Dự án đầu tư nâng cao năng lực nghiên cứu và phát triển giống cây nguyên liệu giấy giai đoạn 2009-2010

Dự án đầu tư nâng cao năng lực nghiên cứu và phát triển giống cây nguyên liệu giấy giai đoạn 2009-2010

ViÖn Nghiªn Cøu C©y nguyªn liÖu giÊy

B¸o c¸o tæng kÕt dù ¸n

Dù ¸n ®Çu t− n©ng cao n¨ng lùc nghiªn cøu

vµ ph¸t triÓn gièng c©y nguyªn liÖu giÊy

giai ®o¹n 2009-2010

Cnda: Hµ V¨n Huy

8677 Phó thä - 2010

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT i

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU ii

DANH MỤC HÌNH ẢNH iv

Tóm tắt 1

I ĐẶT VẤN ĐỀ 4

II MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG THỰC HIỆN DỰ ÁN 6

2.1 Mục tiêu của dự án 6

2.1.1 Mục tiêu tổng quát 6

2.1.2 Mục tiêu năm 2010 6

2.2 Nội dung của dự án 6

III KẾT QUẢ THỰC HIỆN 7

3.1 Mua sắm trang thiết bị 7

3.2 Nghiên cứu hoàn thiện quy trình kỹ thuật nuôi cây mô và giâm hom cho một số dòng bạch đàn và keo lai 7

3.2.1 Hoàn thiện quy trình kỹ thuật nuôi cấy mô 8

3.2.1.1 Thử nghiệm ảnh hưởng của nồng độ các chất trong môi trường nuôi cấy đến hiệu quả của các giai đoạn tạo chồi, nhân nhanh chồi và tạo rễ 8

3.2.1.2 Thử nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ, độ ẩm cường độ ánh sáng và thời gian chiếu sáng đến tạo chồi, nhân nhanh chồi và tạo rễ 17

3.2.1.3 Thử nghiệm thời gian huấn luyện và cường độ ánh sáng trong quá trình huấn luyện đến tỷ lệ cây sống khi chuyển cây từ ống nghiệm ra vườn ươm 31

3.2.2 Hoàn thiện kỹ thuật giâm hom 35

3.2.2.1 Thử nghiệm ảnh hưởng của các điều kiện khác nhau đến tỷ lệ sống và tỷ lệ ra rễ của hom 35

3.2.2.2 Thử nghiệm ảnh hưởng của tuổi hom, vị trí lấy hom, kích thước hom và thời điểm lấy hom đến tỷ lệ sống và tỷ lệ ra rễ của hom 41

3.3 Xây dựng bản hướng dẫn kỹ thuật nhân giống mô hom cho một số dòng nghiên cứu 49

3.4 Hoàn thiện cơ sở dữ liệu về quản lý giống 49

3.5 Phân tích xác định ADN cho một số giống sản xuất và nghiên cứu 50

3.5.1 Đối tượng vật liệu nghiên cứu 50

3.5.2 Nội dung nghiên cứu 50

3.5.3 Phương pháp nghiên cứu 50

3.5.3.1 Tách ADN tổng số 50

3.5.3.2 Phản ứng RADP 50

3.5.3.3 Phân tích số liệu RAPD 51

3.5.4 Kết quả nghiên cứu 51

b

3.5.4.1 Tách chiết ADN và kiểm tra chất lượng ADN của các mẫu nghiên cứu 51

3.5.4.2 Phân tích tính đa hình ADN của các giống bạch đàn 52

3.5.5 Kết luận 55

3.6 Đào tạo và tập huấn kỹ thuật 55

3.6.1 Phương pháp đào tạo 56

3.6.2 Nội dung đào tạo dự án 56

3.6.3 Đối tượng đào tạo 56

3.6.4 Kết quả đào tạo 56

3.6.4.1 Tài liệu, giáo trình 56

3.3.4.2 Thời gian và kết quả đào tạo 56

IV KẾT LUẬN 58

5.1 Mua sắm dụng cụ trang thiết bị 58

5.2 Hoàn thiện công nghệ nhân giống mô - hom 58

5.3 Xây dựng bản hướng dẫn kỹ thuật 59

5.4 Hoàn thiện cơ sở dữ liệu 60

5.5 Phân tích xác định ADN cho một số giống sản xuất và nghiên cứu 60

5.6 Đào tạo và tập huấn kỹ thuật 60

VI KIẾN NGHỊ 60

i

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

VNCCNLG

Bộ NN&PTNT

Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy

Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn

ii

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 01 Danh mục thiết bị máy móc mua sắm năm 2010 7

Bảng 02 HSNC, TLCHH và Hchồi của E urophylla dòng PN54 sau 21 ngày nuôi cấy. 10

Bảng 03 HSNC, TLCHH và H chồi của E urophylla dòng PN54 sau 21 ngày nuôi cấy. 11

Bảng 04 HSNC, TLCHH và Hchồi của E urophylla dòng PN54 sau 21 ngày nuôi cấy. 12

Bảng 05 HSNC, TLCHH và Hchồi của E urophylla dòng PN54 sau 21 ngày nuôi cấy. 13

Bảng 06 Ảnh hưởng của nồng độ ABT1 đến TLRR, số rễ trung bình/cây và Lrễ cây bạch đàn mô dòng PN54 sau 14 ngày nuôi cấy 15

Bảng 07 Ảnh hưởng của nồng độ GA3 đến TLRR, số rễ trung bình/cây và Lrễ cây bạch đàn mô dòng PN54 sau 14 ngày nuôi cấy 16

Bảng 08 HSNC, TLCHH và H chồi của E urophylla dòng PN54 sau 21 ngày nuôi cấy. 19

Bảng 09 Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến khả năng tạo và nhân chồi bạch đàn dòng PN54 sau 21 ngày nuôi cấy 21

Bảng 10 Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến khả năng ra rễ bạch đàn dòng PN54 sau 14 ngày nuôi cấy 22

Bảng 11 Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng đến khả năng tạo và nhân chồi bạch đàn dòng PN54 sau 21 ngày nuôi cấy 24

Bảng 12 Ảnh hưởng của độ ẩm đến khả năng tạo và nhân chồi bạch đàn dòng U6 sau 21 ngày nuôi cấy 25

Bảng 13 Ảnh hưởng của độ ẩm đến khả năng tạo và nhân chồi bạch đàn dòng PN54 sau 21 ngày nuôi cấy 26

Bảng 14 Ảnh hưởng của hệ thống chiếu sáng lên HSNC, TLCHH và Hchồi bạch đàn dòng U6 sau 21 ngày nuôi cấy 27

Bảng 15 TLCHH và hình thái của bình nhân cây U6 ở các công thức thí nghiệm bảo quản 29

Bảng 16 Phương pháp bố trí các công thức huấn luyện 32

Bảng 17 Tỷ lệ cấy sống ở các công thức huấn luyện 33

Bảng 18 Khả năng ra rễ và tỷ lệ sống của Bạch đàn PN10 ở thí nghiệm mùa vụ 36

Bảng 19 Khả năng ra rễ và tỷ lệ sống của Keo lai KL2 ở thí nghiệm mùa vụ 37

iii

Bảng 20 Ảnh hưởng của chế độ chăm sóc vườn cấp hom đến khả năng ra rễ của hom

Bạch đàn PN10 vụ hè 38

Bảng 21 Ảnh hưởng của chế độ chăm sóc vườn cấp hom đến khả năng ra rễ của hom Keo lai KL2 vụ hè 39

Bảng 22 Ảnh hưởng của chế độ chăm sóc vườn cấp hom đến khả năng ra rễ của hom Bạch đàn PN10 vụ thu 39

Bảng 23 Ảnh hưởng của chế độ chăm sóc vườn cấp hom đến khả năng ra rễ của hom Bạch đàn PN10 vụ thu 40

Bảng 24 Ảnh hưởng của thời vụ giâm hom đến tỷ lệ ra rễ của hom 43

Bảng 25 Ảnh hưởng của thời vụ giâm hom đến tỷ lệ ra rễ của hom 44

Bảng 26 Ảnh hưởng của chế độ chăm sóc cây đầu dòng đến tỷ lệ ra rễ của hom 45

Bảng 27 Ảnh hưởng của thời vụ giâm hom đến tỷ lệ ra rễ của hom 46

Bảng 28 Ảnh hưởng của thời vụ giâm hom đến tỷ lệ ra rễ của hom 47

Bảng 29 Ảnh hưởng của chế độ chăm sóc cây đầu dòng đến tỷ lệ ra rễ của hom 47

Bảng 30 Danh mục các mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu 50

Bảng 31 Nồng độ ADN tổng số tách từ lá của các mẫu Bạch đàn nghiên cứu 51

Bảng 32 Tổng số phân đoạn ADN xuất hiện khi điện di sản phẩm RAPD với 18 mồi. 52

Bảng 33 Hệ số tương đồng di truyền ở mức độ ADN giữa 11 giống bạch đàn 53

iv

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 01 Chất lượng chồi bạch đàn dòng PN54 sau 21 ngày nuôi cấy, từ trái qua phải

công thức CT9 và công thức CT10 13

Hình 02 Ảnh hưởng của độ ẩm không khí lên HSNC, TLCHH, Hchồi và hình thái chồi dòng U6 sau 21 ngày nuôi cấy 26

Hình 03 Ảnh hưởng của hệ thống chiếu sáng giai đoạn tạo và nhân nhanh chồi dòng U6 29

Hình 04 Bình nhân cây mô dòng U6 bảo quản ở 100C sau 30 ngày bảo quản 30

Hình 05 Điện di kiểm tra mẫu ADN tổng số của bạch đàn 52

Hình 06 So sánh đa hình ADN của 11 giống bạch đàn ở mức độ phân tử 55

1

Tóm tắt

Dự án “Đầu tư nâng cao năng lực nghiên cứu và phát triển giống cây nguyên

liệu giấy giai đoạn 2009-2010” được phê duyệt theo quyết định số 4329/QĐ-BCT

ngày 01 tháng 08 năm 2008 của Bộ trưởng Bộ Công Thương và được đầu tư thực hiện trong 2 năm 2009 và năm 2010 với mục tiêu tăng cường (cơ sở vật chất, trang thiết bị, nguyên vật liệu, nhân lực ) và hoàn thiện quy trình kỹ thuật nhân giống một số dòng cây nguyên liệu giấy

Trong khuân khổ năm 2009, dự án đã thực hiện một số hạng mục và thu được một số kết quả cụ thể sau:

* Mua sắm dụng cụ trang thiết bị: nồi hấp vô trùng 01 cái, cân kỹ thuật điện

tử 01 cái, tủ sấy 01 cái, máy cất nước một lần 01 cái, tủ cấy vô trùng 08 cái

* Hoàn thiện công nghệ nhân giống mô - hom

- Quy trình nuôi cấy mô dòng U6:

+ Môi trường dinh dưỡng trong giai đoạn nhân và tạo chồi: có hàm lượng CaCl2.4H20 là 396mg/l; hàm lượng nhóm NH4NO3, KNO3, KH2PO4 lần lượt là 900mg/l, 1710mg/l và 153mg/l; hàm lượng nhóm vitamin Glycine và B6 lần lượt là 1mg/l và 0.25mg/l

+ Chế độ chăm sóc trong quá trình nuôi cấy tạo và nhân nhanh thích hợp là:

7-10 ngày đầu trong điều kiện 220

C và 0-1000 lux, sau đó chuyển sang nuôi dưỡng ở

270C và 2500-3000 lux Chu kỳ chiếu sáng 5h chiếu sáng→1h tối→5h chiếu

sáng→13h tối

+ Chế độ chăm sóc cho giai đoạn tạo rễ là: Cường độ ánh sáng 7-10 ngày đầu

là 0-500 lux, cường độ 11-14 ngày sau là 1000-2000 lux

+ Điều kiện huấn luyện bình rễ thích hợp: Sử dụng 1 lớp lưới đen che không cho ánh sáng chiếu trực tiếp vào bình cây (cường độ sánh sáng bình quân là 5672 lux) và thời gian huấn luyện 2 tuần

- Giâm hom dòng bạch đàn PN10: sử dụng hom từ 20-25 ngày tuổi, hom

đoạn ngọn có chiều dài 9-12cm và hom lấy vào buổi sáng từ 5-7 h cho tỷ lệ sống và

ra rễ cao nhất; nồng độ IBA là 0.5%; mùa vụ giâm hom thích hợp là mùa Xuân; độ che phủ ánh sáng 50% (che 1 lớp lưới)

2

- Giâm hom dòng keo lai KL2: sử dụng hom từ 26 -30 ngày, hom đoạn ngọn

dài 14 - 17cm và hom lấy vào buổi sáng sớm từ 5 - 7 giờ cho tỉ lệ sống và tỉ lệ ra rễ cao nhất; nồng độ IBA là 0.5%; mùa vụ giâm hom thích hợp là mùa Thu; độ che phủ ánh sáng 50% (che 1 lớp lưới)

* Đào tạo và tập huấn kỹ thuật: 05 lớp cho 21 CBCNV về kỹ thuật: Thu hái,

chế biến hạt giống; kiểm nghiệm và bảo quản hạt giống; kỹ thuật xử lý cây mẹ tạo chồi và khảo nghiệm giống; kỹ thuật thu chồi và xử lý chồi; kỹ thuật nuôi cấy mô

và giâm hom cây lâm nghiệp

Năm 2010, dự án tiếp tục thực hiện và hoàn thiện các nội dung đăng ký và thu được một số kết quả cụ thể như:

* Mua sắm dụng cụ trang thiết bị: 01 nồi hấp vô trùng, 01 tủ sinh trưởng, 20

giá nuôi cấy, 250 bộ bóng đèn, 01 bộ phụ kiện cho hệ thống chiếu sáng, 02 bộ điều khiển hệ thống chiếu sáng, 02 máy hút ẩm, 06 điều hoà nhiệt độ, 7300 bình trụ tròn thuỷ tinh 250ml, 7300 bình tam giác thuỷ tinh 500ml

* Hoàn thiện công nghệ nhân giống mô - hom:

Dự án đã thực hiện hoàn hiện và bổ sung vào quy trình công nghệ nhân giống

mô hom cho các dòng Bạch đàn U6, PN54 và PN10 và Keo lai KL2

- Quy trình nuôi cấy mô cây Bạch đàn dòng U6: Độ ẩm phòng nuôi 55±5%

Sử dụng hệ thống chiếu sáng 02 bóng đèn compact Rạng Đông 3U 20W

- Quy trình nuôi cấy mô cây Bạch đàn dòng PN54:

+ Môi trường tạo và nhân chồi dòng PN54: Nồng độ NH4NO3 là 937.5mg/l, KNO3 là 1781.3 mg/l và KH2PO4 là 159.4 mg/l; nồng độ vitamin Inositol là 100mg/l, Nicotinic là 5mg/l, vitamin B1 là 1mg/l và vitamin C là 10mg/l; BAP nồng độ 1.2mg/l

Chế độ nuôi cấy cho quá trình tạo và nhân nhanh chồi thích hợp là: 7-10 ngày đầu trong điều kiện 220

C và 0-1000 lux, sau đó chuyển sang nuôi dưỡng ở 270C và 2500-3000 lux Chu kỳ chiếu sáng 5h chiếu sáng→1h tối→5h chiếu sáng→13h tối

3

Điều kiện huấn luyện bình rễ thích hợp: không sử dụng lưới đen che ánh sáng

và thời gian huấn luyện là 10 ngày

- Quy trình kỹ thuật giâm hom dòng Bạch đàn PN10 và Keo lai KL2: chế độ

tưới vườn cấp hom là 1 ngày/1 lần; bón phân NPK 200g/cây, 2lần/năm Giâm hom

vụ thu có tỷ lệ sống cao hơn vụ hè

* Xây dựng hoàn thiện 04 bản hướng dẫn kỹ thuật cho các dòng nghiên

cứu

* Hoàn thiện cơ sở dữ liệu cho 11 giống bạch đàn đã được công nhận giống

(PN2, PN14, PN3d, PN10, PN46, PN47, PN54, PN116, PN21, PN24, PN108)

* Phân tích xác định ADN cho 11 giống Bạch đàn với 18 mồi khác nhau và

xây dựng cây phát sinh chủng loại cho 11 giống nghiên cứu

* Đào tạo và tập huấn kỹ thuật: tiếp tục 03 lớp tập huấn về kỹ thuật: Thu hái,chế biến hạt giống; kỹ thuật xử lý cây mẹ tạo chồi và khảo nghiệm giống; kỹ thuật thu chồi và xử lý chồi

4

I ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay nhu cầu giống tốt cho trồng rừng nguyên liệu giấy là rất lớn Dự án

mở rộng nhà máy giấy Bãi Bằng giai đoạn II đã được Chính phủ phê duyệt và đang

tổ chức thực thi, khi đi vào hoạt động công suất nhà máy sẽ nâng lên 318,000 tấn giấy và bột giấy/năm Để đáp ứng đủ nguyên liệu cho nhà máy, diện tích trồng rừng được quy hoạch là 164,440ha Thực tế sản xuất 1 tấn bột giấy tẩy trắng phải cần 4.7m3 gỗ keo hoặc bạch đàn, như vậy sau khi nhà máy giấy Bãi Bằng giai đoạn II

đi vào hoạt động, hàng năm phải khai thác và trồng lại khoảng 20,000-21,000ha rừng, nếu mật độ trồng rừng là 1333 cây/ha, thì hàng năm nhu cầu cây giống cho trồng rừng nguyên liệu giấy cần đến 28-30 triệu cây các loại, đây là một nhu cầu lớn và thực sự cần thiết nhưng với công xuất và quy mô nhà xưởng, trang thiết bị của Viện chỉ đáp ứng được 1/10 nhu cầu về giống của các đơn vị trồng rừng trong Tổng công ty giấy Việt Nam chưa kể các cá nhân, đơn vị trong vùng và cả nước Qua 35 năm nghiên cứu và thử nghiệm Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy (VNCCNLG) đã lựa chọn được các loài, giống, dòng cây bạch đàn, keo tai tượng, keo lai và thông có khả năng sinh trưởng tốt, năng suất rừng tăng từ 20 - 30% so với rừng sản xuất đại trà Cho đến nay, ngoài 16 loài, dòng, giống cây được công nhận là giống Quốc gia, giống tiến bộ kỹ thuật thì Viện còn tuyển chọn và lưu giữ hàng trăm các dòng cây trội có triển vọng thuộc các loài trên, đây là nguồn vật liệu, nguồn gen quý để sản xuất giống vô tính có chất lượng cao bằng công nghệ mô - hom

Sản xuất giống bằng kỹ thuật nhân vô tính (mô - hom) sẽ tạo được giống cây trồng có những đặc tính di truyền quý của giống gốc Mặt khác công nghệ này còn cho phép nhân nhanh để sản xuất cây giống theo quy mô công nghiệp với số lượng lớn và chất lượng tốt Sau 14 năm nghiên cứu và thử nghiệm, VNCCNLG có một đội ngũ cán bộ nghiên cứu giàu kinh nghiệm, đội ngũ kỹ thuật viên và công nhân lành nghề trong lĩnh vực nghiên cứu và sản xuất giống vô tính bằng công nghệ mô - hom Về cơ sở vật chất, Viện có một nhà nuôi cấy mô diện tích 320 m2

vừa nghiên cứu, vừa sản xuất được trên 2.5 triệu cây/năm, ngoài nhà nuôi cấy mô Viện còn có một nhà giâm hom với diện tích 1,400m2

sản xuất được 0.5 triệu cây/năm Như vậy

có thể nói VNCCNLG là đơn vị đi đầu về nghiên cứu và sản xuất cây giống lâm nghiệp vô tính ở vùng Trung tâm cũng như trong ngành giấy

5

Với nhu cầu về số lượng và chất lượng cây giống như hiện nay của ngành giấy nói chung và của địa phương trong vùng nói riêng, thì việc nâng cao năng lực nghiên cứu và phát triển giống cây nguyên liệu giấy có năng suất cao bằng công nghệ mô - hom phục vụ trồng rừng sản xuất kinh doanh gỗ nguyên liệu giấy là vô cùng cần thiết, góp phần giải quyết sự thiếu hụt nguyên liệu cho ngành giấy hiện nay và trong tương lai

Vì vậy, “Dự án đầu tư năng cao năng lực năng lực nghiên cứu và phát triển

giống cây nguyên liệu giấy” đã được Bộ Công Thương phê duyệt thực hiện trong

hai năm 2009-2010

5) Xác định mức độ sai khác ADN cho 11 giống bạch đàn

6) Tiếp tục đào tạo, tập huấn 03 lớp

2.2 Nội dung của dự án

a Mua sắm trang thiết bị, dụng cụ phục vụ nghiên cứu và sản xuất: 01 tủ sinh

trưởng, 01 nồi hấp tiệt trùng, 20 giá nuôi cấy 5 tầng, 250 bộ hệ thống chiếu sáng cho dàn nuôi cấy mô, 01 bộ phụ kiện cho hệ thống chiếu sáng, 01 bộ điều khiển hệ thống chiếu sáng, 02 máy hút ẩm, 06 điều hoà nhiệt độ, 7300 bình trụ tròn thuỷ tinh 250ml, 7300 bình tam giác thuỷ tinh 500ml

b Tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện quy trình kỹ thuật nuôi cây mô và giâm hom

cho một số dòng bạch đàn và keo lai (U6, PN54, PN10, KL2) trong đó:

- Nghiên cứu hoàn thiện quy trình kỹ thuật nuôi cấy mô dòng bạch đàn PN54

- Tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện quy trình kỹ thuật giâm hom dòng bạch đàn PN10 và keo lai KL2

c Xây dựng hướng dẫn kỹ thuật nhân giống mô hom cho 04 dòng nghiên cứu

d Hoàn thiện cơ sở dự liệu về quản lý 11 giống bạch đàn

e Phân tích xác định ADN cho 09 giống bạch đàn

f Đào tạo và tập huấn 03 lớp: 01 lớp kỹ thuật thu hái và chế biến hạt giống; 01

lớp kỹ thuật xử lý cây mẹ tạo chồi và khảo nghiệm giống; 01 lớp kỹ thuật thu chồi

và xử lý chồi

7

III KẾT QUẢ THỰC HIỆN

3.1 Mua sắm trang thiết bị

Theo đề cương kỹ thuật và dự toán kinh phí đã được Bộ Công Thương phê duyệt năm 2010 cho việc mua sắm các thiết bị máy móc phục vụ dự án

Viện đã tiến hành tổ chức thực hiện việc mua sắm hàng hoá trang thiết bị theo đúng các thủ tục quy định Kết quả năm 2010 Viện ký hợp đồng với Công ty để cung cấp các máy móc trang thiết bị như sau:

Bảng 01 Danh mục thiết bị máy móc mua sắm năm 2010

Đơn giá và các thông số kỹ thuật của từng loại máy móc, thiết bị, xuất xứ

bạch đàn E urophylla (PN2, PN14, PN3d, PN10, PN46, PN47, PN54, PN116,

PN21, PN24, PN108) và 3 dòng keo lai (KL2, KL20, KLTA3)

8

Tuy nhiên để đưa giống mới trên vào sản xuất đại trà và hạ giá thành sản phẩm đòi hỏi phải có quy trình kỹ thuật nhân giống cho từng dòng đảm bảo cho tỷ

lệ ra rễ và hệ số nhân trong nuôi cấy mô phải cao

Chính vì vậy việc nghiên cứu hoàn thiện kỹ thuật nuôi cây mô và giâm hom cho một số dòng bạch đàn và keo lai cần phải thực hiện

3.2.1 Hoàn thiện quy trình kỹ thuật nuôi cấy mô

Một trong những điều kiện quan trọng đảm bảo sự thành công cho quá trình nhân giống bạch đàn bằng nuôi cấy mô là môi trường nuôi cấy, nhiệt độ, độ ẩm, cường độ ánh sáng, thời gian chiếu sáng, thời gian huấn luyện trong giai đoạn tạo chồi, nhân nhanh chồi và tạo rễ; tỷ lệ cây sống khi chuyển từ ống nghiệm ra vườn ươm

3.2.1.1 Thử nghiệm ảnh hưởng của nồng độ các chất trong môi trường nuôi cấy đến hiệu quả của các giai đoạn tạo chồi, nhân nhanh chồi và tạo rễ

Năm 1993, Trung tâm nghiên cứu cây nguyên liệu giấy thực hiện dự án nhập công nghệ mô - hom của Trung quốc Sau khi tiếp nhận và triển khai công nghệ, Trung tâm đã trở thành đơn vị đầu tiên trong ngành Lâm nghiệp ở Việt Nam ứng dụng thành công công nghệ nuôi cấy mô tế bào để sản xuất cây con phục vụ trồng rừng nguyên liệu giấy Đến nay, trung tâm có quy mô sản xuất hơn 3 triệu cây bạch đàn mô mỗi năm các dòng bạch đàn như U6, PN2, PN54…

Dòng bạch đàn PN54 được tuyển chọn từ cây trội rừng trồng sản xuất ở Tam Nông - Phú Thọ và được công nhận giống tiến bộ kỹ thuật theo quyết định số 1773QĐ/BNN-KHCN năm 2005, năng suất rừng trung bình đạt 28-33m3/ha/năm Kết quả nghiên cứu nuôi cấy mô dòng PN54 cho thấy: hệ số nhân chồi hiện nay đạt trung bình 3.1 lần, chiều cao trung bình khoảng 3.1cm, tỷ lệ ra rễ 59% Cho thấy, đây là 1 dòng có thể hoàn thiện đưa vào sản xuất Tuy nhiên, để có thể tiến tới sản xuất, đặt ra yêu cầu phải nâng cao hơn nữa tỷ lệ ra rễ, tăng tỷ lệ nhân chồi (vì tỷ

lệ nhân chồi thí nghiệm thường cao hơn so với sản xuất)

Vì vậy, việc tiến hành các nghiên cứu sâu hơn góp phần đánh giá cụ thể và tổng hợp của các yếu tố, thành phần dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy đến hiệu quả của các giai đoạn tạo chồi, nhân nhanh chồi và tạo rễ dòng bạch đàn PN54

là hết sức cần thiết

9

3.2.1.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Vật liệu nghiên cứu: Cây bạch đàn E urophylla dòng PN54 đã được Bộ

NN&PTNT công nhận là giống tiến bộ kỹ thuật năm 2005

- Đối tượng nghiên cứu: giai đoạn tạo, nhân nhanh chồi và tạo rễ dòng PN54 trong quy trình nuôi cấy mô

3.2.1.1.2 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ các chất đa lượng, vitamin và các chất điều hòa sinh trưởng đến hiệu quả của các giai đoạn tạo chồi, nhân nhanh chồi dòng PN54;

- Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến hiệu quả của giai đoạn tạo rễ dòng PN54

3.2.1.1.3 Phương pháp nghiên cứu

- Điều kiện thí nghiệm: Các mẫu được nuôi cấy trên các môi trường thí nghiệm bổ sung 30g/l đường sucrose, 5g/l agar và được khử trùng ở 1210C, 1.4kg/cm2 trong 20 phút, pH sau khử trùng là 5.8 Mẫu được nuôi cấy ở điều kiện nhiệt độ 270C (20C), độ ẩm 55% (5%) Cường độ ánh sáng 1000-3000 lux tùy từng giai đoạn nuôi cấy, sử dụng ánh sáng đèn huỳnh quang neon Thời gian chiếu sáng từ 10-11h/ngày

- Bố trí thí nghiệm: Các thử nghiệm đối với giai đoạn tạo và nhân nhanh chồi

sử dụng môi trường đối chứng MS3; các thử nghiệm giai đoạn tạo rễ sử dụng môi

trường đối chứng MR3 (phụ lục 02) Các công thức thí nghiệm được bố trí dựa trên

nguyên tắc chỉ thay đổi hàm lượng các nhân tố thí nghiệm (tỷ lệ thay đổi tùy từng nhân tố cụ thể), giữ nguyên các thành phần khác như môi trường MS3 Mỗi công thức bao gồm 6 mẫu/bình x 10 bình, lặp lại 3 lần về mặt thời gian

- Thiết kế thí nghiệm bao gồm:

+ Các thử nghiệm đối với giai đoạn tạo và nhân nhanh chồi: 4 thử nghiệm ảnh hưởng của NH4NO3, KH2PO4, KNO3; 2 thử nghiệm ảnh hưởng của vitamin C; 3 thử nghiệm ảnh hưởng của Inositol, nicotinic và B1; 5 thử nghiệm về các nồng độ BAP

+ Các thử nghiệm đối với giai đoạn tạo rễ: 5 thử nghiệm nồng độ ABT1 và 4 thử nghiệm bổ sung GA3

10

- Các chỉ tiêu theo dõi và đánh giá: hệ số nhân chồi (HSNC);Tỷ lệ chồi hữu hiệu (TLCHH); Chiều cao chồi hữu hiệu (Hchồi); Tỷ lệ ra rễ (TLRR); Số lượng rễ trung bình/cây (Số rễ/cây); Chiều dài trunh bình rễ (Lrễ); Quan sát hình thái thân, lá,

rễ

- Xử lý thống kê các số liệu theo phương pháp thông dụng, sử dụng các chương trình Excel 2010 và SPSS 16.0 để phân tích, đánh giá

3.2.1.1.4 Kết quả nghiên cứu

a Ảnh hưởng của nồng độ các chất đa lượng đến giai đoạn tạo và nhân nhanh chồi dòng PN54

Kết quả thử nghiệm ảnh hưởng của nhóm chất NPK lên HSNC, TLCHH và Hchồi trong nuôi cấy mô dòng PN54 được tổng hợp trong bảng 02

Bảng 02 HSNC, TLCHH và Hchồi của E urophylla dòng PN54 sau 21 ngày nuôi cấy

Ghi chú: NS: Khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê với p ≤ 0.05 *: khác biệt có ý nghĩa

về mặt thống kê với p ≤ 0.05 CT1) đối chứng, giữ nguyên nồng độ NH 4 NO 3 , KH 2 PO 4 , KNO 3 ; CT2) giảm nồng độ NH 4 NO3, KH 2 PO 4 , KNO 3 đi 10%; CT3) giảm nồng độ NH 4 NO 3 , KH 2 PO 4 , KNO 3 đi 20%; CT4) tăng nồng độ NH 4 NO3, KH 2 PO 4 , KNO 3 thêm 10%; CT5) tăng nồng độ

NH 4 NO 3 , KH 2 PO 4 , KNO 3 thêm 20%

Tỷ lệ chồi hữu hiệu các công thức dao dộng trong khoảng 71.9% đến 79.7%

và tăng dần theo nồng độ nhóm chất NPK Tuy nhiên, ở nồng độ nhóm chất NPK tăng so với đối chứng 20% thấy có callus xuất hiện rõ rệt do nguồn Nitơ có tác

dụng tích cực tới sự tái sinh chồi, nguồn Nitơ cao có thể gây độc cho tế bào in

vitro, tăng sự hình thành callus

Chiều cao trung bình của chồi hữu hiệu có sự biến động rõ rệt, cao nhất ở công thức CT5 và công thức đối chứng CT1 là 3.10cm, đứng thứ ba là công thức CT4 là 3.07cm, nhóm thấp nhất là 2 công thức CT2 và CT3 lần lượt đạt 2.91cm và 2.79cm

Sử dụng tiêu chuẩn Dunnett‘C tiến hành so sánh về Hchồi giữa từng cặp đôi một cho thấy có thể phân các công thức thí nghiệm thành các nhóm sau: nhóm 1 bao gồm: công thức CT1, CT5 và CT4; nhóm 2 bao gồm: công thức CT2 và CT3

b Ảnh hưởng của nồng độ các chất vitamin

Các chất vitamin chính được bổ sung trong nuôi cấy mô dòng bạch đàn PN54 gồm có Inositol, nicotinic, B6, B1, glycine và C Trong đó, B1 được biết đến

là 1 chất không thể thiếu trong nuôi cấy mô thực vật Inositol là một vitamin kích thích tích cực đối với sự sinh trưởng và phát triển của thực vật, mặc dù không cần thiết trong tất cả các trường hợp Nicotinic giúp nâng cao sức sinh trưởng của cây

Dự án tiến hành nghiên cứu thay đổi nồng độ các vitamin được đánh giá và chia làm 2 nhóm: Nhóm 1 bao gồm: Inositol, nicotinic và B1; Nhóm 2: vitamin C

* Thử nghiệm Inositol, nicotinic và B1

Kết quả thử nghiệm ảnh hưởng của Inositol, nicotinic và B1 đến khả năng

tạo chồi dòng PN54 được thể hiện trong bảng 03

Bảng 03 HSNC, TLCHH và H chồi của E urophylla dòng PN54 sau 21 ngày nuôi cấy

12

Ghi chú: NS: Khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê với p ≤ 0.05 *: khác biệt có ý nghĩa

về mặt thống kê với p ≤ 0.05 a,b: Kết quả so sánh theo Dunnett’ C CT6) Giảm nồng độ nhóm Inositol, nicotinic và B1 đi 20%; CT7) Đối chứng, giữ nguyên nồng độ nhóm Inositol, nicotinic và B1; CT8) Tăng nồng độ nhóm Inositol, nicotinic và B1 thêm 20%.

Kết quả bảng 03 cho thấy, HSNC và TLCHH giữa các công thức thí nghiệm

có sự dao động rất nhỏ HSNC dao động trong khoảng 3.03 đến 3.09 lần, TLCHH dao động trong khoảng 75.9% đến 79.9% Sử dụng SPSS để phân tích cho thấy, HSNC và TLCHH giữa các công thức thí nghiệm có sự sai khác nhưng không có ý nghĩa thống kê Hay, sự thay đổi về nồng độ Inositol, Nicotinic và Vitamin B1 trong thí nghiệm không ảnh hưởng rõ rệt lên sự hình thành và chất lượng chồi Điều này có thể là do sự hình thành và phát triển chồi được quyết định bởi môi trường dinh dưỡng khoáng và các chất hoocmon tăng trưởng, thực vật cần các vitamin để xúc tiến các quá trình biến dưỡng khác nhau

Phân tích về chiều cao trung bình chồi hữu hiệu bằng tiêu chuẩn Dunnett’ C cho thấy, Hchồi giữa các công thức thí nghiệm CT7 (đối chứng) có Hchồi đạt 3.10cm

và CT8 (tăng 20% nồng độ) có Hchồi đạt 3.15cm không có sự sai khác rõ rệt với mức ý nghĩa p ≤ 0.05 Công thức thí nghiệm CT6 (giảm 20% nồng độ) cho Hchồi thấp nhất là 2.88cm không có sự sai khác rõ rệt với 2 công thức còn lại Điều đó cho thấy, vitamin có tác dụng kích thích sự tăng trưởng của tế bào và sự phân chia

tế bào trong nuôi cấy mô thực vật

* Thử nghiệm vitamin C và B2

Kết quả thử nghiệm ảnh hưởng của vitamin C đến khả năng tạo chồi dòng

PN54 được thể hiện trong bảng 04

Bảng 04 HSNC, TLCHH và Hchồi của E urophylla dòng PN54 sau 21 ngày nuôi cấy

Ghi chú: NS: Sự sai khác không có ý nghĩa về mặt thống kê với p ≤ 0.05 CT9: không bổ sung

C và B2 vào môi trường CT10: giữ nguyên nồng độ C và B2

13

Kết quả bảng 04 cho thấy, khi không bổ sung vitamin C ta thấy, HSNC TLCHH và Hchồi đều giảm so với công thức đối chứng CT10 Công thức không bổ sung vitamin C có HSNC đạt 3.02 lần, TLCHH đạt 74.6% và Hchồi đạt 2.85cm; so với công thức đối chứng CT10 có HSNC đạt 3.09 lần, TLCHH đạt 75.9% và Hchồi đạt 3.10cm

Hình 01 Chất lượng chồi bạch đàn dòng PN54 sau 21 ngày nuôi cấy, từ trái qua phải

công thức CT9 và công thức CT10

Tuy nhiên, qua phân tích thống kê cho thấy, sự thiếu hụt vitamin C không ảnh hưởng rõ rệt tới các chỉ tiêu phát triển của chồi như HSNC và TLCHH và Hchồi Nhưng bên cạnh đó, vitamin C lại có tác dụng chống oxi hóa giúp năng cao chất lượng, độ đồng đều và ảnh hưởng tới hình thái chồi (hình 01)

c Ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng BAP đến hiệu quả giai đoạn tạo và nhân nhanh chồi dòng PN54

Kết quả thử nghiệm ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BAP đến khả

năng tạo chồi dòng PN54 được thể hiện trong bảng 05

Bảng 05 HSNC, TLCHH và Hchồi của E urophylla dòng PN54 sau 21 ngày nuôi cấy

14

Phân tích thống kê

Ghi chú: NS: Khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê với p ≤ 0.05 *: khác biệt có ý nghĩa

về mặt thống kê với p ≤ 0.05 a,b,c: Kết quả phân nhóm theo tiêu chuẩn Dunnett’C CT11: BAP nồng độ 0.8mg/l CT12: BAP nồng độ 0.9mg/l CT13: BAP nồng độ 1.0mg/l (đối chứng) CT14: BAP nồng độ 1.1mg/l CT15: BAP nồng độ 1.2mg/l.

Kết quả nghiên cứu theo bảng 05 cho thấy:

Hệ số nhân chồi cao giảm dần khi nồng độ BAP giảm Cụ thể như sau: công thức CT15 có HSNC cao nhất đạt 3.41lần, các công thức CT14, CT13 và CT12 lần lượt có HSNC đạt 3.22, 3.09 và 2.80 lần, công thức CT11 có HSNC thấp nhất đạt 2.60 lần Kết quả phân tích phương sai và phân nhóm Duncan cho thấy, HSNC có phụ thuộc vào nồng độ chất kích thích BAP và công thức CT15 với nồng độ BAP 1.2mg/l thuộc nhóm có HSNC cao nhất, vượt so với công thức đối chứng

Tỷ lệ chồi hữu hiệu giữa các công thức dao động trong khoảng 67.9% đến 75.9% nhưng không phụ thuộc vào nồng độ BAP Hoocmon sinh trưởng BAP thuộc nhóm cytokinin có tác dụng kích thích sự hình thành và phát sinh chồi, tuy nhiên BAP ở nồng độ cao không cho phép tái sinh cây hoàn chỉnh và gây đột biến cao Vì vậy, sự bổ sung hoocmon sinh trưởng BAP có một giới hạn nhất định

Chiều cao trung bình chồi hữu hiệu các công thức thí nghiệm có sự sai khác

Cụ thể như sau: công thức có Hchồi lớn nhất bao gồm các công thức CT13 (đối chứng) với Hchồi đạt là 3.10cm; sau đó là công thức CT15, công thức CT14 và công thức CT12 có Hchồi lần lượt đạt 3.03cm, 3.02cm và 2.49cm và thấp nhất là công thức CT11 có Hchồi đạt 1.97cm

Kết quả phân tích thống kê cho thấy, điều kiện phân tích phương sai không bằng nhau Do đó, sử dụng tiêu chuẩn Dunnett‘ C để so sánh giữa từng cặp công thức thí nghiệm cho thấy: giữa công thức CT13, CT14 và CT15 không có sự sai khác có ý nghĩa ở mức độ p ≤ 0.05; công thức CT12 cũng như công thức CT11 có

sự sai khác có ý nghĩa so với 3 công thức còn lại Như vậy ở đây, sự bổ sung hoocmon sinh trưởng BAP ở 1 giá trị nhất định có tác dụng kích thích sự phát triển kéo dài chồi Đây có lẽ là do tác dụng bổ trợ đối với hoocmon thuộc nhóm auxin cũng được bổ sung vào môi trường nuôi cấy là NAA và do sự phân hóa về mặt thời điểm phát sinh và hình thành chồi (dữ liệu không chỉ ra)

15

d Ảnh hưởng của ABT1 đến khả năng ra rễ in vitro cây bạch đàn dòng PN54

Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của ABT1 đến khả năng ra rễ in vitro của cây

bạch đàn mô dòng PN54 được thể hiện trong bảng 06

Bảng 06 Ảnh hưởng của nồng độ ABT1 đến TLRR, số rễ trung bình/cây và Lrễ cây bạch

đàn mô dòng PN54 sau 14 ngày nuôi cấy

Ghi chú: NS: Khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê với p ≤ 0.05 *: khác biệt có ý nghĩa

về mặt thống kê với p ≤ 0.05 a,b: Kết quả phân nhóm theo tiêu chuẩn Duncan CT16: ABT1 nồng độ 0.8mg/l CT17: ABT1 nồng độ 0.9mg/l CT18: ABT1 nồng độ 1.0mg/l (đối chứng) CT19: ABT1 nồng độ 1.1mg/l CT20: ABT1 nồng độ 1.2mg/l.

Kết quả thử nghiệm với các nồng độ chất kích thích ABT1 khác nhau cho thấy:

- Thời gian xuất hiện rễ vào ngày thứ 5 sau khi cấy;

- Tỷ lệ ra rễ tăng dần theo nồng độ ABT1 Khi nồng độ ABT1 tăng từ 1.2mg/l thì TLRR tăng từ 62.2% đến 77.8% Tuy nhiên, kết quả phân tích thống kê cho thấy sự sai khác này không có ý nghĩa;

0.8 Số rễ trung bình/cây có sự sai khác có ý nghĩa thống kê và được chia làm 2 nhóm cơ bản (bảng 06) Trong đó, công thức CT18 (đối chứng), công thức CT19, CT20 và công thức CT17 có số rễ trung bình lớn nhất là 3.3 rễ/cây và 3.2 rễ/cây, công thức CT16 có số rễ trung bình thấp nhất là 3.0 rễ/cây Điều đó phản ánh, khả

năng ra rễ in vitro phụ thuộc một phần vào giống Sự bổ sung chất kích thích ra rễ

ABT1 có tác dụng kích thích ra rễ và sự hình thành mầm rễ ở một giới nhất định;

- Chiều dài trung bình rễ Lrễ không phụ thuộc vào nồng độ ABT1

Như vậy, công thức cho hiệu quả ra rễ cao nhất là công thức CT20 có nồng độ ABT1 là 1.2mg/l

Bảng 07 Ảnh hưởng của nồng độ GA3 đến TLRR, số rễ trung bình/cây và Lrễ cây bạch

đàn mô dòng PN54 sau 14 ngày nuôi cấy

Ghi chú: NS: Khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê với p ≤ 0.05 *: khác biệt có ý nghĩa

về mặt thống kê với p ≤ 0.05 a,b: Kết quả phân nhóm theo tiêu chuẩn Duncan CT21: GA3 nồng độ 0.0mg/l (đối chứng) CT22: GA3 nồng độ 0.4mg/l CT23: GA3 nồng độ 0.8mg/l CT24: GA3 nồng độ 1.2mg/l.

Kết quả nghiên cứu bảng 07 cho thấy:

- Tỷ lệ ra rễ tăng dần theo nồng độ GA3 bổ sung vào môi trường nuôi cấy Khi nồng độ chất kích thích GA3 tăng dần từ 0.0mg/l lên 1.2mg/l, TLRR tăng dần từ 71.7% đến 77.8% Tuy nhiên, sự sai khác này là chưa rõ rệt về mặt thống kê;

- Số rễ trung bình/cây có sự biến động nhưng không rõ rệt, dao động trong khoảng 3.3 rễ/cây đến 3.4 rễ/cây và sai khác không có ý nghĩa thống kê Điều này phản ánh, GA3 không có tác dụng kích thích hình thành mầm rễ;

- Chiều dài trung bình rễ Lrễ có phụ thuộc vào nồng độ chất kích thích GA3 Lrễ cao nhất ở công thức bổ sung GA3 nồng độ 1.2mg/l đạt 2.83cm và thấp nhất ở 3 công thức GA3 nồng độ 0.8mg/l, GA3 nồng độ 0.4mg/l và GA3 nồng độ 0.0mg/l với giá trị lần lượt là 2.41cm, 2.39cm và 2.35cm Như vậy, GA3 không có tác dụng kích thích sự hình thành rễ nhưng có tác dụng gia tăng tỷ lệ sản xuất tế bào và kích thước đỉnh sinh trưởng rễ

17

f Sản xuất thử nghiệm cây mầm mô

Dựa trên các kết quả nghiên cứu đã thực hiện, dự án đã tiến hành thử nghiệm quy trình đã tạo được 30 bình giống gốc và 300 cây mầm mô bạch đàn dòng PN54

- Nồng độ các vitamin Inositol, Nicotinic, vitamin B1 và vitamin C thích hợp lần lượt là 100mg/l; 5mg/l; 1mg/l và 10mg/l có tác dụng tăng hình thái, chất lượng chồi;

- Hoocmon sinh trưởng BAP có tác dụng kích thích sự tái sinh chồi, nồng độ BAP 1.2mg/l cho hiệu quả tái sinh chồi cao nhất;

- Các nồng độ khác nhau của chất kích thích ra rễ ABT1 trong thí nghiệm không ảnh hưởng rõ rệt đến tỷ lệ ra rễ và chiều dài rễ nhưng có ảnh hưởng đến số lượng rễ trung bình/cây Nồng độ ABT1 1.2mg/l cho hiệu quả ra rễ cao nhất với TLRR đạt 77.8%, số rễ trung bình/cây đạt 3.3 rễ và Lrễ đạt 2.26cm;

-Hoocmon sinh trưởng GA3 kích thích sự phân chia tế bào và kích thích đỉnh sinh trưởng rễ, nồng độ GA3 1.2mg/l được bổ sung cho hiệu quả ra rễ cao nhất với TLRR đạt 77.78%, số rễ trung bình/cây đạt 3.4 rễ và Lrễ đạt 2.83cm

3.2.1.2 Thử nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ, độ ẩm cường độ ánh sáng và thời gian chiếu sáng đến tạo chồi, nhân nhanh chồi và tạo rễ

Các nghiên cứu trước đây về quy trình kỹ thuật nuôi cấy mô dòng bạch đàn PN54 mới chỉ nghiên cứu đến các yếu tố thành phần dinh dưỡng, vitamin và hoocmon; mà chưa có báo cáo, nghiên cứu đầy đủ về ảnh hưởng của các yếu tố vi khí hậu, nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng lên hiệu quả của trong quá trình nuôi cấy mô các dòng bạch đàn

Hơn nữa, các phân tích về quá trình vi nhân giống quang tự dưỡng đã chỉ ra rằng:

- Cây in vitro có thể tự dưỡng hay quang hợp;

18

- Điều kiện nuôi cấy trong môi trường in vitro làm cho nồng độ CO2 thấp, do

đó cây phải sống quang dị dưỡng (sử dụng đường của môi trường);

- Độ ẩm trong bình nuôi cấy quá cao làm hạn chế khả năng hô hấp, cũng như khả năng tự điều tiết quá trình trao đổi nước tự nhiên của cây

Việc điều khiển các điều kiện vi khí hậu trong quá trình nuôi cấy sẽ giúp:

- Điều kiển được quá trình sinh trưởng, quang hợp của cây;

- Tăng tỷ lệ sống sót cũng như khả năng thích nghi nhanh chóng, uyển chuyển

của cây mầm khi chuyển sang điều kiện ex vitro

3.2.1.2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Tương tự mục 3.2.1.1.1

3.2.1.2.2 Nội dung nghiên cứu

- Ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ đến giai đoạn tạo và nhân nhanh chồi dòng PN54;

- Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến giai đoạn tạo chồi, nhân nhanh chồi

- Thử nghiệm bảo quản bình nhân cây U6 trong điều kiện nhiệt độ thấp

3.2.1.2.3 Phương pháp nghiên cứu

- Điều kiện thí nghiệm: Các mẫu được nuôi cấy trên các môi trường thí nghiệm bổ sung 30g/l đường sucrose, 5g/l agar và được khử trùng ở 1210C, 1.4kg/cm2 trong 20 phút, pH sau khử trùng là 5.8 Mẫu được nuôi cấy ở điều kiện nhiệt độ 270C (20C), độ ẩm 55% (5%) Cường độ ánh sáng 1000-3000 lux tùy từng giai đoạn nuôi cấy, sử dụng ánh sáng đèn huỳnh quang neon Thời gian chiếu sáng từ 10-11h/ngày

- Bố trí thí nghiệm: Các mẫu nghiên cứu nuôi và tạo chồi dòng PN54 nuôi cấy trên môi trường MS3 và tạo rễ trên môi trường MR3 Mẫu nghiên cứu dòng bạch đàn U6 được nuôi cấy nhân tào tạo chồi trên môi trường MU6 Các mẫu được nuôi

19

cấy trong điều kiện (nhiệt độ: 2720C; ánh sáng: tuần đầu: 1000 lux, sau đó 2500 -

3000 lux; chu kỳ: 10 - 11h /ngày) Mỗi công thức bao gồm 6 mẫu/bình x 10 bình, lặp lại 3 lần về mặt thời gian

- Thiết kế thí nghiệm bao gồm:

+ Các thí nghiệm đến giai đoạn tạo và nhân nhanh chồi dòng PN54: 3 thử nghiệm về nhiệt độ nuôi cấy, 4 thử nghiệm về cường độ ánh sáng và 2 thử nghiệm

về thời gian chiếu sáng;

+ Các thí nghiệm đến giai đoạn tạo rễ dòng PN54: 4 thử nghiệm về cường độ ánh sáng

+ Thí nghiệm về độ ẩm đến giai đoạn tạo và nhân nhanh chồi dòng U6 và PN54: 3 thử nghiệm các độ ẩm khác nhau là 95 ± 5%, 75 ± 5% và 55 ± 5%

+ Thí nghiệm về hệ thống chiếu sáng: 3 hệ thống chiếu sáng được đưa vào thử nghiệm là hệ bóng đèn compact 3U ở 2 công suất 14W và 20W so sánh với bóng đèn huỳnh quang dài T8 40W

+ Thí nghiệm bảo quản được tiến hành với dòng U6 ở các nhiệt độ 100C, 180C

và 270C trong 15 ngày và 30 ngày bảo quản

- Các chỉ tiêu theo dõi đánh giá:

Thu thập, đánh giá các chỉ tiêu tương tự mục 3.2.1.1.3

3.2.1.2.4 Kết quả nghiên cứu

a Ảnh hưởng tổng hợp của nhiệt độ đến giai đoạn tạo chồi và nhân nhanh chồi dòng PN54

Kết quả thử nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng nhân chồi dòng

20

về mặt thống kê với p ≤ 0.05 a,b,c: Kết quả nhân nhóm theo tiêu chuẩn Duncan CT1: nuôi cấy hoàn toàn ở nhiệt độ 22 0 C CT2: nuôi cấy 10-14 ngày đầu ở nhiệt độ 22 0 C, 7-11 ngày sau

ở 27 0

C CT3: nuôi cấy hoàn toàn ở 27 0 C.

Kết quả bảng 08 cho thấy:

- Hệ số nhân chồi, tỷ lệ chồi hữu hiệu và chiều cao trung bình của chồi hữu hiệu ở các công thức thí nghiệm có sự sai khác;

- Kết quả phân tích thống kê cho thấy, nhiệt độ có ảnh hưởng rõ rệt lên các chỉ tiêu hình thành và phát triển của chồi bạch đàn PN54 sau 21 ngày nuôi cấy

- HSNC cao nhất ở 2 công thức thí nghiệm CT2 và CT1 đạt lần lượt 3.44 và 3.40 lần Và thấp nhất ở công thức CT3 đạt 3.09 lần Như chúng ta đã biết, thứ nhất quá trình hình thành chồi được quyết định trong giai đoạn đầu - giai đoạn cảm ứng

- của quá trình nuôi cấy, trong giai đoạn này mẫu cấy mới được xử lý (cắt, cấy chuyển) nên cần một giai đoạn thích nghi với môi trường Thứ hai, nhiệt độ tăng đồng nghĩa với việc làm tăng sự trao đổi chất và hô hấp Thứ ba, các chất kích thích sinh trưởng như auxin hay cytokinin rất nhạy cảm với nhiệt độ và ánh sáng; nhiệt

độ cao làm giảm tác dụng và gây phân hủy các hoocmon sinh trưởng Vì vậy, công thức thí nghiệm CT1 và CT2 với giai đoạn cảm ứng (7-10 ngày đầu ở 220C) là sự phản ánh, đáp ứng đúng một phần của các nguyên lý trên

- TLCHH và Hchồi cao nhất ở công thức thí nghiệm CT2 lần lượt đạt 81.3% và 3.51cm; TLCHH và Hchồi của công thức CT3 đứng thứ 2 lần lượt đạt 75.9% và 3.10cm; TLCHH và Hchồi thấp nhất ở công thức CT1 đạt 62.8% và 2.71cm Sau 7-

10 ngày nuôi cấy cảm ứng tạo chồi, các bình mẫu cấy được chuyển vào các điều kiện nhiệt độ khác nhau để thúc đẩy phát triển và nuôi dưỡng chồi, với công thức CT2 và CT3 giai đoạn này được tiến hành ở nhiệt độ 270C, còn công thức CT1 nhiệt độ là 220C Đây là giai đoạn chồi phát triển mạnh về chiều cao và hình thái, nhiệt độ cao gần với nhiệt độ tối thích giúp tăng cường các phản ứng trao đổi chất, phân chia tế bào, kéo dài lóng và tạo chồi hoàn chỉnh Chính vì vậy, công thức CT1 với nền nhiệt độ nuôi cấy ở 220C tỏ ra không còn phù hợp cho sự phát triển chồi Hơn nữa, nhiệt độ nuôi cấy thấp làm tăng độ ẩm không khí gây hiện tượng thủy tính thể làm giảm tỷ lệ chồi hữu hiệu Nhiệt độ cao hơn 270C trong giai đoạn này đã giúp tăng cường sự trao đổi khí giữa bên trong và bên ngoài bình nuôi cấy, làm quá

21

trình sự thoát hơi nước ở lá cây diễn ra mạnh hơn cho khí khổng mở ra và lá lấy được nhiều CO2

Như vậy, công thức thí nghiệm CT2 (nuôi dưỡng 7-10 ngày đầu ở nhiệt độ

220C, sau đó chuyển sang nhiệt độ 270C) cho kết quả nhân chồi tốt nhất đối với cây bạch đàn dòng PN54 sau 21 ngày nuôi cấy

b Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến giai đoạn tạo chồi, nhân nhanh chồi dòng PN54

Kết quả thử nghiệm ảnh hưởng của cường độ ánh sáng lên giai đoạn tạo và nhân nhanh chồi dòng PN54 được thể hiện trong bảng 09

Bảng 09 Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến khả năng tạo và nhân chồi bạch đàn

dòng PN54 sau 21 ngày nuôi cấy

Ghi chú: NS: Khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê với p ≤ 0.05 *: khác biệt có ý nghĩa

về mặt thống kê với p ≤ 0.05 a,b,c: Kết quả nhân nhóm theo tiêu chuẩn Duncan CT4 - nuôi dưỡng tuần đầu ở cường độ 0-1000 lux, sau đó chuyển sang 2500-3000 lux; CT5 - nuôi dưỡng tuần đầu ở cường độ 1000-1500 lux, sau đó chuyển sang 2500-3000 lux; CT6 - nuôi dưỡng tuần đầu ở cường độ 0-1000 lux, sau đó chuyển sang điều kiện ánh sáng tự nhiên; CT7 - Nuôi dưỡng tuần đầu ở cường độ 1000-1500 lux, sau đó chuyển sang điều kiện ánh sáng tự nhiên.

Kết quả bảng 09 cho thấy:

- Hệ số nhân chồi, tỷ lệ chồi hữu hiệu và chiều cao trung bình của chồi hữu hiệu ở các công thức thí nghiệm có sự sai khác;

- Kết quả phân tích thống kê cho thấy, cường độ ánh sáng có ảnh hưởng rõ rệt lên các chỉ tiêu hình thành và phát triển của chồi bạch đàn PN54 sau 21 ngày nuôi cấy

HSNC cao nhất ở 2 công thức CT4 và CT6 lần lượt là 3.48 và 3.42 lần; HSNC thấp nhất ở 2 công thức CT5 và CT7 lần lượt đạt 2.94 và 2.82 lần HSNC đối với

22

thí nghiệm về cường độ ánh sáng cũng giống thư thí nghiệm về khác đều được quyết định vào giai đoạn đầu của quá trình nuôi cấy Nhưng trong thí nghiệm về cường độ ánh sáng, yếu tố tiên quyết lại là sự nhạy cảm của các hoocmon sinh trưởng với ánh sáng mạnh Vì vậy, ở đây cường độ ánh sáng độ ánh sáng trong các thử nghiệm CT4 và CT6 là 0-500 lux có tác dụng làm chậm sự phân hủy nhóm các chất kích thích sinh trưởng bổ sung vào môi trường và duy trì hoạt tính của nhóm các hoocmon này Hơn nữa, cường độ ánh sáng cao đồng nghĩa với nhiệt độ cũng cao hơn Chính vì vậy, sự tương hỗ của 2 yếu tố này có tác động tiên quyết với sự hình thành và phát triển chồi trong nuôi cấy mô thực vật

TLCHH và Hchồi thu được cũng tương tự như đối với HSNC TLCHH đạt cao nhất ở 2 công thức CT4 và CT5 lần lượt là 75.4% và 76.6%, 2 công thức CT6 và CT7 có TLCHH thấp hơn đạt 63.6% và 66.1% Chiều cao trung bình chồi hữu hiệu đạt cao nhất ở công thức CT4 là 3.21cm, đứng thứ 2 là công thức CT5 đạt 3.06cm, xếp sau là công thức CT6 đạt 2.80cm và thấp nhất là công thức CT7 đạt 2.66cm Ở đây, TLCHH, Hchồi và hình thái chồi được quyết định ở giai đoạn sau của quá trình nuôi cấy Nuôi cấy với điều kiện ánh sáng tự nhiên ở giai đoạn sau (với cường độ ánh sáng lúc cao nhất gần 20,000 lux) lại gây táp ngọn ảnh hưởng đến hình thái và

sự phát triển của chồi Hơn nữa, ánh sáng tự nhiên khi sử dụng là nguồn sáng trong nuôi cấy mô còn có thể gây hiệu ứng nhà kính, làm tăng nhiệt độ trong phòng nuôi cũng như tại vùng vi khí hậu quanh bình nuôi cấy, làm tăng lượng tiêu hao điện năng điều hòa để giảm nhiệt độ phòng nuôi Vì vậy, trong nuôi cấy mô khi chồi chưa được huấn luyện thích nghi và không có các biện pháp che chắn hạn chế sự chiếu sáng trực tiếp thì việc sử dụng ánh sáng mặt trời nên được xem xét cụ thể và

sử dụng hợp lý

c Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến giai đoạn tạo rễ dòng PN54

Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến giai đoạn tạo rễ dòng PN54 được thể hiện trong bảng 10

Bảng 10 Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến khả năng ra rễ bạch đàn dòng PN54 sau

14 ngày nuôi cấy

Ghi chú: NS: Khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê với p ≤ 0.05 **: khác biệt có ý

nghĩa về mặt thống kê với theo tiêu chuẩn Dunnett’C CT8: Nuôi dưỡng trong điều kiện tối

(0-500 lux), đối chứng (ĐC).CT9: Nuôi dưỡng 5-7 ngày trong điều kiện tối hoàn toàn, sau đó chuyển sang 1000-2000 lux CT10: Nuôi dưỡng 5-7 ngày trong điều kiện tối hoàn toàn, sau đó chuyển sang cường độ 2000-2500 lux CT11: Nuôi dưỡng 5-7 ngày trong điều kiện tối hoàn toàn, sau đó chuyển sang điều kiện ánh sáng tự nhiên

Kết quả bảng 10 cho thấy:

- TLRR, số rễ/cây và Lrễ có sự sai khác giữa các công thức thí nghiệm Tuy nhiên, sự chênh lệch về TLRR và số rễ/cây là không lớn;

- Kết quả phân tích thống kê cũng cho thấy, TLRR và số rễ/cây không phụ thuộc vào cường độ ánh sáng Lrễ có phụ thuộc vào cường độ ánh sáng Công thức thí nghiệm CT9 cho chiều dài rễ lớn nhất 2.70cm, các thử nghiệm còn lại (CT8, CT10 và CT11) có chiều dài rễ lần lượt là 2.39cm, 2.24cm và 2.20cm không có sự sai khác rõ rệt

Kết quả tương tự cũng thu được đối với dòng bạch đàn U6 Đánh giá về kết quả này cho thấy, sự hình thành mầm rễ được quyết định trong 5-7 ngày đầu đối với cây PN54 do cây PN54 hình thành rễ vào khoảng ngày thứ 5 sau khi cấy Do vậy, các thử nghiệm với cường độ ánh sáng thấp từ 0-500lux ở giai đoạn đầu - cảm ứng hình thành rễ - đã cho hiệu quả cao và đồng đều với tỷ lệ ra rễ đạt trên 70% Sau 5-7 ngày nuôi cấy ra rễ, cường độ ánh sáng được tăng cường có vai trò huấn luyện của cây, tăng độ cứng cáp của cây Hơn nữa, trong giai đoạn này cây đã có thể tự dưỡng Do đó, ánh sáng đóng vai trò là nguồn năng lượng giúp cây quang tự dưỡng, kéo theo đó là sự phát triển của hệ rễ giúp cây tăng cường khả năng hút khoáng chủ động

Tuy nhiên, ánh sáng với cường độ cao (2000-2500lux) và ánh sáng tự nhiên trong giai đoạn sau lại không thu được hiệu quả ánh sáng cường độ 1000-2000lux

Rễ cây bản chất có tính hướng đất dương, mẫm cảm với ánh sáng Do đó, cường độ ánh sáng cao trong điều kiện nuôi cấy môi trường thạch gây kìm hãm hệ rễ Hơn nữa, khi ánh sáng cường độ cao chiếu sáng duy trì một thời gian, rễ cây có thể tiết

24

ra các chất nhờn màu đen nhằm bảo vệ hệ rễ (dữ liệu không chỉ ra) Vì vậy, trong điều kiện cường độ ánh sáng cao hay với những loài có hệ rễ nhạy cảm với ánh sáng, sự bổ sung than hoạt tính trong giai đoạn này có thể được xem xét

d Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng đến giai đoạn tạo chồi, nhân nhanh chồi dòng PN54

Kết quả thử nghiệm ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng đến giai đoạn tạo và nhân nhanh chồi dòng PN54 được thể hiện trong bảng 11

Bảng 11 Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng đến khả năng tạo và nhân chồi bạch đàn

dòng PN54 sau 21 ngày nuôi cấy

Ghi chú: NS: Khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê với p ≤ 0.05 *: khác biệt có ý nghĩa

về mặt thống kê với p ≤ 0.05 CT12: Chế độ chiếu sáng với chu kỳ 11h sáng liên tục/13h tối liên tục CT13: Chế độ chiếu sáng với 1h tối xen kẽ, 5h chiếu sáng1h tối5h chiếu sáng13h tối.

Kết quả bảng 11 cho thấy, HSNC, TLCHH và Hchồi giữa 2 thử nghiệm có sự sai khác nhưng không nhiều

Thử nghiệm CT12 cho HSNC đạt 3.09 lần, TLCHH đạt 75.9% và Hchồi đạt 3.10cm; thử nghiệm CT13 có HSNC đạt 3.06 lần, TLCHH đạt 78.5% và Hchồi đạt 3.34cm Kết quả phân tích thống kê cho thấy, HSNC và TLCHH không phụ thuộc vào thời gian chiếu sáng, sự sai khác về chiều cao trung bình chồi hữu hiệu có ý nghĩa về mặt thống kê Thử nghiệm CT13 với chế độ chiếu sáng xen kẽ, bổ sung 1h tối trong chu kỳ 11h chiếu sáng có Hchồi đạt cao hơn so với công thức chiếu sáng liên tục CT12

Theo T Kozai and C Kubota, Cholorophy trong lá cây mầm nuôi cấy mô có khả năng hấp thụ ánh sáng và cây nuôi cấy mô có khả năng quang hợp tự dưỡng một phần Quá trình nuôi cấy mô thông thường với thời gian chiếu sáng dài, liên lục và cây mô được nuôi dưỡng trong một điều kiện kín làm sản sinh ra nhiều loại

25

khí khác nhau như ethylen và đặc biệt là sự suy giảm của nồng độ CO2 không đủ cân bằng và cung cấp cho quá trình quang hợp Vì vậy, ở đây trong điều kiện thí nghiệm chỉ tiến hành việc tạo một pha tối xen kẽ với mục tiêu giảm sự quang hợp trong một thời gian nhất định, đảm bảo sự cân bằng về nồng độ khí CO2 trong bình nuôi giúp cây có thể phát triển cân bằng, liên tục Kết quả thử nghiệm cụ thể đã cho thấy hiệu quả những luận điểm trên Hơn nữa, công thức chiếu sáng như trong thử nghiệm CT13 còn giúp giảm một phần điện năng hao phí do chiếu sáng và sử dụng điều hòa nhiệt độ

e Ảnh hưởng của độ ẩm đến giai đoạn tạo chồi, nhân nhanh chồi dòng PN54 và dòng U6

* Ảnh hưởng của độ ẩm đến giai đoạn tạo chồi, nhân nhanh chồi dòng U6

Kết quả thử nghiệm ảnh hưởng của độ ẩm phòng nuôi đến giai đoạn tạo và nhân nhanh chồi dòng U6 được thể hiện trong bảng 12

Bảng 12 Ảnh hưởng của độ ẩm đến khả năng tạo và nhân chồi bạch đàn dòng U6 sau 21

ngày nuôi cấy

Ghi chú: NS: Khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê với p ≤ 0.05 *: khác biệt có ý nghĩa

về mặt thống kê với p ≤ 0.05 a,b,c: Kết quả phân nhóm theo tiêu chuẩn Duncan CT14: độ ẩm 55±5% CT15: độ ẩm 75±5% CT16: độ ẩm 95±5%

Kết quả số liệu và phân tích trong bảng 12 cho thấy:

- HSNC của các nghiệm thức có sự sai khác nhưng không có ý nghĩa về mặt thống kê Các thử nghiệm được thiết kế trong 10 ngày đầu cùng 1 điều kiện nhiệt

độ 27 ± 20C, cường độ ánh sáng 0-1000 lux, độ ẩm tương đối 75 ± 5%, nồng độ khí CO2 ngang bằng với tự nhiên, đây chính là giai đoạn cảm ứng tạo chồi Vì vậy, ở giai đoạn này sự hình thành và phát triển chồi là tương đồng giữa các thử nghiệm

26

- TLCHH có sự sai khác và phụ thuộc và độ ẩm không khí phòng nuôi TLCHH đạt cao nhất ở công thức CT15 đạt 89.9%, công thức CT14 đạt TLCHH là 81.1%, thử nghiệm CT16 với độ ẩm 95% có TLCHH thấp nhất đạt 65.0%

- Chiều cao trung bình chồi hữu hiệu có sự sai khác giữa các công thức thí nghiệm và phụ thuộc vào độ ẩm không khí phòng nuôi Hchồi cao nhất ở công thức

độ ẩm 55% đạt 3.23cm, đứng thứ 2 là công thức độ ẩm 75% đạt 3.03cm và thấp nhất là công thức độ ẩm 95% đạt 2.50cm Trong các công thức thử nghiệm trên, độ

ẩm không khí cao trong các hộp nuôi cấy làm giảm cường độ ánh sáng đến bình nuôi từ đó ảnh hưởng đến TLCHH cũng như chiều cao trung bình của chồi hữu hiệu và gây hiện tượng thủy tinh thể, cây bị xanh lợt

Hình 02 Ảnh hưởng của độ ẩm không khí lên HSNC, TLCHH, Hchồi và hình thái chồi dòng U6 sau 21 ngày nuôi cấy

* Ảnh hưởng của độ ẩm đến giai đoạn tạo chồi, nhân nhanh chồi dòng PN54

Kết quả thử nghiệm ảnh hưởng của độ ẩm phòng nuôi đến giai đoạn tạo và nhân nhanh chồi dòng PN54 được thể hiện trong bảng 13

Bảng 13 Ảnh hưởng của độ ẩm đến khả năng tạo và nhân chồi bạch đàn dòng PN54 sau

21 ngày nuôi cấy

27

Ghi chú: NS: Khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê với p ≤ 0.05 *: khác biệt có ý nghĩa

về mặt thống kê với p ≤ 0.05 a,b,c: Kết quả phân nhóm theo tiêu chuẩn Duncan CT17: độ ẩm 55±5% CT18: độ ẩm 75±5% CT19: độ ẩm 95±5%

Kết quả số liệu và phân tích trong bảng 13:

- HSNC của các nghiệm thức có sự sai khác nhưng không có ý nghĩa về mặt thống kê Các thử nghiệm được thiết kế trong 10 ngày đầu cùng 1 điều kiện nhiệt

độ 22 ± 20C, cường độ ánh sáng 0-1000 lux, độ ẩm tương đối 75 ± 5%, nồng độ khí CO2 ngang bằng với tự nhiên, đây chính là giai đoạn cảm ứng tạo chồi Vì vậy, ở giai đoạn này sự hình thành và phát triển chồi là tương đồng giữa các thử nghiệm

- TLCHH có sự sai khác và phụ thuộc và độ ẩm không khí phòng nuôi TLCHH đạt cao nhất ở công thức CT15 đạt 80.3%, công thức CT14 đạt TLCHH là 75.7% gần bằng so với công thức CT15 Thử nghiệm CT16 với độ ẩm 95% có TLCHH thấp nhất đạt 57.3%

- Chiều cao trung bình chồi hữu hiệu có sự sai khác giữa các công thức thí nghiệm và phụ thuộc vào độ ẩm không khí phòng nuôi Hchồi cao nhất ở công thức

độ ẩm 55% đạt 3.56cm, đứng thứ 2 là công thức độ ẩm 75% đạt 3.11cm và thấp nhất là công thức độ ẩm 95% đạt 2.67cm

Kết quả thu được là tương tự như đối với thí nghiệm trên dòng U6

e Thử nghiệm sử dụng bóng đèn compact thay thế bóng huỳnh quang trong nuôi cấy mô

Kết quả thử nghiệm ảnh hưởng của hệ thống chiếu sáng đối với cây mô dòng U6 trong quá trình nuôi cấy được thể hiện trong bảng 14

Bảng 14 Ảnh hưởng của hệ thống chiếu sáng lên HSNC, TLCHH và Hchồi bạch đàn dòng U6 sau 21 ngày nuôi cấy

28

về mặt thống kê với p ≤ 0.05 a,b,c: Kết quả phân nhóm theo tiêu chuẩn Duncan CT20: đối chứng, hệ bóng huỳnh quang dài 40W CT21: bóng compact 15W CT22: bóng compact 20W

Kết quả số liệu trong bảng 14 cho thấy:

- HSNC đạt cao nhất ở công thức CT22 đạt 3.14 lần, đứng thứ 2 là côngthức CT20 đạt 2.06 lần và thấp nhất là công thức CT21 đạt 2.03 lần Tuy nhiên, sự sai khác này là không nhiều và HSNC không phụ thuộc vào hệ thống chiếu sáng Đây

là do trong quy trình thử nghiệm, trong 10 ngày đầu cảm ứng hình thành chồi các bình mẫu được nuôi dưỡng ở cùng một điều kiện ánh sáng 0-500 lux (không chiếu sáng kết hợp che đậy), nhiệt độ 220C, độ ẩm 75±5% nên chưa thu được sự khác nhau về HSNC

- TLCHH giữa các thử nghiệm cơ bản có sự sai khác, TLCHH cao nhất ở công thức CT22 đạt 83.4%, đứng thứ 2 là công thức CT20 đạt 82.7% và thấp nhất là công thức CT21 đạt 76.5% Tuy nhiên, TLCHH không phụ thuộc vào hệ thống chiếu sáng

- Chiều cao trung bình chồi hữu hiệu đạt cao nhất ở công thức CT20 và CT22 lần lượt đạt 3.11cm và 3.04cm và thấp nhất là công thức CT21 đạt 2.64cm Hchồiphụ thuộc và hệ thống chiếu sáng

Nhiệt độ màu của bóng đèn compact 6500K, so với bóng đèn huỳnh quang là 5000-6500K và nhiệt độ màu của ánh sáng ban ngày là 6500K Như vậy, quang phổ của bóng đèn compact gần với quang phổ ánh sáng mặt trời với đầy đủ các bước sóng và màu sắc hơn so với bóng đèn huỳnh quang Do đó, cây được nuôi dưỡng bằng bóng đèn compact có thể hấp thụ các bước sóng khác nhau cung cấp năng lượng cho bộ máy quang hợp Bóng đèn compact 15W có quang phổ tương tự như bóng đèn 20W nhưng cường độ chiếu sáng hay mật độ photon lại thấp hơn vì vậy hiệu quả trong nuôi cấy mô bị hạn chế

Hơn nữa, nếu dùng 65% điện năng để thắp sáng trong các phòng nuôi cấy mô, thì song song đó cần 25% điện năng để làm mát phòng nuôi cấy; bóng đèn compact 20W còn có độ bền cao gấp 5 lần so với bóng đèn huỳnh quang Vì vậy, việc sử dụng bóng đèn compact 20W trong nuôi cấy mô thực vật tỏ ra có ưu thế hơn so với bóng đèn huỳnh quang 40W, giúp tiết kiệm nhiên liệu, hạ giá thành sản phẩm mà chất lượng sản phẩm không thay đổi

29

Hình 03 Ảnh hưởng của hệ thống chiếu sáng giai đoạn tạo và nhân nhanh chồi dòng U6

f Thử nghiệm bảo quản bình nhân cây U6 trong điều kiện nhiệt độ thấp

Đối với các thí nghiệm về bảo quản, lưu giữ bình nhân cây U6 Sau quá trình bảo quản và tái thích nghi, tiến hành quan sát hình thái, đo đếm xác định tỷ lệ chồi hữu hiệu còn lại từ đó xác định khả năng bảo quản, lưu giữ của từng công thức thí nghiệm Các chồi này cũng được cấy thử nghiệm để xem xét thực tế chất lượng chồi sau quá trình bảo quản lưu giữ Bảng số liệu 15 dưới đây chỉ trình bày thống

kê lại tỷ lệ chồi hữu hiệu còn lại so với trước khi bảo quản

Bảng 15 TLCHH và hình thái của bình nhân cây U6 ở các công thức thí nghiệm bảo

quản

STT Công thức thí nghiệm Chỉ tiêu theo dõi

Kết quả cho thấy, công thức bảo quản ở 100C (nhiệt độ thực tế dao động khoảng 80

C-130C, độ ẩm 37% và ánh sáng xấp xỉ bằng 0lux) cho hiệu quả bảo quản tốt nhất với chất lượng chồi không thay đổi

30

Hình 04 Bình nhân cây mô dòng U6 bảo quản ở 100C sau 30 ngày bảo quản

g Sản xuất thử nghiệm cây mầm mô dòng U6 và PN54

Trên cơ sở ứng dụng các kết quả nghiên cứu vừa được tiến hành nhằm mục đích có những thử nghiệm cuối cùng trước khi đưa ra những khuyến cáo cho sản xuất và ứng dụng, dự án đã tiến hành sản xuất thử nghiệm được 10 bình giống gốc

và 300 cây mầm mô cho mỗi dòng (U6 và PN54) hoàn toàn đủ tiêu chất lượng

3.2.1.2.5 Kết luận

Dự án đã thực hiện đầy đủ các nội dung và hạng mục công việc theo thuyết minh được duyệt Kết quả thí nghiệm cho thấy:

- Nhiệt độ thích hợp cho tạo và nhân nhanh chồi dòng PN54 là 220C trong

7-10 ngày đầu, sau đó chuyển sang nuôi dưỡng ở 270

C;

- Cường độ ánh sáng thích hợp cho tạo và nhân nhanh chồi dòng PN54 là

0-500 lux cho 7-10 ngày đầu, sau đó chuyển sang chăm sóc ở 20-500-3000lux;

- Cường độ ánh sáng thích hợp cho tạo rễ dòng PN54 là 0-500 lux cho 5-7 ngày đầu, sau đó chuyển sang chăm sóc ở 1000-2000lux;

- Thời gian chiếu sáng thích hợp cho tạo và nhân nhanh chồi dòng PN54 là 5h chiếu sáng1h tối5h chiếu sáng13h tối;

- Độ ẩm thích hợp cho tạo và nhân nhanh chồi dòng PN54 và dòng U6 là 55±5%

- Hệ thống ánh sáng cho hiệu quả tạo và nhân chồi cao nhất là hệ bóng đèn compact 3U 20W;

- Nhiệt độ bảo quản 100C cho không làm giảm số chồi hữu hiệu sau 30 ngày bảo quản với dòng U6

Trong điều kiện nhiệt đới ở nước ta với lượng ánh sáng lớn và có sự thay đổi mạnh giữa các mùa cũng như trong một ngày nên quá trình huấn luyện cây còn gặp nhiều khó khăn nhiều khi không đạt được những hiệu quả mong muốn Thực tế sản xuất hiện nay cho thấy nhiều đợt cây mầm cấy ra vườn ươm cho tỷ lệ sống còn thấp

mà nguyên nhân chính đó là thời gian huấn luyện chưa thích hợp, cây cấy ra vườn ươm gặp điều kiện bất lợi về thời tiết dẫn đến chết nhiều

Hiện nay ở nước ta chưa có nhiều công trình thử nghiệm về ảnh hưởng của thời gian và cường độ ánh sáng trong quá trình huấn luyện đến tỷ lệ sống và chất lượng của cây con ở giai đoạn vườn ươm FRC hiện đang huấn luyện cây mầm trong khoảng thời gian từ 7-10 ngày với cường độ ánh sáng khoảng 2000 - 5000 lux, tuy nhiên chưa có số liệu cụ thể về vấn đề này

Xuất phát từ những đặc điểm khoa học và thực tiễn nêu trên, việc thực thử

nghiệm các điều kiện huấn luyện nhằm nâng cao tỷ lệ sống của cây con là cần thiết 3.2.1.3.1 Đối tƣợng nghiên cứu

- Vật liệu nghiên cứu: Cây bạch đàn E urophylla dòng PN54 đã được Bộ

NN&PTNT công nhận là giống tiến bộ kỹ thuật năm 2005

- Đối tượng nghiên cứu: quá trình huấn luyện tạo cây mầm mô hoàn chỉnh dòng PN54 trong quy trình nuôi cấy mô

3.2.1.3.2 Nội dung nghiên cứu

- Thử nghiệm ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và chất lượng cây mầm mô Bạch đàn dòng PN54 khi chuyển cây con từ ống nghiệm ra vườn ươm;

- Thử nghiệm ảnh hưởng của cường độ ánh sáng trong quá trình huấn luyện đến tỷ lệ sống và chất lượng cây mầm mô Bạch đàn dòng PN54 khi chuyển từ ống

nghiệm ra vườm ươm;

32

- Cấy chuyển cây từ trong ống nghiệm ra vườm ươm để đánh giá tỷ lệ sống và chất lượng cây con

3.2.1.3.3 Phương pháp nghiên cứu

a Thử nghiệm ảnh hưởng của thời gian huấn luyện

Thử nghiệm ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và chất lượng cây con ở vườn ươm Cây mầm đã ra rễ trong bình trụ được để trong nhà huấn luyện với các khoảng thời gian khác nhau như sau:

- Bình cây được huấn luyện 5 ngày

- Bình cây được huấn luyện 10 ngày

- Bình cây được huấn luyện 15 ngày

- Bình cây được huấn luyện 20 ngày

b Thử nghiệm ảnh hưởng của cường độ ánh sáng

Cây con được để trong nhà huấn luyện, khi thời tiết không có nắng thì không che lưới đen Khi có nắng thì che nắng bằng lưới đen, sử dụng lưới đen đơn, độ tàn che khoảng 50% Cụ thể các công thức như sau:

- Không sử dụng lưới en và bố trí sao cho ánh sáng không chiếu trực tiếp vào bình cây

- Sử dụng 1 lớp lưới đen che ánh sáng

- Sử dụng 2 lớp lưới đen che chắn ánh sáng

Cây con đã ra rễ (trong bình trụ) được đưa ra nhà huấn luyện có mái lợp nhựa trong, lưới đen được che xung quanh có thể kéo ra kéo vào Sơ đồ bố trí các công thức thí nghiệm được thể hiện cụ thể ở bảng 16

c Bố trí thí nghiệm

Các bình cây ở các công thức thí nghiệm được bố trí theo phương pháp ngẫu nhiên đầy đủ Mỗi công thức thử nghiệm 10 bình, mỗi bình cấy 10 cây và lặp lại 3 lần theo thời gian

d Cấy cây con ra vườn ươm

Cây mầm sau khi huấn luyện được cấy ra vườn ươm theo quy trình cấy và chăm sóc cây mầm mô của VNCCNLG

Bảng 16 Phương pháp bố trí các công thức huấn luyện

33

Bình cây được huấn

luyện 5 ngày

Không sử dụng lưới đen và bố trí sao cho ánh sáng

Bình cây được huấn

luyện 10 ngày

Không sử dụng lưới đen và bố trí sao cho ánh sáng

Bình cây được huấn

luyện 15 ngày

Không sử dụng lưới đen và bố trí sao cho ánh sáng

Bình cây được huấn

luyện 20 ngày

Không sử dụng lưới đen và bố trí sao cho ánh sáng

e Thu thập và xử lý số liệu

- Đo cường độ ánh sáng của các thí nghiệm ở các thời điểm 10h và 15h trong ngày từ đó tính trung bình cho các khoảng thời gian thử nghiệm

- Theo dõi hình thái, màu sắc thân và lá cây cho từng công thức thử nghiệm

- Đo đếm tỷ lệ sống, hình thái cây con và chất lượng cây con ở vườn ươm sau

8 tuần từ khi cấy

- Số liệu được xử lý trên phần mềm Excel và chương trình SPSS

3.2.1.3.4 Kết quả nghiên cứu

Cây mầm sau khi được huấn luyện theo các công thức khác nhau được cấy ra vườn ươm Tỷ lệ sống của cây con ở vườn ươm đánh giá sau 4 tuần và 8 tuần ở các lần lặp như sau được tổng hợp ở trong bảng 17

Bảng 17 Tỷ lệ cấy sống ở các công thức huấn luyện

Công thức Cường độ ánh sáng

bình quân (lux)

Tổng số cây cấy

Số cây sống

Tỷ lệ sống bình quân (%)