tạo dòng ngô biến đổi gen kháng sâu kháng thuốc diệt cỏ

Nghiên cứu tạo dòng ngô kháng sâu/kháng thuốc diệt cỏ bằng phương pháp lai ngược chọn lọc làm vật liệu cho nghiên cứu chuyển gen; 10 dòng ngô ưu việt làm vật liệu để lai với các nguồn kh

-

Chương trình trọng điểm phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực nông nghiệp và phát triển nông thôn đến hết năm 2020

BÁO CÁO TỔNG KẾT KHOA HỌC VÀ KỸ THUẬT ĐỀ TÀI

TẠO DÒNG NGÔ BIẾN ĐỔI GEN

KHÁNG SÂU/KHÁNG THUỐC DIỆT CỎ

Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Văn Đồng

Cơ quan chủ trì: Viện Di truyền nông nghiệp

Cơ quan chủ quản: Bộ Nông nghiệp & PTNT Thời gian thực hiện:1/2006 – 10/2010

Hà Nội, 2010

LỜI CẢM ƠN

Chủ nhiệm đề tài xin chân thành cảm ơn Viện Di truyền Nông nghiệp đã ủng

hộ, tạo điều kiện thuận lợi về trang thiết bị và nhân lực cho cán bộ chủ trì và các cán bộ tham gia thực hiện đề tài này

Chủ nhiệm đề tài và các cán bộ thực hiện xin chân thành cảm ơn Vụ Khoa học, Công nghệ và Hợp tác quốc tế, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đã tạo điều kiện về kinh phí và quản lý quá trình thực hiện các nội dung nghiên cứu của đề tài trong suốt thời gian qua

CƠ QUAN CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI

Hà Nội, ngày tháng năm 2010

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI

TS Nguyễn Văn Đồng

1

Hà Nội, ngày tháng 10 năm 2010

BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

I THÔNG TIN CHUNG

1 Tên đề tài/dự án: Tạo dòng ngô biến đổi gen kháng sâu / kháng thuốc diệt cỏ

Mã số đề tài, dự án:

Thuộc:

2 Chủ nhiệm đề tài/dự án:

Họ và tên: Nguyễn Văn Đồng

Ngày, tháng, năm sinh: 01/02/1959 Nam/ Nữ: Nam

Fax: 37543196 E-mail: dongjircas@yahoo.com

Tên tổ chức đang công tác: Viện Di truyền Nông nghiệp

Địa chỉ tổ chức: Đường Phạm Văn Đồng, Từ Liêm, Hà Nội

Địa chỉ nhà riêng: C13- Khu TT Thời báo Kinh tế- Đồng Xa, Mai Dịch,

Cầu Giấy, Hà Nội

3 Tổ chức chủ trì đề tài/dự án:

Tên tổ chức chủ trì đề tài: Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện

KHNNVN

2

E-mail: vdt@agi.ac.vn

Địa chỉ: Đường Phạm Văn Đồng, Từ Liêm, Hà Nội

Họ và tên thủ trưởng tổ chức: PGS TS Lê Huy Hàm

Số tài khoản: 301.01.035.01.16

Ngân hàng: Kho bạc Nhà nước Từ Liêm, Hà Nội

Tên cơ quan chủ quản đề tài: Bộ Nông nghiệp và PTNT

II TÌNH HÌNH THỰC HIỆN

1 Thời gian thực hiện đề tài/dự án:

- Theo Hợp đồng đã ký kết: từ 01 tháng 10 năm 2006 đến tháng 10 năm 2010

- Thực tế thực hiện: từ 01 tháng 10 năm 2006 đến 30 tháng 10 năm 2010

- Được gia hạn: không

Thời gian

(Tháng, năm)

Kinh phí (Tr.đ)

Thời gian (Tháng, năm)

Kinh phí (Tr.đ)

3 Các văn bản hành chính trong quá trình thực hiện đề tài/dự án:

(Liệt kê các quyết định, văn bản của cơ quan quản lý từ công đoạn xác định nhiệm vụ, xét chọn, phê duyệt kinh phí, hợp đồng, điều chỉnh (thời gian, nội dung, kinh phí thực hiện nếu có); văn bản của tổ chức chủ trì đề tài, dự án (đơn, kiến nghị điều chỉnh nếu có)

5 QĐ số

336/QĐ-BNN-KHCN

ngày 29/10/2008

Quyết định tăng cường thiết bị các đề tài/dự

án thuộc Chương trình trọng điểm phát triển

và ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực nông nghiệp và phát triển nông thôn đến năm 2020

6

691b/PLHĐ-BNN-KHCN

ngày 18/11/2008

Phụ lục hợp đồng trách nhiệm Thực hiện đề tài nghiên cứu khoa học công nghệ

11 QĐ số 145/QĐ- Quyết định công nhận các quy trình tiến bộ

Nội dung tham gia chủ yếu

Sản phẩm chủ yếu đạt được

Ghi chú*

1 Viện

Nghiên

cứu Ngô

Viện Nghiên cứu Ngô

Cung cấp các dòng ngô chọn lọc; Tiến hành các phép lai ngược giữa các dòng ngô chọn lọc với các dòng ngô mang gen kháng sâu /kháng thuốc diệt cỏ

- Đã lựa chọn, đánh giá đặc tính nông học của

24 dòng ngô chọn lọc làm vật liệu ban đầu cho các nghiên cứu chuyển gen và 10 dòng ngô ưu việt làm vật liệu cho nghiên cứu lai ngược

- Chọn tạo được 01 dòng ngô kháng sâu và

8 dòng ngô kháng thuốc diệt cỏ bằng phương pháp lai ngược

Thiết kế vectơ mang gen /Promoter thích hợp dùng

để biến nạp tạo các dòng ngô biến đổi gen

- Đã thiết kế được 05 vectơ chuyển gen mang gen kháng sâu pADT1, pADT2, pADT3, pADT4 và pADT5

- Tạo được 07 chủng vi khuẩn Agrobacterium mang các vectơ chuyển gen đã thiết kế

6

5 Cá nhân tham gia thực hiện đề tài, dự án:

(Người tham gia thực hiện đề tài thuộc tổ chức chủ trì và cơ quan phối hợp, không quá 10 người kể cả chủ nhiệm)

Nội dung tham gia chính

Sản phẩm chủ yếu đạt được

Ghi chú*

Viết thuyết minh, báo cáo kết quả của đề tài Tham gia các nội dung nghiên cứu do Viện DTNN thực hiện

Sản phẩm khoa học chính của

đề tài

Chủ nhiệm

Nghiên cứu chuyển các gen kháng sâu Cry1Ac vào các dòng ngô chọn lọc và các dòng ngô mô hình

Các dòng ngô

mô hình, dòng ngô chọn lọc mang gen kháng sâu Cry1Ac

Tư vấn chung về khoa học và tham gia kiểm tra, đánh giá biểu hiện của các gen chuyển nạp trong các dòng chuyển gen ở điều kiện nhà kính

Số liệu phân tích mức độ biểu hiện của gen kháng sâu trong các dòng ngô chuyển gen trong điều kiện nhà kính

7

Vịnh của các dòng ngô

chọn lọc

tiếp nhận gen của các dòng ngô chọn lọc

5 CN Lê

Thị Thu

Về

CN Lê Thị Thu

Về

Thu thập và đánh giá các dòng ngô nhập nội có khả năng tái sinh cao làm vật liệu cho nghiên cứu chuyển gen

Đánh giá biểu hiện của các gen chuyển nạp trong các dòng chuyển gen ở điều kiện nhà kính

02 dòng ngô nhập nội có khả năng tái sinh cao Số liệu phân tích mức

độ biểu hiện của gen kháng sâu trong các dòng ngô chuyển gen trong điều kiện nhà kính

6 CN Nhữ

Đình Sĩ

ThS Trần Minh Thu

Nghiên cứu chuyển các gen kháng sâu Cry1Ac vào các dòng ngô chọn lọc và các dòng ngô mô hình

Các dòng ngô

mô hình, dòng ngô chọn lọc mang gen kháng sâu Cry1Ac

Xây dựng hệ thống tái sinh đối với các dòng ngô chọn lọc Nghiên cứu chuyển các gen kháng sâu

Quy trình tái sinh của các dòng ngô chọn lọc Các dòng ngô mô hình, dòng ngô chọn

8

dòng ngô chọn lọc và các dòng ngô mô hình

kháng sâu Cry1Ac

8 TS Đặng

Trọng

Lương

TS Đặng Trọng Lương

Thu thập, tuyển chọn nguồn gen các dòng/giống ngô kháng sâu, kháng thuốc diệt

cỏ Phân tích và đánh giá mức độ biểu hiện các đặc tính của gen chuyển và các đặc tính nông sinh học ưu việt

Các dòng/giống ngô kháng sâu, kháng thuốc diệt cỏ làm vật liệu cho nghiên cứu lai hồi giao

Số liệu đánh giá mức độ biểu hiện các đặc tính của gen chuyển và các đặc tính nông sinh học ưu việt

9 TS Lê Thị

Thu Hiền

TS Lê Thị Thu Hiền

Tạo vật liệu ban đầu (vật liệu di truyền) cho các nghiên cứu biến nạp di truyền

Đã thiết kế được

05 vectơ chuyển gen mang gen kháng sâu pADT1,

pADT2, pADT3, pADT4

và pADT5 Tạo được 07 chủng

vi khuẩn A tumefaciens

mang các vectơ chuyển gen đã thiết kế

9

ngô chọn lọc làm vật liệu ban đầu cho biến nạp di truyền Nghiên cứu tạo dòng ngô kháng sâu/kháng thuốc diệt cỏ bằng phương pháp lai ngược

chọn lọc làm vật liệu cho nghiên cứu chuyển gen;

10 dòng ngô ưu việt làm vật liệu

để lai với các nguồn kháng sâu, kháng thuốc trừ cỏ Đã chọn tạo được

01 dòng ngô kháng sâu và 8 dòng ngô kháng thuốc diệt cỏ bằng phương pháp lai ngược

- Lý do thay đổi (nếu có): PGS.TS Đỗ Năng Vịnh làm chủ trì các đề tài khác nên không tham gia thực hiện được đề tài này Phần nhiệm vụ được giao cho ThS Đinh Văn Trình; CN Nhữ Đình Sĩ thay đổi cơ quan công tác, phần nhiệm vụ giao cho ThS Trần Minh Thu; ThS Nguyễn Thị Khánh Vân tham gia thực hiện các đề tài khác,phần nhiệm vụ được giao cho CN Lê Thanh Nga

6 Tình hình hợp tác quốc tế:

Số

TT

Theo kế hoạch

(Nội dung, thời gian, kinh

phí, địa điểm, tên tổ chức

người tham gia )

Ghi chú*

1

2

(Nội dung, thời gian,

kinh phí, địa điểm )

Ghi chú*

1

2

- Lý do thay đổi (nếu có):

8 Tóm tắt các nội dung, công việc chủ yếu:

(Nêu tại mục 15 của thuyết minh, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát trong nước và nước ngoài)

Theo kế hoạch

Thực tế đạt được

1 Thu thập, đánh giá nguồn vật

liệu ban đầu (vật liệu TV)

cho các nghiên cứu biến nạp

di truyền

03/2007

03/2007

10/2006-TS Nguyễn Văn Đồng ,

TS Phan Xuân Hào

và cs

2 Tạo nguồn vật liệu ban đầu

(vectơ chuyển gen) cho các

nghiên cứu biến nạp di truyền

12/2007

12/2007

10/2006-TS Lê Thị Thu Hiền và

cs

3 Xây dựng hệ thống tái sinh

đối với các dòng ngô đã được

chọn lọc

12/2007

12/2007

10/2006-TS Nguyễn Văn Đồng

và cs

4 Thử khả năng biến nạp của

các dòng ngô chọn lọc

12/2007

12/2007

4/2007-TS Nguyễn Văn Đồng

và cs

5 Nghiên cứu chuyển các gen

quan tâm vào ngô

12/2008

12/2008

1/2008-TS Nguyễn Văn Đồng

7 Cải tiến vectơ mang gen

kháng sâu/kháng thuốc diệt

cỏ trên cơ sở các nguồn vật

liệu di truyền thu thập được

12/2008

012/2008

1/2008-Nông Văn Hải, Viện CNSH

8 Tạo dòng ngô chuyển gen

bền vững mang gen kháng

sâu/thuốc diệt cỏ

10/2010

10/2010

01/2008-TS Nguyễn Văn Đồng

và cs

9 Phân tích các dòng ngô

chuyển gen nhận được

10/2010

10/2010

01/2008-TS Nguyễn Văn Đồng

10/2010

01/2008-TS Nguyễn Văn Đồng,

TS Lê Thị Thu Hiền và

cs

11 Thu thập, tuyển chọn nguồn

gen các dòng/giống ngô ưu

việt

03/2007

03/2007

10/2006-TS Phan Xuân Hào

và cs

12 Thu thập, tuyển chọn nguồn

gen các dòng/giống ngô

kháng sâu, kháng thuốc diệt

cỏ

03/2007

03/2007

10/2006-TS Nguyễn Văn Đồng,

TS Phan Xuân Hào

và cs

13 Tiến hành các phép lai ngược

giữa các dòng/ giống ngô ưu

việt với các dòng/giống ngô

kháng thuốc diệt cỏ Phân

tích và đánh giá mức độ biểu

12/2009

12/2009

04/2007-TS Phan Xuân Hào,

TS Nguyễn Văn Đồng,

và cs

12

chuyển và các đặc tính nông

sinh học ưu việt trong các thế

hệ con lai

14 Thực hiện các phép lai ngược

giữa các dòng/giống ngô ưu

việt với các dòng ngô kháng

sâu/kháng thuốc diệt cỏ đã

tạo ra được bằng kĩ thuật biến

nạp di truyền

10/2010

10/2010

01/2010-TS Nguyễn Văn Đồng,

và cs

III SẢN PHẨM KH&CN CỦA ĐỀ TÀI, DỰ ÁN

1 Sản phẩm KH&CN đã tạo ra:

hoạch

Thực tế đạt được

1 Dòng ngô mang gen kháng sâu tạo ra

bằng công nghệ chuyển gen dòng 02-03 03

1.1 Dòng ngô mô hình mang gen kháng

sâu tạo ra bằng công nghệ chuyển

gen

1.2 Dòng ngô chọn lọc mang gen kháng

sâu tạo ra bằng công nghệ chuyển

gen

2 Dòng ngô mang gen kháng thuốc diệt

cỏ tạo ra bằng phương pháp lai hồi

giao

dòng 04-05 08

3 Dòng ngô mang gen kháng sâu tạo ra

bằng phương pháp lai hồi giao dòng 0 01

- Lý do thay đổi (nếu có):

b) Sản phẩm Dạng II:

Hiệu quả tái sinh tốt Có khả năng

áp dụng ở quy mô phòng thí nghiệm

ở quy mô phòng thí nghiệm

Hiệu quả chuyển nạp gen tốt Có khả năng áp dụng

ở quy mô phòng thí nghiệm

(*)

3 Quy trình tạo cây ngô

mang gen kháng sâu

Có khả năng tạo cây ngô chuyển gen kháng sâu bền vững

Có khả năng tạo cây ngô chuyển gen kháng sâu bền vững

(*)

4 Tần số tái sinh cây, tần

số biến nạp

Số liệu chính xác, đáng tin cậy

Số liệu chính xác, đáng tin cậy

5 Các chỉ tiêu nông học Số liệu chính xác,

đáng tin cậy

Số liệu chính xác, đáng tin cậy

6 Báo cáo khoa học Số liệu chính xác,

đáp ứng đầy đủ nội dung yêu cầu của đề tài

Số liệu chính xác, đáp ứng đầy đủ nội dung yêu cầu của đề tài

7 Báo cáo tổng kết đề tài Số liệu chính xác,

đáp ứng đầy đủ nội dung yêu cầu của đề tài

Số liệu chính xác, đáp ứng đầy đủ nội dung yêu cầu của đề tài

- Lý do thay đổi (nếu có): (*): Theo TMTT và Hợp đồng đã được phê duyệt, sản phẩm dạng II là các phương pháp Theo quyết định 1776/QĐ-BNN-KHCN ngày 23/6/2010 của Bộ NN &PTNT sản phẩm dạng II là các phương pháp đã được thay đổi thành các quy trình

1 Nghiên cứu chuyển gen

nguyên cây ở ngô

Có ý nghĩa khoa học và

là kết quả nghiên cứu của đề tài

Có ý nghĩa khoa học và là kết quả nghiên cứu của đề tài

Tạp chí Công nghệ Sinh học 7(2): 221-

227

2 Nghiên cứu khả năng

phát sinh mô sẹo phôi

hóa và mức độ tái sinh

cây hoàn chỉnh từ phôi

non của một số dòng

ngô Việt Nam

Có ý nghĩa khoa học và

là kết quả nghiên cứu của đề tài

Có ý nghĩa khoa học và là kết quả nghiên cứu của đề tài

Tạp chí Công nghệ Sinh học

7(4): 1-8

3 Kết quả bước đầu trong

nghiên cứu chuyển gen

kháng sâu cry1Ac vào

phôi non các dòng ngô

mô hình

Có ý nghĩa khoa học và

là kết quả nghiên cứu của đề tài

Có ý nghĩa khoa học và là kết quả nghiên cứu của đề tài

Tạp chí Công nghệ Sinh học 8(1): 1-8

2010

4 Nghiên cứu khả năng

tiếp nhận gen kháng sâu

cryIA(c) thông qua vi

khuẩn Agrobacterium

tumefaciens của một số

dòng ngô Việt Nam

Có ý nghĩa khoa học và

là kết quả nghiên cứu của đề tài

Có ý nghĩa khoa học và là kết quả nghiên cứu của đề tài

Tạp chí Khoa học

và Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam (đang

1

Đào tạo Thạc sĩ 01-02 04 2007, 2008,

2009

15

- Lý do thay đổi (nếu có): (*) Năm 2009 NCS của đề tài được cử đi đào tạo ở nước ngoài (CHLB Đức) theo chương trình CNSHNN Vì thế NCS sẽ bảo vệ sau khi đề tài kết thúc (dự kiến năm 2012)

đ) Tình hình đăng ký bảo hộ quyền sở hữu công nghiệp, quyền đối với giống cây trồng:

Theo

kế hoạch

Thực tế đạt được

2

- Lý do thay đổi (nếu có):

e) Thống kê danh mục sản phẩm KHCN đã được ứng dụng vào thực tế

Kết quả

sơ bộ

1

2

2 Đánh giá về hiệu quả do đề tài, dự án mang lại:

a) Hiệu quả về khoa học và công nghệ:

- Nghiên cứu của đề tài đã góp phần tăng cường năng lực chuyên môn trong lĩnh vực công nghệ gen, mở ra khả năng mới trong việc ứng dụng công nghệ

gen vào việc chọn tạo các giống cây trồng mới

- Đề tài tạo nền móng cho việc nghiên cứu ứng dụng CNSH trong chọn tạo giống ngô thương mại của Việt Nam Vì vậy, hiệu quả của đề tài là tạo ra nguồn nhân lực tại chỗ, chủ động tạo ra sản phẩm mang thương hiệu của VN Góp phần đưa việc ứng dụng CNSH của nước ta hoà trong tiến trình phát triển của khu vực

b) Hiệu quả về kinh tế xã hội:

16

góp quan trọng trong các lĩnh vực sản xuất tương ứng Các giống kháng sâu sẽ góp phần giảm chi phí cho thuốc trừ sâu, chống ô nhiễm môi trường, qua đó làm giảm chi phí sản xuất, làm tăng diện tích trồng trọt và sản lượng Các giống kháng thuốc diệt cỏ sẽ làm giảm chi phí công lao động trong việc phòng trừ cỏ dại Sản phẩm của đề tài là các giống ngô biến đổi gen kháng sâu/kháng thuốc trừ cỏ có khả năng áp dụng và triển khai trong sản xuất

3 Tình hình thực hiện chế độ báo cáo, kiểm tra của đề tài, dự án:

Số

TT Nội dung

Thời gian thực hiện

Đã thu thập được các dòng/giống ngô ưu việt làm nguồn bố mẹ và các dòng/giống ngô mang gen kháng sâu/kháng thuốc diệt cỏ làm vật liệu cho các thí nghiệm lai hồi giao

5/07/2007 Đã lựa chọn đựợc 02 dòng ngô nhập nội có

khả năng tái sinh cao; 04 dòng ngô chọn lọc làm vật liệu cho biến nạp di truyền; Đã thiết

kế được 2 vectơ chuyển gen mang gen kháng sâu pADT1 và pADT2; Đã tạo được 04 chủng Agrobacterium mang vectơ pADT1 và pADT2; Đã thu thập và đánh giá được 06 dòng/giống ngô ưu việt, 02 dòng ngô mang gen kháng sâu/kháng thuốc diệt cỏ làm vật liệu cho lai hồi giao; Tạo được 01 dòng ngô

Agrobacterium chứa vectơ chuyển gen; Đã

cải thiện được phương pháp tái sinh cây đối với dòng ngô chọn lọc; Đã tạo được 01 dòng ngô mô hình mang gen kháng sâu (với số liệu phân tích sự có mặt của gen chuyển trong các cây ngô tái sinh); Đã tạo được 01 dòng ngô lai Bcr1/Bcr2 mang gen kháng sâu Lần 4: Báo

6/6/2008 Đã biến nạp chủng LBA4404/ EHA105

mang vectơ pADT1 chứa gen kháng sâu vào dòng ngô mô hình / dòng ngô chọn lọc; Đã

tạo được chủng vi khuẩn A tumefaciens

LBA4404 mang gen cry1A(c), promoter Ubiquitin, gen chỉ thị chọn lọc thực vật bar;

Đã đánh giá được các đặc tính nông học, khả năng kháng thuốc trừ cỏ của các dòng BC2

và tiếp tục tạo các dòng BC3; Đang triển khai đánh giá đặc tính nông học, khả năng kháng sâu của các dòng BC2 và tiếp tục tạo các dòng BC3

Lần 6: Báo 13/07/2009 Đang tiến hành các thí nghiệm biến nạp với

15/11/2009 Đã thu nhận được các cây ngô chuyển gen

với vectơ pADT2, pADT3, pADT4 mang

gen kháng sâu cry1Ac/Vip3A và gen chọn lọc

pmi của dòng ngô mô hình / dòng ngô chọn

lọc Đã đánh giá được hiệu quả chuyển gen của vectơ pADT2, pADT3, pADT4 ở dòng ngô mô hình / dòng ngô chọn lọc

Số liệu phân tích PCR để kiểm tra đánh giá

sự có mặt của gen chuyển (Cry1Ac /Vip3A /pmi) trong các dòng ngô chuyển gen tái sinh, các cá thể chuyển gen T0 của dòng ngô

mô hình/chọn lọc

Số liệu đánh giá mức độ kháng sâu của các

cá thể chuyển gen T0 của dòng ngô mô hình /chọn lọc (sau 3 lần thử sâu) Đã tạo được 8 dòng lai BC4 mang gen kháng thuốc diệt cỏ

Đã tạo được 1 dòng lai BC4 mang gen kháng sâu

Lần 8: Báo

cáo định

kỳ tình

hình thực

31/07/2010 Tiếp tục các thí nghiệm chuyển gen vào dòng

ngô mô hình/ngô chọn lọc với vector pADT2, pADT3, pADT4 và thu nhận được

19

2010 gen chuyển (Cry1Ac /Vip3A /pmi) trong các

dòng ngô chuyển gen tái sinh

Đã tiến hành các phép lai ngược giữa các dòng/giống ngô ưu việt với các dòng/giống ngô kháng sâu/ kháng thuốc diệt cỏ đã thu thập được

II Kiểm tra định kỳ

Lần 1 13/11/2007 Đề tài đã thực hiện các nội dung: thu thập,

đánh giá nguồn vật liệu ban đầu; Tạo vector chuyển gen; Xây dựng hệ thống tái sinh; Chuyển gen vào dòng ngô mô hình; Tạo dòng ngô kháng sâu/thuốc diệt cỏ bằng lai ngược; Sản phẩm đề tài: 02 dòng ngô có khả năng tái sinh; 04 dòng ngô chọn lọc; 01 dòng ngô kháng sâu và 01 dòng ngô kháng thuốc diệt cỏ bằng pp lai ngược

Người chủ trì: PGS TS Trịnh Khắc Quang Lần 2 10/7/2008 Đã thiết kế được các vector và đã thực hiện

chuyển nạp gen vào các dòng ngô mô hình

và một số giống ngô Hiệu quả chuyển gen

có thể rất thấp, vì vậy cần tạo được nhiều dòng To để chọn lọc tiếp Đối với lai hồi giao cần chọn lọc và xác định nguồn vật liệu

để lai, chọn lọc theo sơ đồ lai hồi giao Cần đẩy mạnh tiến độ Người chủ trì: Thứ trưởng Bùi Bá Bổng

Lần 3 4/06/2010 Nhìn chung đề tài thực hiện đúng các nội

dung theo tiến độ Tuy nhiên, do việc điều chỉnh các thay đổi về nội dung, kinh phí của

12/2008 Đề tài hoàn thành các nội dung nghiên cứu

theo thuyết minh đã được phê duyệt

12/2009 Đề tài hoàn thành các nội dung nghiên cứu

theo kế hoạch, sản phẩm thu được đáp ứng yêu cầu

21

BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

MỤC LỤC

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU……… 1.1 Đặt vấn đề……… 1.2 Mục tiêu nghiên cứu……… 1.3 Đối tượng nghiên cứu ……… 1.4 Phạm vi nghiên cứu……… 1.5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài………

CHƯƠNG 2 :TỔNG QUAN TÀI LIỆU……… 2.1 Tính cấp thiết của đề tài……… 2.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước………

2.2 1 Tình hình sản xuất ngô trên thế giới ………

2.2.2 Thành tựu và ứng dụng của cây trồng biến đổi gen ………… 2.2.3 Công nghệ sinh học và chọn tạo cây ngô chuyển gen kháng sâu, kháng thuốc diệt cỏ ………

2.2.4 Các nghiên cứu cải tiến quy trình chuyển nạp gen ở cây ngô

2.3 Tình hình nghiên cứu trong nước………

2.3.1 Tình hình sản xuất ngô trong nước………

2.3.2 Sâu hại ngô………

2.3.3 Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh và chuyển gen ở ngô

CHƯƠNG 3:VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………… 3.1 Nội dung nghiên cứu………

3.1.1 Nghiên cứu tạo dòng ngô kháng sâu/kháng thuốc diệt cỏ bằng kỹ thuật biến nạp di truyền………

3.1.2 Nghiên cứu tạo dòng ngô kháng sâu/kháng thuốc diệt cỏ bằng phương pháp lai ngược (backcross) ………

3.2 Phương pháp nghiên cứu……… 3.3.1 Nghiên cứu tạo dòng ngô kháng sâu/ kháng thuốc diệt cỏ bằng kỹ thuật biến nạp di truyền……… 3.3.2 Nghiên cứu tạo các dòng/giống ngô kháng sâu / kháng thuốc diệt cỏ bằng phương pháp lai ngược (backcross) ………

CHƯƠNG 4:KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU……… 4.1 Nghiên cứu tạo dòng ngô kháng sâu/kháng thuốc diệt cỏ bằng kỹ thuật biến nạp di truyền………

4.1.1.Thu thập, đánh giá nguồn vật liệu ban đầu (vật liệu TV) cho các nghiên cứu biến nạp di truyền……… 4.1.2.Tạo nguồn vật liệu ban đầu (vector chuyển gen) cho các nghiên cứu biến nạp di truyền………

4.1.3 Xây dựng hệ thống tái sinh đối với các dòng ngô đã được chọn lọc……… 4.1.4 Thử khả năng biến nạp của các dòng ngô chọn lọc ……… 4.1.5 Tạo dòng ngô chuyển gen bền vững mang gen kháng sâu… 4.1.6 Phân tích các dòng ngô chuyển genT0 nhận được và đánh giá biểu hiện của gen chuyển trong các dòng chuyển gen ở điều kiện nhà kính……… 4.1.7 Phân tích các dòng ngô chuyển gen T1 nhận được và đánh giá biểu hiện của gen chuyển trong các dòng chuyển gen ở điều kiện nhà kính……… 4.1.8 Tổng kết hiệu quả chuyển nạp của các vector biểu hiện mang gen kháng sâu cry1A(c)/vip3A………

4.2 Nghiên cứu tạo dòng ngô kháng sâu/kháng thuốc diệt cỏ bằng phương pháp lai ngược (backcross) ………

4.2.1 Thu thập, tuyển chọn nguồn gen các dòng/giống ngô ưu việt

và các nguồn gen các dòng/giống ngô kháng sâu, kháng thuốc diệt cỏ……… 4.2.2 Nghiên cứu tạo dòng ngô kháng sâu/kháng thuốc diệt cỏ bằng phương pháp lai ngược………

CHƯƠNG 5: TỔNG QUÁT HÓA VÀ ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ THU ĐƯỢC……… 4.1 Kết quả về khoa học……… 4.2 Kết quả đào tạo……… 4.3 Kết quả nổi bật ……… 4.4 Trình độ công nghệ……… 4.5 Khả năng áp dụng……… 4.6 Tình hình sử dụng kinh phí……… 4.7 Danh sách các công trình công bố……… 4.8 Hạn chế của đề tài ………

CHƯƠNG 6: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……… 6.1 Kết luận……… 6.2 Kiến nghị………

CHƯƠNG 7: TÀI LIỆU THAM KHẢO………

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Sản lượng của các nước sản xuất ngô chính

Bảng 2.2 Diện tích và năng suất các loại cây trồng chuyển gen chính

Bảng 2.3 Danh mục các cây một lá mầm (ngô, lúa) được chuyển gen Bt

Bảng 2.4 Các event được phát triển nhằm tạo giống ngô chuyển gen thương mại

Bảng 2.5 Số liệu thống kê sản xuất ngô ở Việt Nam năm 2009

Bảng 3.1 Trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu tạo dòng ngô kháng sâu bằng kỹ thuật biến nạp

di truyền

Bảng 3.2 Trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu tạo các dòng/giống ngô kháng thuốc diệt cỏ bằng

phương pháp lai ngược (backcross)

Bảng 4.1 Một số đặc điểm nông học của các dòng ngô nhập nội

Bảng 4.2 Đặc tính nông sinh học của các dòng ngô Việt Nam

Bảng 4.3 Thông tin về vector pADT1

Bảng 4.4 Thông tin về vector pADT2

Bảng 4.5 Thông tin về vector pADT3

Bảng 4.6 Thông tin về vector pADT4

Bảng 4.7 Thông tin về vector pADT5

Bảng 4.8 Thăm dò phản ứng in vitro và khả năng tái sinh của một số dòng ngô chọn lọc

Bảng 4.9 Biểu hiện tạm thời của gen gus sau khi lây nhiễm các chủng Agrobacterium khác nhau

vào phôi non dòng ngô VH1

Bảng 4.10 Biểu hiện tạm thời của gen gus sau khi biến nạp với các chủng Agrobacterium khác

nhau vào phôi non dòng ngô VH11

Bảng 4.11 Kết quả các thí nghiệm biến nạp gen kháng sâu vào các dòng ngô vụ đông xuân 2007 Bảng 4.12 Kết quả các thí nghiệm biến nạp gen kháng sâu vào các dòng ngô vụ hè thu 2008

Bảng 4.13 Kết quả các thí nghiệm biến nạp gen kháng sâu vào các dòng ngô vụ đông xuân 2008 Bảng 4.14 Kết quả các thí nghiệm biến nạp gen kháng sâu vào các dòng ngô vụ hè thu 2009

Bảng 4.15 Kết quả các thí nghiệm biến nạp gen kháng sâu vào các dòng ngô vụ đông xuân

2009-2010

Bảng 4.16 Kết quả PCR phân tích các dòng ngô chuyển gen T0 (2007-2010)

Bảng 4.17 Kết quả phân tích Southern blot của các event thế hệ T0

Bảng 4.18 Kết quả xác định protein cry1Ac và thử sâu của các cây chuyển gen thế hệ T0

Bảng 4.19 Kết quả phân tích các dòng ngô chuyển gen T1

Bảng 4.20 Đánh giá hiệu quả chuyển nạp của các vector biểu hiện mang gen kháng sâu

cry1A(c)/vip3A ở ngô (2007-2010)

Bảng 4.21 Một số đặc tính nông sinh học của các nguồn vật liệu mang gen kháng sâu

Bảng 4.22 Một số đặc điểm nông học của các nguồn vật liệu kháng thuốc trừ cỏ

Bảng 4.23 Một số đặc điểm nông học chính của các tổ hợp lai giữa các dòng ưu tú với các nguồn

kháng thuốc trừ cỏ

Bảng 4.24 Đặc tính nông học của các dòng kháng thuốc trừ cỏ Glyphosate (BC3)

Bảng 4.25 Đặc tính nông học của các dòng kháng thuốc trừ cỏ Glyphosate (BC3)

Bảng 4.26 Kết quả đánh giá các tổ hợp backcross kháng thuốc diệt cỏ glyphosate

Bảng 4.27 Khả năng kết hợp chung của cây thử

Bảng 4.32 Đặc tính nông sinh học của các dòng kháng sâu đục thân (BC2)

Bảng 4.33 Đặc tính nông sinh học của các dòng kháng sâu đục thân (BC3)

Bảng 4.34 Kết quả đánh giá các tổ hợp backcross kháng sâu

Bảng 4.35 Tóm tắt các tổ hợp lai qua các năm nghiên cứu

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Phản ứng tổng hợp EPSP từ S3P và PEP dưới sự xúc tác của enzyme EPSPS

Hình 4.1 Sơ đồ cấu trúc vector pC1300-Ubi-cryIA(c) (ký hiệu pADT1)

Hình 4.2 Sơ đồ cấu trúc vector pNOV-Ubi-cryIA(c) (ký hiệu pADT2)

Hình 4.3 Sơ đồ cấu trúc vector pPTN-Ubi-cryIA(c) (ký hiệu pADT3)

Hình 4.4 Sơ đồ cấu trúc vector pNOV-35S-vip3A (ký hiệu pADT4)

Hình 4.5 Sơ đồ cấu trúc vector pPTN-35S-vip3A (ký hiệu pADT5)

Hình 4.6 Sơ đồ quy trình tái sinh cây từ phôi non của các dòng ngô chọn lọc

Hình 4.7 Biểu hiện của gen gus ở phôi non dòng ngô chọn lọc sau khi lây nhiễm với các

chủng A.tumefaciens khác nhau

Hình 4.8 Sơ đồ quy trình chuyển nạp gen vào dòng ngô chọn lọc

Hình 4.9 Sơ đồ quy trình tạo cây ngô mang gen kháng sâu

Hình 4.10 Một số hình ảnh tái sinh cây trong phòng thí nghiệm

Hình 4.11 Bắp của các cây ngô T0 thu được sau khi đưa ra môi trường tự nhiên

Hình 4.12 Một số hình ảnh tái sinh của cây ngô chuyển gen

Hình 4.13 Bắp của cây T0 vụ đông xuân 2008

Hình 4.14 Phân tích PCR gen pmi trên các cây T0

Hình 4.15 Phân tích PCR gen Cry1A(c) trên các cây T0

Hình 4.16a Kết quả phân tích PCR sử dụng lai Southern blot của các dòng ngô chuyển gen

thế hệ T0

Hình 4.16b Kết quả phân tích Southern blot của các dòng ngô chuyển gen thế hệ T0

Hình 4.17 Kết quả xác định protein Cry1Ac các cây chuyển gen thế hệ T0 dòng HR9

Hình 4.18 Hình ảnh kết quả thử sâu trong điều kiện nhà lưới

Hình 4.19 Phân tích PCR gen pmi trên các cây T1

Hình 4.20 Phân tích PCR gen Cry1A(c) trên các cây T1

Hình 4.21a Kết quả phân tích PCR sử dụng lai Southern blot của các cây ngô chuyển gen

thế hệ T1 của dòng VN106

Hình 4.21b Kết quả phân tích Southern blot của các cây ngô chuyển gen thế hệ T1 của

dòng VN106

Hình 4.22 Phân tích PCR gen CP4-EPSPS trên các cây BC4 thuộc dòng 2ABC4S2

Hình 4.23 Kết quả xác định protein Cry1Ac các cây của dòng 2BBC4S2

Hình 4.24 Hình ảnh của các dòng ngô tạo ra bằng phương pháp lai backcross

Hình 4.25 Phân tích PCR gen cry1A(c) trên các cây F1 TN118 x VH1

NOS: Nopaline Synthetase

NS, N.suất: Năng suất

OD600: Mật độ vi khuẩn đo ở bước sóng 600nm bằng quang phổ kế DUR800 Spectrophotometer của hãng Beckman Coulter

PCR: Polymerase Chain Reaction

TT Chức danh khoa học, học vị, họ và tên Tổ chức công tác

A Chủ nhiệm đề tài

TS Nguyễn Văn Đồng

Viện Di truyền nông nghiệp

B Cán bộ tham gia nghiên cứu

CHƯƠNG 1

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Ngô là một trong ba cây lương thực quan trọng nhất trên thế giới (cùng với lúa

mì và gạo), và là cây lương thực có vai trò kinh tế quan trọng bậc nhất, so với lúa

mì và lúa gạo thì ngô đứng thứ ba về diện tích, thứ hai về năng suất nhưng thứ nhất

về sản lượng Tính đến năm 2009 diện tích trồng ngô thế giới vào khoảng 157, 51 triệu ha, năng suất 4,96 tấn/ha, sản lượng đạt 785,1 triệu tấn Theo dự đoán, vào năm 2020, nhu cầu về cây ngô sẽ tăng lên 50% với hơn 800 triệu tấn một năm và

có thể vượt qua cả gạo và lúa mì (Pingali và Padney, 2001) Công nghệ sinh học được mong đợi sẽ đóng vai trò làm tăng sản lượng ngô đáp ứng đủ nhu cầu ngày một tăng của thế giới

Tại Việt Nam, ngô là cây lương thực quan trọng thứ hai sau lúa và là đối tượng chủ lực trong công cuộc xóa đói giảm nghèo, đặc biệt ở các tính vùng núi Năm 2009, diện tích trồng ngô trong nước đạt xấp xỉ 1,1 triệu ha, năng suất khoảng

4 tấn/ ha, sản lượng 4,38 triệu tấn Tuy nhiên sản xuất ngô đang phải đối mặt với tình hình sâu bệnh dịch hại ngày càng tăng Hiện nay, rất nhiều loại thuốc trừ sâu hóa học đang được sử dụng để phòng trừ sâu bệnh với chi phí tốn kém, gây

ô nhiễm môi trường và gây độc hại cho sức khỏe con người, vật nuôi Để cải thiện tình hình này, những kỹ thuật tiên tiến trong bảo vệ cây trồng nhằm xây dựng một nền nông nghiệp sạch, bền vững được nghiên cứu ngày càng rộng rãi Trên thế giới, việc tạo ra các giống cây trồng biến đổi di truyền (Genetically Modified Crops, GMCs) có khả năng kháng sâu bệnh và côn trùng nhờ kỹ thuật tạo dòng phân tử, kỹ thuật chuyển gen thực vật đang được quan tâm nghiên cứu

và ứng dụng vào thực tiễn nhằm nâng cao năng suất cây trồng và đem lại lợi ích tối đa cho nền nông nghiệp

Cây ngô chuyển gen đầu tiên được thương mại hóa vào năm 1996, đến năm

2009, sau hơn 10 năm, ngô chuyển gen đã được trồng ở 17 quốc gia với tổng diện tích trồng lên đến 42 triệu ha, chiếm 26% tổng diện tích trồng ngô trên toàn thế giới (http://www.gmocompass.org/) Tuy nhiên các giống ngô GMO này chủ yếu là giống kháng sâu và kháng thuốc trừ cỏ

Tại Việt Nam, cho đến thời điểm đề tài bắt đầu được tiến hành, việc tạo ra các cây trồng biến đổi gen ở nước ta mới chỉ là bước đầu với những nghiên cứu mới được triển khai một cách lẻ tẻ, chưa tập trung Mặc dù trong thời gian gần đây, các nghiên cứu về biến nạp gen đã được chú ý nhiều hơn, nhưng với đối tượng cây ngô, có thể nói đây là loài cây trồng tương đối khó tính trong quá

trình nuôi cấy in vitro cũng như chuyển nạp gen, cho đến nay vẫn chưa có

nghiên cứu nào tạo ra được cây chuyển gen bền vững mang các gen có giá trị Các công trình nghiên cứu trên thế giới đã khá thành công ở đối tượng này, nhưng hầu hết các quy trình biến nạp đều rất phụ thuộc vào kiểu gen, khó được

áp dụng ở các phòng thí nghiệm khác nhau, thậm chí trên cùng một kiểu gen Vì thế, việc xây dựng quy trình, tạo nguồn vật liệu ban đầu thích ứng với điều kiện của Việt Nam là hết sức quan trọng Các nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh

và biến nạp gen thành công trong thời gian vừa qua tại Viện Di truyền Nông nghiệp đã tạo cơ sở để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo, chuyển các gen có giá trị kinh tế vào cây ngô

Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn và dựa trên các cơ sở lý luận khoa học, đề tài

“Tạo dòng ngô biến đổi gen kháng sâu/kháng thuốc diệt cỏ” đã được chúng

tôi tiến hành trong 4 năm từ tháng 10/2006 đến tháng 10/2010 với mục tiêu sử dụng kỹ thuật biến nạp di truyền và hồi giao tạo ra các dòng ngô mang gen kháng sâu/kháng thuốc diệt cỏ

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Sử dụng kỹ thuật biến nạp di truyền và hồi giao tạo ra các dòng ngô mang gen kháng sâu/kháng thuốc diệt cỏ

1.3 Đối tượng nghiên cứu

- Đối tượng được sử dụng để thực hiện thí nghiệm biến nạp và lai hồi giao là các dòng ngô mô hình và các dòng ngô của Việt Nam có phẩm chất, tiềm năng năng suất tốt, làm bố mẹ cho các giống ngô lai đang được trồng phổ biến tại Việt Nam

- Tính trạng được nghiên cứu biến nạp và lai hồi giao vào các dòng ngô là tính trạng kháng sâu và kháng thuốc diệt cỏ

1.4 Phạm vi nghiên cứu

- Nghiên cứu chuyển gen kháng sâu cry1A(c) vào dòng/giống ngô mô hình

và dòng/giống Việt Nam được tiến hành bằng phương pháp biến nạp thông qua

A.tumefaciens tumefaciens

- Nghiên cứu chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ Gluphosinate hoặc Glyphosate vào dòng giống ngô Việt Nam, mô hình được tiến hành bằng phương pháp lai hồi giao

- Đề tài thực hiện trong 4 năm tháng 10/2006 đến tháng 10/2010

1.5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

- Đây là công trình đầu tiên tiến hành nghiên cứu biến nạp gen kháng sâu vào ngô tại Việt Nam

- Quá trình triển khai và thực hiện đề tài đã góp phần đào tạo đội ngũ (nhân lực), tăng cường trang thiết bị (vật lực) phục vụ công tác nghiên cứu chuyển gen

ở thực vật nói chung và ở ngô nói riêng

- Sản phẩm của đề tài sẽ góp phần tăng cường vật liệu khởi đầu và rút ngắn thời gian chọn tạo giống, tạo ra những giống ngô mới có khả năng kháng sâu/kháng thuốc diệt cỏ thể áp dụng được cho sản xuất

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tính cấp thiết của đề tài

Cây ngô là một trong những đối tượng quan trọng để áp dụng các phương pháp công nghệ sinh học, ở nước ta đây là cây lương thực quan trọng thứ hai đứng sau lúa Trong lĩnh vực chọn tạo giống ngô mặc dù đã có những chuyển biến hết sức tích cực nhưng công nghệ sinh học vẫn chưa được áp dụng rộng rãi vào công tác chọn tạo giống ngô Việc áp dụng công nghệ sinh học mới chỉ giới hạn ở việc ứng dụng các công nghệ như công nghệ đơn bội, đánh giá khoảng cách di truyền vào chọn tạo giống ngô ở quy mô rất hạn chế Do đó, đóng góp của công nghệ sinh học vào sản xuất ngô hầu như chưa đáng kể

Trong khi đó, do đặc thù của điều kiện tự nhiên nước ta, từ Nam ra Bắc với

6 vùng sinh thái khác nhau đặt ra cho công tác chọn tạo giống những đòi hỏi rất đặc thù, thậm chí nghiêm ngặt cho từng vùng Việc nghiên cứu ứng dụng công nghệ gen để tạo ra các giống ngô có các đặc tính mới mà phương pháp truyền thống không tạo ra được là hết sức cần thiết để tạo ra các giống ngô thích hợp với các vùng sinh thái khác nhau, nâng cao năng suất và sản lượng ngô

Ở Việt Nam, chúng ta vẫn chưa tạo ra được giống cây trồng chuyển gen, các nghiên cứu chuyển gen chỉ là những nghiên cứu lẻ tẻ, không mang tính chất hệ thống và chỉ giới hạn trong phòng thí nghiệm Để làm chủ được công nghệ hiện đại tạo giống cây trồng như ý muốn của con người, chúng ta cần phải làm chủ được công nghệ tái tổ hợp DNA, trong đó có xác định các gen có ích, phân lập

và thiết kế vector biểu hiện ở các loài thực vật khác nhau, xây dựng hệ thống chuyển gen và đánh giá biểu hiện của gen chuyển, làm cơ sở cho việc tạo ra các giống cây trồng mới, đáp ứng với yêu cầu của sản xuất và xã hội

Các nghiên cứu gần đây cho thấy rằng các giống cây trồng ngắn ngày, chống chịu được sâu bệnh và các điều kiện bất lợi của môi trường như lạnh, hạn có thể

được tạo ra bằng kỹ thuật di truyền Trong hàng loạt các yêu cầu cần phải có để tạo được giống chuyển gen thì việc xây dựng được quy trình chuyển gen thuận lợi và có hiệu quả cao là một trong những đòi hỏi cần thiết Một trong những hạn chế làm giảm hiệu quả của việc chuyển gen vào cây trồng nói chung và đối với cây ngô nói riêng là tần số tiếp nhận gen lạ và kả năng tái sinh thấp Chỉ có một số giống ngô ôn đới: A188 và H99, một số giống ngô có nguồn gốc Trung Quốc: G10, G11 là những giống có tần số biến nạp gen lạ và khả năng tái sinh cao, được dùng làm đối tượng trong các nghiên cứu chuyển gen ở ngô (Stamp, 1994) Tuy nhiên, nhược điểm lớn của các giống ngô này là chúng chỉ thích nghi với điều kiện khí hậu ôn đới mà rất khó thích nghi với điều kiện khí hậu nhiệt đới như ở nước ta Một hệ thống tái sinh cây từ phôi ngô non tạo nguồn vật liệu ban đầu cho các nghiên cứu biến nạp gen đã được thiết lập và tối ưu hoá tại Viện

Di truyền Nông nghiệp (Phạm Thị Lý Thu & CS, 2003)

Các kết quả nghiên cứu trong khoảng thời gian từ 2002 đến 2005 được tiến hành tại Viện Di truyền Nông nghiệp cho thấy, quy trình chuyển gen vào phôi ngô non đã được xây dựng và hoàn thiện sử dụng phương pháp biến nạp bằng

súng bắn gen và thông qua A.tumefaciens Các dòng ngô chuyển gen bền vững

đã nhận được bằng việc áp dụng cả hai quy trình chuyển gen này Điều này cho thấy, việc thu nhận cây ngô chuyển gen bền vững hoàn toàn có thể thực hiện được trong điều kiện nước ta

Cùng với Viện Di truyền Nông nghiệp, các nghiên cứu trong lĩnh vực chuyển gen vào cây trồng cũng đang được tiếp cận, đầu tư và triển khai nghiên cứu, ứng dụng chủ yếu tại các phòng Thí nghiệm của Viện Công nghệ Sinh học, Viện Sinh học Nhiệt đới và Viện Nghiên cứu Lúa Đồng bằng sông Cửu Long Viện Công nghệ Sinh học đã thu thập, phân lập và thiết kế được rất nhiều gen có giá trị, các gen và các vector chuyển gen này sẽ được chuyển giao cho các đơn vị nghiên cứu trong nước cũng như nước ngoài, nhằm chuyển vào các đối tượng thực vật khác nhau, tạo ra các giống cây trồng mang các đặc tính mong muốn

Vector mang gen cry1A(c) sẽ được sử dụng để chuyển vào ngô nhằm tạo các

dòng/giống ngô mới có khả năng kháng sâu (Lê Thị Thu Hiền & CS., 2002)

2.2 1 Tình hình sản xuất ngô trên thế giới

Ngô là một trong ba cây lương thực quan trọng nhất trên thế giới (cùng với lúa

mỳ và gạo), và là cây lương thực có vai trò kinh tế quan trọng bậc nhất, so với lúa

mỳ và lúa gạo thì ngô đứng thứ ba về diện tích, thứ hai về năng suất nhưng thứ nhất

về sản lượng Tính đến năm 2009 diện tích trồng ngô thế giới vào khoảng 157,51 triệu ha, năng suất 4,96 tấn/ha, sản lượng đạt 785,1 triệu tấn Theo dự đoán, vào năm 2020, nhu cầu về cây ngô sẽ tăng lên 50% với hơn 800 triệu tấn một năm và

có thể vượt qua cả gạo và lúa mì (Pingali và Padney, 2001) Ngô được trồng ở hơn

100 quốc gia trên thế giới tập trung ở các nước Mỹ, Trung Quốc, Braxin, Mehicô, Pháp và ấn Độ

Vào những năm cuối thế kỷ 20, ngành sản xuất ngô đã có những bước phát triển nhanh chóng nhờ áp dụng các giống ngô lai, áp dụng biện pháp canh tác tiên tiến và những thành tựu khoa học khác về di truyền tạo chọn giống Mỹ là nước có sản lượng ngô cao nhất thế giới với tổng sản lượng là 307,1 triệu tấn chiếm 39,11% tổng sản lượng của thế giới Châu Á đóng góp khảng 1/3 sản lượng, trong đó Trung Quốc dẫn đầu với 162,5 triệu tấn, năng suất 5 tấn/ha trên diện tích trồng trọt là 25 triệu ha Tại Đông Nam, những nước có diện tích trồng ngô lớn nhất là Indonesia, Philippines, Thái Lan và Việt Nam (Nguồn: FAOSTAT, www.faostat.fao.org)

Bảng 2.1 Sản lượng của các nước sản xuất ngô chính

(Nguồn: USDA, www usda.gov)

TT Quốc gia Sản lượng (triệu tấn) Tổng sản lượng

thế giới (%) 2008/09 2009/2010

2.2.2 Thành tựu và ứng dụng của cây trồng biến đổi gen

Theo báo cáo thường niên của ISAAA, diện tích cây trồng biến đổi gen không ngừng tăng trong thời gian gần đây, đạt 134 triệu ha năm 2009 Cây chuyển gen đã được trồng rộng rãi trên 25 quốc gia Trong số các loại cây trồng chuyển gen chính

đã được thương mại hóa trên toàn cầu, cây đậu tương chuyển gen chiếm 77% , cây bông chuyển gen chiếm 49% và cây ngô chuyển gen chiếm 26%

Bảng 2.2 Diện tích và năng suất các loại cây trồng chuyển gen chính (James, 2009)

Cây trồng Tổng diện tích cây trồng

2.2.3 Chọn tạo cây ngô chuyển gen kháng sâu, kháng thuốc diệt cỏ

a Chọn tạo cây ngô chuyển gen kháng sâu

Bacillus thuringensis (Bt) là loại vi khuẩn đất, phần lớn các độc tố sinh ra

của B thuringensis có khả năng gây độc cao đối với côn trùng thuộc bộ tiêu

chính trong kỹ thuật di truyền tạo cây trồng chuyển gen kháng côn trùng Gen quy định tổng hợp endotoxin đã được phân lập từ những năm 1980 (Schneph và Whitley, 1981) và trở thành gen đầu tiên được sử dụng trong thiết kế cây chuyển gen kháng sâu trên cây khoai tây và cây thuốc lá (Barton et al, 1987) Trong tổng số 134 triệu ha cây trồng biến đổi gen các loại thì các giống cây

trồng chuyển gen Bt chiếm khoảng 19,1 triệu ha (15%) Các loại cây trồng được

chuyển gen rất đa dạng bao gồm: thuốc lá, khoai tây, cải, bông, đậu tương ,

thực quan trọng là ngô và lúa

Các gen Bt (các gen có nguồn gốc từ Bacillius thuringensis) được ứng dụng

và chuyển gen thành công ở cây ngô và cây lúa bao gồm gen cry1Ab, cry1A(c),

cry1Af, cry2A, cry3Bb1, cry34Ab1, cry35Ab1 Trong đó độc tố do gen cry1A(c)

tổng hợp có khả năng kháng với nhiều loài sâu thuộc bộ Lepidoptera

Bảng 2.3 Danh mục các cây một lá mầm (ngô, lúa) được chuyển gen Bt

Cây

trồng Gen chyển Loại sâu hại Nguồn tham khảo

Ngô Cry1Ab Ostrinia nubilalis Koziel et al., 1993;

Amstrong et al., 1995

Cry1A(c) Pectunophora gosippiella

Ostrinia furnacalis Guenée

Buschman et al.,1998 Ali et al, 2010

Cry1Af Diatrea saccharalis,

Spodoptera frugiperda, Agrotis ipsilon,

Loxagrotis albicosta Smith

U.S Environmental Protection Agency 2005;

Catangui và Berg, 2006; Siebert

Diabrotca spp Gao Y et al., 2004

Lúa cry 1Ab Chilo suppressalis,

Cnaphalocrosis medinalis G., Scirpophaga incertulas

Fujimoto et al., 1993; Wunn et al., 1996;

Husnain et al., 2002; Datta et al., 2002; Wu et al., 2002

Cry1A(c) Cnaphalocrosis medinalis G.,

Tu et al.,2000 ; Ramesh et al., 2004

Cry2A Chilo suppressalis,

Maqbol et al., 2001

Năm 1997, gen cry1Ab đã được chuyển vào giống ngô lai giữa giống CML139 và CML 167 biểu hiện khả năng kháng sâu đục thân Ostrinia nubilalis (Bergvinson et al., 1997) Tiếp đó, giống ngô lai CBH351 chuyển gen cry9C đã

được tạo ra và trồng thử nghiệm trên đồng ruộng (William et al., 1997) Năm

2003, Koziel và cộng sự đã tạo ra cây ngô chuyển gen có khả năng kháng cao

đối với sâu đục thân Châu Âu (Ostrinnia nubilalis Hubner) Một phiên bản ngắn

của gen cry1Ab đã được thiết thiết kế, phiên bản này có số cặp guanine-cytocine

tăng từ 38% lên 65% làm tăng biểu hiện của gen trong cây ngô chuyển gen.Một

số gen kháng côn trùng và kháng thuốc diệt cỏ đã được chuyển vào các giống ngô dưới sự cho phép của Cộng đồng chung Châu Âu, và được thương mại hóa năm 2006 Điều đáng lưu ý là hầu hết các giống ngô chuyển gen kháng sâu đã

được thương mại hóa đều mang gen cry1Ab Tuy nhiên, nghiên cứu biến nạp sử dụng vector mang gen cry1A(c) cũng đã thành công trên một số đối tượng cây

trồng như lúa, ngô, khoai tây (Saxena et al., 2004)

Khả năng biểu hiện của các gen cry1A trên cây ngô chuyển gen đã được kiểm

nghiệm trong điều kiện phòng thí nghiệm và điều kiện đồng ruộng Công ty Monsato tiến hành các thí nghiệm đồng ruộng đối với giống ngô chuyển gen

“YieldGard” Baccillus thuringiensis chứa gen cry1A(c) tại Trung Quốc (Ali et

al, 2010), nhằm đánh giá khả năng kháng đối với sâu đục thân châu Á Ostrinia

furnacalis Guenée Kết quả đánh giá thiệt hại của cây và số lượng ấu trùng còn

sống sót chỉ ra rằng giống ngô Bt có khả năng kháng cao đối với sâu đục thân ngô châu Á Speese và cộng sự (2005) tiến hành thí nghiệm đánh giá khả năng

kháng sâu của các giống ngô ngọt chuyển gen Bt trong các điều kiện canh tác

khác nhau tại Virginia, Mĩ Kết quả cho thấy trong điều kiện áp lực sâu vừa phải, cây ngô chuyển gen có khả năng kháng sâu mà không cần sử dụng bất kì biện pháp phòng trừ nào

Các giống ngô kháng sâu là một trong những cây trồng biến đổi gen đầu tiên được thương mại hóa vào năm 1999 Hiện nay, nhiều công ty giống đã bán ra thị trường các giống ngô chuyển gen kháng sâu phát triển từ các “sự kiện biến nạp gen” (transformation events) Các giống ngô này có thể mang một hoặc nhiều gen kháng Cho đến nay, đã có khá nhiều nghiên cứu thành công tạo ra được các giống ngô chuyển gen mang một hoặc hai gen (kháng sâu và kháng thuốc diệt cỏ) Dòng ngô chuyển gen MON 88017 có khả năng kháng côn trùng ở miền tây

(D virgifera) và miền bắc nước Mỹ (D barberi) và biểu hiện khả năng kháng thuốc trừ cỏ glyphosate Hai gen cry3Bb1 và cpepsps đã được chuyển vào dòng ngô LH198 bằng phương pháp biến nạp thông qua A.tumefaciens Dòng ngô

barberi và D baberi zeae của Mexico nhờ việc chuyển 3 gen cry34Ab1, cry35Ab1 và gen pat vào dòng ngô lai HiII thông qua A.tumefaciens Hai gen cry34Ab1, cry35Ab1 phân lập từ vi khuẩn Bt dòng PS149B1 được chuyển vào

dòng ngô lai HiII và gen pat cũng được chuyển đồng thời vào dòng ngô này, cho

phép người ta sử dụng glufosinate như một công cụ chọn lọc các cây có mang hai gen nói trên Dòng ngô BT11 vừa có khả năng kháng côn trùng, vừa có khả năng kháng thuốc diệt cỏ đặc biệt là glufosinate Dòng ngô ngày được tạo ra

bằng việc chuyển trực tiếp plasmid pZ01502 có chứa một dạng gen cry1Ab và gen pat vào tế bào trần và tái sinh cây trên môi trường chọn lọc (Duyn, 2008)

Một tiến bộ mới đây trong nghiên cứu tìm nguồn gen kháng khác nguồn

cry, nhằm đa dạng hóa nguồn gen sử dụng trong phòng trừ sâu hại cây trồng, là

việc phát hiện ra các gen độc tố vip được biểu hiện trong vi khuẩn B

thuringiensis ở giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng (vip-vegetative insecticidal

protein) Đây là loại độc tố có phổ kháng rộng, kháng được nhiều loài côn trùng

gây hại Tiêu biểu nhất cho nhóm gen này là gen vip3A, một gen độc tố đang được nghiên cứu ứng dụng trong phòng trừ sâu hại cây trồng vip3A từ B

thuringensis, kháng các loài sâu thuộc bộ Lepidoptera, vip1 và vip2 từ B.cereus

kháng các loài sâu thuộc bộ Coleodoptera (Estruch et al, 1996; Moellenbeck et

al, 2001) Protein kháng sâu do gen vip tạo ra có phương thức gây độc hoàn toàn khác so với độc tố do gen cry1A tạo ra (Lee et al, 2003) Vì vậy, việc kết hợp sử dụng gen vip3A với các gen cry trong chuyển gen vào cây trồng sẽ làm gia tăng

phổ gây hại, tăng tính kháng bền vững của cây chuyển gen đối với sâu hại

Bảng 2.4 Các event được phát triển nhằm tạo giống ngô chuyển gen

thương mại (Duyn, 2008)

Gen chuyển Công ty phát

triển giống Giống nguyên bản Tên thương mại

cry1Ab Monsanto Syngenta NK Agrisure CB

Yieldgard CB

cry1Ab Monsanto Dekalb và một số giống khác Yieldgard CB

cry1F Mycogen Mycogen, Pioneer và một số

b Chọn tạo cây ngô chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ

Trong sản xuất nông nghiệp, kiểm soát cỏ dại là một vấn đề quan trọng, nếu không kiểm soát cỏ dại có thể làm giảm sản lượng cây trồng từ 20-60% Ngày nay, hàng loạt các biện pháp phòng trừ cỏ dại đã được áp dụng như: sử dụng các thuốc diệt cỏ chọn lọc hoặc không chọn lọc, phun 1 lần hoặc phun liên tục trước

và sau khi trồng Đặc biệt ở những vùng có hiện tượng xói mòn đất, thuốc diệt

cỏ được sử dụng như một giải pháp duy nhất để loại trừ cỏ dại

Glyphosate (N-(phosphonomethyl) glycine) là chất diệt cỏ phổ rộng, không chọn lọc (Amrhein et al., 1980, 1983), được sử dụng để diệt các loài cỏ dại, cây

có lá rộng và các cây lấy gỗ Nó được phun hoặc cho hấp thụ qua lá, hoặc tiêm vào thân và di chuyển tới phần mô đang phát triển Sản phẩm thương mại đầu tiên có tên là Roundup do Công ty Monsanto sản xuất vào năm 1970 Theo số liệu thống kê ở Mỹ hằng năm sử dụng glyphosate khoảng từ 2500 - 4000 tấn ở mức độ gia đình và 40000 - 50000 tấn cho sản xuất nông nghiệp

Glyphosate là một chất ức chế cạnh tranh với phosphoenolpyruvate (PEP) trong quá trình tổng hợp 5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate (EPSP) Dưới sự