

PLBs In vitro Teixeira da

Silva

et al (2006)

Dendrobium moschatum

(Buch.-Ham) / Stem KC + 3mg/l BAP + 2mg/l NAA PLBs In vitro Kanjilal et al (1999)

Dendrobium nobile Lindl /

PLBs In vivo Malabadi et al

(2005)

Dendrobium sp (D16 and

D36) / Stem MS + 1mg/l BAP + 1mg/l NAA PLBs In vitro Nhat and Dung (2006)

Doritaenopsis New Candy; MS + 9.0µM TDZ PLB In vitro Park et al

Tiêu đề	Nghiên cứu ứng dụng công nghệ bioreactor, công nghệ lớp mỏng tế bào, và phân phối vô tính phục vụ nhân nhanh một số giống cây trồng có giá trị ở quy mô công nghiệp
Tác giả	Trần Văn Minh, Bùi Thị Tường Thu, Nguyễn Trung Hậu, Nguyễn Phi Viễn Phương, Mai Thị Phương Hoa, Nguyễn Văn Nam, Nguyễn Thị Ngọc Tú, Nguyễn Thị Thanh, Đỗ Năng Vịnh, Hà Thị Thúy, Đoàn Duy Thanh
Người hướng dẫn	PGS.TS Trần Văn Minh
Trường học	Viện Khoa Học Và Công Nghệ Việt Nam
Chuyên ngành	Khoa học và công nghệ thực vật
Thể loại	Báo cáo tổng hợp đề tài nghiên cứu
Năm xuất bản	2010
Thành phố	TP. Hồ Chí Minh

Định dạng
Số trang	520
Dung lượng	35,2 MB