nghiên cứu công nghệ rnai để kiểm soát bệnh virus ở lúa và cà chua

Hội, TS Huấn 4 Chuyển nạp vector mang gen thiết kế vào lúa, cà chua và đánh giá khả năng kháng bệnh của cây chuyển gen 2007 2010 4.1 Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh in vitro ở lúa

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NT

CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƯỚC KC04

BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ RNAi

ĐỂ KIỂM SOÁT BỆNH VIRUS

Ở LÚA VÀ CÀ CHUA

MÃ SỐ KC04 -11/2007-2010

Cơ quan chủ trì đề tài: VIỆN DI TRUYỀN NÔNG NGHIỆP,

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

Chủ nhiệm đề tài: GS TS ĐỖ NĂNG VỊNH

8370

Hà Nội, 11- 2010

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NT

CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƯỚC KC04

BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ RNAi

ĐỂ KIỂM SOÁT BỆNH VIRUS

Ở LÚA VÀ CÀ CHUA

MÃ SỐ KC04 -11/2007-2010

Chủ nhiệm đề tài Cơ quan chủ trì đề tài

Ban chủ nhiệm chương trình Bộ Khoa học và Công nghệ

(ký tên) (ký tên và đóng dấu khi gửi lưu trữ)

Hà Nội, 11- 2010

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

Hà nội , ngày tháng năm 2010

BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

I THÔNG TIN CHUNG VỀ ĐỀ TÀI

Tên Đề tài/Dự án: Nghiên cứu công nghệ RNAi (RNA interference) để kiểm soát

bệnh virus lúa và cà chua

Mã số: KC.04.11/06-10

Thời gian thực hiện: 36 tháng từ 12/2007 đến /11/2010

Kinh phí: 2.985 triệu đồng

Chủ nhiệm Đề tài, Dự án: GS TS Đỗ Năng Vịnh

Chức danh khoa học: Nghiên cứu viên chính

Chức vụ: Phó Viện trưởng Viện Di truyền Nông nghiệp

Điện thoại: 7544711 Nhà riêng: 7870542 Mobile: 0903466990

Fax: 7543196 E-mail: donangvinh@netnam.vn

Tên tổ chức đang công tác: Viện Di truyền Nông nghiệp

Địa chỉ tổ chức: Đường Phạm Văn Đồng, Từ liêm, Hà nội

Tổ chức chủ trì đề tài: Viện Di truyền nông nghiệp

Điện thoại: 7544712 Fax: 7543196

E-mail: lhham@agi.ac.vn

Địa chỉ: Viện Di truyền nông nghiệp, Từ Liêm, Hà Nội

Họ và tên thủ trưởng tổ chức: PGS.TS Lê Huy Hàm

Được gia hạn (nếu có):

Thời gian (Tháng, năm)

Kinh phí (Tr.đ)

Ghi chú

(Số đề nghị quyết toán)

Kinh phí đề tài được duyệt là: 3150.0 triÖu đồng

Kinh phí sau điều chỉnh: 2985 triệu đồng, lý do: Viện Di truyền Nông nghiệp

đã đăng ký thực hiện nghiên cứu 4 loại virus: 3 virus RGSV, RTBV RRSV ở lúa và virus TYLCV ở cà chua Qua một năm nghiên cứu, chúng tôi đã xác định bằng thực nghiệm 2 loại virus RGSV, RRSV lúa là phổ biến, trong khi chưa thấy mẫu bệnh do virus Tungro gây ra Do vậy, chúng tôi xin đề nghị thôi không nghiên các chuyên đề

về virus Tungro trong nội dung nghiên cứu của đề tài Tổng phần kinh phí dự trù cho chuyên đề virus RTBV là 165,0 triệu xin chuyển trả nhà nước

c) Kết quả sử dụng kinh phí theo các khoản chi:

Đối với đề tài:

- Lý do thay đổi (nếu có): Giảm chi trả công lao động do điều chỉnh giảm bớt 01 đối

tượng nghiên cứu (RTBV ở lúa); Giảm nguyên vật liệu do tiết kiệm khi đấu thầu;

Giảm chi khác do tiết kiệm chi đoàn vào

3 Các văn bản hành chính trong quá trình thực hiện đề tài/dự án:

(Liệt kê các quyết định, văn bản của cơ quan quản lý từ công đoạn xác định nhiệm

vụ, xét chọn, phê duyệt kinh phí, hợp đồng, điều chỉnh (thời gian, nội dung, kinh phí

thực hiện nếu có); văn bản của tổ chức chủ trì đề tài, dự án (đơn, kiến nghị điều

chỉnh nếu có)

Số

TT

Số, thời gian ban

hành văn bản Tên văn bản Ghi chú

2 Quyết đinh số

2809/QĐ-BKHCN

Ngày 27 tháng 11

năm 2007

Phê duyệt kinh phí 04 đề tài, 03 dự

án sản xuất thử nghiệm ban đầu thực hiện năm 2007 thuộc chương trình

KH & CN trọng điểm cấp nhà nước giai đoạn 2006-2010 “Nghiên cứu, phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học” Mã số KC04/06-10 Quyết đinh số

“Nghiên cứu, phát triển và ứng dụng công nghệ Sinh học” Mã số

KC04/06-10 Quyết đinh số

“Nghiên cứu, phát triển và ứng dụng công nghệ Sinh học” Mã số

KC04/06-10 Quyết đinh số

16/QĐ-BKHCN

Ngày 08 tháng 01

năm 2010

V/v điều chỉnh nội dung và địa điểm

đi công tác nước ngoài của đề tài KC.04/06-10 thuộc chương trình

“Nghiên cứu, phát triển và ứng dụng công nghệ Sinh học” Mã số

KC04/06-10 Quyết đinh số

4 Tổ chức phối hợp thực hiện đề tài, dự án:

Nội dung tham gia chủ yếu

Sản phẩm chủ yếu đạt được

Ghi chú*

5 Cá nhân tham gia thực hiện đề tài, dự án:

(Người tham gia thực hiện đề tài thuộc tổ chức chủ trì và cơ quan phối hợp, không quá

Nội dung tham gia

chính

Sản phẩm chủ yếu đạt được

Ghi chú*

Chỉ đạo quản lý các hoạt động chung của đề tài

- Tổ chức, phối hợp đào tạo, hợp tác quốc tế, hội nghị, hội thảo, tổng hợp báo cáo

- Chỉ đạo, kiểm tra, đánh giá kết quả thu thập và giám định mẫu bệnh, thiết kế vectors, chuyển gen, biểu hiện gen

và chọn dòng chuyển gen

Thuý Hà

TS Lê Quỳnh Mai

- Phân lập và tách dòng gen của một trong các virus gây bệnh vàng lùn và lùn xuăn lá ở lúa

- Thiết kế các loại vector tái tổ hợp mang các RNAi gen tạo hpRNA có gen đích là gen của virus lúa Thiết kế vector theo phương pháp Gateway

Văn Đồng

TS Nguyễn Văn Khiêm

- Thiết kế các loại vectors mang gen virus và các vectors mang gen RNAi với gen đích là CP gene

- Đánh giá biểu hiện của các gen RNAi

trong cây chuyển gen

Xuân Hội

ThS

Nguyễn Thành Đức

- Phân lập và tách dòng gen của virus TYLCV cà chua

- Thiết kế các loại vectors mang gen C1 (Rep) virus cà chua và các vectors mang gen RNAi có gen đích là C1 ở cà chua

- Đánh giá biểu hiện của các gen RNAi trong cây cà chua chuyển gen

Thương Lan

TS Hà Viết Cường

- Phân lập và tách dòng, nhân dòng RRSV, RGSV ở lúa, thư viện cDNA virus ở lúa

Ngọc Thanh

- Phân lập RNA, DNA của các chủng virus thu thập

- Thiết kế các loại vector tái tổ hợp mang các gen CP virus cà chua và lúa

và các gen RNAi có khả năng tạo

hpRNA cho bất hoạt gen vỏ protein

ở lúa và cà chua

Duy Thanh

ThS Tạ Kim Nhung

- Chuyển gen RNAi vào các giống lúa thông qua

Agrobacterium và

bắn gen

- Chọn dòng có tính kháng virus

- Đánh giá biểu hiện của các gen RNAi trong cây cà chua chuyển gen

7 TS Hà Thị

Thuý

TS Hà Thị Thuý

Thư ký đề tài

- Giúp Chủ nhiệm

đề tài trong công tác quản lý và phối hợp n/c của đề tài

- Phân lập RNA, DNA của các chủng virus thu thập

- Thiết kế các loại vector tái tổ hợp mang các gen CP virus cà chua và lúa

và các gen RNAi có khả năng tạo

hpRNA cho bất hoạt gen vỏ protein

ở lúa và cà chua

Văn Huấn

ThS Đỗ Thị Thu Hương

- Phân lập và tách dòng gen của virus TYLCV cà chua

- Thiết kế các loại vectors mang gen C1 (Rep) virus cà chua và các vectors mang gen RNAi có gen đích là C1 ở cà chua

Thị Vượng

TS Phạm Thị Vượng

Thu thập mẫu lúa

và cà chua nhiễm bệnh virus

- Đánh giá các dòng chuyển gen lúa và

cà chua trong nhà lưới

- Chọn dòng có tính kháng virus qua gây nhiễm nhân tạo

- Lý do thay đổi ( nếu có):

Các cá nhân tham gia là TS Võ Thị Thương Lan và TS Lê Hùng thuộc khoa sinh học ĐHKHTN Sau khi đề tài được phê duyệt, chúng tôi đã chuyển thuyết minh đề tài và các văn bản kèm theo đến TS Võ Thị Thương Lan và TS Lê Hùng

đề nghị xác nhận nội dung tham gia nghiên cứu cụ thể để tiến tới ký kết hợp đồng

chính thức Sau khi nghiên cứu tài liệu cả 2 tiến sỹ đều từ chối, thôi không tham gia

đề tài nữa Theo chúng tôi được biết, TS Hùng đã chuyển đi cơ quan khác, không còn làm việc tại ĐHKHTN nữa

Thay vào đó, chúng tôi đã thảo luận và mời TS Hà Viết Cường, chuyên gia virus , Giám đốc Trung tâm bệnh cây nhiệt đới thuộc Đại học Nông nghiệp I, cộng tác

6 Tình hình hợp tác quốc tế:

HỢP TÁC QUỐC TẾ CỦA ĐỀ TÀI

(Quá trình hợp tác quốc tế (nếu có): tên đối tác nước ngoài; nội dung đã hợp tác; hình thức thực hiện; kết quả hợp tác, tác động của việc hợp tác đối với kết quả của

đề tài)

Dr Sunil K Mukherjee thăm và làm việc tại Viện DTNN

hiện ĐOÀN VÀO

Nội dung làm việc: Hướng dẫn

kỹ thuật, giảng bài, thảo luận hợp tác về RNAi ứng dụng ở lúa

- Thảo luận về kỹ thuật phân lập gen virus lúa và thiết kế vector RNAi

- Làm việc với PTN về kỹ thuật thiết kế amiRNA

- Bài giảng tại hội trường (chiều): Tổng quan về công nghệ sinh học lúa, cuộc Cách mạng xanh mới và vai trò của công nghệ RNAi

- Một số thành tựu mới về RNAi ở lúa và xây dựng kế hoạch hợp tác: Highly Specific Gene Silencing by Artificial microRNA in Rice Toward a second Green

Thời gian làm việc từ 25 tháng 11 đến 1 tháng 12- 2007

- Giải trình tự hệ gen (Genom DNA-A) của virus cà chua có

độ dài lớn (khoảng từ 2700 –

2800 cặp nucleotide, gồm 6 gen khác nhau)

- Tổng hợp nhân tạo gen có độ dài 500 nucleotide

( Viện Di truyền nông nghiệp

và các viện trong nước chưa

đủ điều kiện giải trình tự và tổng hợp đoạn gen dài như vậy

Chuyên gia về CNSH

virus thực vật và công

nghệ RNAi thuộc Trung

tâm kỹ thuật gen và

CNSH quốc tế

1/ Giảng bài (3 bài):

1 Overview of RNAi ( Tổng quan về công nghệ RNAi )

2 Detection and Mechanism of Viral Suppressors of RNAi ( Phát hiện và n/c cơ chế kìm hãm RNAi thực vật của virus)

3 RNAi - Antipathogenic functions ( RNAi – Chức năng kiểm soát các tác nhân gây bệnh)

2/ Thảo luận các vấn đề kỹ thuật, hướng dẫn phân lập virus gây bệnh xoăn lá cà chua

và kỹ thuật RNAi 3/ Thăm đồng ruộng, thu thập

mẫu bệnh

Thời gian làm việc: từ ngày

Đại học Montpellier và

nhóm n/c lúa ở IRD

nghệ RNAi – Nguyên lý và ứng dụng” sẽ được tổ chức trong thời gian GS ở Việt Nam

Nội dung và kết quả:

- Đã thăm quan PTN, tập đoàn quỹ gen, đồng ruộng, nhà lưới nhà kính, học hỏi các thành tựu về di truyền chọn tạo giống lúa, nguồn gen kháng bệnh virus có liên quan đến đề tài

- Đã gặp gỡ và thảo luận với các chuyên gia có liên quan:

TS Darshan S Brar, Trưởng khoa di truyền và CNSH của IRRI;

TS Phillippe Herve, Trưởng PTN CNSH lúa;

TS Tô Phúc Tường, P Tổng Giám đốc IRRI;

TS Hey Leung;về phương pháp nghiên cứu và khả năng hợp tác

- Đã dự thảo hợp tác nghiên cứu và đào tạo ngắn hạn cho PTN về RNAi và virus lúa

- Đã thu thập nhiều tài liệu và thảo luận hợp tác với các chuyên gia đầu ngành của IRRI về lúa và bệnh virus lúa như

Tuy vậy, nội dung hợp tác với IRRI sau đó gặp khó khăn v́ì chuyên gia chính về công nghệ RNAi của IRRI là TS

Phillippe Herve, Trưởng PTN CNSH lúa đă rời IRRI sang

Mỹ (làm việc cho Sygenta)

4 ngày, từ 10 tháng 3 đến 13 tháng 3 năm

2008

- Ths Nguyễn Thành

Đức

Thực tập về chuyển gen và phân tích cây chuyển gen ở

Thời gian 2 tháng/ người

hiện đại ta chưa có

(60 ngày), 15/5/2010 đến

15/7/2010

HỘI THẢO QUỐC

TẾ

Tên Hội thảo:

Nguyễn Thành Đức:

- Nghiên cứu phân lập, giải trình gen virus gây bệnh vàng lùn, lùn xoăn lá lúa (RGSV và RRSV) và công nghệ RNAi ứng dụng tạo giống kháng bệnh ( Study on isolation and sequencing of rice virus (RGSV, RRSV) genes and application of RNAi for virus resistance breeding)

Đỗ Năng Vịnh:

Công nghệ RNAi - Định hướng nghiên cứu và phát triển (RNAi Technology – Proposal for Research and

Delelopment)

Trần Ngọc Thanh:

- Nghiên cứu phân lập, giải trình DNA-A genom của virus gây bệnh xoăn lá cà chua (ToLCV) và công nghệ RNAi ứng dụng tạo giống cà chua kháng bệnh virus (Study on isolation and sequencing of DNA-A genome of Tomato Leave Curl Virus (ToLCV) and application of RNAi for

Ngày 05 tháng

7 năm 2010

virus resistance breeding)

(Nội dung, thời gian, kinh phí,

địa điểm, tên tổ chức hợp tác,

số đoàn, số lượng người tham

tháng: Đào tạo thiết kế vector

RNAi xác định các hpRNAi và

Đi Pháp: Cử đoàn 02 người đi công tác tại Trường Đại học Montpellier 2 - Pháp

siRNAi ở lúa, chuyển gen

tháng): Thiết kế RNAi vector

cà chua

Kinh phí: 110.000.000 đ (Một

trăm mười triệu đồng chẵn)

- Lý do thay đổi (nếu có): Đề tài KC04.11/06-10 không thực hiện đi thực tập tại Philipin và Ấn Độ vì Viện nghiên cứu lúa Quốc tế IRRI (Phillipin) không bố trí được chuyên gia đào tạo về công nghệ RNAi và chúng tôi đã xin được 01 xuất đào tạo thực tập sinh tại Trung tâm ICGEB bằng nguồn kinh phí hỗ trợ khác Bộ KH-

CN đã cho phép điều chỉnh kế hoạch hợp tác quốc tế của đề tài sang đi Pháp, nơi có nhóm chuyên gia sâu về công nghệ RNAi ở lúa

7 Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị:

(Nội dung, thời gian,

kinh phí, địa điểm )

Địa điểm: Tại Phòng HTQT -

Viện Di truyền Nông nghi

Kinh phí: 30.000.000 đ (Ba

mươi triệu đồng chẵn)

Hội thảo: Công nghệ RNAi – Nguyên lý và ứng dụng

Thời gian từ 8 giờ 30’ đến

16 giờ 30, ngày 05/7/2010

Địa điểm: Tại Phòng HTQT - Viện Di truyền Nông nghi

Kinh phí: 30.000.000 đ (Ba mươi triệu đồng chẵn)

8 Tóm tắt các nội dung, công việc chủ yếu:

(Nêu tại mục 15 của thuyết minh, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát trong nước và nước ngoài)

a/ Nội dung đã được duyệt ban đầu

Thời gian thực hiện

Các nội dung, công việc chủ yếu cần

được thực hiện (các mốc đánh giá chủ yếu) Bắt

đầu

Kết thúc

Cá nhân,

tổ chức thực hiện

bệnh vàng lùn, lùn xoăn lá lúa và xoăn lá

cà chua ở Việt Nam

- VDTNN

1.1 Thu thập mẫu bệnh xoăn lá cà chua và các

mẫu bệnh vàng lùn, lùn xoăn lá lúa từ các

2 Giải mã được trình tự của các gen đặc thù

gây bệnh vàng lùn, lùn xoăn lá lúa và xoăn

2.3 Xây dựng thư viện cDNA từ một số phân

đoạn gen của các chủng virus gây bệnh lúa

có genom là RNA

(TS Hà)

2.4 Xác định trình tự các phân đoạn DNA/

c-DNA của từng chủng nghiên cứu và so

sánh genom với các chủng tương tự trên

2.6 Thiết kế các cặp mồi đặc hiệu cho các gen

quan trọng của các virus nghiên cứu

(TS Hội, TS Hà)

virus và các vectors mang gen RNAi biểu

hiện làm gây bất hoạt gen gây bệnh vàng

2008 2009

lùn, lùn xoăn lá lúa và xoăn lá cà chua

3.1 ứng dụng các chương trình phần mềm khác

nhau nhằm thiết kế trình tự gen mã hoá

cho RNA dạng kẹp tóc (hpRNA)

(TS Hà, TS.Hội,)

- ĐHKHTN (TS Lan,

TS Hùng)

3.2 Xác định các intron, thiết kế các cặp mồi

đặc hiệu để tái bản đoạn intron và lựa chọn

được intron có độ dài tối ưu cho cấu trúc

dsRNA

(TS Hà)

- ĐHKHTN (TS.Lan,

TS Hựng)

3.3 Nghiên cứu thiết kế các vector mang gen

virus và vector mang RNAi với gen đích là

CP gen hoặc C1 gen (Rep) ở virus TYLCV

cà chua

(TS Hà)

- ĐHKHTN (TS.Lan,

TS Hựng)

3.4 Nghiên cứu thiết kế các vector mang gen

virus và mang gen RNAi cho các gen đích

khác nhau ở virus lúa (gen vỏ CP của các

virus khác nhau ở lúa và một vài gen khác)

(TS Đồng

TS Hội,

TS Huấn)

4 Chuyển nạp vector mang gen thiết kế vào

lúa, cà chua và đánh giá khả năng kháng

bệnh của cây chuyển gen

2007 2010

4.1 Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh in

vitro ở lúa và cà chua thích hợp cho việc

4.2 Nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển

gen RNAi vào lúa và cà chua

cây chuyển gen đối với virus gây bệnh ở

5.2 Đánh giá biểu hiện gen ở cây chuyển gen 2009 2010 - VDTNN

( TS Thanh,

TS Huấn,

TS Đồng)

- ĐHKHTN (TS Lan,

TS Hựng)

- VBVTV (TS.Vượng)

- ĐHKHTN

- VBVTV Xin điều chỉnh:

- Bỏ hạng mục 2.1: “Nghiên cứu phân lập DNA của virus RTBV ở lúa” (trang

32, thuyết minh đề tài) và các nội dung, chuyên đề có liên quan đến virus gây

bệnh Tungro (RTBV, RTSV) vì không tìm thấy virus và bệnh nay ở các vùng

lúa

b/ Nội dung nghiên cứu sau điều chỉnh theo bảng dưới đây:

Thời gian thực hiện

Các nội dung, công việc

chủ yếu cần được thực hiện;

đầu

Kết thúc

Cá nhân,

tổ chức thực hiện

bệnh vàng lùn, lùn xoăn lá lúa và xoăn lá cà

chua ở Việt Nam

- VDTNN

1.1 Thu thập mẫu bệnh xoăn lá cà chua và các

mẫu bệnh vàng lùn, lùn xoăn lá lúa từ các

vùng bệnh

- VBVTV

- VDTNN

1.2 Xác định các mẫu nhiễm bệnh virusTYLCV

cà chua và nhiễm virus ở lúa (RGSV,

RRSV)

-Viện DTNN

2 Giải mã được trình tự của các gen đặc thù

gây bệnh vàng lùn, lùn xoăn lá lúa và xoăn

2.2 Nhân dòng cDNA của một vài phân đoạn

gen của các chủng virus gây bệnh lúa có

genom là RNA

2.3 Xác định trình tự các phân đoạn DNA/

c-DNA của từng chủng nghiên cứu và so sánh

genom với các chủng tương tự trên thế giới

2.5 Thiết kế các cặp mồi đặc hiệu cho các gen

quan trọng của các virus nghiên cứu

DTNN

và các vectors mang gen RNAi biểu hiện

làm gây bất hoạt gen gây bệnh vàng lùn, lùn

xoăn lá lúa và xoăn lá cà chua

I

3.2 Xác định các intron, thiết kế các cặp mồi

đặc hiệu để tái bản đoạn intron và lựa chọn

được intron có độ dài tối ưu cho cấu trúc

dsRNA

3.3 Nghiên cứu thiết kế các vector mang gen

virus và vector mang RNAi với gen đích là

CP gen hoặc C1 gen (Rep) ở virus TYLCV

cà chua

3.4 Nghiên cứu thiết kế các vector mang gen

virus và mang gen RNAi cho các gen đích

khác nhau ở virus lúa (gen vỏ CP của các

virus khác nhau ở lúa và một vài gen khác)

4 Chuyển nạp vector mang gen thiết kế vào

lúa, cà chua và đánh giá khả năng kháng

bệnh của cây chuyển gen

2008 2009

4.1 Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh in

vitro ở lúa và cà chua thích hợp cho việc

chuyển gen

4.2 Nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen 2007 2009 VDTNN

RNAi vào lúa và cà chua

chuyển gen đối với virus gây bệnh ở lúa và

III SẢN PHẨM KH&CN CỦA ĐỀ TÀI, DỰ ÁN

1 Sản phẩm KH&CN đã tạo ra:

kế hoạch

Thực tế đạt được

Ghi chú

- Xác định được 8 chủng virus ToLCV gây xoăn lá cà chua có trình tự genom DNA-A khác biệt và đã đăng ký các trình tự ở NCBI

đoạn DNA-A genom của ToLCV, mỗi trình tự gồm 6 gen khác nhau của virus

cDNA virus gây

bệnh vàng lùn và

Trình tự gen của virus

Trình

tự của 1-2 gen

14 trình tự gen khác nhau của 2 loại virus (RGSV và RRSV), mỗi loại 3 gen khác

kế hoạch

Thực tế đạt được

Ghi chú

virus lúa

nhau Lưu giữ cDNA của 6 gen virus đã giải trình tự

Đăng ký 14 trình tự gen virus lúa ở NCBI

3-4 vector mang gen RNAi

6 vector RNAi có cấu trúc khác nhau với gen đích là các gen virus

1) Dòng VR1: dòng các cây lúa chuyển gen mang đoạn trình tự bảo thủ 21 nt (amiRNA) của Coat protein pc5 gene của virus RGSV,

49 cây T0 biểu hiện tính kháng bệnh sau lây nhiễm nhân tạo

2) Dòng VR2: dòng các cây lúa chuyển gen mang đoạn trình tự 500 nt của Coat protein pc5 gene của virus RGSV, 29 cây T0 biểu hiện tính kháng bệnh sau lây nhiễm nhân tạo

3) Dòng các cây lúa chuyển gen mang đoạn trình tự 500

nt của Spike protein gene của virus RRSV, 150 cây thu được từ chuyển gen, trong đó có 45 cây T0 đã xác định mang gen theo

kế hoạch

Thực tế đạt được

Ghi chú

kiểm tra bằng PCR

4) Dòng các cây lúa chuyển gen mang đoạn trình tự bảo thủ 21 nt (amiRNA) của spike protein gene của virus RRSV, 156 cây thu được từ chuyển gen, trong đó 43 cây T0 đã xác định mang gen theo kiểm tra bằng PCR

5) Các dòng cà chua mang các trình tự bảo thủ của 6 gen khác nhau của ToLCV virus cà chua, trong đó tổng

số 76 cây T0 đã được xác định mang gen bằng PCR

virus bằng PCR đối với các

virus nghiên cứu

pháp PCR, RT-PCR và giải trình tự gen để xác định chủng virus

7 Phương pháp phân lập DNA,

RNA virus cà chua, lúa và

lập thư viện cDNA của virus

gây bệnh lúa n/c

DNA, RNA virus cà chua

và lúa (Rolling Circle Amplification – RCA;

PCR, RT-PCR) và các phương pháp lập thư viện cDNA của chủng virus lúa

8 Phương pháp thiết kế vector

mang gen RNAi

1

4 Phương pháp thiết kế các loại vector khác nhau mang gen RNAi

1) Phương pháp thiết kế

Vector tasiRNA 2) Phương pháp thiết kế

hp RNAi 3) Phương pháp thiết kế pANDA vector

4) Phương pháp thiết kế amiRNA

thông qua Agrobacterium

cho cà chua

chuyển gen

thông qua Agrobacterium

Cây cà chua chuyển gen chưa đưa ra ngoài do thời tiết còn quá nóng

12 Sơ đồ thiết kế cấu trúc

dsRNA và các vector tái tổ

hợp

vector RNAi cho virus cà chua:tasiRNA và hnRNA

và 2 loại thiết kế vector cho virus lúa: amiRNA và pANDA vector:

1) Vector pBI121 mang đoạn trình tự tasiRNA, được biến nạp vào chủng

Agrobacterium

(LBA4404) TasiRNA Vector mang đoạn trình tự ToLCV resistance (ToLCVr) với tổng kích

thước là 503 Nucleotide, trong đó bao gồm các đoạn trình tự bảo thủ của các gen khác nhau của virus AV1, AV2, AC1, AC2, AC3,AC4, đoạn trình tự enzyme giới hạn

của BamHI và SacI, đoạn trình tự bám của miR390 vào 2 đầu

2) Hairpin Vector pART27 mang 2 đoạn trình tự ToLCVr ngược chiều, cũng được biến nạp

vào chủng Agrobacterium

(LBA4404) để chuyển gen tạo cây cà chua kháng bệnh virus ToLCV Việt nam

3) Vector pANDA mang đoạn trình tự 500 nt của spike protein gene nằm trên S9 của virus RRSV

4) Vector pANDA mang đoạn trình tự 500 nt của Coat protein pc5 genenằm trên S5 của virus RGSV

5) Vector pC2300 mang đoạn trình tự bảo thủ 21 nt của spike protein gene của virus RRSV và đồng thời không trùng lặp với trình

tự gen của lúa 6) Vector pC2300 mang đoạn trình tự bảo thủ 21 nt của Coat protein pc5 gene của virus RGSV và đồng thời không trùng lặp với trình tự gen của lúa

13 Sơ đồ quan hệ di truyền giữa

các chủng virus phân lập ở

nước ta và các chủng quốc tế

di truyền của các chủng virus lúa và virus cà chua với các chủng quốc tế và trong nước

14 Báo cáo phân tích các kết

quả nghiên cứu của đề tài

1 Nhiều báo cao, Đang tiến

hành lập báo cáo tổng thể

tiếp tục gửi đăng 2-3 bài thời gian tới Cụ thể:

1) “Công nghệ can thiệp RNA (RNAi) gây bất hoạt gen và tiềm năng ứng dụng to lớn” Tạp chí CNSH, Số 5(3), 265 –

275, 2007

2) “Nghiên cứu phân lập

và giải trình tự hệ gien DNA-A của virus gây bệnh xoăn lá cà chua ở miền Bắc Việt Nam” Tạp chí Nông nghiệp và PTNT, số 15/2010, 14-20

3) “Rice virus research

(RGSV and RRSV) and developing RNAi approaches for virus disease control in Vietnam” The 3nd

International Rice Congress (IRC2010),

Đang viết 2 bài mới:

- Nghiên cứu thiết kế vector RNAi và chuyển gen vào lúa thông qua Agrobacterium

- Nghiên cứu thiết kế

vector RNAi và chuyển gen vào cà chua thông qua Agrobacterium

và chuyển gen RNAi và chuyển gen đã

được sử dụng cho hội thảo

“Công nghệ RNAi –

Nguyên lý và ứng dụng”,

tổ chức ngày 5 tháng 5 năm 2010 và các tài liệu

về phương pháp chuyển gen

sỹ sẽ bảo vệ trong năm

2010, đã đào tạo 2 cử nhân làm luận án tốt nghiệp

- Một thạc sỹ đã bảo vệ luận án năm

2010:“Nghiên cứu phân

lập, xác định trình tự hệ gen virus gây bệnh xoăn lá

Cà chua (ToLCV) và thiết

kế vector RNAi với các gen đích khác nhau ở virus gây bệnh ”

- 1 thạc sỹ đã bảo vệ trong

năm 2010 Đề tài” Nghiên

cứu tái sinh in vitro và quy trình biến nạp gen ở lúa Indica thông qua Agrobacterium” đã bảo vệ

cấp bộ môn

- Đề tài “Đánh giá khả

năng tái sinh in vitro và biến nạp gen GFP vào lúa Japonica thông qua Agrobacterium” sẽ bảo vệ

vào cuối năm

- Đã đào tạo 2 cử nhân làm luận án tốt nghiệp

Số lượng, nơi công bố (Tạp chí, nhà xuất bản)

Bài báo 2-3 4 (đến kỳ báo

cáo)

RNA (RNAi) gây bất hoạt

gen và tiềm năng ứng

Breitler3, Christophe

Brugidou4, Pascal

Gantet2, Do Nang Vinh1

Post, Abstract, The third International Rice Congress

2010 (IRC2010), November 8-12,

Lúa (RRSV) từ mẫu lúa

nhiễm bệnh tại Việt

Nam”,

Tạp chí NN và PTNT, đã nhận

in

- Nghiên cứu thiết kế

vector RNAi và chuyển

gen vào lúa thông qua

Agrobacterium

Đang hoàn thiện

bài mới

6 - Nghiên cứu thiết kế

vector RNAi và chuyển

gen vào cà chua thông

qua Agrobacterium

Đang hoàn thiện

bài mới

d) Kết quả đào tạo:

Số lượng (Thời gian kết thúc) Ghi chú

Thực tế đạt được

3 Ths và 2

cử nhân

1- Một thạc sỹ đã bảo vệ luận án năm

2010:“Nghiên cứu phân lập, xác định trình

tự hệ gen virus gây bệnh xoăn lá Cà chua (ToLCV) và thiết kế vector RNAi với các gen đích khác nhau ở virus gây bệnh ”

2- Một thạc sỹ đã bảo vệ trong năm 2010

Đề tài” Nghiên cứu tái sinh in vitro và quy

trình biến nạp gen ở lúa Indica thông qua Agrobacterium” đã bảo vệ cấp bộ môn

3- Đề tài “ Đánh giá khả năng tái sinh in

vitro và biến nạp gen GFP vào lúa Japonica thông qua Agrobacterium” sẽ bảo vệ vào

hạn - NCS)

- 2 NCS Tiến sỹ: Trần Ngọc Thanh và Vũ Văn Tiến, Luận án về ứng dụng công nghệ RNAi để kiểm soát bệnh virus ở ICGEB, đã

trao đổi chuyên gia

đ) Tình hình đăng ký bảo hộ quyền sở hữu công nghiệp, quyền đối với giống cây trồng:

Ghi chú (Thời gian kết thúc)

1

Dự kiến sẽ đăng ký bản

quyền đối với các dòng

cây chuyển gen sau khi

đánh giá đầy đủ về các

dòng cây và cây chuyển

gen

2

2 Đánh giá về hiệu quả do đề tài, dự án mang lại:

a) Hiệu quả về khoa học và công nghệ:

(Nêu rõ danh mục công nghệ và mức độ nắm vững, làm chủ, so sánh với trình độ công nghệ so với khu vực và thế giới…):

Kết quả nghiên cứu cho thấy đề tài có tính khoa học-công nghệ cao, nội dung và kết quả nghiên cứu của đề tài có tính mới, tính hiện đại, tính thời sự và tính cấp bách không chỉ đối với trong nước Đề tài thể hiện khả năng tiếp cận nhanh của nhóm nghiên cứu đối với các công nghệ và phương pháp mới, đặc biệt là công nghệ RNAi mới được trao giải thưởng Nobel năm tháng 10 /2006, đề tài đi vào thực hiện

từ tháng 12/2007 Dưới đây là tổng hợp các kết quả cụ thể:

1) Đã phân lập được nhiều chủng virus gây bệnh vàng lùn, lùn xoăn lá lúa, xoăn lá cà chua ở Việt Nam:

- Xác định được 14 chủng virus có trình tự gen khác biệt ở lúa và đã đăng ký các trình tự khác biệt ở Gene Bank, NCBI

- Xác định được 8 chủng virus ToLCV gây xoăn lá cà chua có trình tự genom DNA-A khác biệt và đã đăng ký các trình tự ở NCBI

( Vượt xa so với 4-5 chủng đăng ký trong đề tài và hợp đồng đề tài)

2) Đã giải mã được trình tự của các gen đặc thù của các chủng virus gây bệnh:

- Đã giải được 14 trình tự gen của phân đoạn DNA-A genom của ToLCV, mỗi trình tự gồm 6 gen khác nhau của virus Đã đăng ký 8 trình tự gen cà chua (DNA-A) trên Ngân hàng gen NCBI

- Đã giải được 14 trình tự gen khác nhau của 2 loại virus (RGSV và RRSV), mỗi loại 3 gen khác nhau Lưu giữ cDNA của 6 gen virus đã giải trình tự Đã đăng

ký 14 trình tự gen virus lúa ở NCBI

(Vượt xa so với đăng ký( 4-5 trình tự phân đoạn DNA-A của virus ToLCV và trình

tự của 1-2 gen của 1-2 virus lúa trong đề tài và hợp đồng đề tài)

3) Đã thiết kế được một số vector RNAi làm bất hoạt gen ở virus gây bệnh vàng lùn, lùn xoăn lá lúa và xoăn lá cà chua (TYLCV)

Đã thiết kế được 6 vector RNAi có cấu trúc khác nhau với gen đích là các gen của 3

loại virus (vượt so với đăng ký 3-4 vector mang gen RNAi trong đề tài và hợp đồng

1) Dòng cà chua C155 mang gen Tasi RNA (ToLCV)

2) Dòng cà chua C155 mang cấu trúc kẹp tóc (ToLCV)

3) Dòng cà chua Balan mang gen Tasi RNA (ToLCV)

4) Dòng cà chua Balan mang cấu trúc kẹp tóc (ToLCV)

(đăng ký là 1-2 dòng)

5) Đã nhận được 4 dòng cây lúa và các dòng cà chua chuyển gen với các gen khác nhau

Đã thử nghiệm lây bệnh virus nhân tạo thông qua tác nhân truyền bệnh là rầy nâu,

đã đánh giá và xác định được một số cây lúa chuyển gen RNAi thế hệ T0 có khả năng chống chịu Kết quả này cần phải được tiếp tục trong thời gian tới

Căn cứ vào kết quả thực hiện thành công các mục tiêu cụ thể trên đây, chúng tôi đã đi được các bước đầu tiên, rất cơ bản tiến tới mục tiêu chung của

đề tài là: Xây dựng và ứng dụng công nghệ RNAi trong việc gây bất hoạt các virus

gây bệnh vàng lùn, lùn xoắn lá lúa và bệnh xoắn lá cà chua

- Lần đầu tiên áp dụng thành công các kỹ thuật mới như Rolling Circle Applification (RCA), RT-PCR, kỹ thuật xác định gen ức chế RNAi, công nghệ Gateway, …trong nghiên cứu cơ bản về virus ToLCV, RGSV, RRSV

Cung cấp các tri thức mới về hệ gen và các biến chủng của các chủng virus này ở nước ta Đăng ký được nhiều trình tự gen mới của 3 virus trên đây tại Ngân hàng gen NCBI

- Đã thiết kế được 6 vector RNAi có cấu trúc khác nhau với gen đích là các

gen của 3 loại virus (vượt so với đăng ký 3-4 vector mang gen RNAi trong đề

tài và hợp đồng đề tài).Lần đầu tiên đã triển khai việc thiết kế nhiều loại

vectors có khả năng tạo các loại RNA ngắn đa dạng nhằm bất hoạt gen đích mong muốn: tasiRNA, amiRNA, hpRNA

- Lần đầu tiên đã nhận được cây lúa và cà chua chuyển gen gồm 4 dòng lúa và

4 dòng cà chua mang các gen khác nhau ở thế hệ T0 đã và đang được đánh giá, trong đó có 2 dòng lúa kháng virus RGSV đã được đánh giá là kháng bệnh sau khi lây nhiễm bệnh nhân tạo

1 Dòng các cây lúa chuyển gen mang đoạn trình tự 500 nt của Coat protein pc5 gene của virus RGSV Dòng này đã được tuyển chọn thông qua lây nhiễm bệnh nhân tạo và được đánh giá kháng bệnh ( Vector chuyển gen pANDA-s5gp2 Ký hiệu là Dòng VR1 ( hpRNA 500nt, virus resistance, siRNA,s5gp2, RGSV)

2 Dòng các cây lúa chuyển gen mang đoạn trình tự bảo thủ 21 nt (amiRNA) của Coat protein pc5 gene của virus RGSV Vector chuyển gen là pC2300-s5gp2 Ký hiệu là Dòng VR2( virus resistance, amiRNA,s5gp2, RGSV)

3 Các dòng khác đang tiếp tục được đánh giá tính kháng qua lây nhiễm bệnh nhân tạo

- Lần đầu tiên triển khai huớng nghiên cứu mới về cộng nghê RNAi gây bất hoạt gen ở virus lúa và cà chua ở Việt Nam Cung cấp cơ sở lý luận, phương pháp, tài liệu, dữ liệu và kỹ năng thực hành có giá trị trong nghiên cứu bất hoạt gen đích ở virus gây bệnh ở lúa và cà chua và cho phép mở rộng ứng dụng cơ chế RNAi vào các mục tiêu nghiên cứu khác Tạo tiền đề cho ứng

dụng công nghệ RNAi trong nhiều lĩnh vực khác nhau của nông nghiệp, thuỷ sản, y học

- Cập nhật kịp thời những kiến thức hiện đại về sinh học phân tử của RNA, cơ chế điều khiển hoạt hóa gen của RNAi giúp cho việc nghiên cứu cơ bản, trong đào tạo Đại học và sau Đại học

- Đội ngũ thực hiện đề tài từ trình độ cử nhân trở lên đã được đào tạo, nâng cấp kiến thức khoa học và thực tiễn Nhiều cá nhân đã được học tập và đào tạo tại nước ngoài về RNAi theo các kênh HTQT Thông qua chuyên gia (3 đợt chuyên gia vào Việt Nam) đã tiến hành giảng bài, đi thực tế và hội thảo quốc tế, đã đào tạo được hàng chục cán bộ khoa học về công nghệ RNAi, đóng góp vốn kiên thức và kinh nghiệm thực tế hữu ích cho đề tài

- Có sự phối hợp bài bản, có tính chất khoa học với các nhóm nghiên cứu bên ngoài, như Viện bảo vệ thực vật, Trung tâm quốc tế nghiên cứu phát triển nông nghiệp Pháp (CIRAD), Đại học Khoa học –Công nghệ Montpellier và Viện Nghiên cứu phát triển (IRD) Pháp; Trung tâm Kỹ thuật gen và CNSH quốc tế (ICGEB) Thông qua HTQT đã gửi được 1 nghiên cứu sinh PhD nghiên cứu công nghệ RNAi ở cà chua (đi năm 2009) và 1 NCS mới đi năm

2010 về đề tài công nghệ RNAi áp dụng cho virus lúa lùn sọc đen Phương Nam, 01 NCS đã được quyết định từ phia Pháp nghiên cứu 6 tháng tại Pháp

và 6 tháng tại Việt Nam về RNAi kiểm soát virus lúa trong năm 2011

- Quảng bá rộng rãi công nghệ RNAi Đào tạo cán bộ trong phòng thí nghiệm của Viện và Trường, nâng cao kiến thức và kỹ năng thực nghiệm liên quan

đến RNAi

b) Hiệu quả về kinh tế xã hội

(Nêu rõ hiệu quả làm lợi tính bằng tiền dự kiến do đề tài, dự án tạo ra so với các sản phẩm cùng loại trên thị trường…):

- Bệnh virus ngày càng trở nên nghiêm trọng trên quy mô toàn cầu như các bệnh HIV, các bệnh viêm gan (B,C,E), H5N1, SARS, ở người Các bệnh virus gây

hại nông nghiệp như bò điên, cúm gà H5N1, lở mồm long móng, bệnh virus chấm trắng ở tôm, bệnh virus Y, X ở khoai tây, bệnh xoăn lá cà chua, các bệnh vàng lùn và lùn xoăn lá ở lúa Nguy cơ xuất hiện các bệnh virus mới - vũ khí vi trùng là rất lớn Do vậy, công nghệ RNAi do chúng tôi nghiên cứu có thể được

sử dụng trong chiến lược quốc gia phòng chống bệnh virus nói chung

- Đề tài đã xây dựng một số phương pháp quan trọng không chỉ ứng dụng đối với các virus lúa và cà chua Đề tài có thể cung cấp tri thức và phương pháp RNAi

để phòng chống các bệnh dịch nghiêm trọng do virus và các virus mới xuất hiện

- Theo tin VNTTX ngày 4/11/2006, tại hội nghị do Thủ tướng chủ trì về giải pháp phòng trừ rầy nâu, bệnh vàng lùn và lùn soắn lá, đã thông báo bệnh dịch đã lây lan ra 21 tỉnh thành, gây thiệt hại trên 500.000 ha, làm giảm sản lượng 825.000 tấn lúa, thiệt hại khoảng 2.000 tỷ đồng cho 500 nghìn hộ nông dân GS Nguyễn Thơ (2007) cho biết " hầu hết các cây trồng ở nước ta đều bị bệnh virus, nhưng bệnh nặng nhất là ở các cây như cà chua, khoai tây, thuốc lá, hồ tiêu, cam quýt", trong đó "Nhóm bệnh virus cà chua, khoai tây, thuốc lá, hồ tiêu, cam quýt xuất hiện hàng năm rất bền vững Bệnh xoăn lá (ToLCV) ở Việt Nam là phổ biến và gây thiệt hại rất lớn trên cây cà chua Đề tài cung cấp các dòng cây chuyển gen

cà chua và lúa có triển vọng kháng virus và có thể phát triển thành các giống mới nếu được tiếp tục triển khai đề tài giai đoạn sau

- Giống kháng bệnh virus có thể giảm thiệt hại và giảm chi phí sản xuất và giảm thiểu ô nhiễm môi trường do giảm lượng thuốc BVTV, góp phần bảo vệ sức khoẻ cho người trồng và nâng cao độ an toàn của hàng tiêu dùng

3 Tình hình thực hiện chế độ báo cáo, kiểm tra của đề tài, dự án:

Số

TT Nội dung

Thời gian thực hiện

Ghi chú

(Tóm tắt kết quả, kết luận chính, người chủ

Chủ nhiệm đề tài

(Họ tên, chữ ký)

Thủ trưởng tổ chức chủ trì

(Họ tên, chữ ký và đóng dấu)

MỤC LỤC

MỤC LỤC 35 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 37 XUẤT XỨ CỦA ĐỀ TÀI 38 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI 38

I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 39 1.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu 39 1.2 Bệnh virus vàng lùn, lùn xoăn lá lúa 39 1.3 Nghiên cứu bệnh vàng lùn, lùn xoăn lá lúa ở nước ta 43

1.5 Bệnh xoăn lá cà chua ở nước ta 48 1.6 Tổng quan về công nghệ RNAi và những khả năng ứng dụng 49

1.8 Những vấn đề đặt ra đối với đề tài 79

II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 83 2.1 Vật liệu 83 2.1.1 Mẫu lúa, cà chua mang virus 83 2.1.2 Mẫu lúa, cà chua sử dụng cho chuyển gen 83

2.1.4 Các vật liệu khác 84 2.2 Phương pháp 85 2.2.1 Thu thập mẫu 85 2.2.2 Tách chiết DNA virus cà chua và RNA virus lúa 86 2.2.3 Thiết kế các cặp mồi đặc hiệu 89 2.2.4 Giải trình tự một số gen virus và so sánh trình tự với các trình tự tương ứng đã được công bố trên ngân hàng gen 91 2.2.5 Xác định trình tự intron cho thiết kế vector 95 2.2.6 Thiết kế vector mang gen RNAi 95 2.2.7 Xây dựng hệ thống tái sinh lúa 102 2.2.8 Xây dựng hệ thống tái sinh cà chua 103 2.2.9 Quy trình chuyển gen vào lúa 104 2.2.10 Quy trình chuyển gen vào cà chua 106 2.2.11 Đánh giá cây chuyển gen 108 III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 112 3.1 Khảo sát và thu thập mẫu bệnh vàng lùn, lùn xoăn lá lúa 112

3.2 Tách chiết DNA/RNA: 119 3.3 Thiết kế các cặp mồi đặc hiệu cho các gen quan trọng của virus gây bệnh ở

cà chua và lúa 120 3.3.1 Thiết kế các cặp mồi cho gen virus gây bệnh ở cà chua 120 3.3.2 Thiết kế các cặp mồi cho gen virus gây bệnh ở lúa .122 3.4 Xác định trình tự DNA virus gây bệnh ở lúa và cà chua 123 3.4.1 Trình tự DNA virus gây bệnh TYLCV 123

3.4.2 Trình tự một số gen quan trọng của virus gây bệnh lùn lúa cỏ và lùn xoăn lá lúa 141 3.5 Xác định intron thích hợp cho thiết kế vector RNAi 176 3.6 Xây dựng hệ thống tái sinh in vitro cho lúa và cà chua 179 3.6.1 Hệ thống tái sinh ở lúa 179 3.6.2 Hệ thống tái sinh ở cà chua 191

(RGSV), lùn xoăn lá lúa (RRSV) và vàng xoăn lá cà chua (TYLCV) 194 3.7.1 Thiết kế vector bất hoạt gen s5gp2-RGSV và s9-RRSV 194 3.7.2 Thiết kế vector bất hoạt virus gây bệnh vàng xoăn lá cà chua –

TYLCV 198

vào lúa và cà chua 207 3.8.1 Chuyển gen vào lúa 207 3.8.2 Chuyển gen vào cà chua 212 3.9 Chọn lọc cây chuyển gen bất hoạt virus lúa và cà chua 216 3.9.1 Chọn lọc cây lúa chuyển gen bất hoạt virus gây bệnh RGSV và RRSV

216

3.9.2 Chọn lọc cây lúa chuyển gen bất hoạt virus gây bệnh TYLCV 220 3.10 Đánh giá biểu hiện gen ở cây chuyển gen 223 3.10.1 Đánh giá biểu hiện gen ở cây lúa chuyển gen bất hoạt virus gây bệnh RGSV, RRSV 223 3.10.2 Đánh giá biểu hiện gen ở cây cà chua chuyển gen bất hoạt virus gây bệnh TYLCV 224 3.11 Tổng hợp các kết quả nghiên cứu chuyển gen vào lúa và cà chua 226

IV TÀI LIỆU THAM KHẢO 233

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

2.4-D: Dichlorophenoxyacetatic acide

BAP: 6- Benzylaminopurine

IAA: γ-Indol-acetic acide

NAA: γ-Naphtylacetic acide

T-DNA: DNA transfer (DNA chuyển nạp)

AS: Acetosyringone

bp: cặp bases

nt: Nucleotide

cDNA: complementary DNA

dNTPs: deoxy nucleotide triphosphat

dsRNA: Double stranded RNA (Sợi RNA đôi)

ssRNA: Single stranded RNA (Sợi RNA đơn)

hpRNA: hairpin RNA (RNA dạng kẹp tóc)

siRNA: small interference RNA (đoạn RNA nhỏ)

miRNA: Micro RNA

amiRNA: Artificial micro RNA (RNA nhân tạo)

XUẤT XỨ CỦA ĐỀ TÀI

Đề tài này có nội dung khoa học-công nghệ hoàn toàn mới đối với trong nước

Đề tài được xây dựng trên cơ sở phát minh về công nghệ can thiệp gen (RNAi) được trao giải thưởng Nobel tháng 10 năm 2006 và phân tích đánh giá khả năng to lớn của công nghệ này đối với kiểm soát các bệnh virus nói chung và bệnh virus ở lúa và cà chua nói riêng Đặc biệt là các virus gây bệnh vàng lùn, lùn xoăn lá lúa gây thiệt hại nghiêm trọng đối với sản xuất lúa ở nước ta Đề tài được Bộ KH-CN phê duyệt cho thực hiện tháng 12 năm 2007

MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI

- Giải mã được trình tự của các gen đặc thù của các chủng virus gây bệnh

- Thiết kế được một số vector RNAi làm bất hoạt gen ở virus gây bệnh vàng lùn, lùn xoăn lá lúa và xoăn lá cà chua (TYLCV)

- Chuyển nạp thành công vectors mang gen thiết kế vào lúa, cà chua và đánh giá khả năng kháng bệnh của cây chuyển gen

Tạo được 1-2 dòng lúa, cà chua mang gen kháng bệnh vàng lùn, lùn xoăn lá lúa

và TYLCV ở cà chua

I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu

Bệnh virus ngày càng trở nên nghiêm trọng trên quy mô toàn cầu và đang gây ảnh hưởng lớn đến nền kinh tế nước ta Do vậy, phòng chống bệnh virus là một chiến lược quốc gia Trong chiến lược kiểm soát bệnh virus, công nghệ RNAi được

cả thế giới đặc biệt quan tâm (Archana Thakur, 2003; Ajit Kumar, 2007) Khám phá

và ứng dụng RNAi được coi là thành tựu lớn nhất của mọi ngành sinh học trong thời gian gần đây (Cousin, 2002) Tuy vậy, công nghệ này còn rất mới mẻ đối với nhiều nước và nhất là đối với nước ta Do vậy, mục tiêu nghiên cứu cơ bản của đề

tài là phải xây dựng được các phương pháp công nghệ RNAi trên đối tượng lúa

và cà chua nhằm khẳng định khả năng của công nghệ này đối với gây bất hoạt gen

và kiểm soát bệnh virus Từ đó, đặt nền tảng cho việc ứng dụng rộng rãi RNAi để gây bất hoạt gen đích phục vụ cho nghiên cứu cơ bản về chức năng gen và nhằm bất hoạt các gen "âm tính" đối với lợi ích con người Tuy vậy, công nghệ RNAi còn hết sức mới mẻ trên thế giới Các kiến thức cơ bản của của chúng ta về RNAi và virus nói chung còn rất hạn chế Do vậy, việc tổng quan tài liệu và triển khai nghiên cứu công nghệ RNAi có ý nghĩa khoa học và thực tiễn quan trọng

1.2 Bệnh virus vàng lùn, lùn xoăn lá lúa

Theo Hiroyuki Hibino (1996), có 15 loại virus khác nhau gây bệnh trên cây lúa Theo Abo và Sy (1998) số loài virus lây nhiễm trên cây lúa lên tới trên 30 loài, trong đó có 25 loại virus gây thiệt hại kinh tế ở lúa Ở Việt nam, các loại virus quan trọng gây ra dịch bệnh vàng lùn, lùn xoăn lá trên quy mô lớn ở lúa

1.5 tháng tuổi, và thiệt hại 0-80% khi cây bị nhiễm ở giai đoạn 2 tháng tuổi

(Iwasaki và cs, 1980; Palomar và Ling, 1968) Sản lượng giảm do thiệt hại của

virus này gây ra rất khó dự đoán bởi rất khó phân biệt với thiệt hại do rầy nâu và virus lùn xoăn lá gây ra (Palmer và cs, 1978; Hibino, 1979) Từ năm 1974-1977, tổng diện tích 1.2 triệu ha ở Indonesia bị nhiễm véc tơ truyền bệnh và virus dẫn đến sản lượng thiệt hại hơn 3 triệu tấn lúa (Palmer và cs, 1978) Cây lúa nhiễm bệnh cũng có biểu hiện thân bị lùn nhưng đẻ nhiều nhánh như bụi cỏ (Cheng C C., Chiu R J., 1982)

Virus gây bệnh lùn lúa cỏ có hai chủng là GSV1 và GSV2 ở Philippines; wilted stunt virus (GSW), Grassy stunt B (GSV) và grassy stunt Y (GSY) ở

Trung Quốc Chủng virus xuất hiện ở ấn Độ, Indonesia, và Thái Lan (Plant virus

online) giống như chủng GSV2 ở Nhật Bản, một chủng được phân lập khác với

hai chủng GSV1 và GSV2 ở Philippines (Hibino & Cabauatan, 1983; Hibino và

cs, 1983; Cabauatan và cs, 1985; Hibino và cs, 1985) nhưng lại có quan hệ gần gũi với các chủng của ấn Độ (Mariappan và cs, 1984) và Thái Lan (Chettanachit và cs, 1985) và với grassy stunt B và wilted stunt phân lập từ Đài Loan Hệ gen của virus gồm 6 đoạn RNA mạch đơn (mã hoá cả 2 chiều, ambisene) có kích thước từ 2584 đến 9760 bp (NC 002323-28), toàn bộ hệ gen

có 12 ORF Trình tự của cả 6 phân đoạn khác nhau từ RNA1đến RNA6 của RGSV và trình tự của các gen (protein) tương ứng ở mỗi phân đoạn đã được xác định (ví dụ, RNA dependent RNA polymerase mã hoá trên RNA1, gen mã hoá cho Nuclecapsid protein, protein P5 trên RNA5,…) Chức năng của từng protein chưa được nghiên cứu đầy đủ nhưng đó cú bằng chứng cho thấy cú thể protein P5 cú vai trũ quan trọng trong việc nhõn lờn và lan truyền của virus này (Chomchan, P., G.J Miranda, và Y Shirako, 2002) Nghiên cứu của Chomchan

và cs (2002) về RGSV cho thấy đoạn gen RNA 5 (vRNA 5) tích luỹ với khối lượng lớn trong mô lá cây và trong cơ thể rầy nâu nhiễm bệnh Protein p5 được

mã hoá bởi RNA5 đóng một vai trò quan trọng cho việc xâm nhiễm của virus

trong cả kí chủ là cây trồng và môi giới