tạo giống lúa chịu hạn bằng phương pháp dấu chuẩn phân tử

chia thành hai nhóm: protein đóng vai trò chức năng và protein đóng vai trò điều tiết các tính hiệu di truyền và sự thể hiện gen khi cây phản ứng với stress Yamaguchi-shinozaki, 1999...2

VIỆN LÚA ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG

CHƯƠNG TRÌNH TRỌNG ĐIỂM PHÁT TRIỂN VÀ ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG LĨNH VỰC NÔNG NGHIỆP

VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN

****************

BÁO CÁO TỔNG HỢP

KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

TẠO GIỐNG LÚA CHỊU HẠN BẰNG PHƯƠNG

PHÁP DẤU CHUẨN PHÂN TỬ

MÃ SỐ ĐỀ TÀI

Cơ quan chủ trì đề tài: Viện lúa Đồng bằng sông Cửu long

Chủ nhiệm đề tài: GS.TS Nguyễn Thị Lang

7834

07/4/2010

Hà Nội - 2010

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM VIỆN LÚA ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG

CHƯƠNG TRÌNH TRỌNG ĐIỂM PHÁT TRIỂN VÀ ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG LĨNH VỰC NÔNG NGHIỆP

VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN

Chủ nhiệm đề tài: Cơ quan chủ trì đề tài

(ký tên) (ký tên và đóng dấu)

GS.TS Nguyễn Thị Lang TS Lê Văn Bảnh

Ban chủ nhiệm chương trình Bộ Khoa học và Công nghệ

(ký tên) (ký tên và đóng dấu khi gửi lưu trữ)

Hà Nội - 2010

Chương 1: GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 2

1.2.1 Mục tiêu tổng quát 2

1.2.2 Mục tiêu cụ thể 2

1.3 Sản phẩm của đề tài cần đạt 3

1.4 Nội dung nghiên cứu 3

Chương 2: TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 4

2.1 Sơ lược về cây lúa 4

2.2 Các phương pháp chọn tạo giống (Jennings và ctv, 1979) 4

2.2.1 Chọn giống bằng cách trồng dồn 4

2.2.2 Chọn tạo giống theo phả hệ 5

2.2.3 Phương pháp hồi giao (Backcross-BC) 6

2.2.4 Chọn giống bằng chỉ thị phân tử (MAS) 7

2.3 Nguyên tắc cơ bản và ứng dụng PCR (Lang và ctv, 2005) 8

2.4 Chỉ thị phân tử SSR (Simple Sequence Repeat hoặc Microsatellites) 11

2.5 Xác định tính trạng thành phần trong chống chịu hạn 12

2.6 Những chỉ thị phân tử và bản đồ QTL tính chống chịu hạn 15

2.7 Bản đồ QTL các tính trạng quan trọng của lúa chống chịu điều kiện khô

hạn 17

2.7.1 Bản đồ QTL đối với tính trạng rễ lúa 17

2.7.2 Bản đồ QTL đối với tính trạng điều tiết áp suất thẩm thấu 20

2.7.3 Bản đồ QTL năng suất và thành phần năng suất dưới điều kiện khô hạn21 2.8 Chuyển nạp gen mục tiêu 22

2.9 Cơ chế truyền tính hiệu 24

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 35

3.1 Vật liệu 35

3.2 Phương pháp 36

3.2.1 Tạo quần thể lai F2 và BC1F1 36

3.2.2 Phân tích kiểu hình 37

3.2.3 Đánh giá kiểu gen 43

3.2.4 Ước đoán sự liên kết khô hạn của quần thể BC1F1 49

3.3 Giải mã DNA theo phương pháp của Lang 2007 và dùng máy A3130/3130 50

3.4 Thiết kế primers 50

3.5 Tuyển gen khô hạn 50

3.6 Phân tích và xử lý số liệu 51

3.6.1 Phân tích kết quả PCR bằng phần mềm NTSYS-pc (Rolfh) 51

3.6.2 Phân tích số liệu tương tác kiểu gen và môi trường 52

3.7 Địa điểm nghiên cứu 55

Chương 4: Kết quả và Thảo luận 56

4.1 Nghiên cứu vật liệu lai 56

4.1.1 Nghiên cứu vật liệu lai bộ du nhập từ Viện lúa Quốc Tế 56

4.1.2 Nghiên cứu vật liệu lai từ các giống cao sản tại Viện lúa lai tạo 76

4.1.3 Nghiên cứu vật liệu lai từ lúa mùa 80

4.2 Đa dạng hóa nguồn gen 85

4.2.1 Phân nhóm kiểu hình trên bộ lowland 86

4.2.2 Phân nhóm kiểu hình trên bộ Upland 89

4.2.3 Phân nhóm kiểu hình trên bộ lúa cao sản 90

4.2.4 Phân nhóm kiểu hình trên bộ lúa mùa địa phương 91

4.2.6 Đánh giá kiểu gen 94

4.2.7 Kiểm tra mức độ chính xác giữa việc đánh giá giống theo kiểu hình và dựa vào chỉ thị phân tử 96

4.3 Tạo dòng con lai chống chịu khô hạn 98

4.3.1 Các cặp lai thu được thông qua phương pháp lai đơn 98

4.3.2 Đánh giá khả năng chịu hạn của thế hệ con lai F1 và F2 99

4.3.3 Đánh giá F2 của tổ hợp OM6468/BP225D-TB-6-8 101

4.3.4 Năng suất và thành phân năng suất 103

4.3.5 Đánh giá F2 của tổ hợp OM4102/IR78933-B-24-B-B-4 106

4.3.6 Đánh giá F2 của tổ hợp lai OM4495/IR65191-3B-2-2-2-2 111

4.3.7 Kết qua lai tạo thông qua phương pháp lai Diallel 115

4.3.8 Kết quả tạo các quần thể hồi giao chuyển gen khô hạn cho các giống ngắn ngày 117

4.4 Cơ chế của gene kháng khô hạn 132

4.4.1 Sự thay đổi độ sâu và chiều dài của rễ 132

4.4.2 Cơ chế nở hoa của các giống chống chịu khô hạn 147

4.5 Nghiên cứu thiết lập bản đồ chống chịu khô hạn 149

4.5.1 Đánh giá tính chống chịu khô hạn trên bố mẹ 149

.5.2 Phân tích cấp độ chống chịu khô hạn trên các cặp lai BC (backcross) 150 4.5.3 Thiết lập bản đồ gen khô hạn bằng SSR chỉ thị phân tử 154

4.5.4 Phân tích QTL khô hạn 154

4.5.5 Quy trình xây dựng bản đồ QTL liên kết với gen khô hạn 165

4.6 So sánh bản đồ trên các nhiễm sắc thể 166

4.7 Tuyển gen khô hạn 168

4.7.1 Thiết lập BAC thư viện 169

4.8.1 Chọn lọc gia phả 176

4.8.2 Kết quả đánh giá sàng lọc cây mang gen kháng từ các quần thể cận giao mang gen khô hạn 177

4.8.3 Liên kết gen và số vị trí của chỉ thị phân tử 182

4.8.4 Sản phẩm phản ứng PCR với chỉ thị phân tử RM38 184

4.8.5 Kết quả đánh giá sàng lọc cây mang gen kháng từ các quần thể hồi giao mang gen khô hạn 186

4.8.6 Kết quả đánh giá và sàng lọc PCR trên các tổ hợp BC2 trên hai tổ hợp OM 1490/WAB881 SG9, OMCS2000/IR 81025-B-116 và OM1490/WAB880-1-38-18-20-P1 187

4.8.7 Kết quả xét nghiệm PCR sàng lọc cây mang gen kháng khô hạn BC4F2193 4.8.8 Mối quan hệ giữa chọn giống cổ điển và chọn giống nhờ chỉ thị phân tử196 4.9 Đánh giá các dòng triển vọng 198

4.9.1 Giới thiệu một số giống đầu dòng hồi giao có triển vọng 198

4.9.2 Các tổ hợp thuộc bộ giống lúa chỉ thị khô hạn 203

4.9.3 Đánh giá các dòng khô hạn 207

4.9.4 Thanh lọc vật liệu khô hạn ở ngoài đồng từ giai đoạn trổ đến thu hoạch211 4.9.5 So sánh các dòng triển vọng trong vụ Đông xuân 2008 215

4.10 Kết quả khảo nghiệm quốc gia vụ Hè Thu 2009 219

4.10.1 Khảo nghiệm năng suất 219

4.10.2 Phản ứng sâu bệnh trên giống lúa OM 6840 219

4.10.3 Phẩm chất gạo của giống OM 6840 221

4.10.4 Phẩm chất gạo của giống OM 6840 và OM 6162 223

5 So sánh kế hoạch đề tài với kết quả thực hiện đề tài 224

5.1 Sản phẩm về giống đề tài yêu cầu 224

5.2 Sản phẩm về số liệu khoa học 224

5.5 Hiệu quả của đề tài 225

Kết luận và kiến nghị 226 TÀI LIỆU THAM KHẢO 230

ASI Anthesis to silking interval

BC

BAC

BLAST

Backcross Bacterial Artificial Chromosome Basic Local Alignment Search Tool

CC Chiều cao cây

CDR Chiều dài rễ

CDR/CDT Chiều dài rễ/chiều dài thân

CDT Chiều dài thân

LNTT Lượng nước trong thân

MAB marker-assisted backcrossing MAS Marker Assisted Selection

OA Osmotic adjustment PCR Polymerase chain reaction PPDK pyruvate orthophosphate dikinase

QTL Quantitative trait loci – QTLs

SB/b Số bông/bụi

SC Số chồi

SH/B Số hạt/bông

SSD single seed descent

TL1000 Trọng lượng 1000 hạt

TLB Trọng lượng bông

TLKT Trọng lượng khô thân

TLTT Trọng lượng tươi thân

YAC Yeast artificial chromosome

khô hạn của một số loài cây trồng (Reddy và ctv, 1999) 14

Bảng 2.2: Các dòng đơn bội kép (DH) được chọn lọc để lai hồi giao (Shen và ctv, 1999) 18

Bảng 2.3: Những QTL đối với hình thái rễ lúa (Shen và ctv, 1999) 19

Bảng 2.4: Sự biểu hiện của các gen mục tiêu liên quan đến tính chống chịu khô hạn, trong cây lúa chuyển gen (Redd và ctv, 1999) 23

Bảng 3.1: Danh sách các giống dùng để lai 35

Bảng 3.2: Quy trình sản xuất giống chống chịu khô hạn 37

Bảng 4.1: Các đặc điểm sinh trưởng của các giống kháng khô hạn 58

Bảng 4.2: Các đặc tính nông học của bộ giống kháng khô hạn 1 (tt) 1 (Xem bảng đầy đủ các giống 62

Bảng 4.3: Năng suất và thành phần năng suất của bộ giống khô hạn 65

Bảng 4.4: Các đặc tính nông học của bộ giống kháng khô hạn Upland 71

Bảng 4.5: Các đặc tính nông học của bộ giống kháng khô hạn Upland 72

Bảng 4.6: Năng suất và thành phần năng suất của các giống thuộc bộ kháng khô hạn 74

Bảng 4.7: Năng suất và thành phần năng suất của các giống thuộc bộ kháng khô 75

Bảng 4.8: Các đặc điểm sinh trưởng của các giống cao sản 77

Bảng 4.9: Các đặc tính sinh học của các giống cao sản 79

Bảng 4.10: Các đặc điểm sinh trưởng của các giống lúa mùa địa phương 81

Bảng 4.11: Các đặc điểm sinh trưởng của các giống lúa mùa địa phương 83

Bảng 4.12: Sự liên quan giữa kiểu gen và kiểu hình của một số dòng lúa với sự kháng khô hạn 97

Bảng 4.13: Tỷ lệ kháng khô hạn ở các tổ hợp lúa lai ở thế hệ F1 100

Bảng 4.15: Năng suất và thành phần năng suất (thế hệ F2) của tổ hợp lai

OM6468/BP225D-TB-6-8 104

Bảng 4.16: Các đặc tính nông học (thế hệ F2) của tổ hợp lai OM4102/IR78933-B-24-B-B-4 107

Bảng 4.17: Năng suất và thành phần năng suất (thế hệF2) của tổ hợp lai OM4102/IR78933-B-24-B-B-4 109

Bảng 4.18: Các đặc tính nông học của tổ hợp lai OM4495/IR65191-3B-2-2-2-2 và khô hạn trên tổ hợp FOM4495/IR65191-3B-2-2-2-2 11OM4495/IR65191-3B-2-2-2-2

Bảng 4.19: Năng suất và thành phần năng suất (thế hệ F2) của tổ hợp lại OM4495/IR65191-3B-2-2-2 113

Bảng 4.20: Hệ số di truyền của 9 tính trạng năng suất và thành phần năng suất của ba tổ hợp lai ở thế hệ F1 115

Bảng 4.21: Tương quan giữa các tính trạng nghiên cứu với năng suất trong quần thể F1 của bộ giống lúa cao sản .116

Bảng 4.22: Phân tích hệ thống tương quan theo đường dẫn (path analysis) giữa các tính trạng với năng suất hạt – bộ giống lai .116

Bảng 4.23: Cấp độ héo lá của các tổ hợp 120

Bảng 4.24: Kết quả đánh giá kháng khô hạn bằng kiểu hình của các tổ hợp lai122 Bảng 4.25: Năng suất và thành phần năng suất tổ hợp BC1F1 của

OM1490/WAB880-1-38-18-20-P1-HB//OM1490 123

Bảng 4.26: Năng suất và thành phần năng suất tổ hợp BC1 của

OM1490/WAB880-1-38-18-20-P1-HB 124

Bảng 4.27: Năng suất và thành phần năng suất tổ hợp BC1F1 của

OM1490/WAB881 SG9 125

Bảng 4.28: Năng suất và thành phần năng suất tổ hợp BC1 của

Bảng 4.30: Năng suất và thành phần năng suất tổ hợp BC1 của

OMCS2000/IR 81025-B-116 128

Bảng 4.31: Kết quả thử phản ứng với kháng khô hạn trên các quần thể hồi giao tại thế hệ BC1 129

Bảng 4.32: Thanh lọc khô hạn bộ lai BC2F2 131

Bảng 4.33: Số dòng được chọn lọc ngoài đồng cho khô hạn tại Tịnh Biên, Đông Xuân 2007-2009 132

Bảng 4.34: Các đặc điểm sinh trưởng của các giống kháng khô hạn 136

Bảng 4.35: Các đặc tính sinh học của các giống kháng khô hạn 138

Bảng 4.36: Các đặc điểm sinh trưởng của các giống cao sản 140

Bảng 4.37: Tỷ lệ rễ/chồi, tỷ lệ rễ dày trên tổng trọng lượng rễ, tỷ lệ rễ dày/chồi của các gióng lúa đất khô và đất ẩm 142

Bảng 4.38: Ảnh hưởng của giống, độ sâu và giai đoạn phát triển tỷ lệ chiều dài/trọng lượng rễ của 4 giống được ghi nhận 142

Bảng 4.39: Sự phân chia thẳng đứng về mật số rễ của 7 giống lúa ở ruộng khô hạn trong vụ Đông Xuân 2008 144

Bảng 4.40: Sự sắp của các chỉ thị phân tử trên các NST của quần thể BC2F2 của tổ hợp OM1490/WAB880-1-38-18-20-P1-HB 154

Bảng 4.41: Xác định QTL của chống chịu khô hạn giai đoạn trỗ hoa bằng phương pháp SMA của 218 dòng BC từ tổ hợp OM1490/WAB880-1-38-18-20-P1-HB 160

Bảng 4.42: Xác định QTL của trọng lượng khô của rễ, (DR) bằng phương pháp SMA của 218 dòng BC từ tổ hợp OM1490/WAB880-1-38-18-20-P1-HB160 Bảng 4.43: Xác định QTL của chiều dài của rễ bằng phương pháp SMA của của 218 dòng BC từ tổ hợp OM1490/WAB880-1-38-18-20-P1-H 161

Bảng 4.45: Xác định QTL năng suất (YG) bằng phương pháp SMA của của

218 dòng BC từ tổ hợp OM1490/WAB880-1-38-18-20-P1-HB 162

Bảng 4.46: QTL của các tính trạng được xác định bằng phương pháp phân tích quãng (interval analysis) trên bản đồ di truyền 164 Bảng 4.47: Kết quả thử phản ứng với gen khô hạn trên chỉ thị phân tử SSR 210 của các dòng hồi giao ở thế hệ BC3F2, vụ Đông Xuân năm 2008-200 189 Bảng 4.48: Kết quả kiểm tra sự hiện diện của gen khô hạn trong trong các dòng hồi giao chuyển gen ở thế hệ BC3F1 bằng kỹ thuật PCR 191 Bảng 4.49: Tổng hợp kết quả PCRvới RM 201, RM 511 đánh giá và xác định gen chống chịu khô hạn trên tổ hợp BC4 của OM 1490/ WAB 880-1-38-18-20-PHB 194 Bảng 4.50 So sánh kiểu gen và kiểu hình trên 4 chỉ thị phân tử 198 Bảng 4.51: Bảng phân tích Anova của các tính trạng ở giai đoạn trổ và thu hoạch của các dòng lúa làm vật liệu khô hạn 199 Bảng 4.52: Kết quả phân nhóm Duncan các tổ hợp dựa trên các đặc tính sinh học 200 Bảng 4.53: Kết quả phân nhóm Duncan của các tổ hợp dựa trên các đặc tính sinh học 201 Bảng 4.54: Bảng phân tích Anova các đặc tính sinh học ở giai đoạn mạ 203 Bảng 4.55: Các đặc tính sinh học ở giai đoạn mạ của các tổ hợp thuộc bộ giống lúa chỉ thị khô hạn 204 Bảng 4.56: Các đặc tính sinh học ở giai đoạn mạ của các tổ hợp thuộc bộ giống lúa chỉ thị khô hạn 205 Bảng 4.57: Bảng phân tích Anova Các đặc tính sinh học ở giai đoạn mạ của các giống thuộc bộ giống lúa chỉ thị khô hạn 207

Bảng 4.59: Các đặc tính sinh học ở giai đoạn mạ của các giống thuộc bộ giống

lúachỉ thị khô hạn 210

Bảng 4.60: Bảng phân tích Anova các đặc tính sinh học của các giống thuộc bộ giống lúa chỉ thị khô hạn từ giai đoạn trổ đến thu hoạch 212

Bảng 4.61: Các đặc tính sinh học của các giống thuộc bộ giống lúa chỉ thị khô hạn từ giai đoạn trổ đến thu hoạch 213

Bảng 4.62: Các đặc tính sinh học của các giống thuộc bộ giống lúa chỉ thị khô hạn từ giai đoạn trổ đến thu hoạch 214

Bảng 4.63: Đặc tính nông học vụ Đông xuân 08-09 trên bộ giống khô hạn 216 Bảng 4.64: Sâu bệnh vụ Đông xuân 08-09 216

Bảng 4.65: Năng suất và thành phần năng suất 216

Bảng 4.66: Chất lượng của 8 giống lúa chống chịu khô hạn 217

Bảng 4.67: Đặc tính nông học vụ Đông xuân 08-09 217

Bảng 4.68: Sâu bệnh vụ Đông xuân 08-09 218

Bảng 4.69: Năng suất và thành phần năng suất 218

Bảng 4.70: Một số chỉ tiêu về phân tích phẩm chất của bộ giống khô hạn 219

Bảng 4.71: Một số đặc tính nông học của các giống lúa khảo nghiệm vụ ĐX08-09 (Nguồn: Nguyễn Quốc Lý và Nguyễn Văn Tuyển, 2009) 220

Bảng 4.72: Năng suất (tấn/ ha) của các giống lúa khảo nghiệm vụ ĐX08-09221 Bảng 4.73: Phản ứng của rầy nâu trên các giống khác nhau Hè Thu 2007 221

Bảng 4.74: Phản ứng rầy nâu 3 giai đoạn mạ qua các vụ từ 2007-2009 (Nguồn: Bộ môn Di truyền giống, 2009) 222

Bảng 6.75: Phản ứng của giống lúa đối với quần thể rầy nâu trong điều kiện nhân tạo vụ ĐX08-09 222

Bảng 4.76: Phản ứng của các giống với bệnh đạo ôn trong điều kiện nhân tạo vụ ĐX08-09 (Nguồn: Nguyễn văn Tuyển và Nguyễn Quốc Lý, 2009) 223

Bảng 4.78: Một số chỉ tiêu dạng cảm quan bên ngoài của các giống triển vọng (Nguồn: Nguyễn Quốc Lý và ctv, 2009) 224 Bảng 4.79: Diện tích giống OM 6162 trên các tỉnh (Đơn vị: ha) (Nguồn: Sở Nông nghiệp các tỉnh, 2009) 225

chia thành hai nhóm: protein đóng vai trò chức năng và protein đóng vai trò điều tiết các tính hiệu di truyền và sự thể hiện gen khi cây phản ứng với stress

(Yamaguchi-shinozaki, 1999) 24

Hình 2.2: Lộ trình truyền tín hiệu và sự thể hiện gen (Yamaguchi-Shinozaki và Shinozaki,1999) 25

Hình 2.3: Mô hình cảm ứng của gen rd29A và hoạt động của các nhân tố hoạt độngcó tính chất cis và trans trong hiện tượng thể hiện gen chống chịu stress (Yamaguchi-Shinozaki và Shinozaki,1999) 25

Hình 2.4: Đóng góp của ngành protein học và trancript học vào chiến lược MAS và chọn giống cây trồng (Salekdeh và ctv, 2002) 26

Hình 2.5: Sự dung hợp chức năng sinh học TPSP, yếu tố biến nạp và Southern-blot hybrization của lúa chuyển gen (In-Cheol Jang và ctv, 2003) 29 Hình 2.6: Mức độ chuyển mã của TPSP và các stress có thể suy ra từ gen của các dòng lúa Ubi1::TPSP và không chuyển gen A, phân tích Northern-blot được hình thành trên tất cả RNA từ 5 dòng của Ubi1::TPSP B, Northern blots của tất cả RNA từ cây không chuyển gen trước và sau xử lý (In-Cheol Jang và ctv, 2003) 30

Hình 3.1: Sơ đồ tạo dòng lúa lai BC 37

Hình 4.1: Bể lúa trồng để thanh lọc khô hạn ở giai đoạn mạ 56

Hình 4.2: Giống lúa thể hiện kháng tốt khô hạn 59

Hình 4.3: Giống không kháng khô hạn 59

Hình 4.4: Phân nhóm kiểu hình của các giống kháng khô hạn dựa trên các tính trạng nông học trong điều kiện khô hạn bằng phần mền NTSYS pc 2.1 86

Hình 4.5: Cây phân nhóm kiểu hình của các giống trong bộ kháng khô hạn 1 dựa vào các tính trạng nông học và năng suất trong điều kiện khô hạn bằng phần mềm NTSYSpc 2.1 88

phần mềm NTSYSpc 2.1 89

Hình 4.7: Phân nhóm kiểu hình của các giống cao sản dựa trên các tính trạng nông học trong điều kiện khô hạn 91

Hình 4.8: Cây phân nhóm kiểu hình các tính trạng của các giống lúa mùa trồng trong điều kiện khô hạn 92

Hình 4.9: Sản phẩm PCR của các dòng lúa chống chịu khô hạn locus RM 201 liên kết với gen khô hạn trên nhiễm sắc thể số 9, vị trí hai băng 210bp và 225bp, trên gel agarose 3 %, TBE (1X.) 96

Hình 4.10: Sản phẩm PCR của các dòng lúa chống chịu khô hạn locus RM 328 liên kết với gen khô hạn trên nhiễm sắc thể số 9, vị trí hai băng 200bp và 210bp, trên gel agarose 3 %, TBE (1X) 96

Hình 4.11: Chương trình lai bộ khô hạn trong nhà lưới 98

Hình 4.12: Thanh lọc giai đoạn mạ và giai đoạn sinh thực và giai đoạn trỗ hoa trên ba tổ hợp A, D, G: OM1490/WAB881 SG9,B, E, H:OMCS2000/OIR 81025-B-116 và C, F, I: OM1490/WAB880-1-38-18-20-P1-HB theo thứ tự121 Hình 4.13: Thanh lọc tính trạng khô hạn ngoài đồng quần thể con lai BC3F2128 Hình4.14: Đánh giá khô hạn ngoài đồng 131

Hình 4.15: Rễ của 3 giống chống chịu khô hạn 134

Hình 4.16: Rễ của 4 dòng kháng khô hạn, cao sản, lúa mùa và IR64 141

Hình 4.17: Rễ của 2 giống P1 trong các tổ hợp lai 146

Hình 4.18: Rễ của P1, P2 và BC1F1 của tổ hợp OM1490/WAB880-1-38-18-20-P1-HB 146

Hình 4.19: Rễ của P1, P2 và BC1F1 của tổ hợp OM1490/WAB881 SG9 146

Hình 4.20: Rễ của P1, P2 và BC1F1 của tổ hợp OMCS2000/OM4495 146 Hình 4.21: Khác biệt giữa OM 1490 và WAB880-1-38-18-20-P1-HB)

Hình 4.23: Sự biến động của của BC 2 F2 trên khô hạn và khô lá trên quần

thể BC2F2 của OM1490/WAB880-1-38-18-20-P1-HB Đánh giá tính trạng

chiều dài rễ của các giống lúa chịu khô hạn 151

Hình 4.24: Rễ của Bố mẹ và các thế hệ lai 1: WAB880-1-38-18-20-P1-HB., 2:

OM 1490, và con lai BC2F2 151 Hình 4.25: Sự biến động của của BC2F2 trên tỉ lệ thụ của hoa và chiều dài của rễ (Thời gian 30 ngày sau khi cấy) quần thể BC2F2 của

RM 201 DNA của 3 clones được phân cắt với Hind III 170

Hình 4.34: Kết quả bản đồ vật lý được thiết lập trên hình 174 Hình 4.35: Chỉ thị phân tử 13A9F-R trên quần thể F2 của OM 4102/ WAB 8818G9 Bản đồ vật lý của gen khô hạn của BAC đã được chứng minh 174 Hình 4.36: Sản phẩm PCR của chỉ thị phân tử RM 201 trên F3 của bốn tổ hợp OM6468/BP225D-TB-6-8, OM4102/IR78933-B-24-B-B-4, OM4495/IR65191-3B-2-2-2-2, OM6468/BP227D-MR-2-12 180

OM4495/IR65191-3B-2-2-2-2, OM6468/BP227D-MR-2-12 180 Hình 4.38: Sản phẩm PCR của chỉ thị phân tử RM 344 trên F3 của bốn tổ hợp OM6468/BP225D-TB-6-8, OM4102/IR78933-B-24-B-B-4, OM4495/IR65191-3B-2-2-2-2, OM6468/BP227D-MR-2-12 180 Hình 4.39: Sản phẩm PCR của chỉ thị phân tử RM 511 trên F3 của bốn tổ hợp OM6468/BP225D-TB-6-8, OM4102/IR78933-B-24-B-B-4, OM4495/IR65191-3B-2-2-2-2, OM6468/BP227D-MR-2-12 180 Hình 4.40: Sản phẩm PCR của chỉ thị phân tử RM 17 và RM 181 trên F3 của bốn tổ hợp OM6468/BP225D-TB-6-8, OM4102/IR78933-B-24-B-B-4, OM4495/IR65191-3B-2-2-2-2, OM6468/BP227D-MR-2-12 181 Hình 4.41: Sản phẩm PCR trên gel agarose 3% của primer RM 272 cho tổ hợp lai OM6468/BP227D-MR-2-12 183 Hình 4.42: Sản phẩm PCR trên gel agarose 3% của primer RM 204 cho tổ hợp OM6468/BP227D-MR-2-12 183 Hình 4.43: Kết quả PCR đối với primer RM 38 184 Hình 4.44: Kết quả PCR đối với primer RM237 184 Hình 4.45: Sản phẩm PCR trên gel polyaromice của primer RM 334 cho tổ hợp OM1490/WAB880-1-38-18-20-P1-HB 185 Hình 4.46: Sản phẩm PCR trên gel agarose 3% của primer RM 201 cho tổ hợp OM1490/WAB880-1-38-18-20-P1-HB và 1490/WAB881 SG9 186 Hình 4.47: Sản phẩm PCR trên gel agarose 3% của primer RM 201 cho tổ hợp OMCS2000/IR 81025-B-116 188 Hình 4.48: Sản phẩm PCR của RM 201 và RM 511 trên quần thể OM 1490/ WAB 880-1-38-18-20-PHB 195 Hình 4.49: Sản phẩm PCR của RM 201 và RM 511 trên quần thể OM 1490/

81025-B-116 196 Hình 4.52: Chọn giống khô hạn bằng chỉ thị phân tử 209

Hình 4.53: Các dòng triển vọng thanh lọc tại Tri Tôn (Tỉnh An giang) 220

1.1 Đặt vấn đề

Quản lý khô hạn là một thách thức lớn cho những vùng đất nông nghiệp chủ yếu nhờ vào nước trời và cải thiện năng suất cây trồng Vì thế khô hạn được xem như là nguyên nhân chính dẫn đến thiệt hại về kinh tế của cây trồng, đe dọa nền an ninh lương thực, trì hoãn hệ thống canh tác và nhất là ảnh hưởng đến nông dân trên vùng cao Khô hạn đã ảnh hưởng đến đời sống nông dân trồng lúa trong vùng cao, vùng chỉ có nước mưa cho sinh hoạt và trồng trọt Tất cả họ đều nghèo khổ, ít đất và giới hạn bởi khoa học kỹ thuật

Nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu và họ đã tìm ra nhiều vị trí tính trạng số lượng (quantitative trait loci – QTLs) cho tính trạng chống chịu khô hạn (Lilley và ctv, 1996; Shen và ctv, 1999; Adam và ctv, 2002; Jonalica và ctv, 2004)[47][12][31][65], đa số họ dựa trên quần thể đơn bội kép (DH) giữa IR64 x Azucena và CT9993-510-1-M x IR62266-42-6-2; đã chuyển thành

công gen chống chịu khô hạn vào cây lúa (Oryza sativa L.) (In-Cheol Jang và

ctv, 2003; Z.Y Li và S.Y Chen, 2000)[30]

Khô hạn sẽ là yếu tố quan trọng bậc nhất ảnh hưởng đến an ninh lương thực của thế giới, nó có thể làm giảm 70% năng suất cây trồng nói chung (Bray và ctv 2000)[16]

Sự khan hiếm về nước tưới phục vụ cho nông nghiệp đã được báo động trong nhiều hội nghị khoa học của thế giới gần đây Đối với Việt Nam không phải là ngoại lệ

Chống chịu khô hạn là tính trạng cực kỳ phức tạp, bị ảnh hưởng bởi sự thể hiện đồng thời cả một hệ thống gen mục tiêu (Thomashow 1999; Xiong và ctv 2002)[70][81] và bị ảnh hưởng bởi các yếu tố về mội trường, vật lý, hóa học (Soltis và Soltis 2003)[69]

Sông Cửu Long và Duyên Hải Miền Trung nên việc nghiên cứu chọn tạo giống lúa chống chịu khô hạn ít được quan tâm Bên cạnh đó nông dân vùng núi đa số là dân tộc thiểu số sống chủ yếu vào nông nghiệp, trình độ khoa học

kỹ thuật còn hạn chế, thường xuyên gặp thiên tai, trong đó chủ yếu nguồn nước không đáp ứng kịp thời cho người dân canh tác cây trồng Khô hạn làm giảm phẩm chất và năng suất của cây trồng, đôi khi cây trồng không cho trái, đặt biệt là cây lúa giai đoạn ra hoa là giai đoạn rất mẫn cảm với điều kiện khô hạn Hạt lúa thường trổ không thoát cổ bông hoặc trổ nhưng bị lép thất thoát năng suất

Vì thế, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Tạo giống lúa chịu hạn bằng phương pháp dấu chuẩn phân tử” nhằm giới thiệu và đồng thời áp dụng

những phương pháp đánh giá mới nhanh và tiện lợi nhờ vào kỹ thuật phân tử, làm cơ sở cho việc phát triển các giống lúa chống chịu khô hạn đáp ứng nhu cầu thực tế sản xuất ở những vùng cao và đảm bảo an ninh lương thực với sự phát triển dân số ngày càng tăng

- Xác định tính đa hình DNA của vật liệu lai trong ngân hàng gen của Viện Lúa ĐBSCL

Đánh giá các dòng triển vọng chống chịu khô hạn: 1-2 dòng

™ Sản phẩm về số liệu khoa học: 1 bản đồ QTL chống chịu khô hạn, 1 Trình tự DNA của 1 gen (1 chỉ thị phân tử)

™ Sản phẩm khoa học: 5 báo cáo

™ Đào tạo thạc sĩ: 1 thạc sĩ, 2 kỹ sư

1.4 Nội dung nghiên cứu

™ Nghiên cứu vật liệu lai

™ Đa dạng di truyền

™ Tạo dòng con lai chống chịu khô hạn

™ Cơ chế của gene kháng khô hạn

™ Nghiên cứu thiết lập bản đồ chống chịu khô hạn

™ So sánh bản đồ trên các nhiễm sắc thể

™ Tuyển gen khô hạn

™ Đánh giá kiểu gen của các con lai và lựa chọn dòng chống chịu khô hạn

™ Đánh giá các dòng triển vọng

Cây lúa có nguồn gốc từ Châu Á, được tìm thấy sớm nhất tại Non Nok

Tha của Thái Lan 3500 năm trước công nguyên Lúa trồng (Oriza sativa) đầu

tiên được công nhận tại Ấn Độ và Đông Nam Á tại Neolithic Chirand, Bắc Bihar (2000-1300 năm trước công nguyên) và cũng được ghi nhận tại Hastinapur (1100-800 năm trước công nguyên) và một vài nơi khác (Randhawa, 1980)[59] Hầu hết 90% diện tích đất trồng lúa ở Châu Á, năm

1999 diện tích lúa trên thế giới được trồng khoảng 152 triệu ha trong đó Châu

Á chiếm 136 triệu ha Vì thế, sản lượng lúa trên thế giới đạt trên 582 triệu tấn,

533 triệu tấn được sản xuất tại Châu Á Ấn Độ là quốc gia có diện tích trồng lúa lớn nhất trên thế giới

Phân loại về cây lúa

Lúa thuộc về genus Oryza, 20 loài và 23 loài được liệt kê bởi

Chatterjee (1948)[18] Dựa trên cơ sở này, Tateoka (1963, 1964)[73] công

nhận 22 loài Oryza là căn bản Trong số đó, chỉ có 2 loài được trồng, Oryza glaberrima Steud được trồng giới hạn tại một số nơi ở Châu Phi, hầu hết lúa trồng là O sativa L có tiềm năng năng suất cao hơn và khả năng thích nghi rộng hơn Số nhiễm sắc thể của genus Oryza là 12 (2n = 24)

Giống lúa trồng O sativa L được chia làm 3 kiểu sinh thái: indica, japonica và javanica được trồng rộng khắp các vùng nhiệt đới và cận nhiệt

đới

2.2 Các phương pháp chọn tạo giống (Jennings và ctv, 1979)[33]

2.2.1 Chọn giống bằng cách trồng dồn

Phương pháp trồng dồn đã được các nhà chọn tạo giống sử dụng từ lâu

ở các vùng nhiệt đới và ôn đới Mặc dầu, phương pháp này có lợi là rất đơn giản nhưng thông qua nhiều năm sử dụng tại vùng Châu Á nhiệt đới đã luôn luôn thất bại không đưa năng suất toàn quốc lên được Tuy nhiên vài chương

từ cũng cho những giống tốt, ổn định

Phương pháp trồng dồn chưa đưa đến nhiều tiến bộ đáng kể trong nền sản xuất lúa vùng nhiệt đới vì các nhà khoa học đã không để ý đến hai nguyên tắc căn bản của cải tiến giống:

1 Ảnh hưởng của hình thái của thân trên khả năng cho năng suất và sự cần thiết phải thay thế những dạng cây cao quá, lá rủ bằng những dạng hình có sản lượng cao hơn

2 Tác dụng loại trừ của sự cạnh tranh trong quần thể phân ly làm giảm đi những cây phân ly có giá trị

Những kiểu cây có tiềm năng cho năng suất cao luôn luôn đã xuất hiện trong quần thể cây F2 trong các chương trình lai giống vùng nhiệt đới; vài cá thể phân ly đôi khi được tìm thấy trong tổ hợp giữa các cây cha mẹ cao, lá rủ

Những nhà chọn giống thường không nhận ra giá trị của nhóm phân ly nhỏ hơn này hoặc bị mất chúng vì chúng bị lấn át thiếu ánh sáng Vì vậy phương pháp trồng dồn không đem lại những bước tiến về năng suất mặc dù

có thể dùng một cách hữu hiệu để chọn những tính trạng kiểu hình không phụ thuộc vào mật độ như kích thước hạt, phẩm chất nấu, thời gian sinh trưởng, tính không quan cảm, tính kháng và tính không lông

Gần đây, do nhận thức được sự tương tác của kiểu hình, khả năng cho năng suất và sự cạnh tranh, đa số các nhà chọn tạo giống đã tránh không dùng hoặc không cải tiến phương pháp trồng dồn thông thường Phương pháp trồng dồn không giới hạn được coi như vô hiệu quả nếu muốn tìm những dạng cây

có tiềm năng năng suất cao trong tổ hợp phân ly mạnh về kiểu hình

2.2.2 Chọn tạo giống theo phả hệ

Phương pháp tuyển chọn theo phả hệ được sử dụng rộng rãi và thành

các số liệu làm căn cứ cho sự lựa chọn lúc lúa chín Người ta phải tốn nhiều công sức vì đối với từng cá thể được chọn vừa phải chuẩn bị trồng ngoài đồng, vừa đánh giá trong phòng thí nghiệm về phẩm chất hạt, tính kháng sâu, bệnh

và về các tính trạng khác đối với những bộ giống đặc biệt Trong tất cả các phương pháp chọn tạo giống, phương pháp phả hệ đòi hỏi phải quen thuộc với những đặc tính của cây đang sử dụng và sự tương tác giữa kiểu gen với môi trường trên sự biểu hiện các tính trạng

Tuy nhiên, vì có nhiều ưu điểm phương pháp phả hệ được sử dụng rộng rãi Quan trọng nhất là những thế hệ sớm đã được chọn ngoài đồng có thể được đánh giá liền trong những trắc nghiệm đặc biệt chọn theo tính trạng như tính kháng chẳng hạn Phương pháp này cho ta cơ sở vững chắc hơn để loại

bỏ những dòng không thích hợp và kết quả tập trung vào những cây có giá trị Khi những dòng mới được trồng ngoài đồng người ta sẽ thu được dữ kiện từ

sự đánh giá từng cá thể trong những thế hệ con cháu sau này Vì vậy, những dòng kém phẩm chất, dể nhiễm sâu bệnh hay có những khuyết điểm khác sẽ

bị loại bỏ ngay từ trong sổ ghi để khỏi mất thời gian

2.2.3 Phương pháp hồi giao (Backcross-BC)

Đây là phương pháp chưa được các nhà chọn tạo giống lúa sử dụng rộng rãi Trong phương pháp hồi giao một tính trạng được chuyển sang một giống cải tiến bằng cách được sử dụng lại làm cây cha mẹ để lai lại nhiều lần

Sự bất lợi chủ yếu của phương pháp hồi giao là không có giống duy nhất nào

lý tưởng đến nổi nó chỉ cần cải tiến một tính trạng Mặc dù, các chương trình chọn tạo giống lúa liên tục tìm ra những giống mới có thể tốt hơn để thay thế những giống cũ nhưng chưa có chương trình lúa nhiệt đới nào đạt đến sự cải tiến vượt bậc về phẩm chất hạt, năng suất hay sự ổn định tiềm năng cho năng suất cao

bệnh cháy lá Sự tuyển chọn trong những thế hệ đầu tiên từ tổ hợp dòng Colombia 1 với những cây lùn cải tiến cho thấy rằng sự phân ly tính kháng xảy ra thường xuyên theo dự đoán nhưng kiểu cây hay hạt thì luôn luôn xấu

Điều này chứng tỏ có sự liên kết mạnh giữa tính kháng và những tính trạng kiểu hình về kiểu cây và hạt giống Colombia 1 Trong trường hợp này,

sự hồi giao nhiều lần với giống cha mẹ lùn cải tiến kết hợp với sự tuyển chọn mạnh ở F1 sau khi mỗi lần hồi giao có thể phá vỡ sự liên kết này

Một thí vụ khác về sự hữu hiệu đặc biệt của phương pháp hồi giao là trong những ngày đầu của chương trình chọn tạo giống của IRRI (Viện nghiên cứu lúa Quốc Tế) khi mà giống Peta có hạt dài trung bình, gạo đục và nhiệt độ đông hồ thấp được lai với giống Belle Patna có hạt dài, gạo trong và nhiệt độ trở hồ trung bình Một loạt hồi giao lại với giống Peta được thực hiện dùng những cây trong mỗi thế hệ F1 có hạt tương tự như hạt của Belle Patna Sản phẩm cuối cùng là một loạt dòng có hình thể tương tự giống Peta nhưng

có dạng hạt của Belle Patna Đây là trường hợp rất đáng chú ý vì tính trạng di truyền độc lập nhau và phức tạp

2.2.4 Chọn giống bằng chỉ thị phân tử (MAS)

Sự phát triển của kỹ thuật di truyền và công nghệ sinh học đã tạo thành công rất lớn cho công tác tạo chọn giống cây trồng Việc ứng dụng các kỹ thuật ở mức độ phân tử cho phép chúng ta chuyển những gen mong muốn hay xác định cá thể có mang gen mong muốn Kỹ thuật hỗ trợ cho việc chọn giống thường được sử dụng là các chỉ thị phân tử RAPD, RFLP, SSR, STS, AFLP,… liên kết chặt với tính trạng mong muốn dựa trên quần thể F2 hoặc quần thể hồi giao (BC-backcross), quần thể các dòng cận giao tái tổ hợp (RIL

- recombinant), quần thể các dòng gần như đẳng gen (NIL - nearly isogenic

Một trong những mục tiêu chung của công tác chọn giống cây trồng là chuyển một gen mục tiêu vào trong giống cây trồng mong muốn Phương pháp hồi giao được các nhà chọn tạo giống lúa sử dụng rộng rãi, tiết kiệm 1-2 thế hệ, giúp cho việc cải tiến cây trồng đáp ứng với sản xuất sớm hơn rất nhiều Trong phương pháp hồi giao, một tính trạng được chuyển sang một giống cải tiến bằng cách dùng cây cha mẹ để lai lại nhiều lần (Lang và ctv, 2002)[2] Hiện nay, với sự trợ giúp nhờ DNA chỉ thị phân tử người ta càng phát triển tiềm năng của hồi giao trong nghiên cứu và ứng dụng du nhập gen

từ các loài hoang dại, thẩm định khả năng du nhập từng bước (introgression)

từ loài hoang dại sang cây trồng (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999)[1]

Thông qua sử dụng chỉ số chọn lọc kết hợp với đánh giá phân tử và đánh giá kiểu hình, chọn giống nhờ đánh dấu phân tử có thể làm gia tăng hiệu quả chọn lọc rất cao so với phương pháp chọn giống cổ truyền Nó còn tạo nên các cơ hội để gia tăng cường độ chọn lọc trong những thế hệ đầu, trong khi phương pháp cổ truyền gần như không có chọn lọc hoặc chọn lọc bằng mắt rất yếu để loại bỏ các dòng xấu (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999)[1]

2.3 Nguyên tắc cơ bản và ứng dụng PCR (Lang và ctv, 2005)

Phản ứng chuỗi polymerase thường được viết tắt là PCR (polymerase chain reaction) Đây là một kỹ thuật ra đời từ đầu thập niên 1990 cho phép chúng ta ứng dụng chỉ thị phân tử theo hướng đơn giản và hiệu quả hơn Phương pháp PCR tạo nên ALP (amplicon length polymorphism) phản ánh DNA có tính đa hình giữa các cá thể, các dòng lai và các giống trên cơ sở điện di Ưu điểm của ALP so với RFLP là kết quả nhanh, không đòi hỏi sử dụng đồng vị phóng xạ, giá thành thấp, số lượng DNA ít Tuy nhiên, khuyết

Kỹ thuật PCR dựa trên sự xúc tác của enzyme DNA polymerase để khuếch đại một đoạn DNA nhờ hai đoạn mồi oligonucleotide (primer) tương hợp với hai đầu 3’ ở cả hai mạch của DNA mục tiêu (target sequence) Để đoạn mồi được gắn vào DNA mục tiêu, trước tiên hai mạch của chuỗi xoắn kép phải được tách ra nhờ nhiệt độ cao, sau đó nhiệt độ giảm xuống để cho đoạn mồi liên kết vào các mạch DNA mục tiêu theo nguyên tắc bổ sung, cuối cùng phản ứng polymer hoá được thực hiện nhờ DNA polymerase để kéo dài mạch bổ sung ra Đó là một chu kỳ của PCR Do các sản phẩm mới được tổng hợp lại được dùng làm khuôn cho đoạn mồi khác, nên sau mỗi chu kỳ số bản sao của DNA lại được tăng gấp đôi so với chu kỳ trước đó Chu kỳ gồm ba bước như trên được lặp lại nhiều lần và tạo ra hàng triệu DNA trong vài giờ Quy trình chuẩn của PCR được tiến hành như sau (Lang, 2002 )[3][43]

- Bước 1: Giai đoạn biến tính (Denaturation) thường là 940C - 950C trong vòng 30 giây -1phút (tuỳ thuộc vào vật liệu)

- Bước 2: Giai đoạn bắt cặp (Annealing) thường nhiệt độ dao động khoảng 40 - 720C thường là 550C và kéo dài từ 30 giây - 1 phút

- Bước 3: Giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (Extension) lúc này nhiệt

độ tăng lên đến 720C, đây là nhiệt độ tối ưu cho nhiều DNA polymerase chịu nhiệt và kéo dài từ 1 phút đến nhiều phút tuỳ vào độ dài DNA cần khuếch đại Chu kỳ gồm 3 bước này sẽ được lặp lại nhiều lần khoảng 25 - 40 (tuỳ vào ứng dụng chuyên biệt) Cuối cùng được kết thúc bằng một “extension” ở

720C trong 5 phút, sau đó cho dừng hẳn bằng cách tổn trữ sản phẩm PCR ở nhiệt độ phòng hoặc ở 40C (tuỳ vào loại máy Thermal cycler được sử dụng) (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004)[4]

Số bản sao DNA được tạo ra nhờ kỹ thuật PCR được tính như sau:

sản phẩm khuếch đại là 1.07x109

Một số thành phần chủ yếu trong hỗn hợp phản ứng PCR:

- DNA polymerase: được dùng phổ biến là Taq polymerase, lấy từ

Themus aquticus, có tính ổn định nhiệt rất cao Taq polymerase nhạy cảm với

ion mangesium (Mg++) Nồng độ tối hảo của Mg++ là 0.5 – 2.5 mM Vì deoxyribonucleotide triphosphate (dNTP) có thể gắn với ion Mg++, cho nên nồng độ chính xác của Mg tuỳ thuộc vào nồng độ của dNTP Các thành phần

khác ít mẫn cảm với Taq polymerase là KCl và Tris Ngoài ra, các chất tẩy

không có ion, gelatin, NP40, và Tween 20 được thêm vào với số lượng nhỏ

nhằm thúc đẩy hoạt động của Taq polymerase với nồng độ hiện được dùng là

0.01% và còn tiếp tục thử nghiệm Trong hầu hết các protocol, người ta

khuyến cáo nồng độ Taq sử dụng là 0.5 U / 25 µl Nếu nồng độ Taq quá cao

(> 1.25 U / 25 µl, những sản phẩm không chuyên tính có thể nhảy vào làm sai

lệch kết quả Nếu nồng độ Taq quá thấp, chúng ta sẽ không có đủ số lượng

men xúc tác tạo ra sản phẩm PCR mong muốn (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004)[4]

- Đoạn mồi và dNTP: dung dịch dNTP làm stock phải được trung

tính ở pH=7.0 Stock ban đầu được pha thêm để có 10 mM, và tổn trữ ở -200C Stock được dùng nên có nồng độ dNTP là 1mM Sự ổn định của dNTP trong suốt các chu kỳ lặp lại ước còn khoảng 50% sau 50 chu kỳ Hàm lượng dNTP trong khoảng 20 – 200 µM cho kết quả ổn định, trung thực và chuyên tính Bốn dNTP được xử lý sao cho nồng độ chúng tương đương nhau, để giảm

thiểu tối đa hiện tượng sai biệt do kết hợp sai mã di truyền nào đó

Sự khuếch đại chuyên biệt đối với DNA cần nghiên cứu, đều phải tuỳ thuộc các đoạn mồi tương xứng Do vậy, chiều dài đoạn mồi và thành phần G + C đều có ảnh hưởng quan trọng đối với nhiệt độ trong quá trình tác động ở

đoạn mồi chứa một đoạn lớn hơn 4 nucleotide liên tục thì nó sẽ làm mất tính đặc hiệu

- DNA mục tiêu: người ta cần phải có những đoạn DNA mang mật

mã biết trước, được gọi với thuật ngữ “ target DNA” (DNA mục tiêu) trong

kỹ thuật PCR Kết quả thu nhận sẽ tốt nhất, nếu DNA thật sự thuần khiết, DNA từ các mô lá Số lượng DNA cần cho một phản ứng không nhiều lắm, chỉ cần 5 – 10 ng DNA thuần khiết, đối với RAPD thì lượng này là 5 – 25 ng

DNA

2.4 Chỉ thị phân tử SSR (Simple Sequence Repeat hoặc Microsatellites)

SSR đã được ứng dụng thành công từ năm 1995 (Mc Cough và ctv, 1996) [48] Đó là tập hợp các đoạn chuỗi mã rất ngắn từ 2 – 10bp Các đoạn này xuất hiện trên chuỗi mã DNA được lặp đi lặp lại nhất định, sắp xếp ngẫu nhiên, rất khác nhau được phân tán khắp nơi trên bộ gen của sinh vật kể cả con người (Gunter Kahl, 2001)[23] Những chuỗi mã ngắn này có thể ở dạng lặp lại của hai, ba hay bốn nucleotide và được sắp xếp ngẫu nhiên trên một dãy của 5 – 50 bản sao (copy) chẳng hạn như (AT)29, (CAC)16 hay (GACA)32, SSR xuất hiện rất nhiều trên bộ gen thực vật và có mặt trung bình sau mỗi 6 – 7kb Các đoạn này được khuyếch đại trong phản ứng PCR nhờ vào mồi xuôi (forward primer) và mồi ngược (reverse primer) Sản phẩm PCR chứa các alen SSR tuân theo sự tự động và đa thành phần cho phép phân tích kiểu gen cùng lúc trên nhiều dòng và nhiều vị trí SSR trở thành loại đánh dấu phân tử đồng trội phổ biến trong phân tích di truyền, ứng dụng trong chọn giống (Yang và ctv, 1994)[84] và đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của di truyền (Tautz và ctv, 1986; Kashi và ctv, 1997; Toth và ctv, 2000)[74][36][76]

triển hàng trăm SSR và lập bản đồ di truyền cho 320 SSR (Tensely, 1993; Akagi và ctv, 1996; Panaud và ctv, 1996; Chen X và ctv, 1997; Temnykh và ctv, 1997; Toth và ctv, 2000)[78][13][19][55][75][76] Các đánh dấu này được dùng để phân tích sự đa dạng di truyền (Yang và ctv, 1994; Olufowote

và ctv, 1997; Cho và ctv, 2000; Harrington, 2000)[84][20][24][54]và để định

vị gen và QTL trên nhiễm sắc thể của cây lúa thực hiện lai cùng và khác loài (Xiao và ctv, 1998; Bao và ctv, 2000; Zou và ctv, 2000; Bres-patry và ctv, 2001; Moncada và ctv, 2001)[80][14][90][15][17][52] SSR hữu ích trong thiết lập bản đồ di truyền, bản đồ vật lý và bản đồ chuỗi mã cơ bản trên cây lúa

Ngoài ra SSR còn cung cấp cho các nhà chọn giống và các nhà di truyền những công cụ đáng tin cậy và hiệu quả để liên kết sự khác biệt giữa kiểu gen và kiểu hình (Lang và ctv, 2004)[4]

2.5 Xác định tính trạng thành phần trong chống chịu hạn

Sự thể hiện tính chống chịu hạn được quan sát thông qua những tính trạng hình thái rễ cây, lá chồi thân, phản ứng co nguyên sinh, bao phấn, quá trình trổ bông… Những tính trạng như vậy gọi là tính trạng thành phần (component traits) Người ta tìm thấy có sự giống nhau về cơ bản và một vài khác biệt nhỏ về cơ chế chống chịu khô hạn, sự cấu thành năng suất của nhiều loài cây trồng khác nhau Sự giống nhau về cơ chế chống chịu hạn ở mức độ phân tử rõ ràng so với sinh lý học và hình thái học Chúng ta có thể nghiên cứu từ một cây rồi suy diễn đối với nhiều cây khác (Reddy và ctv, 1999)[61]

Hầu hết các nguyên cứu về chỉ thị phân tử đều quan tâm đến những thành phần rất đặc biệt trong sự kiện chống chịu hạn đó là:

¾ Khả năng của rễ cây phát triển xuống tầng đất bên dưới

¾ Sự điều tiết áp suất thẩm thấu (OA=được viết tắt từ chữ osmotic adjustment)

¾ Hiện tượng biến dưỡng ABA (abscisic acid)

¾ Hiện tượng nông học WUE (ý nghĩa của hiệu quả sử dụng nước)

Nhiều nghiên cứu khác còn đề cập đến năng suất và thành phần cấu tạo năng suất Do đó, người ta đã cố gắng xác đinh vị trí các QTL cho các tính trạng có liên quan đến chống chịu khô hạn và năng suất cũng như thành phần năng suất Số QTL được tìm thấy đối với tính chống chịu khô hạn thường thay đổi từ 1 đến 4 đối với một tính trạng thuộc thành phần trong sự kiện chống chịu hạn và những QTL này trãi rộng trên toàn bộ bộ gen với nhiều nhóm liên kết Thí dụ, tính trạng WUE (hiệu quả sử dụng nước) được tìm thấy với rất ít QTL từ 4-5 trong cây đậu nành (Milan và ctv, 1998)[53]

Trong một vài trường hợp, có những QTL định vị trên cùng một nhóm liên kết gen, điều khiển nhiều tính trạng quan trọng như khả năng điều tiết áp suất thẩm thấu (OA), khả năng chống chịu sự thủy phân, chúng liên kết với những tính trạng hình thái học của rễ lúa (Lilley và ctv, 1996)[31] Biến thiên kiểu hình đối với từng tính trạng xét trên mỗi vị trí QTL xoay quanh giá trị 10% Trong trường hợp ngoại lệ, QTL đối với tính trạng chiều dài rễ ở giai đoạn 28 ngày tuổi biến thiên 30% (Price và Tomas, 1997)[57] Mối quan hệ giữa năng suất và QTL thường cho kết quả âm tính trong vài trường hợp nhưng đối với tính trạng ASI kết quả chống chịu hạn không kháng đối với năng suất (Ribaut và ctv, 1996)[62] Những QTL đối với tính trạng ASI có tính ổn định nhiều năm, trong điều kiện mức độ stress khác nhau sẽ được xem

như là những ứng cử viên trong chiến lược ứng dụng MAS

Tính trạng Cây trồng Quần thể lập bản đồ QTL Tác giả

Đặc tính của rễ

Hình thái Lúa 203 RILs của cặp lai

Co39 x Moroberekan Champoux và ctv (1995) Phân bố rễ Lúa Quần thể DH:105 dòng Yadav và ctv

Đặc tính sinh lý

Hàn lượng nước và khả năng

điều tiết nguyên sinh chất Lúa mạch 187 dòng RIL Teulat và ctv (1997, 1998)

Đặc điểm tung phấn, phun râu Bắp 272 dòng F 2 Ribaut và ctv

(1996)[62]

Mức thiệc hại trước khi trổ Cao lương 98 dòng RIL Tuinstra và ctv

(1996) Mức thiệt hại sau khi trổ Cao lương 98 dòng RIL Tuinstra và ctv

Cà chua

F3 và các tổ hợp BC1F1, 11 tổ hợp có WUE cao và 8 thấp

Martine và ctv (1989)

Năng suất và thành phần

năng suất, tương tác GxE

Năng suất và thành phần năng

đường thẳng, chúng được xem xét ở mức độ phân tử DNA, hoặc nhiễm sắc thể mà những khác nhau về di truyền có thể tìm thấy nhờ nhiều công cụ xét nghiệm có tính chất phân tử (Li, 1999)[44] Bửu và Lang (2002)[2] những loại chỉ thị phân tử chính thường được sử dụng là:

+ RFLP là chỉ thị phân tử có tính chất đồng trội và rất đáng tinh cậy,

kỹ thuật này sử dụng DNA hoặc thể probe, được đánh dấu bằng phóng xạ và

sự phân cắt hạn chế của enzyme

+ RAPD là một dạng chỉ thị phân tử DNA được sản sinh nhờ kỹ thuật PCR Mức độ khuếch đại cao từ cặp mồi đơn giản, ngắn, được thiết kế ngẫu nhiên (10 mer) Đây là chỉ thị phân tử có tính trội và có mức tinh cậy thấp

+ STS là chỉ thị phân tử được thiết kế từ chuỗi ký tự của RFLP (20-24 mer), có tính chất đồng trội, được sản sinh nhờ kỹ thuật PCR, đôi khi nó cũng thể hiện tính trội Đây là phương pháp có thể sử dụng enzyme phân cắt trong trường hợp đa hình không thể hiện rõ Kết quả có độ tin cậy tốt

+ Vi vệ tinh hay SSR là chỉ thị phân tử được thiết kế từ những vệ tinh

có chuỗi ký tự đơn giản, lặp lại nhiều lần Cặp mồi được thiết kế từ trước và sau Những vệ tinh như vậy chỉ thị phân tử có tính chất đồng trội, mức độ tinh cậy cao, khả năng dò tìm đa hình khá nhạy Do đó, nó đã nhanh chống thay thế RFLP và RAPD với các mô típ “di-nucleotide” hoặc “tri-nucleotide” (GA,

GT, CAT, CTT) trong bộ gen cây lúa

+ AFLP là một dạng trong những chỉ thị phân tử dựa trên cơ sở PCR, theo cách chọn lọc của hai “adaptor” (là những enzyme phân cắt hạn chế) Nó phối hợp cả hai tính chất của RFLP và RAPD, nên có khả năng phát hiện đa hình rất tốt Nhưng nó thường có tính chất trội nên gặp hạn chế khi thể hiện alen lặn

nay được người ta quan tâm và sử dụng là vi vệ tinh (SSR)

Mục tiêu cơ bản của bản đồ QTL là tìm hiểu cơ sở di truyền của những tính trạng số lượng bằng cách xác định số lượng các vị trí, những ảnh hưởng của gen và hoạt động của những vị trí bao gồm tương tác gen (epistasis) và tương tác QTL x E (môi trường) Một mục đích khác của bản đồ QTL là xác định những QTL mang tính chất hiệu quả, phục vụ yêu cầu chọn dòng (giống) chống chịu khô hạn Mục tiêu lâu dài của thí nghiệm về bản đồ QTL là

“cloning” các gen điều khiển tính trạng số lượng vô cùng phức tạp, thông qua tiếp cận kỹ thuật “map-base cloning” Nguyên tắc lập bản đồ QTL với chỉ thị phân tử DNA là phát hiện cho được những kết hợp giữa chỉ thị phân tử và tính trạng trên cơ sở liên kết gen, thông qua các phương pháp bố trí thí nghiệm và phương pháp phân tích thống kê chính xác

Quần thể phục vụ cho yêu cầu như vậy thường là: F2, hồi giao (backcross-BC), đơn bội kép (DH) hoặc cận giao tái tổ hợp (RIL) từ một tổ hợp lai giữa hai dòng cận giao phân ly những tính trạng số lượng mục tiêu và nhiều chỉ thị phân tử đi kèm theo Quần thể này phải được đánh giá kiểu hình rất đầy đủ và được đánh giá kiểu gen thông qua bản đồ liên kết gen với mật

độ chỉ thị phân tử phủ trên nhiễm sắc thể dày đặc

Các phương pháp phân tích thống kê phải đáp ứng yêu cầu chính xác, đánh tin cậy, thông qua phân tích từng chỉ thị phân tử đơn, phân tích bản đồ cách quãng và mô hình tuyến tính Cho đến nay, người ta biết rằng QTL ảnh hưởng nhiều tính trạng nông học quan trọng Những QTL này đóng vai trò ảnh hưởng chính (tính công và/hoặc tính trội), chúng được tìm thấy thông qua

mô hình “main-effect QTL” được mô tả bởi Lander và Botstein (1989)[39], Zeng (1994)[86], Li (1999)[44]

Mô hình “main-effect QTL” có những đặc điểm cơ bản sau:

lớn) và có tính chất xác định rõ ràng thông qua quần thể và môi trường

+ Những QTL mẫu phải có ảnh hưởng chính khá nhỏ và đại diện cho hơn 80% vị trí được nhận dạng trong bộ gen cây trồng

+ Những thí nghiệm MAS đối với nội dung chuyển các QTL mong muốn để cải tiến tính trạng số lượng phải được thực hiện với sự thận trọng nhất định Bởi vì tương tác giữa QTL x E, hiện tượng epistasis cần phải được giải thích

Hiện tượng epistasis và sự kiểm soát biến dị di truyền đã được đề cặp trong các mô hình cải tiến Bên cạnh đó tương tác QTL x E cũng được thảo luận

2.7 Bản đồ QTL các tính trạng quan trọng của lúa chống chịu điều kiện khô hạn

2.7.1 Bản đồ QTL đối với tính trạng rễ lúa

Hệ thống rễ phát triển tốt là một tính trạng vô cùng quan trọng giúp cây trồng chống chịu khô hạn Người ta đã sử dụng quần thể đơn bội kép (DH) của cặp lai IR64 x Azucena tại Viện Lúa Quốc Tế (IRRI) Quần thể này được phát triển gần như đẳng gen (NIL) (Shen và ctv, 1999)[66] với những QTL chủ lực Các tác giả đã xác định bốn đoạn trên nhiễm sắc thể (NST) số 1, 2, 7

và 9 là nơi định vị các QTL chủ lực trong phân tích chọn lọc từng QTL mục tiêu Có 4 dòng DH với hiện tượng tổ hợp alen riêng rẽ tại 4 đoạn NST này, trong đó có ít hơn 50% alen của Azucena Bốn dòng này được chọn làm vật liệu cho gen chống chịu (donor) Các dòng này cho lai lui lại với IR64 cho đến khi thu hoạch quần thể BC3F1, rồi sau đó cho chúng tự thụ bình thường

Áp dụng MAS (Chỉ thị phân tử Assisted Selection) đối với 4 đoạn NST để hoàn thiện quy trình chọn lọc từ BC1F1 đến BC3F2. Tất cả con lai của BC3F2

người ta kết luận rằng có sự thể hiện về di truyền từ thế hệ trước sang thế hệ sau trong quá trình du nhập gen (introgression) (Shen và ctv, 1999)[66] Điều tra cơ bản phần còn lại của bộ gen cho thấy những cây của BC3F2 có một phần nhỏ của những alen thuộc Azucena định vị trên những vùng không phải mục tiêu, gần với giá trị lý thuyết khoảng 3% Người ta thực hiện nhiều cặp lai giữa các cây BC3F2 mang những đoạn mục tiêu của vật liệu cho gen điều khiển rễ lúa phát triển tốt, để loại trừ ảnh hưởng di truyền theo kiểu “genetic drag” và ảnh hưởng các QTL mục tiêu khác nhau chồng lấp theo hình tháp (Shen và ctv, 1999)[66]

Bảng 2.2: Các dòng đơn bội kép (DH) được chọn lọc để lai hồi giao (Shen và

Chỉ thị phân

tử

Độ dài của quảng (cM)

Nhiễm thể

Chỉ thị phân tử

RM234-RZ978-CD038-RG351-RM248

CD0418-42.4 2 W1-RG331

RZ228-RZ12-RM201-RG667

RM242-30.8 7

Est9-RG351

trạng thể (interval) chỉ thị phân tử QTL QTL score R hưởng cộng

0.0 12.0 12.0 14.0 10.0 0.0 14.0 0.0 0.0 0.0 2.0 8.0 0.0 4.0 0.0 0.0 4.0

126.3 187.9 202.2 189.9 185.9 190.2 103.0 146.8 128.4 128.4 140.1 8.0 128.4 142.1 128.4 101.3 34.0

4.7 4.6 5.1 3.1 4.7 5.6 6.3 3.4 7.4 8.1 5.5 3.4 7.0 5.3 5.7 4.2 3.6

21.4 21.1 35.2 13.3 23.0 22.9 33.4 14.8 28.8 31.2 23.0 21.5 27.7 23.4 24.4 16.8 18.4

-0.042 -0.125 -0.158 -0.003 -0.035 -3.758 -6.160 +4.565 -5.078 -0.005 -0.004 -0.035 -0.039 -0.036 -3.713 -3.561 -0.112

Ghi chú: DRW: trọng lượng rễ dài <30cm, DR/S: trọng lượng rễ dài/thân

chồi, DR/T: trọng lượng rễ dài/số chồi, MRL: chiều dài rễ tối đa, THK: độ dầy rễ, TRW: trọng lượng rễ tổng số

Bên cạnh thành công của Shen cà ctv (1999)[66], tổ hợp lai của Azucane (kháng khô hạn) với Bala năm 1992 và quần thể F2 được sử dụng để phân tích QTLs cho các tính trạng đơn giản của rễ các cây trồng (Price and Tomos, 1997; Price và ctv, 1997)[57][58] Để chuẩn bị cho thí nghiệm một lượng lớn các vùng bộ gen ảnh hưởng đến chiều rộng và chiều dài rễ được xác định 102 RFLP, 34 AFLP và 6 chỉ thị phân tử vi vệ tinh được sử dụng cho mỗi bộ gen có chiều dài 1732 cM và trung bình khoảng cách giữa các chỉ thị phân tử là 12.2 cM (Adam và ctv, 2002)[12] Quần thể này dùng để nghiên cứu tính trạng rễ lúa được trồng trong nhà lưới Tổng số 170 dòng được trồng trong các bọc nylon (0.9m chiều sâu, 0.08m đường kính) dưới điều kiện khô hạn hoặc điều kiện đầy đủ nước (Price và ctv, 1999)[57] Sau 4 tuần, lấy lúa

1999)[57] Nhóm tác giả này đã tìm được 4 vùng mục tiêu định vị trên NST 2,

5, 7, 9 và 11, NST số 2 có 125 cM

Nhiễm sắc thể số 5 có 85 cM, số 7 có 80 cM, số 9 có ít hơn và 11 khoảng 85 cM

2.7.2 Bản đồ QTL đối với tính trạng điều tiết áp suất thẩm thấu

Thành tựu của công nghệ sinh học trong việc thực hiện bản đồ di truyền phân tử cho phép chúng ta xem xét những tính trạng di truyền phức tạp như tính chống chịu khô hạn và năng suất (Zhang và ctv, 1999)[91] Tại đại học Texas Tech nhóm tác giả này đã thực hiện bản đồ di truyền QTL đối với hai tính trạng quan trọng liên quan đến sự kiện chống chịu khô hạn đó là: khả năng điều tiết áp suất thẩm thấu (OA) và những tính trạng hình thái rễ lúa

Hiện nay, người ta biết rằng: nghiên cứu sinh lý học đã tìm ra 3 hợp phần chính đóng góp vào sự kiện chống chịu khô hạn của cây lúa: (1) khả năng ăn sâu của rễ xuống tầng đất phía dưới, (2) khả năng điều tiết áp suất thẩm thấu (cơ chế chống chịu), giúp cây bảo vệ sinh mô không bị tổn hại do mất nước, (3) khả năng kiểm soát sự mất nước bên ngoài khí khổng của lá

Hiện tượng điều tiết áp suất thẩm thấu (OA) là một hợp phần quan trọng sự kiện chống chịu khô hạn Khả năng OA của cây giúp nó tích lũy chất điều hòa tan một cách chủ động trong tế bào khi cây bị khô hạn Tính trạng

OA kết hợp với tính trạng năng suất ổn định trong điều kiện bị stress do khô hạn đã được quan sát ở lúa mì và cao lương nhưng hiện tượng này không được ghi nhận trên cây lúa (Zhang và ctv, 1999)[91]

Các quần thể đã được sử dụng trước đây để lập bản đồ QTL tính trạng

OA là: (1) Quần thể cận giao tái tổ hợp (RIL) của tổ hợp lai CO39/Moroberekan với 1 QTL (Lilley và ctv, 1996)[31]; (2) Quần thể đơn bội kép (DH) của tổ hợp lai CT9993/IR62266 với 4 QTL (Zhang và ctv,