nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học trogn việc tạo dòng bố, mẹ phục vụ cho chọn giống lúa lai siêu cao sản ở việt nam

Cùng với sự phát triển mạnh mẽ của chỉ thị phân tử, một quy trình công nghệ chọn giống mới được ra đời, đó là quy trình chọn giống nhờ chỉ thị phân tử Marker-Assisted Selection MAS.Thông

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN

CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC CÔNG NGHỆ CẤP NHÀ NƯỚC

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KC.04 /06-10

BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI NĂM 2009-2010

Tên đề tài: Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học trong việc tạo dòng

bố, mẹ phục vụ cho chọn giống lúa lai siêu cao sản ở Việt nam

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN

CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC CÔNG NGHỆ CẤP NHÀ NƯỚC

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KC.04/ 06-10

BÁO CÁO TỔNG HỢP

KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI NĂM 2009-2010

Tên đề tài: Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học trong việc tạo dòng

bố, mẹ phục vụ cho chọn giống lúa lai siêu cao sản ở Việt Nam

MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU……….… 3

1 Mục tiêu của đề tài……… … 5

2 Đối tượng nghiên cứu……….……… … ……6

3 Tính cấp thiết ……… ……6

4 Phạm vi nghiên cứu………… ……….………… … 6

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn……… ……… ………6

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU……….…… ……7

1.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu và phát triển lúa lai các nước trên thế

giới………… ……… ….7

1.1.1 Tình hình nghiên cứu và phát triển lúa lai ở ở các nước trên thế giới……….……….…… … 7

1.1.2 Chỉ thị phân tử và ứng dụng trong chọn giống cây trồng 8

1.1.3 Nghiên cứu sử dụng chỉ thị phân tử liên kết với gen kháng bệnh

bạc lá trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh ………… ………… … 11

1.1.4 Nghiên cứu sử dụng CTPT liên kết với gen kháng rầy nâu gen phụchồi 14

1.1.5 Nghiên cứu sử dụng CTPT liên kết với gen TGMS … 16

1.1.6 Nghiên cứu sử dụng CTPT liên kết với gen WC… …17

1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước……… ……… …17

1.2.1 Nghiên cứu phát triển lúa lai đại trà…… ……17

1.2.2 Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học trong chọn giống lúa lai… ……… ……… …… 20

CHƯƠNG 2: VÂT LIỆU NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ……… … 25

2.1 Vật liệu nghiên cứu……… …………25

2.1.1 Các dòng giống lúa……… …… 25

2.1.2 Nguồn bệnh 25

2.1.3 Hoá chất và các cặp mồi 25

2.2 Nội dung nghiên cứu………… … 28

2.3 Phương pháp nghiên cứu…… ……… ……….29

2.3.1 Phương pháp chọn tạo giống truyền thống ……….29

2.3.2 Phương pháp phân tích phân tử… …31

2.3.3 Phương pháp lây nhiễm nhân tạo đánh giá … …… 35

2.3.4 Phương pháp phân loại các dòng, giống …… … 37

2.3.5 Phương pháp thí nghiệm đồng ruộng 38

CHƯƠNG 3: CÁC KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC 39

3.1 Kết quả đánh giá các dòng, giống lúa Indica và Japonica 39

3.2 Kết quả xác định sự có mặt của chỉ thị phân tử (CTPT) liên kết với các gen quan trọng trong lúa lai 51

3.2.1 Kết quả xác định các CTPT liên kết với gen kháng bệnh bạc

lá 51

3.2.2 Kết quả xác định sự có mặt của CTPT liên kết với gen kháng rầy nâu .60

3.2.3 Kết quả xác định sự có mặt của chỉ thị phân tử liên kết với gen tương hợp rộng………… ……… ……… 62

3.2.4 Kết quả xác định sự có mặt của CTPT liên kết với gen phục hồi……… 63

3.2.5 Kết quả xác định sự có mặt của CTPT liên kết với gen TGMS……… … ……… 68

3.3 Sử dụng CTPT kết hợp với phương pháp lai truyền thống chọn các dòng bố, mẹ kháng bệnh……… ……… 69

3.3.1.1 Chọn dòng bố có gen kháng bằng chỉ thị phân

tử……….71

3.3.1.2 Kết quả lây nhiễm nhân tạo các cá thể chứa gen kháng……… …75

3.3.1.3 Đánh giá đặc tính nông sinh học, năng suất của các dòng bố có gen kháng bạc lá được lựa chọn ……… ……….75

3.3.2 Lai và chọn lọc các dòng TGMS mang gen kháng bệnh bạc lá

………… ……… 77

3.3.3 Kết quả chọn tạo dòng bố lúa lai ba dòng mang gen phục hồi (RF)……… ……….82

3.3.4 Kết quả ứng dụng phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử chọn giống bất dục đực mẫn cảm nhiệt độ (TGMS) ……….………… 86

3.3.5 Kết quả chọn lọc các dòng bố, mẹ có gen WC 88

3.3.5.1 Kết quả chọn lọc các dòng mẹ có gen tương hợp

rộng 88

3.3.5.2 Kết quả chọn các dòng bố có gen tương hợp rộng……….… … 93

3.3.6 Kết quả chọn tạo dòng bố mẹ mang gen kháng bệnh bạc lá và rầy nâu……… 96

3.4 Lai, chọn các tổ hợp lai có triển vọng……… … 100

3.5 Kết quả đánh giá năng suất của các tổ hợp lai triển vọng……… … 110

3.5.1 Kết quả sản xuất hạt F1 của các tổ hợp lúa lai triển vọng … ……… ………110

3.5.2.Kết quả so sánh, đánh giá tiềm năng nằng suất các tổ hợp lúa lai triển vọng……… ….114

3.6 Sản phẩm KH & CN của đề tài dự án………126

3.6.1 Sản phẩm KH&CN đã tạo ra……… …… 126

3.6.2 Đánh giá về hiệu quả do đề tài, dự án mang lại 129

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……… … 130

4.1 Kết luận……… ……… … 130

4.2 Kiến nghị……… ……… 132

TÀI LIỆU THAM KHẢO……….…… ………133

Phụ lục 1a……… ………140

QUY TRÌNH CHỌN TẠO DÒNG MẸ TGMS KHÁNG BẠC LÁ, MẸ TGMS CÓ GEN TƯƠNG HỢP RỘNG……… …….140

1 Sơ đồ lai tạo, chọn tạo dòng TGMS kháng bạc lá, dòng TGMS có gen tương hợp rộng ……… ……… 140

1.1 Sơ đồ lai tạo dòng TGMS có gen kháng bạc lá, dòng TGMS có gen tương hợp rộng……….………140

1.2 Các chỉ thị đã xác định phục vụ cho chọn tạo các dòng TGMS có gen kháng bạc lá, TGMS có gen tương hợp rộng……….………… 141

2 Các bước tiến hành……… ……….141

Phụ lục 1b: Các chỉ thị phân tử và phương pháp phân tích trong phòng thí nghiệm ……… ……… ………145

Phụ lục 2a……… ……… ………148

QUY TRÌNH CHỌN TẠO DÒNG BỐ CÓ GEN KHÁNG BẠC LÁ, GEN TƯƠNG HỢP RỘNG ……… ………….…………148

1 Sơ đồ lai tạo và các chỉ thị phân tử sẽ sử dụng……… …….…… …148

2 Các bước tiến hành……… ……… 149

Phụ lục 2b: Các chỉ thị phân tử và phương pháp phân tich trong phòng thí nghiệm ……… ……… ………152

1, Các chỉ thị liên kết với gen Xa4, xa5, Xa7 ……… …….152

2, Phương pháp phân tích phân tử……… ……… 152

3, Phương pháp lây nhiễm nhân tạo đánh giá khả năng kháng bệnh… 157

BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AND Axit deoxyribonucleic - Deoxyrybonucleic acid

AFLPs Đa hình chiều dài đoạn phân cắt được nhân bội -

Amplified fragment length polymophisms

B Dòng duy trì bất dục đực cho dòng CMS - Maintainer BAC Nhiễm sắc thể nhân tạo của vi khuẩn –

Bacterial artificial chromosome

BC Lai trở lại – Backcross

BSA Phân tích thể phân ly theo nhóm –

Bulked segregant analysis CAPs Trình tự đa hình được nhân bội và phân cắt –

Cleaved amplyfied polymophic sequences

cM Centimorgan (đơn vị đo chiều dài bản đồ di truyền) CMS (ký hiệu là dòng A) – Bất dục đực tế bào chất –

Cytoplasmic male sterility

IRRI Viện nghiên cứu lúa Quốc tế -

International rice research institute

LOD Tỷ số chênh lệch có khả năng nhất –

pms Gen bất dục đực nhân nhạy cảm với chu kỳ chiếu sáng – Photoperiod sensitive genic male sterility gene

QTLs Những locut kiểm soát tính trạng số lượng-

Quantitative trait loci

RAPD AND khác biệt được nhân bội ngẫu nhiên –

RFLPs Đa hình chiều dài đoạn phân cắt giới hạn-

SSRs Những trình tự lặp lại đơn giản

– Simple sequence repeats

Themosensitive genic male sterility

Themosensitive genic male sterility gene

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Gene kháng rầy nâu đã được công bố……… ……… 15

Bảng 2.1 Thành phần dung dịch EB (extraction buffer)……… ……… 31

Bảng 2.2 Thành phần dung dịch CTAB Buffer và dung dịch TE 31

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR 33

Bảng 2.4 Chu trình nhiệt của phản ứng 34

Bảng 3.1 Đặc tính nông sinh học của một số dòng trong tập đoàn giống lúa Japonica, Xuân 2009 39

Bảng 3.2 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của tập đoàn giống lúa Japonica tại Viện CLT-CTP, Xuân 2009 41

Bảng 3.3 Một số đặc điểm chất lượng gạo của tập đoàn lúa Japonica 43

Bảng 3.4 Khả năng chống chịu bệnh bạc lá, đạo ôn và rầy nâu của một số dòng giống lúa Japonica 47

Bảng 3.5 Đặc điểm một số dòng Indica có trong tập đoàn 49

Bảng 3.6 Gen kháng bệnh bạc lá đã được xác định trước 6/2005 51

Bảng 3.7 Kiểm tra độ chính xác của chỉ thị MP1, MP2 thông qua lây nhiễm nhân tạo 54

Bảng 3.8 Kiểm tra độ chính xác của chỉ thị P3 thông qua lây nhiễm nhân tạo……… 56

Bảng 3.9 Kiểm tra độ chính xác của chỉ thị phát hiện gen Xa21 và xa5 thông qua lây nhiễm nhân tạo chủng gây bệnh đặc trưng (Chủng 4)… 57

Bảng 3.10 Các chỉ thị liên kết với gen Xa4, xa5, Xa7 và Xa21 và trình tự mồi tương ứng……… ….59

Bảng 3.11 Chỉ thị phân tử sử dụng trong nghiên cứu di truyền tính phục hồi hữu thụ của dòng bố mẹ……… … 64

……… …69 Bảng 3.13 Tổng hợp kết quả PCR phát hiện gen Xa4, xa5, Xa7 và Xa21

……… ……… 71 Bảng 3.14 Phản ứng của các cá thể chọn đối với 3 chủng bệnh bạc lá… …75 Bảng 3.15 Một số đặc điểm nông học cơ bản của các dòng R mang gen kháng

bạc lá - vụ Xuân 2010……… 76 Bảng 3.16 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của một số dòng R

mang gen kháng bạc lá vụ xuân - năm 2010……….… 77 Bảng 3.17 Các dòng TGMS bất dục thế hệ F5BC1 78 Bảng 3.18 Tổng hợp kết quả chọn lọc gen kháng bạc lá ở các quần thể dòng

mẹ……… 80

B ng 3.19 Năng suất và các yếu tố cấu thành thành năng suất của một số dòng

R triển vọng vụ Xuân năm 2010……….83 Bảng 3.20 Một số đặc điểm nông học cơ bản của các dòng R triển vọng mang

gen phục hồi ……….85 Bảng 3.21 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của một số dòng R triển

vọng mang gen phục hồi được xác định băng CTPT - vụ Xuân năm 2010 ……… … 86

Bảng 3.23 Một số đặc tính về dạng hình của các dòng TGMS 89 Bảng 3.24 Một số đặc tính nông sinh học của các dòng TGMS mới ở thời kì bất

dục 90 Bảng 3.25 Một số đặc tính nông sinh học của các dòng TGMS mới thời kỳ bất

dục……… 90 Bảng 3.26 Kết quả kiểm tra gen tương hợp rộng của các của các dòng TGMS

mới được chọn lọc……… 91 Bảng 3.27 Kết quả đánh giá độ thuần đồng ruộng của các dòng TGMS

mới 92

Bảng 3.28 Kết quả đánh giá độ thuần đồng ruộng của các dòng TGMS

mới 93 Bảng 3.29 Đặc điểm của các dòng lúa bố mới từ tổ hợp lai có mẹ mang gen

tương hợp rộng 94 Bảng 3.30 Các tổ hợp lai F1 và F1BC1……… ……….… 96 Bảng 3.31: Chọn được 39 tổ hợp cao hơn hẳn so với đối chứng vụ mùa

2009……… ………… 102 Bảng 3.32 Chọn được 72 tổ hợp cao hơn hẳn so với đối chứng vụ mùa

2009……….…105 Bảng 3.33 Kết quả quan sát và đánh giá cuối cùng chúng tôi đã chọn ra được

58 tổ hợp có độ thuần tốt và năng suất thực thu cao từ 70 tạ/ha – 113 tạ/ha được trình bày tại bảng 3.33 như sau: (Vụ xuân 2010)……… ……… 108 Bảng 3.34 Thời vụ gieo của các tổ hợp triển vọng………… ………111 Bảng 3.35 Thời gian sinh trưởng của các dòng bố mẹ (Vụ Xuân 2010)… 112 Bảng 3.36 Khối lượng hạt F1 và độ thuần của các tổ hợp……… …………113 Bảng 3.37 Một số đặc điểm nông sinh học của các tổ hợp tham gia thí nghiệm

so sánh vụ xuân 2009……… … 114 Bảng 3.38 Các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất thực thu của các tổ hợp

trong thí nghiệm so sánh – vụ xuân 2009…… … …… 116 Bảng 3.39 Một số đặc điểm nông sinh học của các tổ hợp vụ mùa

2009 118 Bảng 3.40 Các yếu tố cấu thành năng suất các tổ hợp mùa 2009 119 Bảng 3.41 Một số đặc điểm nông sinh học của các tổ hợp trong thí nghiệm so

sánh vụ xuân 2010 121 Bảng 3.42 Mức độ sâu bệnh hại của các tổ hợp trong thí nghiệm Sơ khởi vụ

xuân 2010 trên đồng ruộng 122

Bảng 3.43a Các yếu tố cấu thành năng suất của các tổ hợp trong thí nghiệm so

sánh vụ xuân 2010 123 Bảng 3.43b: Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất, năng suất lý thuyết và

năng suất thực thu của một số giống lúa khảo nghiệm, vụ Hè Thu 2010, tại Krông Pắk - Đắk Lắk 125

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH VÀ SƠ ĐỒ

Hình 3.1 Điện di sản phẩm PCR gen Xa4 các cây Bố, Mẹ, F1 và quẩn thể F2

của tổ hợp lai (IR24 x IRBB4)……….……… 53

Hình 3 2 Hình ảnh lây nhiễm nhân tạo gen Xa4 chủng 2A 54

Hình 3.3: Điện di sản phẩm PCR gen Xa7các cây Bố, Mẹ, F1 và quẩn thể F2 của tổ hợp lai (IR24 x IRBB7) 53

Hình 3.4 Điện di sản phẩm PCR gen Xa21các cây Bố, Mẹ, F1 và quẩn thể F2của tổ hợp lai (IR24 x IRBB21) 58

Hình 3.5 Hình ảnh lây nhiễm nhân tạo chủng 4 trên gen Xa21……… 58

Hình 3.6 Hình ảnh lây nhiễm nhân tạo chủng 4 trên gen xa5…… … ….58

Hình 3.7 Ảnh minh hoạ sử dụng chỉ thị phân tử SSR (RM7187) liên kết BphZ xác định con lai mang gen kháng……… 61

Hình 3.8 Ảnh minh hoạ sử dụng chỉ thị phân tử RM6997 chọn lọc các dòng mang gen kháng……… …… ….61

Hình 3.9 Ảnh minh họa kết quả đánh giá mức kháng trên đồng ruộng……… 62

Hình 3.10 Sự đa hình của các mồi khi chạy với dòng bố mẹ … ….… … 63

Hình 3.11.Các chỉ thị cho đa hình khi chạy với bố mẹ ……… …….67

Hình 3.12 Kết quả chạy genotype với marker RM258……… …….67

Hình 3.13 Kết quả chạy genotype với marker RM315……… … …….68

Hình 3.14 Kết quả chạy genotype với marker RM5862……… … 68

Hình 3.15 Kết quả chạy genotype với marker RM5897……… 69 Hình 3.16 Điện di sản phẩm PCR phát hiện và chọn lọc gen kháng

Xa4……… ………… 72 Hình 3.17 Điện di sản phẩm PCR phát hiện và chọn lọc gen kháng

xa5……… ………72 Hình 3.18 Điện di sản phẩm PCR phát hiện và chọn lọc gen kháng Xa7quần thể

V140………… ……… 81 Hình 3.19 Kết quả chạy genotype với marker RM225… … ……… 95 Hình 3 20 Kết quả chạy genotype với marker RM253……… ………… 95 Hình 3.21 Ảnh minh hoạ sử dụng chỉ thị phân tử SSR (RM 6997) liên kết

BphZ chọn lọc các dòng mang gen kháng của tổ hợp lai 1028/E7……… 99 Hình 3.22 Ảnh minh hoạ sử dụng chỉ thị phân tử SSR SSR (RM7187) liên kết

BphZ xác định con lai BC1 mang gen kháng của tổ hợp lai……….……100

Sơ đồ lai tạo dòng TGMS có gen kháng bạc lá, dòng TGMS có gen tương hợp rộng……… ……… 140

Sơ đồ lai tạo và các chỉ thị phân tử sẽ sử dụng…… ……… 148

MỞ ĐẦU

Lúa gạo là lương thực của 3 tỉ người trên thế giới, phần lớn lúa gạo trên thế giới được tiêu thụ bởi những nông dân trồng lúa Sản lượng lúa gia tăng trong thời gian qua đã mang lại sự an sinh Ngày 16/12/2002, kỳ họp thứ 57 hàng niên của Hội đồng Liên hiệp Quốc đã chọn năm 2004 là năm Lúa gạo Quốc tế với khẩu hiệu “Cây lúa là Cuộc sống” Lúa là cây lương thực quan trọng có diện tích 148,4 triệu ha ở thế giới, (trong đó Châu Á 135 triệu ha) Việt Nam có diện tích sản xuất lúa 4,089 triệu ha, sản lượng 39,900 triệu tấn (Bùi Bá Bổng, 2010) Những năm gần đây, năng suất của giống lúa thuần đã gần kịch trần Việc nghiên cứu khai thác ưu thế lai đã trở thành một giải pháp quan trọng để tạo ra những giống lúa mới có năng suất cao Lúa lai là một trong những thành tựu khoa học nông nghiệp lớn nhất trong thập kỷ 80, là một tiến bộ

kỹ thuật đã được ứng dụng vào nước ta với tốc độ nhanh chóng, trên quy mô ngày càng rộng lớn Năng suất lúa lai cao hơn lúa thuần từ 20%-30% không chỉ

ở Trung Quốc mà còn ở hàng loạt các nước trên thế giới Như vậy sử dụng ưu thế lai ở lúa là một trong những chiến lược quan trọng để tăng năng suất lúa Lúa lai đã được đưa vào khảo nghiệm và nhanh chóng phát triển ở nước ta Năm 2004 tổng diện tích lúa lai là 577.000 ha với năng suất là 6.04tấn /ha Từ năm 2005 đến 2007 mỗi năm diện tích lúa lai là 600-650.000 ha Qua 15 năm phát triển lúa lai những vùng sản suất lúa lai chính được xác định rõ là các tỉnh miền núi phía bắc, vụ xuân ở các tỉnh đồng bằng sông Hồng, các tỉnh bắc Trung

bộ Gần đây lúa lai đươc trồng trên diện tích lớn ở Tây Nguyên và một số tỉnh Duyên Hải Nam Trung Bộ và vùng trung tâm lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long Hiện nay nhiều tổ hợp lúa lai Trung Quốc và lai tạo trong nước có chất lượng cao như: Nhị Ưu 838, Bắc ưu 903, D.ưu 527, Sin 6, Bio 404, Bồi tạp sơn thanh, Bồi tạp 49, VL20, TH3-3, HYT83, HYT100, HYT102, HYT103 được gieo trồng trong sản suất thay thế dần tổ hợp Sán ưu 63 có chất lượng thấp Tuy nhiên trong nghiên cứu và phát triển lúa lai ở nước ta vẫn tồn tại nhiều hạn chế

và khó khăn:

Còn thiếu những tổ hợp lúa lai có năng suất cao, chất lượng tốt, kháng sâu bệnh được chọn tạo ở trong nước

Việt Nam đã chọn tạo được một số tổ hợp lai có năng suất khá cao, chất lượng tốt nhưng tính kháng rầy nâu, bạc lá chưa cao, năng suất hạt lai trong sản xuất hạt lai F1còn thấp, việc sản xuất hạt giống gặp khó khăn nên diện tích tăng chậm không thật sự nổi trội so với lúa lai 3 dòng nhập nội Nhiều tổ hợp lúa lai 2 dòng cho năng suất hạt lai cao như VL 20, TH 3-3 nhưng năng suất hạt lai thương phẩm còn thấp…

suất thực tế không cao trên diện đại trà do bố mẹ chưa thích ứng với điều kiện sinh thái của Việt Nam, đặc biệt nhiễm nặng với bạc lá, rầy nâu

chọn tạo giống lúa lai hạn chế

Ngày nay, công nghệ sinh học được coi như là phương tiện hữu ích để giải quyết những vấn đề khó khăn mà công tác chọn giống truyền thống không thể thực hiện được Những thành tựu của kỹ thuật chỉ thị phân tử ADN và kỹ thuật lập bản đồ gen kiểm soát các tính trạng kinh tế quan trọng là những công

cụ mới góp phần trợ giúp đắc lực cho công tác chọn tạo các giống cây trồng Hiện nay có khoảng 20 gen chính kháng bệnh bạc lá, 30 gen kháng đạo ôn, 12 gen kháng rầy nâu và một số QTL kháng đạo ôn và rầy nâu đã được phát hiện Ngoài ra gen thơm của giống Jasmin, gen điều khiển tính trạng hạt dài, gen điều khiển thời gian sinh trưởng và nhiều gen và QTL có liên quan đến các tính trạng khác của cây lúa như chịu hạn, chịu mặn, chịu độc nhôm, chịu thiếu phốt-pho, bất dục đực nhân nhậy cảm quang chu kỳ, mẫn cảm nhiệt độ (TGMS), gen tương hợp rộng(WC) cũng được phát hiện hay được lập bản đồ phân tử để đưa vào sử dụng trong chọn giống

nghệ sinh học, có thể giúp các nhà chọn giống làm chủ công nghệ chọn tạo dòng

dòng, giống.Công nghệ cao được sử dụng cũng giúp các nhà chọn giống tạo ra các tổ hợp lúa lai 2, 3 dòng kháng bệnh bạc lá, rầy và năng suất cao Tạo điều kiện khai thác tốt ưu thế lai khi lai giữa 2 loài phụ Indica/Japonica Đây là tạo ra bước đột phá về năng suất cho lúa lai

Trong bối cảnh khủng khoảng lương thực của thế giới, tình trạng mất đất trồng lúa ngày càng nghiêm trọng, dân số Việt Nam tăng nhanh chúng ta muốn tiếp tục đảm bảo an ninh lương thực cho 100-120 triệu dân trong tương lai, với diện tích trồng lúa ổn định 3.6 triệu ha thì việc tạo ra những giống lúa lai siêu cao sản là một hướng đi đúng và cấp thiết Giải quyết được lúa lai siêu cao sản ở Việt Nam chúng ta có thể khai thác được lợi thế về trồng lúa, tiếp tục xuất khẩu 5-6 triệu tấn gạo với giá gạo tiên đoán 1500-2000USD/tấn trong tương lai Do vậy phát triển lúa lai không chỉ có ý nghĩa quyết định với an ninh lương thực mà

còn mang lại hiệu quả kinh tế cao trong tình hình hội nhập

Để đạt được sản phẩm cuối cùng là giống lúa lai siêu cao sản, chất lượng tốt, kháng bạc lá, rầy nâu, cần một thời gian từ 5-10 năm Tuy nhiên trong 2-3 năm sẽ tạo ra những sản phẩm trung gian như 2-3 dòng mẹ mang gen kháng bệnh , 3-5 dòng bố mang gen kháng bệnh và tương hợp rộng và 1-2 tổ hợp lúa lai có tiềm năng năng suất 10-12 tấn/ vụ

1, Mục tiêu của đề tài

- Làm chủ công nghệ tạo dòng giống bố mẹ mang gen tương hợp rông và gen kháng bênh bạc lá và rầy nâu

- Xác định được các dòng bố, mẹ mang gen kháng bệnh và tương hợp rộng và

1-2 tổ hợp lúa lai có tiềm năng năng suất 11-2-14 tấn/ha

2 Đối tượng nghiên cứu:

nghiên cứu và phát triển lúa lai được chon tạo bằng các công nghệ truyền thống phục vụ là nguyên vật liệu cho nghiên cứu về công nghệ sinh học Đối tượng nghiên cứu chính là các dòng bố mẹ lúa lai với các gen tms, gen kháng bạc lá,

gen tương hợp rộng, gen phục hồi Lai thử để chọn tạo lúa lai siêu lúa ,lúa lai khang bạc lá, rầy nâu.Tuy nhiên trong 2 năm đầu chủ yêu tập trung vào tạo vật liệu bố mẹ giả quyết những nghiên cứu mặt phương pháp để xây dựng quy trình

3 Tính cấp thiết :

Việc sử dụng chỉ thị phân tử để chọn tao bố mẹ lúa lai co gen tương hợp rộng, và các gen kháng sâu bệnh,và các gen quan trọng khác là công việc hết sức bức thiết Đây thực sự là yêu cầu sử dụng công nghệ cao để giải quyết những vấn đề cụ thể của sản xuất Như tạo giống lúa lai kháng sâu bệnh,lúa lai siêu cao sản đảm bảo an ninh lương thực trong tiến trình ứng phó với biến đổi khí hậu và

sự giảm nhanh chóng của diện tích trồng lúa do công nghiệp hóa ở Việt nam

4 Phạm vi nghiên cứu:

Đề tài chỉ tập trung sử dụng những thành tựu của công nghê sinh học phục

vụ cho công tác chọn tạo giống lúa lai nên mang ý nghĩa ứng dụng cao Đề tài cũng kế thừa một số các sản phẩm trung gian của đề tai khác phục vụ cho nghiên cứu về công nghệ sinh học

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Việc lai tạo ra các dòng bố mẹ có gen tương hợp rộng là nền tảng cho chọn giống lúa lai siêu năng suất, việc đưa các gen quan trọng vào các dòng bố

mẹ lúa lai một cách chủ động và hiệu quả có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu và phát triển lúa lai ở các nước trên thế giới

1.1.1 Tình hình nghiên cứu và phát triển lúa lai ở các nước trên thế giới

- Trung Quốc là nước đầu tiên trên thế giới sử dụng lúa lai trong sản xuất đại trà Năm 1994, năm có diện tích lúa lai đạt cao nhất là 18 triệu ha Diện tích trồng lúa của Trung Quốc hiện nay là 31 triệu ha trong đó diện tích lúa lai chiếm khoảng 16 triệu ha, năng suất bình quân riêng lúa lai 6.9 tấn/ha so với lúa thuần năng suất bình quân là 5.4 tấn/ha, tăng 1,5 tấn/ha trên toàn bộ diện tích Diện tích sản xuất hạt lai F1 là: 140.000ha, năng suất hạt giống bình quân 2,5 tấn/ha Những năm gần đây, ngày càng nhiều các dòng bốmẹ được chọn tạo ở nhiều cơ quan nghiên cứu nông nghiệp như: Mian 2A, D702A, Bức khôi 838, Thục khôi

527, Miên khôi 725( Tứ Xuyên), Y hoa Nông A, Quảng khôi 128 (Quảng đông), Peiai 64s, Xiang 125S, Zhu1S, II32A, Xinxiang 2A (Hồ Nam), E 9311 (Giang Tô), Minh khôi 86 (Phúc Kiến) Cácdòng bố mẹ này có nhiều ưu điểm như: nguồn tế bào chất bất dục phong phú, khả năng kết hợp cao, khả năng nhận phấn ngoài cao

- Trung Quốc đã chọn tạo thành công một vài tổ hợp phù hợp với kiểu siêu lúa lai như: Peiai 64s/E32, liangyou Peijiu (Peiai64/9311), Er you Ming 86(II 32A/Minh khôi 86) Ngoài ra các nhà khoa học Trung Quốc còn áp dụng nhiều kỹ thuật công nghệ cao như: nuôi cấy bao phấn, chuyển gen nhằm đưa các gen quý như: WC, Xa21, gen chịu thuốc trừ cỏ HR vào các dòng bố mẹ làm tăng năng suất, tăng khả năng chống chịu sâu bệnh, tăng độ thuần của các tổ hợp lai

- Trung Quốc là quốc gia thành công nhất về siêu lúa lai (Super hybrid rice) Kế hoạch năng suất siêu lúa lai giai đoạn một đạt năng suất 10,5 tấn /ha vào năm 2000 và giai đoạn hai năng suất đạt 12 tấn/ha vào năm 2005

- Những thành tựu về lúa lai ở Trung Quốc mang tính đột phá cho phát triển lúa lai:

* Sử dụng genomic ADN từ cỏ Barnyard Grass (cỏ lồng vực cạn) để tạo ra

những nguồn vật liệu mới cho lúa lai Đoạn ADN có Barnyard được chuyển vào dòng R207 (khẳng định qua phân tích chỉ thị di truyền)

Gen C4 từ ngô đã được phân lập và đang đưa vào lúa lai năng suất cao Trên

cơ sở này siêu lúa lai phấn đấu đạt năng suất 13,5 tấn/ha trên diện rộng vào năm

2010

- Tình hình phát triển lúa lai của các nước khác:

Ngoài Trung Quốc, diện tích trồng lúa lai thương phẩm ở các nước tăng nhanh, theo thống kê tính đến năm 2004 các nước lần lượt như sau:

Ấn độ: 560 000 ha, Philippin:192 330 ha và Banglades:40 000 ha

- Ở Mỹ, lúa lai được trồng đại trà từ năm 2000 và đến năm 2004, diện tích lúa lai đã lên tới 43.000 ha, các nước Inđônêsia, Srilanca, Ai Cập, Nhật Bản, Braxin cũng đã trồng lúa lai tuy nhiên diện tích còn ở mức khiêm tốn

- Về năng suất sản xuất hạt lai F1: Trung Quốc đã đạt năng suất bình quân 2.750 kg/ha, Ấn Độ đạt 1.600 kg/ha Các nước khác năng suất của ruộng sản xuất hạt lai đạt thấp từ 500 – 900 kg/ha Tuy nhiên, một số công ty tư nhân ở các nước này đạt tương đối khá như: SL Agritech của Philippines đã đạt năng suất 2.000 kg/ha Họ đã cơ giới hoá cao độ khâu thu hoạch hạt lúa từ cây mẹ Mỗi năm SL Agritech đã sản xuất 1000-1.500 ha/năm

1.1.2 Chỉ thị phân tử và ứng dụng trong chọn giống cây trồng

công tác chọn giống cây trồng đang được nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới triển khai rộng rãi Nhiều bản đồ phân tử cùng vị trí các gen kiểm soát các tính trạng khác nhau đã được định vị thay thế cho những phương pháp đánh giá theo hình thái cổ điển thông thường Các nhà khoa học ở Trường ĐHTH Cornel (Mỹ)

là những người đầu tiên định vị hàng loạt các chỉ thị phân tử RFLP trên bản đồ

di truyền ở lúa Trong chương trình genom lúa do Nhật chủ trì, các nhà khoa học

đã phát hiện và tách dòng hơn 3000 đoạn ADN bổ trợ Đến nay đã có khoảng chục nghìn chỉ thị phân tử SSR (vi vệ tinh) ở lúa đã được phát hiện và thiết kế, trong đó có nhiều chỉ thị liên kết với gen có ý nghĩa kinh tế quan trọng Hiện nay

có khoảng 20 gen chính kháng bệnh bạc lá, 30 gen kháng đạo ôn, 12 gen kháng rầy nâu và một số QTL kháng đạo ôn và rầy nâu đã được phát hiện Ngoài ra gen thơm của giống Jasmin, gen điều khiển tính trạng hạt dài, gen điều khiển thời gian sinh trưởng và nhiều gen và QTL có liên quan đến các tính trạng khác của cây lúa như chịu hạn, chịu mặn, chịu độc nhôm, chịu thiếu phốt-pho, bất dục đực nhân nhậy cảm quang chu kỳ, bất dục đực nhân nhậy cảm nhiệt độ, gen tương hợp rộng cũng được phát hiện hay được lập bản đồ phân tử để đưa vào

sử dụng trong chọn giống Nhiều chỉ thị phân tử liên kết với các gen nói trên đã được phát hiện bởi các tác giả trong nước Ngoài ra, thông qua việc đánh giá đa dạng di truyền và khoảng cách di truyền, chỉ thị phân tử còn giúp các nhà chọn giống xác định gián tiếp các cặp lai có khả năng cho ưu thế lai

Cùng với sự phát triển mạnh mẽ của chỉ thị phân tử, một quy trình công nghệ chọn giống mới được ra đời, đó là quy trình chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (Marker-Assisted Selection) (MAS).Thông thường, trong quy trình chọn tạo giống truyền thống, người ta đưa nguồn gen mới có tính trạng mong muốn vào 1 giống khác bằng phương pháp hồi giao liên tục qua 5-6 thế hệ, hoặc chọn lọc cá thể trong quần thể phân ly từ thế hệ F2 đến các thế hệ tiếp theo Mỗi gen chính thường chỉ kháng được với 1 chủng gây bệnh hoặc nòi gây hại nào đó, do vậy nếu quy tụ được vài gen kháng vào một dòng hoặc giống lúa thì sẽ tạo ra được 1 dòng lúa kháng được với nhiều chủng gây bệnh hoặc nhiều nòi gây hại Như vậy muốn tạo ra giống lúa kháng bền vững đối với dịch hại, người ta phải đưa được vài gen kháng hiệu quả cao vào "genom đích" Bằng phương pháp chọn giống truyền thống, việc đưa gen lặn vào tổ hợp lai, hoặc du nhập cùng một lúc vài gen mong muốn vào "genom đích" (quy tụ nhiều gen vào 1 dòng ưu việt) thường gặp rất nhiều khó khăn hoặc đôi khi không thể thực hiện được (Mohan et al., 1997) Còn đối với quy trình MAS, nguồn gen mới nhập được phát hiện gián tiếp thông

qua các chỉ thị phân tử liên kết chặt với những gen đó Như vậy chọn giống nhờ chỉ thị phân tử, khi phối hợp với chọn giống truyền thống, tỏ ra rất hiệu quả, tiết kiệm công sức và rút ngắn đáng kể thời gian tạo giống Những nước có nền CNSH phát triển như Mỹ, Nhật, Úc và Viện Lúa Quốc tế đặc biệt quan tâm đến công nghệ MAS Công nghệ MAS đã được ứng dụng thành công trong việc chọn tạo cây cho gỗ chất lượng cao làm nguyên liệu giấy Ở lúa, MAS đã được ứng dụng với các gen kháng bệnh bạc lá, đạo ôn và ruồi đục thân và 1 số gen khác Riêng đối với chọn giống lúa kháng rầy nâu, MAS vẫn chưa được ứng dụng rộng rãi do số lượng chỉ thị phân tử liên kết gần với các gen kháng rầy nâu vẫn còn khá ít ỏi

Bằng phương pháp chọn tạo giống truyền thống đã có nhiều dòng/giống lúa mang gen kháng đơn được tạo ra và đưa và sản xuất Song những dòng/giống này nhanh chóng bị nhiễm trở lại do: (1) Mỗi một gen kháng chính thường chỉ kháng được với một hoặc một vài nòi gây bệnh hay biotip gây hại, trong khi đó thành phần của quần thể gây hại lại rất đa dạng và phong phú và luôn biến động theo điều kiện của môi trường và theo các vùng sinh thái (2) Bản thân nòi gây hại dưới áp lực của chọn lọc (sử dụng giống lúa kháng) cũng phát sinh đột biến để thích ứng (Sheng Chen et al., 2000; Deng Qi-ming et al., 2006; Lee et al., 2002) Như vậy một yêu cầu đặt ra là phải tạo được giống có tính kháng bền vữngcó nghĩa là “tính kháng của giống được duy trì có hiệu quả khi giống được gieo trồng trên diện rộng và lâu dài”, hay nói một cách khác: giống phải có phổ kháng rộng Muốn vậy một trong những hướng tạo giống kháng bền vững là đưa được vài gen kháng chính vào genom đích, hay còn gọi

là phương pháp quy tụ gen (Pyramiding genes) (Lee et al., 2002) Để tạo được một giống được qui tụ hai và nhiều hơn số gen kháng bằng phương pháp chọn lọc truyền thống thông qua chọn lọc kiểu hình là rất khó khăn, sự biểu hiện tương tác gữa các gen Sử dụng các chỉ thị phân tử liên kết gần với các gen kháng có thể nhận biết và xác định được cá thể mang nhiều hơn một gen kháng trong một quần thể phân ly Như vậy việc kết hợp giữa chọn giống nhờ sự trợ

giúp của chỉ thị phân tử (MAS) và chọn giống truyền thống sẽ có hiệu quả, tiết kiệm công sức và rút ngắn quá trình chọn tạo

1.1.3 Nghiên cứu sử dụng chỉ thị phân tử liên kết với gen kháng bệnh bạc

lá trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh

Bệnh bạc lá ở lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae gây ra là

một trong những loại bệnh gây thất thoát nghiêm trọng về năng xuất và sản lượng của ngành trồng lúa Bệnh bạc lá có diện phân bố rộng và tác hại nghiêm trọng đối với cây lúa, lần đầu tiên bệnh được ghi nhận và thông báo bởi nông dân Nhật bản vào năm 1884, sau đó theo trình tự thời gian bệnh này được ghi nhận và thông báo từ các vùng trồng lúa khác nhau của Châu Á, Bắc Úc, Châu Phi và Mỹ (Gnanamanickam, 1999) Theo thông báo thì thiệt hại do bệnh bạc lá gây ra đối với các vùng bị dịch lên tới 50% sản lượng (Gnanamanickam, 1999) Các nghiên cứu về mức độ thiệt hại chỉ ra rằng thiệt hai về năng xuất hạt do bệnh này gây ra biến động rất rộng tùy thuộc vào giai đoạn bị nhiễm bệnh, mức

độ nhiễm của giống, điều kiện thời tiết và môi trường khi bệnh diễn ra, thiệt hại

về năng xuất dao động từ 20 đến 30% và có thể tới 80% Bệnh diễn ra ở giai đoạn mạ sẽ gây héo và chết cho các nhánh nhiễm, nếu bệnh ở giai đoạn đẻ nhánh sẽ làm cho lá bị bạc (Lee et al., 2002)

Trong những năm thuộc thập niên 90 của thế kỷ trước lúa lai đã được nghiên cứu thành công và đưa vào sản xuất đại trà Việc đưa lúa lai vào sản xuất

đã làm tăng đáng kể về năng xuất và sản lượng của ngành trồng lúa trên thế giới Trung Quốc là nước đầu tiên nghiên cứu và triển khai lúa lai vào sản xuất, ngày nay lúa lai được gieo trồng ở nhiều nước trên thế giới như Ấn Độ, Philippin, Việt Nam, Mỹ Song cũng như các giống lúa thuần, lúa lai cũng bị ảnh hưởng rất nặng bởi bệnh bạc lá vì hầu hết các dòng bố mẹ là nhiễm bệnh (Zhang et al., 1998)

Tuy việc nghiên cứu và đề xuất các biện pháp phòng trừ đối với bệnh bạc

lá được triển khai rất sớm, đã có nhiều biện pháp phòng trừ được đề xuất và đưa vào áp dụng, song cho tới nay bệnh này vẫn là một trong những bệnh nguy hại

của ngành trồng lúa Cho tới nay, biện pháp phòng trừ chính được dùng rộng rãi

ở tất cả các vùng trồng lúa là biện pháp sử dụng thuốc hóa học Tuy nhiên biện pháp này cũng có nhiều hạn chế và hiệu quả thấp, hơn nữa việc lạm dụng thuốc hóa học trong phòng trừ dịch hại đã gây ra những nguy hại mới đối với môi trường sống, phá vỡ sự cân bằng sinh thái, gây ô nhiễm môi trường và tác động tới sức khỏe cộng đồng Ngày nay, với những thành tựu đạt được trong việc phát hiện và xác định các gen kháng định tính (major genes) và các gen kháng định lượng (quantitative genes) đã đặt nền tảng cho những thành công trong công tác chọn tạo giống kháng bệnh, khai thác và ứng dụng các giống lúa kháng bệnh trở thành một phương pháp khả thi và hữu hiệu trong công tác phòng trừ bệnh nói chung và bệnh bạc lá nói riêng Cho tới nay đã có rất nhiều gen kháng chính và các QTLs kiểm soát bệnh bạc lá đã được xác định, định vị trên nhiễm sắc thể và lập bản đồ phân tử Theo Chen và cs (2002) đã có 27 gen kháng chính kiểm soát tính kháng bạc lá, 30 gen kháng đạo ôn và 12 gen kháng rầy nâu đã được phát hiện Theo Babu và cs (2004) đã có 25 gen kháng bạc lá đã được xác định và một số gen trong số đó đã được chuyển vào các giống lúa đang gieo trồng bằng phương pháp chọn giống truyền thống Theo Zhaohui Chu và cs (2006) đã có

30 gen kháng chính kiểm soát tính kháng của cây chủ đối với các nòi vi khuẩn bạc lá khác nhau đã được phát hiện và xác định, trong đó có 21 gen trội và 9 gen lặn được ký hiệu từ Xa1 đến Xa29 Cũng theo Zhaohui Chu thì đã có 5 gen kháng bạc lá (Xa1, xa5, Xa21, Xa26 và Xa27) đã được phân lập, đánh giá và đã bắt đầu được sử dụng trong nghiên cứu chuyển gen Nhiều các gen kháng nói trên đã được nghiên cứu và định vị trên nhiễm sắc thể, nhiều gen cũng đã được lập bản đồ mức độ phân tử Theo các tài liệu công bố thì các gen kháng bạc lá đã được phát hiện nằm trên các nhiễm sắc thể (NST) khác nhau: Trên NST 11 có những gen Xa21, Xa4, Xa3, Xa10; trên nhiễm sắc thể số 5 có gen xa5; Xa8 nằm trên NST 8; Xa7 nằm trên NST 6, xa13 nằm trên NST số 8 (Lin et al., 1996; Zhang et al., 1998; Chen et al., 2002; Lee et al., 2003, Yang et al., 2003) Những kết quả nghiên cứu này đã tạo điều kiện đáng kể cho việc khai thác và sử dụng

các gen này một cách có hiệu quả trong công tác chọn, tạo giống kháng

Để tạo thêm điều kiện cho công tác nghiên cứu và chọn tạo giống lúa kháng bạc lá tại IRRI một hệ thống các dòng đẳng gen (near-isogenic lines – NIL) mang đơn gen kháng bạc lá được tạo ra Ngoài ra bằng phương pháp qui tụ gen tại IRRI, các dòng mang 2, 3 gen kháng cũng đã được tạo ra – đây là nguồn cây cho gen (donor) rất thiết thực trong công tác qui tụ và tạo giống kháng bền vững Bằng phương pháp MAS đã có rất nhiều giống và dòng mang gen kháng được tạo ra tại nhiều nước gieo trồng lúa, trong số đó đã có những thành tựu chuyển gen kháng bạc lá vào các dòng bố mẹ để tạo giống lúa lai cao sản Tại Trung Quốc, Deng Qi-ming và cs (2006) đã sử dụng phương pháp MAS để chuyển thành công hai gen Xa21 và Xa4 vào dòng phục hồi Mianhui 725 cho tổ hợp lúa lai Shuhui 207 Sheng Chen và cs (2000) cũng bằng phương pháp MAS

sử dụng các chỉ thị phân tử liên kết pTA21 và AB9 đã chuyển thành công gen Xa21 vào dòng phục hồi Minghui63 (tổ hợp lúa lai Shanyou 63) Yuqing He và

cs cũng công bố đã sử dụng thành công phương pháp MAS để cải thiện tính kháng của các giống lúa lai thông qua qui tụ hai gen kháng bạc lá Xa21, Xa7 vào dòng phục hồi Minghui63 và làm tăng đáng kể phổ kháng của dòng mang hai gen kháng so với dòng Minghui mang đơn gen kháng Cũng tương tự, các tác giả cũng đã thu được dòng phục hồi Minghui 63 mang tổ hợp gen kháng bạc

lá (Xa21) và gen Bt kháng sâu, dòng Minghui 63 mang hai gen kháng đạo ôn 1(t) và Pi-2(t), dòng Minghui 63 mang hai gen kháng rầy nâu Với sự phát triển của lúa lai hai dòng trong những năm gần đây, các nhà chọn tạo giống cũng đã quan tâm tới việc cải tiến và nâng cao tính kháng bệnh bạc lá cho lúa lai hệ này Loida và cs của Viện nghiên cứu lúa Philippin đã chuyển thành công bằng MAS các gen Xa21, Xa4, Xa7 vào lúa lai hai dòng TGMS1 (PhilRice Genbank Acc

Pi-No PRT-1)

Danh mục các dòng NILs mang đơn, đa gen kháng

TT Tên

dòng

Gen kháng

1.1.4 Nghiên cứu sử dụng chỉ thị phân tử liên kết với gen kháng rầy nâu:

Rầy nâu cũng là nguyên nhân gây thiệt hại thiệt hại nặng nề cho cây lúa Rầy nâu (brown planthopper) là loại côn trùng có tên khoa học là Nilaparvata Lugens Stal Chúng gây hại trực tiếp bằng cách hút nhựa cây, dẫn đến cháy rầy Ngoài ra rầy nâu còn gây hại gián tiếp thông qua việc truyền các bệnh virus cho cây Dịch rầy nâu được coi là loại dịch côn trùng quan trọng nhẩt trên cây lúa Những thiệt hại do rầy nâu gây ra hàng năm làm mất khoảng 10% sản lượng lúa, đôi khi tới 30% hoặc hơn nữa Biện pháp chủ yếu để ngăn chặn nạn dịch rầy nâu

là sử dụng thuốc diệt côn trùng Tuy nhiên, việc sử dụng lan tràn các loại thuốc trừ sâu đã gây ra sự trỗi dậy của loại côn trùng này như kết quả của sự thích nghi

có chon lọc (Ngô Lực Cường và cộng sự, 1997, Banerjee, 1996) Do vậy, nhiều công trình nghiên cứu của các nhà khoa học trong và ngoài nước đã nêu bật vai trò quan trọng của việc sử dụng các giống lúa kháng rầy nâu trong sản xuất

nâu (pathak và Khush, 1979) Gần đây, các nhà khoa học trên thế giới đã sử dụng markers phân tử để xác định và mô tả nguồn gene kháng Ở lúa có 19 gene chính kháng rầy đã được lập bản đồ phân tử (bảng 1.1) Những gen kháng này

có thể dễ dàng chuyển vào những giống lúa có những đặc tính ưu việt thông qua chọn giống chỉ thị phân tử (MAS) (Qifa Zhang 2007)

Bảng 1.1 : Gene kháng rầy nâu đã được công bố

Theo tác giả Jirapong và ctv (2007) thì gen Bph 13 định vị trên nhiễm sắc thể số 3, Bph 12 định vị trên nhiễm sắc thể số 4 Ngoài ra, theo bản đồ của các tác giả ở trường đại học Cornell của Mỹ lập năm 2001 thì gen Bph 3 năm trên nhiễm sắc thể số 4 Các chỉ thị liên kết chặt với gen Bph 3 là RZ69, RG396, RZ749, GN0271.Nhưng năm 2007, Jirangpong lại lập bản đồ gen Bph3 trên nhiễm sắc thể số 6

Locus gen bph2 kháng rầy nâu được xác định và lập bản đồ phân tử từ giống lúa Indica ASD7 bph2 nằm trên nhiễm sắc thể số 12, liên kết chặt với SSR marker RM7102 và RM463 với khoảng cách 1.0cM bph2 là một trong

những locus gen kháng rầy nâu rất thuân lợi cho việc chọn giống bằng chỉ thị

phân tử (Sun và cộng sự, 2006) Gen kháng rầy nâu bph4 đã được phát hiện và

lập bản đồ tại vị trí trên cánh tay đòn ngắn của nhiễm săc thể số 6 (Mitsuhiro và

cộng sự, 2001) Locus gen Bph17 kháng rầy nâu được lập bản đồ phân tử từ

giống lúa trồng Rathu Heenati của Sri lankan Giống lúa này có khả năng kháng

với 4 biotyes rầy nâu Gen kháng rầy Bph17 liên kết chăt với hai marker

RM8213 và RM5953 trên nhiễm săc thể số 4, khoảng cách bản đồ khoảng 3.6cM (Lihong Sun và cộng sự, 2005) Ishii và ctv (1994) đã thiết lập bản đồì

RFLP và xác định gen Bph-10 kháng biotype 2 và 3, định vị trên nhiễm sắc thể

12 liên kết với RG457 Cặp primer được thiết kế từ RG457 (chỉ thị STS) đã phát

hiện được gen kháng rầy nâu Bph-10 với khoảng cách di truyền 1.7 cM trên quần thể lúa hoang Oryza australiensis và những dòng con lai có xuất xứ từ loài

lúa hoang này

1.1.5 Nghiên cứu sử dụng chỉ thị phân tử liên kết với gen TGMS, gen phục hồi:

Lúa lai là một trong những thành tựu khoa học nông nghiệp lớn nhất trong thập kỷ 80, là một tiến bộ kỹ thuật đã được xâm nhật vào nước ta với tốc độ nhanh chóng, trên quy mô ngày càng rộng lớn Năng suất lúa lai cao hơn lúa thuần từ 20%-30% không chỉ ở Trung Quốc mà con ở hàng loạt các nước trên thế giới Như vậy sử dụng ưu thế lai ở lúa là một trong những chiến lược quan trọng để tăng năng suất lúa Đây như một yếu tố có tính chất quyết định nhằm tăng sản lượng lương thực, góp phần hạn chế khó khăn gây ra bởi sự bùng nổ dân số và nhu cầu cuộc sống nhân sinh của cả nhân loai trong giai đoạn hiện nay Tuy nhiên, muốn khai thác và sử dụng thành công ưu thế lai ở lúa, biện pháp đầu tiên là phải nghiên cứu đưa ra một quy trình sản xuất hạt lai thích hợp, hiệu quả, chất lượng Vấn đề này phụ thuộc vào nguồn vật liệu khởi đầu được sử dụng trong quá trình sản xuất hạt lai Do vậy các nhà khoa học đã và đang nghiên cứu di truyền và lập bản đồ các gene bất dục đực bằng chỉ thị phân tử, từ

đó chuyển nó vào những giống lúa có những đặc tính ưu việt Wang và cộng sự (2003) đã lập bản đồ chi tiết gen tms5 (gen bất dục đực mẫn cảm nhiệt độ) trên nhiễm sắc thể số 2 tms5 liên kết với hai AFLP marker (AF10, AF8), một RAPD marker (RA4), một STS marker (C365), một CASP marker (G271-1) và bốn SSR markers ( RM279, RM492, RM327, RM324) tms5 được lập bản đồ với vị

trí giữa hai STS markers C365-1 và CAP marker G227-1 với khoảng cách 1,04

cM từ C365-1 và 2.08 từ G227-1 (Wang et al 2003) Một số gen bất dục đực mẫn cảm nhiệt độ khác cũng được như tms6, tgms-vn1 cũng được xác định (Lee

et al 2005, Dong et al 2000) Gene phục hồi bất dục đực tế bào chất cũng được xác định bởi chỉ thị marker phân tử như Rf-1 Gen Rf-1 là gen phục hồi bất dục đực đầu tiên của cây lương thực đã được phân lập (Toshiyuki et al 2004)

1.1.6 Nghiên cứu sử dụng chỉ thị phân tử liên kết với gen tương hợp rộng

Khả năng bất thụ của cây lai F1 cũng là một hạn chế lớn trong sử dụng ưu thế lai giữa các loài phụ ở lúa Để khắc phục vấn đề này, các nhà khoa học trên thê giới đã nghiên cứu và phát hiện gene tương hợp rộng để chuyển vào cây bố

mẹ trong sản xuất lúa lai Gene tương hợp rộng (wide- compatibility gene) là một tính trạng quan trọng có khả năng tạo cây hữu thụ khi lai giữa hai loài phụ Indica và Japonica (Kumar and Virmani 1992, Singh at al 2006, Qing Ji et al 2005) Kumar and Virmani (1992) đã phát hiện một số giống thuộc nhóm có nguồn gốc từ Australia (giống Dular) mang gene tương hợp rộng Những năm gần đây, gene tương hợp rộng đã được các nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu, xác định và lập bản đồ di truyền phân tử Gene tương hợp rộng Sn5, S5, S8, f5-Du đều có nguồn gốc từ giống lúa Dular đã được lập bản đồ phân tử chính xác với những marker liên kết trên các chromosome 4, 5, 6, 7, 11, 12 (Singh at

al 2006, Qing Ji et al 2005, Wang et al 2006, Sigrd et al 2003) Một số nhà khoa hoc Trung Quốc đã thành công trong việc chuyển gene này vào dòng bố

mẹ trong lúa lai (Lin et al 2007)

1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

1.2.1 Nghiên cứu phát triển lúa lai đại trà

+ Thông qua dự án giống giai đoạn 2000-2006, mỗi năm các cơ sở nghiên cứu và sản suất giống trong nước đã nhân thuần và đưa vào sản suất 70-80 tấn giống bố mẹ lúa lai Đây là sự đóng góp quan trọng để Việt nam tự sản suất được 3.500-4000 tấn giống/năm trong giai đoạn 2000-2003

+ Kết quả lai tạo các dòng TGMS, PGMS mới cho phát triển lúa lai 2dòng ở Việt nam:

Thông qua nhập nội, lai hữu tính, nuôi cấy hạt phấn, đột biến, kết hợp với lai tạo và chọn lọc truyên thống, các viện nghiên cứu đã tạo rra nhiều dòng TGMS mới đang được sử dụng ở nhiều mức độ khác nhau: 103S, TiS-96 đang được khai thác để sản suất hạt lai cho các tổ hợp VL20, TH3-3, TH3-4, các dòng AMS27A, AMS30S, AMS31S, AMS32S, AMS33S đang là mẹ của nhiều tổ hợp lúa lai 2 dòng rất triển vọng như: HYT 103 (AMS30S/R103), HYT 100 (AMS30S/GR10), AMS29S/R1025, HYT106 (AMS30S/R253), HYT107 (AMS30S/9311), 25A/KB1, năng suất 7,5-8tấn/ha, có thời gian sinh trưởng ngắn (100-110 ngày trong vụ mùa và 120-125 ngày trong vụ xuân muộn), rất có triển vọng ở các tỉnh phía Bắc và Bắc trung bộ

+ Trong đề tài nghiên cứu lúa lai giai đoạn 2001-2005, một chương trình lai tạo các dòng TGMS mới được thực hiện giữa 29 giống lúa thuần thấp cây có nhiều đặc điểm tốt ở Việt Nam: Khang Dân 18, CR203, các dòng 25B, II-32B, BoB, Quế 99, Trắc 64 với các dòng TGMS đã đựoc chọn lọc từ các thế hệ lai lại khác nhau, hàng chục dòng TGMS đã thuần, có thời gian sinh trưởng ngắn thấp cây, có đặc tính nở hoa tốt, bất dục đực ổn định trong điều kiện Việt nam được chọn tạo ở các đơn vị nghiên cứu như: 25S, KimS, BoA, II-32S Đây là nguồn vật liệu quan trọng đã được tiếp tục hoàn thiện để tạo ra những tổ hợp lúa lai 2 dòng mang thương hiệu Việt nam giai đoạn 2006-2010

+ Kết quả lai tạo các tổ hợp lúa lai mới:

Trong 7 năm, từ 2000-2007 đã lai tạo và sản suất thử nghiệm nhiều tổ hợp lúa lai có triển vọng Các tổ hợp lúa lai tốt nhất đã được công nhận và đưa vào sản suất đại trà ở các mức độ khác nhau như:

- Các tổ hợp lúa lai 2 dòng:

1/ VL20: (103S/R20) là tổ hợp lúa lai ngắn ngày thích ứng cho vụ Xuân muộn (125-130 ngày), Mùa sớm (100-110 ngày) Năng suất đạt 6-8 tấn/ha Giống được công nhận chính thức năm 2003

2/ Tổ hợp 2 dòng TH3-3 (T1S-96/R3): có thời gian sinh trửơng ngắn tương

tự VL20, sản xuất hạt lai dễ đạt năng suất cao, chất lượng khá thích ứng cho vùng đất trung du miền núi Giống được công nhận chính thức năm 2005

3/ Tổ hợp TH3-4: (T1S-96/R4) là tổ hợp lúa lai 2 dòng cho năng suất cao hơn tổ hợp TH3-3, sản xuất hạt lai dễ đạt năng suất cao, chất lượng ăn uống không bằng TH3-3, giống mới được công nhận tạm thời năm 2005

6/ Tổ hợp HYT 103: (AMS30S/R103) là tổ hợp lúa lai 2 dòng, có thời gian sinh trưởng ngắn trong vụ Xuân 120-130 ngày, trong vụ Mùa sớm 100-105 ngày, năng suất 70-90 tạ/ha trong vụ Xuân, 60-65 tạ/ha trong vụ Mùa, cơm ngon mềm, dẻo Giống được công nhận tạm thời năm 2007

- Các tổ hợp lúa lai 3 dòng:

7/ Tổ hợp HYT83: (IR58025A/RTQ5) có thời gian sinh trưởng trung bình 110-115 ngày trong vụ Mùa sớm, 130-135 ngày trong vụ Xuân muộn Ưu điểm: cho năng suất cao tương đương D.ưu 527, cao hơn Nhị ưu 838 Ở vụ Mùa, HYT83 cho năng suất cao hơn và chống chịu bạc lá tốt hơn các giống lúa lai Trung Quốc Giống được công nhận chính thức năm 2005 và đã được đăng ký bảo hộ năm 2005

8/ Tổ hợp HYT 100: (IR58025A/R100) đây là tổ hợp 3 dòng chất lựơng cao, thời gian sinh trưởng 110 ngày vụ Mùa, 130-135 ngày vụ Xuân muộn Năng suất cao tương đương với lúa lai Trung Quốc: D.ưu 527, Nhị ưu 838 trong vụ xuân Gạo dài > 7mm, đủ tiêu chuẩn xuất khẩu gạo trong, cơm dẻo thơm, hợp với thị hiếu gạo chất lượng cao ở Việt nam Sản xuất hạt lai dễ, đạt năng suất

cao 2-2,8 tấn/ha Độ thuần dòng bố mẹ rất tốt Tuy nhiên giống dễ bị nhiễm bệnh bạc lá trong vụ Mùa Giống được công nhận tạm thời và đăng ký bảo hộ giống năm 2005

9/ Tổ hợp chất lượng cao HYT92: (IR58025A/PM3) tổ hợp này cho năng suất cao trong vụ xuân và vụ mùa.Ưu điểm: đây là giống có gạo chất lượng cao, gạo dài, hợp cho vùng ruộng hơi trũng như: Hà Nam, Thái Bình, Hải Phòng HYT92 kháng bạc lá tốt trong vụ Xuân và vụ Mùa HYT92 được công nhận tạm thời năm 2005

Gạo HYT 100 cùng với HYT92 đã được đăng ký bảo hộ thương hiệu gạo chất lượng cao tại Bộ KHCN với thưong hiệu Thiên Hương HYT 100 và Thiên Hương HYT92 bởi công ty tư nhân Thống Nhất Giao Thuỷ- Nam định Riêng HYT 83 được sản xuất ra trên diện tích khoảng 5000ha trong năm 2002-2005 Cơm của HYT83 được đông đảo người tiêu dùng chấp nhận, cơm ngon hơn những giống lúa lai Trung Quốc và lúa thuần Khang Dân.( Nguyễn Trí Hoàn 2005)

1.2.2 Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học trong chọn giống lúa lai:

- Kháng bệnh bạc lá:

Ở Việt nam việc chọn tạo giống kháng bạc lá cũng đã được triển khai, trong quá trình chọn tạo giống bằng phương pháp truyền thống đã có những dòng, giống tạo ra có tính kháng bạc lá Từ những năm của thập niên cuối thế kỷ trước các dòng đẳng gen (NILs) mang đơn gen kháng đã được nhập về các viện nghiên cứu của Việt nam (chính thức và không chính thức), các dòng này ở các mức độ khác nhau đã được các chuyên gia chọn tạo giống sử dụng để lai chuyển gen kháng vào các dòng/giống mới Cũng nhờ có bộ các dòng NILs này các nhà nghiên cứu việt nam đã triển khai đánh giá hiệu quả kháng của các gen kháng bạc lá với các chủng, nòi vi khuẩn bạc lá của Việt nam Qua kết quả nghiên cứu của Viện Bảo vệ Thực vật, trường Đại học Nông nghiệp I, Viện KHKTNNVN, Viện Nghiên cứu lúa ĐBSCL, Viện Di truyền Nông nghiệp cho thấy rằng các gen Xa21, Xa4, Xa7, Xa5 có hiệu ứng kháng tốt và phổ kháng rộng đối với các

chủng nòi vi khuẩn bạc lá ở Việt nam Những nghiên cứu mang tính công nghệ cao (kỹ thuật chuyển gen, kỹ thụât sinh học phân tử) đã được triển khai từ những năm cuối của thế kỷ trước tại các Viện nghiên cứu, các kỹ thuật công nghệ này thực sự phát triển và được áp dụng rộng rãi trong nghiên cứu là vào những năm đầu của thế kỷ này Cùng với trào lưu đó việc ứng dụng chỉ thị phân tử trong việc đánh giá nguồn gen và vật liệu phục vụ chọn tạo giống cũng được triển khai

và thu được những kết quả khả quan Tại một số Viện nghiên cứu và trường ( Đại học NN1, Viện Di truyền NN, Viện Công nghệ Sinh học, Viên Lúa ĐBSCL, ) đã triển khai sử dụng chỉ thị phân tử để phát hiện gen kháng bệnh và lập bản đồ gen kháng đối với một số cây trồng chính, trong đó có nghiên cứu về gen kháng bệnh bạc lá đối với cây lúa Đã có những báo cáo về ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa kháng bạc lá, và đã có một số dòng kháng có triển vọng được tạo ra bằng kỹ thuật này (Nguyễn Vĩnh Phúc, 2005) Mới đây, giai đoạn 2006 - 2010 một dự án về chọn tạo giống lúa thuần bằng công nghệ chỉ thị phân tử đã được Bộ NN&PTNT giao cho Viện DTNN chủ trì và thực hiện với sự phối hợp của Trường Đại học Nông nghiệp I Đối với lúa lai, tại nhiều đơn vị nghiên cứu lúa lai, cùng với việc tạo các dòng bố mẹ cho các tổ hợp lai, các nhà nghiên cứu cũng đã chú trọng và triển khai chuyển và qui tụ các gen kháng bạc lá vào các dòng bố mẹ có triển vọng Bước đầu theo thông báo đã

có những dòng lúa lai do Việt Nam tạo ra bằng phương pháp lai và chọn lọc truyền thống có tính kháng bệnh bạc lá tốt hơn các tổ hợp lúa lai Trung quốc, phổ kháng rộng hơn Đối với các tổ hợp lúa lai Trung quốc nhập nội các nhà nghiên cứu đã lai dòng đẳng gen mang gen kháng với các dòng phục hồi và tạo

ra dòng phục hồi được cải thiện về tính kháng so với dòng gốc: BL4/4492, BL4/quế99, BL4?RTQ5,… Trường đại học Nông nghiệp 1 sử dụng nguồn gen Xa4 đã tạo được một số dòng triển vọng(Phan Hữu Tôn 2005) Qua thử nghiệm cho thấy các dòng này kháng được với đa số các chủng vi khuẩn đưa vào lây nhiễm Tuy nhiên để tạo được các tổ hợp lúa lai kháng bền vững với bệnh bạc lá thì phải qui tụ vào các dòng bố mẹ không chỉ một gen kháng, mà là một tổ hợp

gen kháng (ít nhất là 2 gen kháng) Việc nhận biết gen kháng và xác định cá thể mang tổ hợp gen kháng được qui tụ phục vụ cho việc chọn lọc chỉ có thể thực hiện một cách có hiệu quả và nhanh là sử dụng công nghệ chỉ thị phân tử, hay nói cách khác là tiến hành qui tụ gen kháng kết hợp chọn lọc theo phương pháp MAS Để có thể rút ngắn thời gian và công đoạn của công tác qui tụ 2 hoặc 3 gen kháng vào một “genom đích” ta có thể sử dụng nguồn donors (cây cho gen) mang tổ hợp 2,3 gen kháng, như hiện nay đang được triển khai với dự án chọn tạo giống thuần kháng bệnh tại Viện Di truyền Nông nghiệp và Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội

- Kháng rầy nâu:

Việc áp dụng các tiến bộ kỹ thuật marker phân tử trong chọn giống lúa chống chịu sâu bệnh hại chính như rầy nâu đang được phát triển Với sự thuận lợi của những chỉ thị trên cơ sở kỹ thuật PCR, chúng ta đã giảm rất nhiều chi phí nghiên cứu so với sử dụng RFLP Ở Việt nam việc nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống kháng rầy nâu.lần đầu được tiến hành tại Viện lúa đồng Bằng sông Cửu Long, Nguyễn thị Lang và ctv (1999) đã sử dụng STS để

phân tích sự du nhập gen kháng rầy nâu từ loài hoang dại Oryza australiensis vào giống lúa trồng Oryza sativa L (IR31917-45-3-2) Hai dòng IR65482-4-136

và IR65482-17-511 là kết qủa của cặp lai giữa lúa hoang với lúa trồng theo cách này được ghi nhận kháng với rầy nâu biotype 2 và 3 Đa hình được ghi nhận trong cặp primer RG457FL/RL, với kiểu gen kháng có kích thước 300, 250, 200

bp, và kiểu gen nhiễm là 500, 200 bp Trong cặp primer RG457FL/BL, kiểu gen kháng có kích thước 500, 300 bp, và kiểu gen nhiễm là 550, 200 bp Chỉ thị này

có giá trị liên kết với gen kháng Bph-10 là 1,7 cM Xây dựng bản đồ liên kết

gen kháng rầy nâu với microsatellite marker trên quần thể IR 64 / Hoa Lài (hình

2 với 229 cá thể con lai F2, cho thấy: chỉ có 118 / 300 primer đựoc ghi nhận thể hiện đa hình, phủ trên 12 nhiễm sắc thể với chiều dài tổng cộng là 1.298,007

cM Gen kháng rầy nâu của vật liệu cho (giống Hoa Lài) được tìm thấy trên nhiễm sắc thể số 12, giá trị liên kết rất chặt là 0,2 cM với chỉ thị RM227 và 5,0

cM với chỉ thị RM260 Điều này cũng cho thấy nó định vị rất gần với chỉ thị RG457

Theo nghiên cứu của Thiều Văn Đường và cs (2000) thì các cây chỉ thị mang gen kháng rầy Bph1, bph5, bph7, và Bph9 đều bị nhiễm với quần thể rầy nâu ở đồng bằng Sông Hồng Còn gen bph 2 kháng vừa, các gen Bph3, bph4 và Bph6 kháng tốt với quần thể rầy nâu ở đồng bằng Sông Hồng Nhưng theo nghiên cứu gần nhất của Nguyễn Văn Đĩnh và ctv, Khoa Nông học, trường Đại học Nông nghiệp I (Nguyễn Văn Đĩnh và cs., 2005) thì các cây chỉ thị mang gen kháng rầy nâu Bph1, bph 2, bph 4, bph 5, Bph6, bph7, bph8 đều đã bị nhiễm rầy

ở mức độ trung bình đến nhiễm cao với quần thể rầy nâu ở đồng bằng Sông Hồng Chỉ còn 2 gen Bph3 ở giống Rathu Heenati và Bph9 ở giống Balamawee

là còn kháng ở mức độ từ điểm 1- 2,5

Ngọc Huyền và cs (2003) đã lập bản đồ phân tử cho 3 gen kháng rầy nâu bphX, bph4, Bph6 và phát hiện được 1 loạt chỉ thị phân tử SSR liên kết gần với các gen kháng đó Ngoài ra B.C.Buu(1997) Nguyễn Thị Lang với sự cộng tác của các tác giả thuộc Viện Nghiên cứu Lúa Quốc tế IRRI đã thành công trong việc lập bản đồ gen kháng Bph10 – 1 gen kháng tốt đối với quần thể rầy nâu thuộc đồng bằng Sông Cửu Long

Như vậy, việc sử dụng chỉ thị phân tử liên kết với các gen kháng rầy nâu phục vụ cho công tác chọn tạo giống lúa lai siêu cao sản kháng rầy nâu ở Việt Nam hiện nay được coi là rất mới mẻ,chưa có kết quả cụ thể phục vụ sản xuất

- Những đặc tính khác

Ngoài ra các nhà khoa học nước ta cũng đã thu được những kết quả khác trong việc ứng dụng công nghệ sinh học nghiên cứu lúa lai như: xác định và lập bản đồ gen bất dục đực mẫn cảm nhiệt độ tgms-VN1 là gen bất dục mẫn cảm nhiệt độ đã được xác định trên nhiễm sắc thể số 2, liên kết với marker E5/M12-

600 (Dong và cộng sự 2000) Nuôi cấy bao phấn làm thuần nhanh các dòng lúa lai bất dục đực mẫn cảm với nhiệt độ(TGMS) ( Lê hùng Lĩnh, 2003).Tác giả đã

chọn và xác định được một số dòng TGMS mới có triển vọng như: BioMS 2,BioMS10

Nhưng chưa có công trình nghiên cứu chính thức công bố nào về gene tương hợp rộng Như vậy, việc sử dụng chỉ thị phân tử liên kết với các gen tương hợp rộng phục vụ cho công tác chọn tạo giống lúa lai năng suất siêu cao sản là hết sức cấp thiết và khả thi

CHƯƠNG 2 VÂT LIỆU NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Các dòng giống lúa

- Các dòng, giống lúa Japonica và indica thu thập (gần200)

- Các dòng TGMS: 827S(AMS30S), 25S(AMS35S), BoS(AMS43S), II32S(AMS36S), KimS(AMS37S), Peiai’64, M5, M6, M8, M9, M13

-Các dòng Bố: IR58025B, II32B, KimB, BoB, R100, R242, R5, HT015, L15, R838, R119, R114, R253, D16, D46, R1025, IR24

-Dòng bố có gen kháng bạc lá gồm: IRBB60, DT57, IRBB5, IRBB7,

IRRBB21

Các dòng bố BB5/R23; BB4/RTQ5; BB11/RTQ5; Chệt Cụt/RTQ5; Chệt cụt/R838; BB11/R23; BB21/Đặc thanh; Chùm bông/Đặc thanh; BB8/4492; BB5/Q99 BB13/Quế

- Các biotype rầy nâu phổ biến ở Việt Nam: Biotype I và Biotype II

(Viện CLT &CTP phân lập )

2.1.3 Hoá chất và các cặp mồi

- Các hóa chất: Formaldehyde, Natri thiolsufat, EDTA, β - Mercaptol ethanol, + Isopropanol alcohol Chloroform : isomyl alcohol, RNase, Taq polymerase

- Các cặp mồi và chỉ thị phân tử liên kết với gen kháng bạc lá: chỉ thị Npb181 liên kết gen Xa4 với trình tự F5’- ATC-GAT-CGA-TCT-TCA-CGA-GG-3’ và R5’-GTG-CTA-TAA-AAG-GCA-TTC-GGG-3’,chỉ thị RG556 liên kết gen xa5 vớí trình tự R5’-AAT-ATT-TCA-GTG-TGC-ATC-TC-3’ và F5’-TAG-CTG-CTG-CCG-TGC-TGT-GC-3’.:chỉ thị P3 liên kết gen Xa7 với mồi R5’-CAT-CAC-GGT-CAC-CGC-CAT-ATC-GGA-3’ và F5’-CAG-CAA-TTC-

ACT-GGA-GTA-GTG-GTT-3’và chỉ thị pTA818 chọn lọc gen kháng Xa21 với

trình tự F5’ ATA GCA ACT GAT TGC TTT GC 3’ và R5’ CGA TCG GTA TAA CAG CAA AAC 3

- Các mồi SSR liên kết gen kháng rầy Bph3 và BphZ:

RM5897 với trình tự GTAGCAGCTGCCAAGGTGAAGC - AACCCAACCCAAACCAGTCTACC

- Các mồi SSR liên kết gen tơng hợp rộng:

RM253 với trình tự TCCTTCAAGAGTGCAAAACC –

GCATTGTCATGTCGA AGC

RM225 với trình tự TGCCCATATGGTCTGGATG –

GAAAGTGGATCAGGA AGGC

2.2 Nội dung nghiên cứu:

Nội dung 1: Nghiên cứu, thu thập và đánh giá nguồn thực liệu lúa Indica và

Japonica phục vu cho việc chọn dòng giống lúa lai

- Thu thập, duy trì các dòng, giống lúa Indica và Japonica tốt

- Đánh giá các chỉ tiêu hình thái sinh trưởng phát triển, các chỉ tiêu năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất, khả năng chống chịu bệnh của nguồn thực liệu đã thu thập

- Phân biệt, phân loại giữa các dòng Indica và Japonica trên cơ sở phản ứng với kiềm

Nội dung 2: Nghiên cứu xác định sự có mặt của các chỉ thị phân tử liên

kết với các gen quan trọng trong lúa lai:

- Kiểm tra sự có mặt của các chỉ thị phân tử liên kết với gen kháng bênh bạc lá

- Kiểm tra sự có mặt của các chỉ thị phân tử liên kết với gen kháng bệnh rầy nâu

- Kiểm tra sự có mặt của các chỉ thị phân tử liên kết gen TGMS

- Kiểm tra sự có mặt của các chỉ thị phân tử liên kết gen tương hợp rộng (WC)

- Kiểm tra sự có mặt của các chỉ thị phân tử liên kết gen phục hồi (RF)

Nội dung 3: Nghiên cứu sử dụng chỉ thị phân tử kết hợp với phuơng pháp

truyền thống trong việc chọn thực liệu và dòng phân ly để tạo dòng bố mẹ có gen kháng bệnh (bạc lá và rầy nâu), gen tương hợp rộng năng suất, chất lượng cao

- Chọn lọc các dòng bố trong các thế hệ phân ly, mang 1-2 gen kháng bạc

lá

- Chọn lọc các dòng mẹ TGMS trong các thế hệ phân ly, mang 2-3 gen kháng bạc lá