Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men bia mới và cải tiến quy trình công nghệ để sản xuất một số sản phẩm bia mới chất lượng cao

Rất may mắn khi Công ty đang thực sự có nhu cầu đó thì được biết Nhà nước đã có chủ trương hỗ trợ các doanh nghiệp trong việc nghiên cứu khoa học và đổi mới công nghệ thông qua Nghị định

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CÔNG TY CỔ PHẦN BIA VÀ NGK HẠ LONG

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ ĐỔI MỚI CÔNG NGHỆ

DO DOANH NGHIỆP THỰC HIỆN THEO NGHỊ ĐỊNH 119/1999/NĐ-CP

BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CHỦNG NẤM MEN BIA MỚI VÀ CẢI TIẾN QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ ĐỂ SẢN XUẤT MỘT SỐ SẢN PHẨM BIA

MỚI CHẤT LƯỢNG CAO (MÃ SỐ ĐỀ TÀI: 04/2009)

Cơ quan chủ trì đề tài/dự án:

Công ty cổ phần Bia và nước giải khát Hạ Long Chủ nhiệm đề tài/dự án:

KS Vũ Thị Minh Châu

9188

Hạ Long - 2011

CP Bia và NGK Hạ Long quyết tâm tìm phương án nghiên cứu phát triển sản phẩm bia mới có chất lượng cao hơn, đây là một điểm quan trọng trong định hướng phát triển chung của công ty Tuy nhiên việc đổi mới công nghệ cần phải được nghiên cứu khảo sát chi tiết trong điều kiện cụ thể của Công ty để các kết quả nghiên cứu phải thực sự phù hợp

và có thể áp dụng triển khai ngay vào thực tiễn sản xuất Do vậy việc nghiên cứu này cần

sự hỗ trợ cả về mặt kỹ thuật của các nhà khoa học đúng chuyên môn và kinh phí nghiên cứu Rất may mắn khi Công ty đang thực sự có nhu cầu đó thì được biết Nhà nước đã có chủ trương hỗ trợ các doanh nghiệp trong việc nghiên cứu khoa học và đổi mới công nghệ thông qua Nghị định 119/1999/NĐ-CP ngày 18/09/1999 của Chính phủ về một số chính sách và cơ chế tài chính khuyến khích các doanh nghiệp đầu tư vào hoạt động khoa học

và công nghệ, do vậy Công ty CP Bia và NGK Hạ Long phối hợp với Viện Công nghiệp Thực phẩm là đơn vị có đủ năng lực chuyên môn hỗ trợ cho Công ty về mặt khoa học công nghệ để xây dựng đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men bia mới

và cải tiến quy trình công nghệ để sản xuất một số sản phẩm bia mới chất lượng cao” với mong muốn là nhanh chóng tạo ra được các sản phẩm bia mới có chất lượng cao hơn sản phẩm hiện có để có thể sản xuất đưa vào thị trường một sản phẩm mới đáp ứng nhu cầu người tiêu dùng khi mà đòi hỏi về chất lượng sản phẩm ngày càng nâng cao

Chất lượng bia chịu ảnh hưởng rất lớn của từng bước trong quy trình công nghệ trong đó những ảnh hưởng sâu sắc nhất là chủng giống nấm men dùng cho lên men bia,

ảnh hướng của thành phần dịch đường do công thức nguyên liệu và quy trình nấu quyết định, ảnh hưởng của quá trình lên men và tàng trữ Thực tế sản xuất bia tại Việt Nam có những đặc thù riêng do tỷ lệ nguyên liệu thay thế sử dụng thường cao, thời gian lên men

và tàng trữ ngắn Do vậy để nâng cao chất lượng bia thì chúng tôi tập trung vào việc lựa chọn được chủng nấm men bia mới có các đặc tính công nghệ phù hợp, xác lập được công thức nguyên liệu và quy trình nấu phù hợp với sản phẩm bia mới, xác định được các điều kiện phù hợp nhất cho quá trình lên men và tàng trữ, đây là yếu tố ảnh hưởng nhiều nhất đến chất lượng bia do vậy để xây dựng được quy trình công nghệ sản xuất sản phẩm bia mới thì nhất thiết phải xác lập được các thông số công nghệ này

Để giải quyết được vấn đề đặt ra trong đề tài thì một số nội dung nghiên cứu chính sau đã được thực hiện:

- Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm men bia mới phù hợp cho sản xuất bia chất lượng cao

- Xác định công thức nguyên liệu và quy trình nấu phù hợp cho sản xuất bia chất lượng cao

- Xác định các điều kiện phù hợp nhất cho quá trình lên men và tàng trữ cho chất lượng bia tốt nhất

- Xây dưựng quy trình công nghệ sản xuất sản phẩm bia mới và ứng dụng vào thực tiễn sản xuất để tạo ra sản phẩm mới tại Công ty cổ phần Bia và nước giải khát Hạ Long

I TỔNG QUAN 1.1 Nấm men dùng trong sản xuất bia

1.1.1 Các đặc tính cơ bản của nấm men bia

Nấm men là một cá thể sống đơn bào có cấu tạo tương đối phức tạp Để hiểu rõ nấm men bia dùng trong nghiên cứu, ta xem xét một số đặc tính chính của nấm men thuộc loài tế bào có nhân chuẩn (Eucaryote) và không có khả năng quang hợp So với vi khuẩn chúng có kích thước lớn hơn gấp nhiều lần và trung bình nấm men bia 7- 10 µm Nấm men rất có ích cho con người và chúng được sử dụng rộng rãi trong trong công nghệ sản xuất bia, rượu vang, rượi cồn và các hoạt chất sinh học khác Tuy nhiên, nấm men cũng

là nguyên nhân gây hư hỏng thực phẩm, nước giải khát.Song bên cạnh đó có một số loài nấm men, chúng có vai trò quan trọng trong lĩnh vực y học Hiện nay có khoảng 700 loài nấm men được phát hiện, nhưng chỉ có một số loài trong đó được xác định tính chất

Mặc dù có rất nhiều khái niệm khác nhau về nấm men cùng tồn tại, nhưng định nghĩa “nấm men là loại nấm đơn bào thuộc loài vi sinh vật có nhân điển hình (Eucaryote), sinh sản bằng phương thức nảy chồi là chủ yếu” được mọi người xem là có tính thuyết phục nhất hiện nay

Nấm men thuộc nhóm vi sinh vật quan trọng được sử dụng rộng rãi với số lượng lớn phục vụ các mục đích kinh tế và thương mại Theo ước tính thì tổng sản lượng nấm men được sản xuất hàng năm gần một triệu tấn, kể cả lượng sinh khối tạo thành trong quá trình sản xuất bia , rượu và các sản phẩm chưng cất khác Một số nhà vi sinh vật học và công nghệ lên men đã sử dụng thuật ngữ “nấm men” có khả năng lên men rượu thuộc chi

Sacharomyces và loài S cerevisiae Mặc dù các giống nấm men này có vai trò quan trọng

trong lĩnh vực kinh tế, hoá sinh và đã thu hút được phần lớn sự quan tâm của các nhà nghiên cứu khoa học đi thế nào đi chăng nữa thì hiện nay đã xuất hiện nhiều giống nấm men lai tạo có những tính chất tốt hơn cho các nghiên cứu thực nghiệm Chính vì thế mà,

nấm men thuộc chi Sacharomyces được biết đến như một quần thể tế bào sống được con

người sử dụng và lưu truyền từ cổ xưa nhất Thật vậy, quá trình phất triển của ngành sản xuất rượu, bia, bánh mỳ đã gắn liền với hoạt động cuả nấm men này một cách ngẫu nhiên

từ thời tiền sử xa xưa Nhiều loài Saccharomyces đã được thừa nhận là an toàn và được sử

dụng trong quá trình trao đổi chất để tạo ra hai loại sản phẩm chính là rượu etylic và khí

CO2

Nấm men là loài vi sinh vật có khả năng sử dụng nhiều loại hydratcacbon và đường khác nhau.Tuy thế , hiện nay trong số các loài nấm men đã phân lập được từ môi trường tự nhiên vẫn chưa có loài nấm men nào được chứng minh là có khả năng hấp thụ

được tất cả các loại đường Loài nấm men S.cerevisiae có thể hấp thụ một số loại đường

như : glucoza, fructoza, mannoza, galactoza, sacaroza, maltoza, maltotrioza và một phần rafinoza ; ngoài ra nó còn có khả năng sử dụng các dextrin phân tử thấp và melibioza

Nấm men bia là loài hô hấp hiếu khí tuỳ tiện, nghĩa là chúng có thể phát triển khi trong môi trường có dư hoặc thiếu oxy Sự tạo thành rượu etylic theo cơ chế Emdeen-Mayerhof-Partnas (quá trình đường phân Glycolitic), theo cơ chế này thì 1gam glucoza sẽ tạo thành 0,51 gam rượu etylic và 0,49 gam CO2 Nhưng thực tế , do một phần nhỏ glucoza đã được tiêu thụ cho sự sinh trưởng của tế bào (để tạo sinh khối ) nên 1 gam glucoza chỉ tạo ra 0,46 gam rượu etylic và 0,44 gam CO2 Quá trình đường phân Glycolytic hoạt động bằng cách chuyển hoá glucoza thành axit pyruvic và năng lượng dưới dạng hợp chất cao phân tử NADH+ ( Glucoza + 2 ADP +2Pi+2NAD+ + 2H+ -> 2Pyruvat +2ATP +2NADH+ +2H+ ) Đây là phản ứng sinh nhiệt mà phần lớn năng lượng sinh ra từ các phản ứng sinh hoá trong mỗi giai đoạn của quá trình đều bị hấp thụ bởi nấm men và dự trữ dưới dạng ATP để sử dụng cho các phản ứng sinh tổng hợp sau này Hầu hết các chủng nấm men đều mẫn cảm với môi trường có độ axit cao, vì thế mà trong quá trình tiến hoá tự bản thân chúng đã hình thành cơ chế giải độc axit bằng cách chuyển hoá axit pyruvic thành rượu etylic và CO2 và tiếp theo hai chất này lại được bài tiết ra khỏi tế bào nấm men, và kết quả của chuỗi phản ứng này là NADH được tạo thành trong quá trình Glycolytic lại bị oxyhoá thành NAD+, và chất này sau đó lại xuất hiện trong quá trình chuyển hoá glucoza tiếp theo Bằng cách này mà nấm men có thể liên tục phát triển

và chuyển hoá đường và phản ứng tạo etylic có thể được viết như sau:

(dehydrozenaza) (Alcoholdehydrozenaza)

CH3COCOOH – - -> CO2 + CH3CHO -> C2H5OH

Nấm men thuộc các loài khác nhau thường có hình dạng không giống nhau Trong cùng một loài, tế bào cũng thay đổi tuỳ thuộc vào điều kiện nuôi cấy và tuổi của nó Trong môi trường đặc hiệu thì nấm men có hình thái rất ổn định Đa số nấm men thường

có hình ovan, hình bầu dục (Saccharomyces cerevisiae ), hình cầu ( Torulopsis utilis)

Ngoài ra nấm men còn tồn tại dưới nhiều hình dạng khác: hình tam giác, hình ống dài, hình bình

Một số loài nấm men có tế bào nối tiếp nhau thành dạng sợi gọi là khuẩn ty (Mycelium), hoặc khuẩn ty giả (Pseudomycelium) Ở khuẩn ty giả tế bào không nối liền với nhau một cách chặt chẽ như ở khuẩn ty Khuẩn ty và khuẩn ty giả thường có ở các

giống Endomyce, Endomycopsis, Candida Nhiều loài nấm men chỉ tạo nên khuẩn ty giả

khi sống trong môi trường thiếu oxy

Kích thước của tế bào nấm men thay đổi rất nhiều tuỳ thuộc vào các loài khác nhau Một số chủng nấm men đơn bào được sử dụng nhiều trong công nghiệp thực phẩm thường có kích thước vào khoảng 3 ÷ 5 x 5 ÷ 10 µm (tỷ lệ dài : rộng = 1 : 2 ) 1.1.2

Dinh dưỡng nấm men

Nấm men bia có nhu cầu sử dụng (đồng hoá) các nguồn cacbon, nitơ, các vitamin thiết yếu, các nguyên tố vi lượng và một lượng nhỏ oxy Các yếu tố này được cung cấp dưới dạng các loại đường có thể lên men được (chủ yếu là maltoza), các aminoaxit, các loại vitamin B từ malt, các nguyên tố vi lượng từ malt và nước sản xuất bia (chủ yếu là các ion Ca, mg, Zn, SO4, PO4) Oxy phân tử được cung cấp trực tiếp bởi quá trình lên men bia ngay từ giai đoạn đầu của quá trìng lên men Đôí với một số nhà máy bia thường bổ sung vào dịch đường hoá malt dịch chiết nấm men (cung cấp các vitamin), (NH4)2PO4 và ZnSO4 Trong môi trường dịch đường hoá malt, nấm men sử dụng các chất dinh dưỡng để cung cấp nằng lượng (ATP) và tạo thành cồn và CO2 Năng lượng nay sẽ chuyển thành dạng khử (nicotinamide adenin dinucleotide phosphat, NADPH) cho quá trình tổng hợp các chất mới cho nấm men Các chất dinh dưỡng được đồng hoá trực tiếp để tạo thành các hợp chất mới cho tế bào nấm men và thường tạo thành các hợp chất trung gian cho quá trình này Sự tạo thành và sử dụng năng lượng có liên quan tới nhau mật thiết Hơn nữa chúng sẽ dẫn đến sự tổng hợp và tiết vào dịch lên men một số lượng lớn các sản phẩm trao đổi chất phụ, rất nhiều trong số này tạo ra hương vị đặc trưng cho bia

Trong quá trình sinh sản và phát triển, nấm men đòi hỏi được cung cấp nguồn dinh dưỡng khá phong phú như nitơ, cacbon, vitamin và các chất khoáng để xây dựng tế bào Môi trường đầy đủ chất dinh dưỡng là một trong những yếu tố thuận lợi giúp cho nấm men giữ được độ thuần khiết ổn định cao, giảm khả năng thoái hoá và đột biến, đồng thời nâng cao chất lượng sản phẩm

1.1.2.1.Nguồn Nitơ

Nấm men có thể sử dụng nguồn nitơ vô cơ như (NH4)2SO4 , urê và nitơ hữu cơ Trong dịch malt nitơ là nguồn dinh dưỡng quan trọng không thể thiếu được trong hoạt đống sống của tế bào nấm men Dịch đường chứa từ 65 ÷ 100 mg nitơ trong 100 ml Khoảng 30% trong số đó là các nitơ axit amin, khoảng 20% là các protein phân tử cao, 40% là các polypeptid, 10% còn lại là purin và các hợp chất chứa nitơ khác Do hoạt tính proteaza ở nấm men rất thấp nên các axit amin trong dịch đường hoá là nguồn nitơ chủ yếu để nấm men hấp thụ

Nấm men đồng hoá các hợp chất chứa nitơ bằng cách khử gốc amin và gốc carboxyl của α - amino tạo thành NH3 và CO2 Như vậy NH3 là đầu mối các con đường dinh dưỡng nitơ của nấm men Nấm men bia có thể tiêu thụ đến 45% toàn bộ nguồn nitơ trong dịch đường, có nghĩa là nấm men đã đồng hoá một phần di-peptid, tri-peptid trong dịch đường, mặc dù tốc độ đồng hoá có thể chậm hơn so với tốc độ đồng hoá các axit amin

Khả năng hấp thụ axit amin của các chủng nấm men là tương đương nhau Nấm men cũng có thể đồng hoá được các axit amin một cách trực tiếp Quá trình hấp thụ trực tiếp axit amin để xây dựng nên protein của nấm men có ý nghĩa rất quan trọng trong giai đoạn đầu của quá trình lên men bia

1.1.2.2 Nguồn cacbon

Nồng độ các loại đường có khả năng lên men và không lên men trong dịch nha rất khác nhau, phụ thuộc vào chất lượng của malt, tỷ lệ nguyên liệu thay thế và công nghệ nấu Lượng carbonhydrat của dịch đường hoá chiếm xấp xỉ 90 ÷ 92% lượng chất khô và trong số này có đến 80% là đường có thể lên men được, trong đó khoảng 60÷70%, glucoza và fructoza 6 ÷ 9%, saccaroza: 2 ÷ 6%

Ngoại trừ một vài trường hợp đặc biệt, nói chung nấm men không thể lên men và đồng hoá được các polysaccharit Đường có khả năng lên men được coi là nguồn cacbon

mà nấm men cần sử dụng cho quá trình sinh sản và phát triển Chẳng hạn chủng nấm men

Saccharomyces cerevisiae và Saccharomyces carlbergensis lên men đường glucoza,

fructoza, sacroza đầu tiên, sau đó là maltoza, maltotrioza Maltotetroza hoàn toàn không được lên men Một vài chủng nấm men khác có khả năng lên men isomaltoza, isomaltotrioza và panoza nhưng với tốc độ rất chậm so với các loại đường có liên kết α−1,4glucozit

Đường glucoza và fructoza được nấm men đồng hoá theo cùng một chu trình Cơ chế nấm men đồng hoá maltoza còn chưa được hiểu rõ Một số ý kiến cho rằng maltoza đi vào trong tế bào nhờ enzym permeasa xúc tác và sau đó bị thuỷ phân bởi enzym maltaza trong tế bào Quá trình lên men maltoza bị hạn chế có thể là do nồng độ enzym maltaza trong tế bào thấp Tuy nhiên ở một vài chủng nấm men bia người ta nhận thấy tốc độ lên men maltoza xảy ra vẫn chậm mặc dù lượng maltaza trong tế bào dư thừa Vì lý do đó người ta cho rằng quá trình đường hoá maltoza không phụ thuộc vào hàm lượng maltaza trong tế bào

Quá trình lên men maltotrioza được thực hiện sau maltoza Một vài chủng nấm men hoàn toàn không lên men maltotrioza Loài nấm men nổi thể hiện khả năng lên men maltotrioza yếu hơn so với nấm men chìm

1.1.2.3 Vitamin và các chất khoáng

Các loài nấm men khác nhau có nhu cầu về vitamin hết sức khác nhau Ngay trong cùng một loài, nhu cầu này cũng thay đổi rất nhiều giữa giai đoạn phát triển và giai đoạn lên men Đa số các chủng nấm men đang ở giai đoạn sinh sản đều cần inositol, canxi pantothenat, thiamin, đặc biệt là biotin

Trong môi trường tổng hợp, các chủng nấm men đang ở pha cân bằng không có nhu cầu biotin, axit pantothenic hoặc inositol Tuy nhiên đối với loài nấm men

Saccharomyces carlsbergensis, hiện tượng thiếu inositol luôn luôn ức chế cả quá trình

phát triển và quá trình lên men

Trong môi trường thiếu axit pantothenic, một vài chủng nấm men bia có khả năng tạo một khối lượng đáng kể H2S Với 0,5 mg pantothenic trong 1 lít dịch đường, không chủng nào sản sinh ra H2S Biotin không chỉ duy trì quá trình phát triển của nấm men mà còn có ảnh hưởng lớn đến tốc độ lên men

Ngoài ra còn có một số loại vitamin khác được nấm men sử dụng trong quá trình

lên men Trong thời gian lên men 7 ngày của chủng Saccharomyces carlsbergensis, hàm lượng thiamin giảm từ 0,3 mg xuống gần như bằng không, hàm lượng biotin, pyrodoxyl,

inositol giảm một cách đáng kể, trong khi hàm lượng riboflavin hầu như không thay đổi Nhu cầu về vitamin của nấm men còn phụ thuộc vào nhiệt độ môi trường Ở nhiệt

độ cao, nếu thiếu biotin, quá trình phát triển của nấm men sẽ bị hạn chế Ở nhiệt độ thấp,

nấm men chỉ bị ức chế khi thiếu cả biotin và inositol, thiếu thiamin và pyridoxyl chỉ gây

ức chế một phần

Nấm men thu nhận photphat từ môi trường dịch đường và tích luỹ dưới dạng các hạt volutin Sự phát triển của nấm men đi đôi với quá trình tích luỹ photphat và đạt đến 60

µg ở thời điểm cao nhất

1.1.3 Bảo quản nấm men

Sự ảnh hưởng của điều kiện bảo quản và thời gian tái sử dụng men sữa đến chất

lượng bia là điều mà rất nhiều nhà sản xuất đặc biệt quan tâm

Trong quá trình sản xuất bia, hiệu suất lên men, đặc tính và chất lượng bia thành phẩm liên quan chặt chẽ với tình trạnh sinh lý nấm men Điều kiện sinh lý của nấm men ảnh hưởng đến hàm lượng este, rượu bậc cao, aldehyt và diaxetyl thông qua quá trình lên men, tàng trữ và góp phần tạo nên tính chất cảm quan của bia thanh phẩm Để đánh giá tình trạng sinh lý của nấm men trong quá trình lên men bia, người ta thường căn cứ vào hai chỉ tiêu quan trọng nhất là khả năng sống của nấm men và hàm lượng glycogen tron tế bào Ngoài ra, chỉ số axit hoá (AP) thể hiện khả năng chuyển hoá glucoza nội bào của nấm men cũng là chỉ số quan trọng khi xem xét chát lượng nấm men bia Nấm men có tỷ

lệ tế bào sống cao, hàm lượng glycogen lớn và chỉ số AP cao là nấm men có tình trạng sinh lý tốt Ngược lại, khi hàm lượng glycogen trong tế bào thấp, tỷ lệ tế bào chất cao và chỉ số AP thấp là nấm me trong tình trạng sinh lý kém Trong quá trình lên men, tình trạng sinh lý của nấm men bị thay đổi qua từng thế hệ và nó phụ thuộc vào điều kiện và quá trình xử lý nấm men và thời gian bảo quản nấm men trong quá trình sản xuất

Trong quá trình bảo quản nấm men để sử dụng cho tái sản xuất, thì nhiệt độ và thời gian bảo quản là hai yếu tố có ảnh hưởng đặc biệt quan trọng đến đặc tính sinh lý và khả năng lên men của nấm men

1.1.4 Các sản phẩm trao đổi chất của nấm men trong quá tình lên men bia

Các quá trình trao đổi chất là một loạt các chu trình hoá sinh Tuy nhiên, sự tiếp nối của các chu trình này lại rất quan trọng Một vài các chu trình được tách từ những chu trình khác Một chu trình hóa sinh được biết đến là một loạt các phản ứng, mỗi phản ứng trung gian được xúc tác bởi một enzym mà qua đó sản phẩm của phản ứng này là cơ chất của phản ứng sau Những chu trình này có mục đích chủ yếu là tạo ra năng lượng bởi sự oxy hoá hoá học của các cơ chất Quá trình oxy hoá thường được thực hiện bởi sự chuyển một ion H+ thành một đồng nhân tố enzym (NAD+ nicotinamide adenin dinucleotide) Vì

vậy NAD+, dạng đã oxy hoá của đồng nhân tố, được tạo thành NADH, dạng khử Các phản ứng oxy hoá khử này được thực hiện bởi các enzym dehydrogenaza Quá trình này giải phóng ra năng lượng (một mẫu không có enzym được gia nhiệt mà lượng nhiệt này đạt được bởi sự đốt cháy các loại dầu hoá thạch) Trong quá trình trao đổi chất, quá trình oxy hoá được kiểm soát chặt chẽ vì một vài loại năng lượng giải phóng ra được giữ bởi tế bào ở dạng ATP (Adenin triphosphat) Phản ứng:

ADP + Phosphat vô cơ (P) → ATP

Tiêu thụ năng lượng được điều khiển bởi các hợp chất cao năng được hình thành trong suốt quá trình trao đổi chất

Phản ứng chuyển đổi(sự thuỷ phân ATP) giải phóng ra năng lượng mà năng lượng này có thể sử dụng để tổng hợp ra các sản phẩm mới

Các phản ứng chuyển đổi năng lượng thường không bao giờ đạt hiệu quả 100%, năng lượng thừa (ở dạng nhiệt) luôn mất đi Đây là nguồn nhiệt tạo ra trong suốt quá trình lên men dịch đường Ở dịch đường, lượng nhiệt dư thừa được tạo ra chủ yếu đủ để làm tăng nhiệt độ của thiết bị lên men được cách nhiệt lên khoảng 170C Một thiết bị lên men bia thường không cách nhiệt hoàn toàn, do vậy mà nhiệt dư thừa bởi quá trình trao đổi chất cần được làm mát nếu quá trình lên men được kiểm soát Ở thiết bị lên men lớn hơn thì bề mặt của nó nhỏ hơn so với thể tích mà nó chứa Do vậy mà các thiết bị lên men lớn hơn cần có các hệ thống làm mát hiệu qủa hơn so với các thiết bị lên men nhỏ

Các chu trình dị hoá được thực hiện để sản sinh ra năng lượng và tạo ra các hợp chất trung gian cho các quá trình tổng hợp sinh học Các chu trình đồng hoá sử dụng năng

lượng dạng khử Sự kết nối hai chu trình này gọi là các phản ứng thoái biến hoàn toàn

Các sản phẩm trung gian tổng hợp sinh học chủ yếu một vài chu trình (ví dụ chu trình đường phân) có các quy luật quan trọng và cung cấp cả hai chức năng này được gọi là lưỡng thể

Các sản phẩm trao đổi chất là những sản phẩm bài tiết chủ yếu của nấm men trong khi lên men nước dịch đường hoá, cồn etylic ít có ảnh hưởng lên hương bia thành phẩm Chủng loại và nồng độ nhiều sản phẩm bài tiết khác do nấm men tạo ra trong lên men nước dịch đường hoá đứng ở vị trí đầu tiên trong việc xác định hương của bia thành phẩm

Sự hình thành nên những sản phẩm này phụ thuộc vào sự cân bằng trao đổi chất tổng thể của dịch men, và có nhiều yếu tố làm thay đổi nó và ảnh hưởng tới hương bia Những yếu

tố đó là: chủng nấm men, nhiệt độ lên men, loại và mức độ các chất thay thế, thiết kế

thùng lên men, pH nước dịch đường hoá, khả năng đệm của nước dịch đường hoá, tỉ trọng nước dịch đường hoá v.v

Một số hợp chất bay hơi cực kì quan trọng và tham gia tích cực vào sự hình thành nên hương bia, ngược lại một số khác lại quan trọng về phương diện tạo hương vị nền Người ta tìm thấy trong bia các nhóm chất sau: Amin và axit hữu cơ, este, cacbonyl, hợp chất sunphua, amin, phenol và một số hợp chất hỗn hợp khác

1.1.4.1 Axit béo và axit hữu cơ

Trong bia có 110 axit, cả axit hữu cơ lẫn axit béo mạch ngắn và trung bình Các axit hữu cơ có tác dụng làm cho pH môi trường giảm trong lúc lên men và nhiều axit có vai trò tích cực trong việc tạo nên hương bia Một phần các axit này sẵn có trong malt và các nguyên liệu thay thế malt, nhưng một phần khác thì sinh ra và tăng lên trong lên men nhờ kết quả của quá trình trao đổi chất của nấm men

Các axit hữu cơ được tạo nên trong quá trình trao đổi chất là: pyruvat, succinat, xitrat và axetat Người ta dự đoán rằng phần lớn các axit này tăng lên là do chu trình tricacboxylic hoạt động không hoàn chỉnh dưới điều kiện yếm khí Người ta đã quan sát thấy pyruvat được bài tiết vào môi trường trong pha lên men tích cực đầu tiên và đến giai đoạn sau, khi mà nấm men đã ngừng sinh trưởng thì pyruvat lại bị tiêu hao và xuất hiện

sự tích luỹ axetat Do đó, trong điều kiện có nhiều sản phẩm glycolytic tạo ra thì sự tiêu hao pyruvat sẽ xác định tốc độ của con đường Các axit béo mạch trung bình ( C6 - C10 ) tăng lên là do tác dụng của enzim tổng hợp axit béo lên sự hình thành các axit béo mạch dài hơn vốn đã được kể đến trong các nhóm khác nhau của lipid nấm men Ngoài ra một

số lại bắt nguồn từ sự đồng hoá và trao đổi chất tiếp theo của các lipid trong nước dịch đường hoá Một số axit béo mạch trung bình và dài có thể liên quan tới vấn đề mất khả năng sống và sự tự phân của tế bào nấm men xảy ra vào lúc tàng trữ sản phẩm

Nồng độ các axit béo hình thành là kết quả của quá trình trao đổi chất nấm men Quá trình này tỉ lệ nghịch với tốc độ lên men Do đó các thông số như nhiệt độ, tỉ lệ giống

có tác dụng làm tăng tốc độ lên men lại làm giảm sự tích luỹ các axit béo Tuy nhiên, như

đã trao đổi trước đây, tuy nồng độ oxy tăng đã làm tăng tốc độ sinh trưởng nấm men nhưng vẫn làm tăng sự tổng hợp các lipid ở màng tế bào Điều đó làm cạn kiệt kho axetyl- CoA cần cho việc tổng hợp các axit béo mạch trung Hàm lượng nitơ rất quan trọng vì các axit như isocaproic và isovaleric có thể được bài tiết ra như là các sản phẩm trung gian của quá trình hình thành các axit amin leucin và valin

1.1.4.2.Rượu bậc cao hay dầu Fusel

Hai con đường tạo ra rượu bậc cao: Trong thuật ngữ hương thơm, cồn bậc cao

(còn gọi là dầu fusel ) xuất hiện trong bia và nhiều đồ uống giầu cồn khác là n-propanol, isobutanol, 2-metyl-1-butanol và 3-metyl-1-butanol Ngoài ra còn có hơn 40 loại cồn khác được phát hiện Quy luật tổng hợp cồn bậc cao khá phức tạp bởi vì chúng có thể được tạo nên từ quá trình trao đổi chất axit amin hoặc từ pyruvat sinh ra trong trao đổi chất hyđratcacbon

Con đường dị hoá (là quá trình sinh hóa trong đó các hợp chất hữu cơ bị phân huỷ,

thường là quá trình giải phóng năng lượng ), trong đó keto-axit sinh ra nhờ chuyển amin

sẽ bị loại CO2 và tạo ra andehyd rồi bị khử tiếp thành rượu nhờ sự xúc tác của enzim NAD-dehydrogenaza Theo cách này các loại rượu sau đây cũng được hình thành:

Isobutanol từ valin

3- metyl-1-butanol từ leucin

2-metyl-1-butanol từ iso leucin

Con đường đồng hoá (là quá trình sinh hóa bao gồm việc tổng hợp các hợp chất

hữu cơ, thường là quá trình tiêu hao năng lượng ) sử dụng cùng con đường tổng hợp các axit amin Tương tự như ở con đường dị hoá, chất trao đổi trung gian keto-axit bị loại

CO2 biến thành andehyd rồi bị khử tiếp thành rượu

Hai con đường nói trên đã tạo ra các loại rượu bậc cao đặc trưng Vì không có axit amin tương ứng nên dị hoá được coi là con đường duy nhất có thể tạo ra n-propanol Nói chung con đường dị hoá cơ bản diễn ra trong giai đoạn đầu của pha sinh trưởng khi mà hàm lượng axit amin ngoại bào còn nhiều Trong giai đoạn sau khi mà nước mu trở nên nghèo nitơ có thể đồng hoá được, con đường dị hoá là con đường chủ yếu tạo ra các rượu bậc cao

Tổng nồng độ cồn bậc cao tạo nên trong khi lên men tỷ lệ thuận với mức độ sinh trưởng của nấm men Do vậy, những điều kiện kích thích sinh trưởng như tăng nồng độ oxy sẽ làm tăng sản sinh cồn bậc cao Tương tự như vậy, bổ sung axit amin cho nước mu

để tăng sinh trưởng nấm men làm tăng việc tích luỹ cồn bậc cao Trong trường hợp này, bản chất các axit amin trong nước mu sẽ được phản ánh trong thành phần cồn bậc cao của bia thành phẩm Lên men dưới áp suất có tác dụng hạn chế sự thải CO2 làm ức chế sự sinh

sản của nấm men sẽ làm giảm mức độ tạo thành các loại rượu bậc cao

Mối quan hệ giữa đồng hoá axit amin và cồn bậc cao:

Cơ chế Ehrlich: Ehrlich (1906-1912) đã thực hiện những bước quan trọng đầu tiên

để giải quyết vấn đề trao đổi chất nitơ của nấm men Ông chỉ ra rằng nấm men sinh trưởng dựa trên axit amin nào đó sẽ tạo ra rượu bậc cao đặc trưng và biểu diễn quá trình

có thể biểu diễn như sau:

α-(CH3)2CHCH2CHNH2COOH + H2O (CH3)2CHCH2CHOHCOOH + NH3

L- Lơxin Axit α-hydroxyisocaproic

- CO2 (CH3)2CHCH2 - CH2OH

Isoamylalcohol

Các công trình nghiên cứu khác về cơ chế Ehrlich

Sau Ehrlich nhiều tác giả đã tiến hành nhiều thí nghiệm nhằm kiểm nghiệm lại cơ chế mà ehrlich đã nêu ra Họ đã khám phá ra nhiều điều khá thú vị Dưới đây là một vài trong các nghiên cứu đã nói

Đã tìm thấy dấu vết của sản phẩm trung gian của quá trình biến đổi phenylglycin thành benzylacohol là axit phenylglyoxilic nhờ nấm men :

CHNH2COOH COCOOH CH2OH

Phenylglycin Axit phenylglyoxilic Benzylalcohol

Do vậy họ đề xuất trật tự phản ứng như sau:

R.CHNH2 - COOH + O R.CO- COOH + NH3

R.CO - COOH R.CHO + CO2

R.CHO + 2H R.CH2OH

Họ không thấy xuất hiện sản phẩm trung gian các axit α-hydroxyl Điều này khẳng định việc khử amin của các axit amin không theo con đường thuỷ phân như Ehrlich đã đề xuất

Đã khám phá ra enzim caboxylaza và cho rằng enzim này đã xúc tác phản ứng loại

CO2 của các axit-keto mà ngày nay chúng ta đã biết khá tường tận

Họ cho rằng trong lúc sinh trưởng trên môi trường chứa các axit amin, nấm men

khử amin của các axit này, sử dụng NH3 tự do cho sinh trưởng và để lại gốc cacbon, gốc cacbon bị loại CO2, rồi bị khử tiếp thành cồn bậc cao

Trước hết Thorne (1937) dùng nấm men nổi S.cerevisiae lên men trong môi trường

tổng hợp dưới điều kiện gần với điều kiện lên men bia hơn là điều kiện mà Ehrlich đã sử dụng và dùng từng loại axit amin như tyrosin, tryptophan, phenylalanin hoặc valin làm nguồn cung cấp nitơ cho nấm men, tách được rượu bậc cao tương ứng tyrosol, tryptophan, β-phennylethanol, isobutanol với hiệu suất 80%, 78%, 67% và 60% so với lý thuyết Tác giả cũng tiến hành thí nghiệm với cặp axit amin (glutamic và arginin) và nhận thấy sản phẩm cuối cùng không phải cồn bậc cao tương ứng theo cơ chế Ehrlich mà là axit sucinic Lượng axit này sinh ra từ axit glutamic xấp xỉ bằng giá trị lý thuyết Ở đây Thorne cho rằng hai bước phản ứng đầu tiên ( tạo ra axit α-oxo-glutamic và khử CO2 của axit này tạo nên γ-aldehid-butyric diễn ra như đã đã biết Aldehid sinh ra liền bị khử thành axit succinic mà đáng ra theo Ehrlich phải thành axit γ-hydroxy-butyric

CH2.CNH2.COOH CH2.CO.COOH

Axit glutamic axit α-xeto-glutamic

CH2.CHO CH2.COOH

CH2.COOH CH2.COOH (Axit γ - aldehid-butyric) axit sucinic Đối với arginin phản ứng diễn ra cũng không theo cơ chế Ehrlich Trong đó xuất hiện hai sản phẩm cuối cùng là axit succinic và γ-butylen glycol với hiệu suất chuyển hoá tương ứng 60% và 19% Để giải thích hiện tượng này Thorne đề xuất các con đường sau:

Sau thí nghiệm của Thorne, ít ai nghiên cứu tiếp sự trao đổi chất argine ở nấm men Nhưng dưới ánh sáng của một số công trình nghiên cứu gần đây thì dường như axit succinic đã có thể tăng lên do axit glutamic, một axit thường hình thành từ arginin trong nhiều hệ thống sinh học

Sau Erhlich rất ít tác giả tiến hành nghiên cứu cơ chế trao đổi chất arginin.Nhưng dưới ánh sáng của một số công tình nghiên cứu mới đây, hình như axit succinic đã tăng lên từ axit glutamic, một loại axit thường sinh ra trong trao đổi chất arginin ở nhiều hệ thống sinh hoá Thực ra con đường phân giải arginin không có enzim arginaza như sơ đồ của Thorne, mà hơn thế arginin đã bị chuyển hoá thành ornithin nhờ enzim arginin deiminaza vốn có ở nấm men (Roche và Lacombe, 1952; Korzenovsky, 1955);

NH 2

NH 2 Urê ornithin

NH 2 (CH 2 ) 3 CHNH 2 COOH CH 2 OH CH 2 CH 2 CH 2 OH + CH 2 = COOH

Ornithin γ - butylen glycol axit succinic

CH 2 - COOH

NH.(CH2)3 CH NH2 COOH + 2H2O

Arginin

NH2 (CH2)3 CHNH2 COOH + CO2 + 2NH3

ornithin

Họ đã tiến hành một số thí nghiệm với chủng nấm men bánh mỳ S.cerevisiae trong

điều kiện phòng thí nghiệm khác với điều kiện lên men ở nhà máy bia và phát hiện ra một

số điều có thể tóm tắt như sau:

1 Dung dịch nấm men đã rửa tạo ra tyrosol từ L-tyrosin dưới điều kiện yếm khí Trong đó phải có mặt glucoza, có lẽ là để cung cấp năng lượng cho sự chuyển dịch tyrosin vào trong tế bào;

2 Chất chiết tế bào nấm men tạo nên glutamat, p-hydroxy-phenyl-axetaldehyd (PHPA) và CO2 từ 2-oxoglutarat và tyrosin dưới xúc tác của pyridoxalphosphat Điều này chứng tỏ trong quá trình biến đổi tyrosin thành tyrosol có vấn đề chuyển amin;

3 Chất chiết tế bào nấm men khử CO2 của p-hydroxy phenylpiruvat ;

4 Chất chiết tế bào khử NAD khi có mặt của PHPA

Những điều trên hoàn toàn có thể giải thích được bằng các phản ứng tổng quát nhờ xúc tác của enzim transaminaza và alcoholdehydrogenaza

Tyrosin + axit 2-oxoglutaric +NADH2 tysosol + L-glutamic + CO2 + NAD Các phản ứng riêng rẽ có thể như sau:

- CO2

C6H4 -OH + NADH2

CH2 - CHO - NAD C6H4OH

CH2-CH2

P-hydroxy P-hydroxy - phenyl

phennyl axetaldehyd ethanol (tyrosol)

Các tác giả đã tinh chế enzim tyrosin-2-oxoglutarat transferata của nấm men và chỉ

rõ enzim này cần piridoxal-phosphat như là một co-enzim với tính đặc hiệu rất cao Họ phát hiện thấy các enzim-transferaza của aspartat, leucin, isoleucin, valin, norvalin, methionin, phenyl-alamin và tyrosin trong các loại nấm men mà chất chiết của nó xúc tác việc chuyển nhóm amin từ các axit amin vừa nói sang axit 2-oxoglutaric Các phản ứng với axit aspastic, leucin, phenylalanin, tyrosin và valin được kích thích bởi pividoxal phosphat Ngoài ra dịch chiết tế bào còn xúc tác sự giải phóng CO2 khi được ủ với 2-oxoglutarat và một trong các axit amin leucin, isoleucin, valin hoặc norvalin Điều đó cho thấy các axit oxo tương ứng tạo nên từ axit amin đã bị dịch chiết khử mất CO2 Bằng chứng là các 2-oxoiso-valerat, 2-oxovalerat, 2- oxoiso caproat và 2-oxo aspartat đã nhanh chóng bị dịch chiết tế bào và enzim cacboxylaza nấm men tinh chế khử CO2 và biến thành các aldehid tương ứng Trong đó enzim cacboxylaza nấm men tinh khiết có hoạt lực yếu hơn một chút

Cuối cùng cũng đã chỉ rõ dịch chiết tế bào oxy hoá NADH2 khi có mặt của hydroxyphenylaxetaldehid, butyraldehid, isobutyr-aldehid, valeraldehid hoặc isovaleraldehyd và tinh thể enzim alcohol-dehydrogenaza cũng có các tính chất tương tự Phản ứng theo chiều ngược lại của quá trình khử NAD khi đó mặt của cồn tương ứng cũng được trình bày Các bước chuyển amin nhờ enzim transaminaza, cacboxylaza và alcoholdehydrogenaza theo cơ chế Ehrlich diễn ra đối với L-leucin diễn ra như sau:

(CH3)2- CH-CH2-CHNH2-COOH +

CH2-CH2-COOH L-leucin Axit 2-oxoglutaric

(CH3)2-CHCH2-CHO + NADH2 (CH3)2-CHCH2-CH2OH + NAD

iso valeraldehyd isopentyl alcohol

(isoamylalcohol)

Sơ đồ trên chẳng những giải thích bản chất sự tạo ra cồn bậc cao từ axit amin và sự thiếu vắng của NH3 tự do trong phản ứng Hơn thế, nó cũng thể hiện vai trò quan trọng của quá trình chuyển amin trong trao đổi chất nitơ.Thật vậy nhờ axit L-glutamic tế bào nấm men có thể tổng hợp nên nhiều axit amin khác từ các axit 2-oxo tương ứng sinh ra từ

trao đổi chất hydrat cacbon Khả năng này rất quan trọng đối với S.cerevisiae, vì chúng có

khả năng tổng hợp nên tất cả hợp chất nitơ cần thiết cho tế bào từ NH3 dùng làm nguồn nitơ duy nhất

Người ta cũng đã chú ý tới tầm quan trọng của việc chuyển amin trong trao đổi chất nitơ Họ chỉ rõ nếu nấm men bia sinh trưởng trên môi trường dùng axit L-glutamic làm nguồn nitơ duy nhất thì tiết ra khá nhiều 2-oxoglutarat tương ứng với lượng glutanic

đã hấp thụ; Tuy vậy rất ít 2-oxoglutarat được giải phóng nếu thay L-glutamic bằng các loại axit amin khác thậm chí không tiết chút nào nếu thay bằng NH3 hoặc methionin; Sự tích luỹ L-glutarnat bị ức chế mạnh mẽ khi bổ sung L-aspartat hoặc NH3 vào môi trường Những thí nghiệm này chứng tỏ tầm quan trọng của hệ thống chuyển amin glutamic-2-oxoglutarat trong trao đổi chất nấm men và 2-oxoglutarat tạo nên từ L-glutamat được dùng nhanh chóng vào phản ứng chuyển amin với các axit amin khác hoặc vào phản ứng amin hoá cùng NH3 nếu NH3 được dùng làm nguồn nitơ duy nhất

Công trình của Ayrapa

Ayrapaa có đóng góp quan trọng vào việc nghiên cứu sự hình thành cồn, trước hết

là β-phenylethanol Năm 1961, ông tách loại cồn này từ bia bằng methanol-chloroform,

tinh chế bằng sắc ký cột và xác định các tính chất của nó bằng sắc ký khí , quang phổ tử ngoại và điểm nóng chảy 3,5-dinitrobenzoate Trong bia loại rượu này có nồng độ 10-40µg/ml và thơm tương tự hoa hồng, góp phần vào sự hình thành nên hương và mùi của bia Năm 1962, Ayrapaa đã trình bày một phương pháp so màu tương đối đơn giản để xác định β-phenylethanol sau khi chiết tách từ bia, phân tách trên máy sắc ký dùng nhôm-axit silic làm pha tĩnh và diethyl ether làm pha động

Trong các thí nghiệm với S.Carlsbergensis, phát triển yếm khí trong môi trường

chứa hỗn hợp axit amin với thành phần tương tự như trong nước đường để lên men, phenylethanol cũng như các cồn bậc cao mạch thẳng đã sinh ra không những khi có mặt của các axít amin tương ứng mà ngay cả khi hàm lượng axít amin đã cạn kiệt, thậm chí cả khi sử dụng NH3 làm nguồn đạm duy nhất (Ayrapaa ,1963 ) Số lượng tạo thành chủ yếu phụ thuộc vào tỷ lệ nitơ có thể đồng hoá so với lượng đường có trong môi trường và đạt hiệu suất cao khi nồng độ nitơ môi trường là 124 µg/ml ; Nếu tăng nồng độ nitơ đồng hoá lên thì sản lượng β-phenylethanol lại giảm xuống

β-Mối quan hệ trên cũng xẩy ra đối với rượu bậc cao có gốc cacbon mạch thẳng và điều này cũng đúng với trường hợp sử dụng sunfat-amon và hỗn hợp các axít amin thường có mặt trong nước đường để lên men hoặc hỗn hợp axít amin thiếu valin, leucin, isoleucin, phenylalanin hay tyrosin làm nguồn cung cấp nitơ Có điều ngạc nhiên là đối với trường hợp nguồn nitơ chỉ gồm ( NH4)2SO4 sản lượng β-phenylethanol và amylalcohol chỉ thấp hơn trường hợp môi trường có hỗn hợp axít amin khoảng 20-40% Thêm phenylalanin vào môi trường chứa hỗn hợp các axít amin làm cho sản lượng β-phenylethanol tăng lên nhưng không tỷ lệ thuận và nhiều nhất cũng chỉ có 30% phenylalanin được chuyển hoá thành β-phenylethanol mà thôi Trong cùng thời gian thêm phenylalanin đã ức chế sự tạo cồn bậc cao cacbon mạch thẳng với mức độ khác nhau Các kết quả nghiên cứu khác của Ayrapaa chỉ rõ sự tạo thành rượu bậc cao ít có quan hệ tới sự khử amin và ý kiến này trùng với ý kiến của nhiều tác giả đã cho rằng rượu bậc cao được tạo thành trong suốt quá trình lên men , thậm chí ngay ở giai đoạn đầu tiên trong lên men dịch đường trước khi các axit amin bị hấp thụ hết Điều này kết hợp với thực tế là rượu bậc cao vẫn được tạo ra trong môi trường lên men chỉ có NH3 là nguồn nitơ duy nhất cho thấy có lẽ các thành phần của rượu bậc cao phải sinh ra do khử amin

của các axit amin mà tế bào đã tổng hợp được từ kho các axit oxo hoặc trực tiếp loại CO2rồi khử các axit oxo này

Ayrapaa cho rằng sự hình thành β-phenylethanol diễn ra tương tự như sự tạo thành rượu bậc cao cácbon mạch thẳng và có quan hệ đặc biệt với mức dinh dưỡng nitơ trong môi trường, với các yếu tố chi phối việc tạo nên kho axit oxo và ngược lại Mối quan hệ

mô tả ở trên phụ thuộc vào hai yếu tố :

Thứ nhất, lượng nitơ sẵn có cho quá trình chuyển amin và amin hoá Các axit oxo

tạo nên trong hoàn cảnh thiếu nitơ sẽ bị biến đổi thành rượu tương ứng Những axit oxo này phải bắt nguồn từ sự trao đổi hydratcacbon, và chúng cũng phải là nguồn axit oxo và cồn bậc cao khi nấm men sinh trưởng trong môi trường chỉ có nguồn nitơ duy nhất là (NH4)2SO4

Thứ hai, sự ức chế ngược của các axit amin lên các phản ứng tổng hợp nên các

mạch cacbon riêng biệt của chúng Theo Ayrapaa hình dạng chung của hai đường biểu thị amylalcohol và isobutanol ở sơ đồ có lí do cơ bản là sự ức chế ngược, nhưng không đúng đối với β-phenylethanol vì có thể phenylalanin đã bị cạn kiệt

Các công trình nghiên cứu của Ayrapaa không chứng minh ảnh hưởng của sự ức chế ngược mà cũng không đóng góp gì thêm cho cơ chế tạo rượu bậc cao từ axit amin của Ehrlich Tuy nhiên nó đã chỉ rõ : mối quan hệ giữa sự hình thành cồn bậc cao và mức dinh dưỡng nitơ là giống nhau, bất kể nguồn nitơ dinh dưỡng là gì, là các axit amin hay (NH4)2SO4 ; do đó sự ức chế ngược của các axit amin bổ sung từ bên ngoài có thể chỉ đóng một vai trò thứ yếu nếu so với sự ức chế của lượng axit amin sẵn có cho việc chuyển và amin hoá

Khi dư thừa nitơ thì con đường sinh tổng hợp phát triển và khi thiếu nitơ thì con đường amin hoá các axit oxo sẽ được đẩy mạnh làm cho khả năng hình thành cồn rượu cao từ các axit oxo khác tăng lên Ngược lại nếu bổ sung thêm lượng nitơ dinh dưỡng từ bên ngoài thì sự chuyển amin có khả năng tăng lên, các axit oxo bị dùng hết và do vậy hình thành ít rượu bậc cao Chỉ khi nào các axit amin có mặt với lượng vượt quá nhu cầu của nấm men thì chúng mới bị khử amin và biến thành rượu bậc cao theo con đường Ehrlich

Trước đây Ayrapa cũng sử dụng chủng S.carlsbergesis sinh trưởng yếm khí ở 250C trong môi trường chứa hỗn hợp axit amin tương tự như có ở trong nước mu và bổ sung

14C-phenylalanin Tại mức axit amin thấp không đủ cung cấp cho sinh trưởng mạnh thì

phần lớn phenylalanin bị chuyển hoá thành phenylethanol Tuy nhiên một số phenylethanol cũng được hình thành theo con đường sinh tổng hợp Tại môi trường có nồng độ axit amin cao với lượng nitơ đồng hoá dư thừa người ta vẫn quan sát thấy có sự hình thành cồn theo con đường sinh tổng hợp, mặc dầu nó lại bị giảm trong cùng điều kiện và trong một thí nghiệm khác cho thấy việc tổng hợp bị phong toả hoàn toàn bởi nồng độ cao của phenylalanin

Ayrapaa chỉ rõ khi các axit amin có khả năng tạo ra rượu bậc cao theo cơ chế Ehrlich có mặt trong hỗn hợp cung cấp cho nấm men với lượng vừa phải thì lượng rượu bậc cao tương ứng trong hỗn hợp lên men sẽ hơi lớn hơn lượng rượu bậc cao khi thiếu các axit amin này Do đó tác giả cho rằng sự tạo rượu bậc cao theo con đường tổng hợp luôn là điều quan trọng nhất Tuy nhiên theo công trình tiếp theo với phenylalanin của tác giả thì có thể tồn tại sự ức chế cơ chế tổng hợp bởi sự có mặt với nồng độ cao các axit amin tương ứng trong môi trường Do đó tác giả đề xuất một sự thay đổi, có thể coi là giả thuyết như sau: Sự ức chế cơ chế tổng hợp có thể được bù trừ bởi sự tạo nên cùng loại cồn con đường Ehrlich Giả dụ rằng hiệu số giữa tổng lượng phenylethanol sinh ra và lượng phenylethanol tạo ra theo con đường tổng hợp là số phenylethanol tạo ra theo cơ chế Ehrlich Các thí nghiệm của Ayrapaa (1965) xác nhận rằng lượng phenylethanol tạo nên theo cơ chế Ehrlich là ít nhất tại nồng độ axit amin cao nhất ( 800µgN/ml), và nhiều nhất nằm trong khoảng nồng độ trung gian giữa 100 và 800µgN/ml Như vậy, khi cung cấp hỗn hợp các axit amin với lượng dư thừa, hình như sự chuyển amin bị giảm đáng kể Thực vậy, phần phenylalanin được chuyển hoá thành phenylethanol tỉ lệ ngược với hàm lượng nitơ tổng số của môi trường, nhưng ít phụ thuộc vào giá trị của phenylalanin tham gia vào hàm lượng nitơ tổng số

Cơ chế hình thành rượu bậc cao từ axit piruvic

Những điều trình bày ở trên chứng minh rằng cơ chế Ehrlich không phải là con đường duy nhất tạo ra rượu bậc cao nhờ nấm men Ingraham (1965 ) đã đưa ra ý kiến trên dựa vào các bằng chứng sau đây :

1 Trong lên men ở môi trường phức tạp , thành phần rượu bậc cao tạo ra không có quan hệ mật thiết với thành phần các axit amin của môi trường khi chưa lên men

2 Mặc dầu các axit amin được nấm men hấp thụ một cách nhanh chóng, nhưng tốc

độ tạo rượu bậc cao ở thời kì hấp thụ nhanh không cao hơn ở thời kì sau khi môi trường hầu như không còn axit amin

3 Một trong hai thứ rượu bậc cao nào đó xuất hiện một cách tự nhiên, ví dụ propanol và α-butanol từ α-aminobutyrat và norvalin;

4 Rượu bậc cao là sản phẩm lên men của tế bào nguyên trong môi trường không chứa axit amin và được tạo nên trong môi trường tổng hợp, môi trường dùng NH3 làm nguồn nitơ duy nhất

Do đó có dấu hiệu rõ ràng là rượu bậc cao có thể được tạo nên nhờ nấm men từ các hợp chất cacbon sinh ra theo con đường trao đổi chất cacbonhydrat, gọi là tổng hợp cồn bậc cao Những hợp chất cacbon này, ví dụ như các axit 2-xeto thường là các sản phẩm trung gian trong tổng hợp axit amin có khả năng kích thích sự chuyển amin với glutamat

Ví dụ về sự hình thành isobutanol diễn ra như sau:

acetyl-CoA

C = O C(OH)COOH CH3 C OH

Xắp xếp lại COOH COCH3 HC(OH)COOH

axit piruvic axit α-axetolactic axit 2,3-dihydroxy-isovaleric

isobutanol isobutyratdehyd axit 2- oxoisovaleric

2-oxobutyrat 2-axetichydroxybutyrat

2,3-dihydroxy-3-methylvalerat

2,3-oxo-3-methylvalerat L-isoleucin

- CO2 pentanol hoạt hoá Methylbutyraldehyd

2-oxobutyrat không chỉ là tiền chất của pentanol hoạt hoá và isoleucin mà còn bị biến đổi thành n-propanol (một loại rượu vốn không có một axit amin tương ứng nào ) nhờ loại CO2 và phản ứng khử trong theo con đường Ehrlich Tương tự, 2-oxovalerat thường được biến đổi thành L-valin và L-leucin như đã trình bày ở trên

CoA 2-oxoisovalerat 3-cacboxy-3-hydroxyisocaproat

2-hydroxy-3-cacboxyisocaproat

- CO2

- CO2 isovaleraldehyd 2-oxoisocaproat L-leucin

isopentanol

Người ta đã dùng nấm men đột biến để nghiên cứu bản chất của sự hình thành rượu bậc cao theo con đường tổng hợp đã phát hiện thấy nấm men đột biến không có khả năng tổng hợp nên một axit amin nào đó, nhưng vẫn có thể tổng hợp nên hỗn hợp các loại rượu bậc cao trừ loại rượu tương ứng với axit amin khiếm khuyết Như vậy thì các nấm men đòi hỏi isoleucin và leucin không hoặc chỉ sản sinh chút ít pentanol hoạt hoá và isopentanol Do đó dường như rượu bậc cao tạo nên nhờ nấm men không đột biến tăng lên từ sản phẩm trung gian của quá trình sinh tổng hợp nên axit amin vốn không có ở nấm men đã đột biến

Rượu bậc cao trong bia

Bia lên men nổi thường có nhiều rượu bậc cao hơn bia lên men chìm Thành phần chủ yếu của rượu bậc cao là: isopentanol, pentanol hoạt hoá và isobutanol Trong số 56 loại bia nổi đem phân tích thì 35 mẫu có hàm lượng rượu bậc cao trung bình 101 ppm (khi dùng hệ thống skimming), 98 ppm (hệ thống Bunton Union) và 62 ppm (khi dùng hệ thống Yorkshive Stone square) Phân tích liên tục các loại bia này thì thấy cồn bậc cao xê dịch trong khoảng 52-101 ppm

Môi trường bia nồng độ cao có nhiều rượu bậc cao hơn bia nồng độ thấp Cao nhất đạt tới 232 ppm Bia lên men chìm rượu bậc cao cao từ 45÷ 83ppm Hàm lượng rượu bậc cao trong bia phụ thuộc các yếu tố sau:

- Chủng loại giống nấm men

- Điều kiện lên men

- Thành phần nước mu

- Phương pháp lên men (nổi/chìm)

- Hệ thống lên men

Theo Hough và Steven đối với bia nổi

- Giai đoạn lên men đầu tiên, rượu bậc cao tăng tỷ lệ thuận nhẹ

- Giai đoạn tiếp theo tăng nhanh

- Lượng rượu bậc cao từ dịch đường 180Bx xê dịch 51-88ppm

- Rượu bậc cao tiếp tục được tạo ra ở giai đoạn lên men thứ hai, nhưng không xuất phát từ nấm men tự phân

- Khi lên men nước dịch đường hoá ở 250C, bia nổi cho nhiều rượu bậc cao hơn bia chìm Nhưng khi lên men ở 100C thì hàm lượng rượu bậc cao cả hai loại bia là ngang nhau Trong đó bia nổi bị ức chế, bia chìm có sự kích thích tăng nhẹ

1.1.4.3 Este

Kiểm soát sự hình thành este trong lên men

Este là những cấu tử thơm quan trọng tạo ra mùi thơm tương tự quả hoặc hoa cho bia, vang và rượu Khi chúng có mặt với nồng độ phù hợp là điều mong đợi nhưng nếu với nồng độ cao thì bia không thể chấp nhận được Điều này, xảy ra khi các điều kiện lên men không khống chế được Các este quan trọng có tác dụng trong cảm quan là ethyl axetat, isoamyl axetat, isobutylaxetat, 2-phenylethyl axetat và ethyl caproat Trong bia có tất cả trên 90 loại este

Ngoài chủng loại nấm men, còn nhiều yếu tố khác ảnh hưởng tới số lượng các este tạo thành trong khi lên men bia Những yếu tố đó là: Nhiệt độ lên men,phương pháp lên men, tỉ lệ giống và sự thông gió

- Nhiệt độ lên men: tăng từ 10 lên 250C, nồng độ ethyl axetat sẽ tăng từ 12,5 lên 21,5 mg/lít;

- Phương pháp lên men: lên men bán liên tục và liên tục cho nồng độ este cao hơn lên men gián đoạn;

- Tỷ lệ giống: tỷ lệ giống cao làm cho hàm lượng ethyl axetat giảm;

- Thông gió: thông gió thấp làm tăng khả năng sinh cồn bậc cao

Este tăng là kết quả của phản ứng giữa cồn (bậc thấp và bậc cao) với axit béo và acyl-CoA Enzim alcohol-acetyl transferaza xúc tác phản ứng này Thành phần acyl của các axit béo hoạt hoá có thể là axetat sinh ra từ phản ứng của piruvat-dehydrogenaza Enzim tổng hợp acyl-CoA-synthetaza có thể hoạt hoá trực tiếp axetat và các axit mạch dài hơn

Thành phần este sinh ra phụ thuộc phần lớn vào chủng loại nấm men Điều này có thể phản ánh qua sự có mặt của một loạt các alcohol axetyltransferaza với các đặc tính cơ chất khác nhau Hoạt tính tương đối của những enzim này phụ thuộc với mức độ nào đó

vào sự sẵn có của các cơ chất: tốc độ tạo và loại ethyl este sinh ra bị ảnh hưởng bởi sự có mặt của các axit béo tương ứng được tổng hợp ở trong tế bào hoặc hấp thụ trực tiếp từ nước mu Sự có mặt của các cồn bậc cao tương ứng là điều quan trọng đối với việc tổng hợp axetat este

Các yếu tố như: tỷ trọng nước mu, nồng độ oxy và nhiệt độ lên men ảnh hưởng lớn tới hàm lượng este tổng số sinh ra trong khi lên men;

- Nồng độ oxy: tăng nồng độ oxy lúc tiếp giống làm giảm đáng kể nồng độ este của bia thành phẩm Nguyên nhân là ở chỗ nồng độ oxy tăng làm cho nấm men sinh trưởng nhiều, tiêu thụ mất nhiều axetyl-CoA, do đó nồng độ chất này vốn rất cần cho sự tổng hợp este bị giảm một lượng đáng kể

- Tỷ trọng nước dịch đường hoá: Tỷ trọng nước mu tăng làm cho nồng độ este của bia thành phẩm tăng; hiện tượng này giới hạn nồng độ nước mu cao nhất có thể sử dụng Về mối quan hệ giữa tỷ trọng nước mu và mức este sinh ra có thể thấy rõ khi dùng các nguyên liệu thay thế đường trong nước mu đậm đặc Nếu tăng tỷ lệ C:N của nước mu thì

sự sinh trưởng của nấm men bị hạn chế do thiếu N, do đó C sẽ thừa để biến thành CoA và cung cấp đủ cơ chất cho việc tổng hợp este

axetyl-Ngoài ra, nếu nồng độ axit béo không no bị pha loãng thì sự tổng hợp este sẽ được kích thích vì giải toả được sự ức chế hoạt động của enzim alcohol axetyltransferaza

Xác định thực tế nồng độ este ( nhất là trong trường hợp nước mu nồng độ cao) bia sản xuất từ nước mu có tỷ lệ C:N thấp và cung cấp đầy đủ oxy, người ta thấy cả hai yếu tố này đều kích thích sự phát triển của nấm men và do đó làm giảm sự tổng hợp este Hiệu ứng này cũng có cùng các nguyên nhân như sự tích luỹ CO2 nội bào đã làm giảm pH tế bào và phá hoại chức năng enzim Thành phần ion của nước mu cũng ảnh hưởng tới sự tổng hợp este Ví dụ nếu bổ sung đều đặn Zn vào nước mu đảm bảo cho nấm men sinh trưởng nhịp nhàng thì có thể thúc đâỷ sự tổng hợp axetat este của các cồn bậc cao Hiệu ứng này có thể do Zn kích thích việc sản sinh cồn bậc cao từ các oxo axit tương ứng, do

đó làm tăng khả năng cung cấp các tiền chất cho việc tổng hợp este sau này

Các con đường trao đổi chất chủ yếu kiểm soát sự tổng hợp este trong nấm men được thể hiện ở hình Từ hình này và phản ứng biểu diễn ở dưới người ta có thể biết nấm men đã tạo ra ethyl axetat như thế nào và loại este này lại hay có trong các nước mu lên men Đó là vì ethanol là loại rượu thông thường nhất trong dịch lên men nhờ nấm men

Nó là một bộ phận cấu thành ethyl axetat

Người ta cho rằng có thể kiểm soát được sự hình thành este trong bia Nói chung, este bay hơi tổng số tăng lên theo nhiệt độ nằm ở trên vùng mà lên men bia sử dụng Do

đó việc áp dụng nhiệt độ lên men thấp hơn có xu hướng tạo ra bia có nồng độ este thấp hơn pH lên men rất ít ảnh hưởng tới hàm lượng este bay hơi, do đó nó cũng không phải là đối tượng kiểm tra

Theo Nordstrôm biện pháp di truyền khó có thể ảnh hưởng đến tỷ lệ tương đối của các este và các loại cồn tương ứng Ngược lại biện pháp chọn lọc chủng giống nấm men lại có thể làm được điều này Giữa khả năng tạo cồn bậc cao và khả năng phân huỷ axit

amin có mối quan hệ với nhau Bởi thế, chủng nấm men S cerevisiae không đồng hoá

isoleucin và valin không thể tạo được isobutanol và 2-methylbutanol (Ingraham 1961) Chủng đột biến này đã hạ thấp khả năng tạo rượu bậc cao bay hơi trong nước mu

Có lẽ các khả năng khống chế sự hình thành rượu bậc cao tập trung vào các phương pháp sau:

- Khống chế sự sinh trưởng của nấm men: Theo Nordstrôm khi nấm men bị ức chế sinh trưởng thì tạo ít este

- Khống chế việc cung cấp các axit amin: bổ sung axit amin có thể đồng hoá kích thích việc tạo este; do đó pha loãng nitơ trong nước mu bằng đường , dịch đường hoá gạo, ngô hoặc chất thay thế tinh bột khác có xu hướng tạo ra bia có nồng độ este thấp và hương vị ít đặc trưng Tuy nhiên bức tranh này hơi phức tạp Việc tạo rượu bậc cao có chiều hướng giảm khi nồng độ nitơ tăng quá mức giới hạn; Điều này hơi ngược với điều

đã trình bày ở trên Nordstrôm phát hiện thấy hàm lượng isopentanol giảm khi nồng độ axít amin tăng và isopentyl axetat ít bị ảnh hưởng bởi nồng độ nitơ có thể đồng hoá hơn

là ethyl axetat hoặc ethylcaprylat

- Khống chế các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp và sự tiêu thụ acyl-CoA vì acyl-CoA ảnh hưởng đến việc tạo este Các yếu tố đó là:

+Sự cung cấp biotin, pantothenat Nordstrôm cho rằng khống chế este bằng cách này hơi khó, bởi vì các yếu tố sinh trưởng vừa nói có quá nhiều trong nước mu, vượt xa nhu cầu của nấm men

+ Tiến hành lên men liên tục có lợi cho việc hình thành este bởi vì nồng độ cồn trong dịch tại mọi thời điểm tương đối cao

Cơ chế tạo ra tạo este chung trong quá trình lên men

Nguồn gốc của phần axít trong este

Nordstrôm bác bỏ sự hình thành este trực tiếp theo phương trình dưới đây:

R-COOH + R'OH R-CO-OR' + H2O (1)

Bởi lẽ dưới điều kiện lên men yếm khí các chất thành phần ở nồng độ cân bằng phương trình (1) trong dịch lại quá dư thừa Thực ra, phương trình (1) diễn ra rất chậm chạp tại pH và nhiệt độ lên men chính và phụ Do vậy Nordstrôm cho rằng este được tạo nên là nhờ vào các phản ứng alcoholysis của hợp chất acyl-CoA:

R CO ∼ S.CoA + R'.OH R.COOR' + CoA ∼ SH (2)

Do đó, sự tạo thành este phụ thuộc vào vấn đề cung cấp cồn và hợp chất acyl-CoA Mặt khác quá trình này cũng phụ thuộc vào nồng độ pantothenat vì nhiều loại nấm men đòi hỏi hợp chất này Tuy nhiên nước mu chứa quá nhiều chất sinh trưởng với lượng lớn hơn nhu cầu cần dùng cho sự phát triển của nấm mem, cho nên sự tạo thành este không

bị ảnh hưởng bởi nồng độ pantothenat ở trong nước mu

Phần axit của este sinh ra từ ba nguồn

- Từ axit béo hoạt hoá:

R.COOH + ATP + CoA ∼ SH R.CO∼SCoA + AMP + PP + CO2 (3)

- Từ các axit oxo bị khử CO 2 :

R.COOH + NAD + CoA ∼ SH R.CO ∼ SCoA + NADH2 + CO2 (4)

- Từ các chất trung gian trong quá trình tổng hợp axit béo:

R-CO ∼SCoA + HOOC-CH2-CO ∼ SCoA + 2NADH2

R-CH2-CH2-CO ∼ S.CoA + CoA ∼ SH + 2NAD + CO2 + H2O (5)

Trong nước mu, nồng độ các axit béo cần cho phản ứng (3) quá thấp và ít hơn nhiều so với lượng axit axetic tạo thành, cho nên phản ứng (3) coi như không quan trọng đối với việc tạo nên este bay hơi trong lên men bia Có lẽ phản ứng (4) phải chịu trách nhiệm nhiều trong việc hình thành axetyl CoA Tuy nhiên, vì axit 2-oxobutyric và các đồng đẳng cao hơn hình như không được tạo nên theo phản ứng (4) cho nên có thể ethyl este của các axit propionic, isobutyric và isovaleric cũng không được tạo nên từ valin, leucin và isoleucin, trừ phi thực sự phản ứng (4) diễn ra một cách chậm chạp tùy theo mức của các este này tích luỹ được thấp hơn mức có thể phát hiện trong bia Nordstrôm phát hiện thấy một lượng nhỏ ethyl este trong các thí nghiệm lên men của mình khi dùng môi trường khiếm khuyết và este này tồn tại trong bia

Sự tạo thành axit và ethyl este của nó trong môi trường xác định

Nồng độ sản phẩm cuối cùng (µg/ml) Gốc axit

Axetat 3700 210 Butyrat 20 1 Caproat 20 2

Caprat 0 8

Vì phần lớn các este trên và các axit béo bậc cao của lipit nấm men có cùng số nguyên tử cacbon, cho nên Nordstrôm gợi ý: một lượng nhỏ các este này và các axit tương ứng tăng lên từ sự mất mát chút ít các hợp chất acyl-CoA bậc thấp trong quá trình tổng hợp các axit béo bậc cao của nấm men, ví dụ các sản phẩm thoát ra từ phản ứng (5) Như vậy, khi cho thêm axit valeric vào môi trường thì ethylvalerat tăng theo chiều tăng của nhiệt độ, trong khi đó ethylcaprylat có thể đạt tới nồng độ tối đa tại 200C Nord strôm

lý luận : Nếu như sự hoạt hoá các axit amin tương ứng là cần cho tổng hợp các este này (phản ứng 3) thì sự tạo thành ethylcaprylat và ethylvalerat hẳn đã tuân thủ cùng một hình mẫu đối với sự biến thiên của nhiệt độ Nhưng vì điều đó không đúng nên Nordstrôm gợi

ý phản ứng (5) phải chịu trách nhiệm về sự hình thành caprylat

Sự tạo thành các este trong quá trình lên men bia

Phản ứng giữa rượu bậc một và một phân tử acyl coenzym A tạo thành một ester (Hình 2)

acetyl CoA 3 methyl butanol 3 methyl butyl acetate

Một số este được tạo thành từ rượu và coenzim A

Các nguồn phân tử acyl CoA chính là acetyl CoA ( tạo ra các acetat ester) và các

hợp chất trung gian trong quá trình tổng hợp chất beó Từ rượu chủ yếu trong nấm men là

ethanol, este phổ biến là ethyl acetat Các este cetat( ethanoate) của các rượu bậc cao

thông thường là các este ethyl của axit béo mạch dài (caproic và caprylic) Các ví dụ điển

hình được đưa ra ở bảng sau:

Một số este điển hình trong bia

Nhiều các sản phẩm hay các sản phẩm phụ khác của quá trình chuyển hoá cũng

ảnh hưởng đến hương bia Một nhóm các hợp chất quan trọng là diketone Diacetyl

(butane 2,3 dione) và hợp chất liên quan pentane 2,3 dione được tạo ra từ các sản phẩm

trao đổi chất của nấm men và được tiết vào trong bia Tiền chất của diacetyl là

α-acetolactat và tiền chất của pentane 2,3 dione α-ketobutyrat Những axit này được tạo thành như các hợp chất trung gian trong quá trình sinh tổng hợp các amino axit valin và isolexin.Trong bia các axit thường trải qua quá trình decacboxyl hoá, oxy hoá để tạo

thành diketone Cả diketone có nhiều hương và được xem như là không mong muốn trong

các loại bia tạo hương nhẹ

Diketones trong bia

Diketone Công thức Ngưỡng nhận biết

trong bia (mg/l)

Nồng độ tối đa cho hương (mg/l)

Nhiều loại và lượng sản phẩm trao đổi chất nhỏ hơn được tạo ra bởi nấm men phụ thuộc vào các chủng nấm men Đó là lý do tại sao các nhà sản xuất bia sử dụng các chủng nấm men đã được lựa chọn cho quá trình lên men Tuy nhiên cùng một chủng nấm men trong cùng dịch đường hoá hoặc các loại dịch đường hoá khác nhau trải qua các điều kiện lên men khác nhau sẽ tạo ra các sản phẩm khác nhau Điều này giải thích là tại sao các nhà sản xuất bia luôn luôn phấn đấu ổn định qui trình lên men và ổn định chất lượng các nguyên liệu để ổn định chất lượng bia

1.1.4.4 Hợp chất cacbonyl

Cho đến nay, các nhà khoa học đã tìm thấy khoảng 200 hợp chất cacbonyl khác nhau, trong thành phần của bia và các đồ uống lên men có cồn khác, chúng góp phần tạo nên hương thơm cho các sản phẩm lên men đó Các chất này được tạo ra trong quá trình trao đổi chất của nấm men khi lên men, chúng là các aldehyt và các vicinal diketon, đáng chú ý nhất là diacetyl Các hợp chất cacbonyl cũng có ý nghĩa quan trọng đối với sự ổn

định của hương bia, khi có nồng độ vượt quá mức cho phép sẽ làm suy giảm hương thơm của bia cho tới nay, ảnh hưởng của aldehyt đến sự ổn định của hương bia, tương tự như mùi cỏ do propanol, 2- methyl butanol và pentanol hay vị giấy của trans-2-nonenal, furfuran làm sáng tỏ

Axetaldehyt là aldehyt có hàm lượng lớn nhất trong số các hợp chất thuộc nhóm cacbonyl Nó được tạo ra khi decacboxyl hoá axit pyruvic và là chất trung gian của rượu etylic Aldehyt này có thể xuất hiện trong bia với nồng độ cao hơn ngưỡng cho phép của

nó (khoảng 10 mg/l), tại nồng độ này nó tạo ra hương "bơ" và " táo xanh" không mong muốn Axetaldehyt được tiích tụ trong suốt quá trình phát triển của tế bào nấm men Nồng

độ của nó giảm xuống trong pha tĩnh của quá trình phát triển và cuối quá trình lên mne Cũng giống như các loại rượu bậc cao và các este, mức độ tích tụ axetaldehyt phụ thuộc vào chủng nấm men và các điều kiện lên men Mặc dù giống nấm men là yếu tố quan trọng hàng đầu, nhưng nồng độ oxy hoà tan, tỉ lệ mne giống và nhiệt độ cũng đều là các yếu tố kích thích sự tích tụ axetaldehyt trong tế bào nấm men Hơn nữa, nấm men kết lắng quá sớm, không tái sử dụng, axetaldehyt đã được tiết ra cũng dẫn tới sự gia tăng hàm lượng của aldehyt này trong bia

Còn rất nhiều cacbonyl khác cũng góp phần quan trọng trong việc tạo hương thơm đặc trưng cho bia thành phẩm, đó là các vicinal diketon, diacetyl (2,3-butandion) và 2,3-pentandion Cả hai hợp chất này đều tạo ra hương bơ không mong muốn cho bia Trong

đó, diacetyl là thành phần quan trọng nhất vì ngưỡng cảm nhận của nó rất thấp, chỉ từ 0,1 mg/l, như vậy là thấp hơn 10 lần so với 2,3-pentandion Vicinal diketon tạo ra hương thơm đặc trưng của một số loại bia có độ rượu thấp, nhưng đối với hầu hết các loại bia có

độ rượu cao nó lại tạo ra hương vị không mong muốn và làm giảm giá trị cảm quan của bia thành phẩm Trong công tác kiểm soát các quá trình lên men và các giai đoạn sau đó, cần phải hạn chế sự tạo thành vicinal diketone này ở hàm lượng dưới ngưỡng cảm nhận của nó trong bia

Diacetyl và 2,3-pentanedion xuất hiện trong bia với vai trò là các sản phẩm trung gian trong quá trình tổng hợp axit amin valin và izolơxin Các axit α-axetohydroxyl là những chất trung gian của quá trình sinh tổng hợp này, và một phần trong số chúng được tiết vào dịch nước mạch nha lên men tạo hương thơm cho bia Tại đây, qua quá trình decacboxyl hoá tự phát, tạo ra các hợp chất vicinal diketon Quá trình chuyển hoá tiếp theo phụ thuộc vào các enzim dehydrogenaza của nấm men Diacetyl bị khử thành axetoin

và cuối cùng là 2,3-butanediol còn 2,3- pentanediol thì chuyển thành các rượu đa chức tương ứng của nó Ngưỡng tạo hương của các rượu đa chức này tương đối cao và để tạo

ra một loại bia có đặc tính cảm quan đạt yêu cầu thì cần phải đặc biệt chú ý tới những giai đoạn cuối cùng của quá trình biến đổi các hợp chất vicinal diketon

Cơ chế hình thành diaxetyl và khử hợp chất này trong các giai đoạn sau đó có liên quan trực tiếp đến sự phát triển của tế bào nấm men và nồng độ dịch nước mạch nha trong quá trình lên men nồng độ cao Hàm lượng diaxetyl tăng dần tới tận cuối pha phát triển của tế bào nấm men ở cuối quá trình lên men, khi nấm men ngừng phát triển thì quá trình khử diaxetyl có trong dịch nước mạch nha đang lên men bắt đầu diễn ra Trong khi kiểm soát quá trình lên men, thì sự cần thiết để đạt hàm lượng diaxetyl mong muốn có thể là nhân tố quyết định khi nào bia có thể chuyển sang giai đoạn lên men phụ Vì vậy, quá trình phân giải diaxetyl là một yếu tố rất quan trọng, quyết định tổng thời gian lên men trong thiết bị, và qua đó ảnh hưởng đến hiệu quả của việc sử dụng trang thiết bị và nhà xưởng

Nồng độ diaxetyl trong dịch nước mạch nha đang lên men có tác dụng điều chỉnh tốc độ tạo thành tiền chất của nó, đó là α-axetolactat, quá trình decacboxyl oxy hoá tiền chất này thành diaxetyl và khử diaxetyl thành axetoin Các phản ứng này phụ thuộc vào chủng giống nấm men, tính chất sinh lý và khả năng thích nghi với công nghệ của nấm men bia, mức độ tác động của thành phần dịch nước mạch nha đến các đặc tính này, kể cả thiết bị lên men và các điều kiện khi tiến hành lên men Các điều kiện lên men kích thích tốc độ phát triển của nấm men, khiến cho nhu cầu về pyruvat cho quá trình sinh tổng hợp axit amin tăng lên, dẫn tới sự gia tăng hàm lượng α-axetolactat Các yếu tố này bao gồm: nhiệt độ cao, tỉ lệ men giống cao, và tốc độ bổ xung oxy hoà tan Kết quả là khi nitơ amin

dễ hấp thụ trong dịch nước mạch nha có hàm lượng cao thì nhu cầu về sự tổng hợp các axit amin giảm xuống và nồng độ α-axetolactat sẽ thấp hơn Hơn thế nữa, sự có mặt của valin và izolơxin có thể gây ra sự ức chế đặc biệt mạnh đối với sự tạo thành các α-axetst hydroxyl

Sự gia tăng của hàm lượng α-axetolactat trong dịch nước mạch nha đã lên men không gây ảnh hưởng tới hàm lượng diaxetyl trong bia Tuy nhiên, nên tránh trường hợp này do sự tạo thành diaxetyl có thể xảy ra ngay cả khi không có nấm men là tác nhân chính kích thích quá trình khử α-axetolactat Quá trình decacboxyl hoá α-axetolactat là

một quá trình phi enzym và nó quyết định tốc độ hình thành và khử diaxetyl Sự hiện diện của oxy trong môi trường là không cần thiết bởi vì các ion kim loại như : Cu2+, Fe3+ và

Al3+có thể thay thế oxy với vai trò là chất cho electron Tốc độ tạo thành diaxetyl từ axetolactat cũng chịu ảnh hưởng bởi pH của dịch lên men Với phổ pH thường gặp trong dịch nước mạch nha đang lên men, giá trị pH thấp tạo điều kiện thuận lợi cho sự tạo thành diaxetyl ngược lại, khi pH có giá trị cao(ví dụ như tại thời điểm nuôi cấy nấm men, pH lớn hơn 5,3) sẽ kích thích sự phát triển của nấm men và làm tăng hàm lượng α-axetolactat trong dịch nước mạch nha Do đó, hàm lượng diaxetyl tạo thành cũng sẽ tăng lên

α-Để khử các hợp chất vicinal diketon trong giai đoạn cuối của quá trình lên men chính và suốt quá trình lên men phụ thí nấm men phải ở trạng thái lơ lửng trong dịch nước mạch nha đã lên men Vì vậy, khi nấm men kết lắng quá sớm thì tốc độ khử diaxetyl sẽ bị giảm xuống và do đó nồng độ của nó trong bia thành phẩm sẽ tăng Quá trình khử diaxetyl cũng chịu ảnh hưởng bởi trạng thái sinh lí của tế bào nấm men Nếu nấm men ở trạng thái sinh lý kém thì trong những giai đoạn cuối của quá trình lên men nó sẽ bị ức chế, làm thời gian khử diaxetyl bị kéo dài

Có rất nhiều biện pháp khác nhau có thể áp dụng được để thu được bia có nồng độ diaxetyl đạt mức yêu cầu Chẳng hạn như, loại bỏ diaxetyl sau khi lên men nhờ quá trình tàng trữ ở lên men phụ Thêm vào đó, phương pháp này có thể sử dụng để duy trì hàm lượng diaxetyl ở mức tối thiểu Để đạt hàm lượng diaxetyl yêu cầu đòi hỏi phải chọn được các điều kiện lên men tối ưu, nhằm kích thích tối đa sự tạo thành axetolactat càng sớm càng tốt, và do đó lượng diaxetyl sẽ nhanh chóng bị khử bởi nấm men ở dạng huyền phù

có độ lơ lửng cao Giai đoạn này có thể kích thích bằng cách tăng nhiệt độ lên men khoảng gấp 2-3 lần so với nhiệt độ lên men phụ trong một khoảng thời gian phù hợp

Gần đây đã có một số phương pháp mới được áp dụng để kiểm soát hàm lượng diaxetyl trong bia Trong đó tại Phần Lan đang sử dụng biện pháp có liên quan đến công nghệ cố định tế bào nấm men những nỗ lực nghiên cứu làm thay đổi đặc tính di truyền của nấm men để tạo ra các chủng nấm men mới có khả năng tạo diaxetyl thấp hơn cũng đang được triển khai thực hiện Những nghiên cứu này đang được triển khai theo 4 hướng sau đây:

- Loại bỏ gen mã hoá cho enzym axit α-axetohydroxyl-synthetaza (ILVZ2), do đó

sẽ làm giảm sự tạo thành của các tiền chất diaxetyl

- Kích thích sự hoạt động của gen mã hoá cho enzym axit izomeraza (ILVZ5), là enzym kích hoạt một phản ứng khử trong quá trình tổng hợp valin

α-axetohydroxyl-và izolơxin cũng đã được áp dụng Qua đó, có thể hạn chế được lượng tiền chất của diaxetyl, vì vậy sẽ kích thích sự tổng hợp axit amin valin và izolơxin một chủng nấm men bia lên men chìm được chuyển gen ILVZ5 được cho lên men ở qui mô phòng thí nghiệm tạo ra hàm lượng diaxetyl thấp hơn 70 - 80% so với chủng nấm men ban đầu Người ta cũng nhận thấy rằng chủng nấm men mới này có đặc tính lên men không đổi, kể

cả hương thơm của bia thành phẩm

- Hướng thứ ba có liên quan đến việc sử dụng enzym α-axetohydroxyl decacboxylaza để thực hiện trực tiếp các quá trình khử α-axetolactat thành axetoin Nhiều loại vi khuẩn có hoạt tính enzym này, nhưng nó lại không có sẵn trong các chủng nấm men bia Các nhà khoa học đã tiến hành phân lập gen mã hoá cho enzym α-axetohydroxyl

decacboxylaza từ Axetobacter Spp sau đó gen này được chuyển vào nấm men bia Hàm

lượng diaxetyl sinh ra do chủng nấm men được tạo bằng phương pháp lai vô tínhnày giảm đáng kể so với chủng nấm men ban đầu tuy nhiên, do những lý do đã được trình bày, các chủng nấm men mới này vẫn chưa đựơc sử dụng trong ngành công nghiệp sản xuất bia không còn nghi ngờ gì nữa khi những lợi ích của công nghệ mới này được công nhận một cách rộng rãi thì phản ứng tiêu cực của công chúng đối với các sản phẩm tạo ra từ các sinh vật chuyển gen sẽ tự nhiên mất đi

- Hướng thứ tư là bổ sung enzym α-axetolactat decacboxylaza vào trong dịch nước mạch nha lạnh trước khi lên men enzym này sẽ giúp chuyển hoá trực tiếp α-axetolactat thành axetoin, do vậy bỏ qua giai đoạn khử diaxetyl Enzym này hiện nay đã trở thành thương phẩm rất sẵn có trên thị trường với tên thương mại là MaturexTM và đến năm 1991 người ta đã phê chuẩn cho phép sử dụng chế phẩm này MaturexTM được sản xuất bởi Novo Nordisk A/S từ Bacillus subtilis mang gen mã hoá α-axetolactat decacboxylaza của Bacillus brevis

1.1.4.5 Các hợp chất Sulphua

Các hợp chất Sulphua có vai trò quan trọng trong việc tạo hương thơm cho bia Mặc dù chúng chỉ có thể được chấp nhận với hàm lượng rất nhỏ trong bia nhưng trong bia không thể thiếu chúng, nếu như các hợp chất này có mặt với hàm lượng lớn, chúng sẽ tạo

ra vị không mong muốn Trong những trường hợp như thế người ta sử dụng nhiều giải

pháp đặc biệt để khử các hợp chất sulphua trong bia như sục khí CO2, kéo dài thời gian tàng trữ… Hầu hết các hợp chất sulphua trong bia đều không được sinh ra trực tiếp từ quá trình lên men mà có nguồn gốc từ nguyên liệu ban đầu Tuy nhiên loại trừ trường hợp của hydro sulfit và dioxit sulphua, sự có mặt của các chất này trong bia hoàn toàn phụ thuộc vào hoạt động của nấm men Sai sót trong khi thực hiện quá trình lên men rất có thể làm cho hàm lượng các hợp chất sulphua tăng cao vượt quá mức cho phép trong bia thành phẩm Hàm lượng hydro sulfit và dioxit sulphua tạo thành chủ yếu được quyết định bởi chủng giống nấm men được sử dụng, mặc dù dịch đường và các điều kiện của quá trình lên men mới là nhân tố chính tạo ra phần lớn các hợp chất này, đặc biệt là khi chúng ở mức cao hơn bình thường Cả hai đều là sản phẩm phụ của quá trình tổng hợp các axit amin có chứa lưu huỳnh như axit systein và methionin Quá trình tổng hợp này phụ thuộc vào thành phần dịch đường, ở đó nấm men sẽ đồng hoá các axit amin có chứa lưu huỳnh Chỉ cho tới khi hàm lượng các axit amin có trong dịch đường bị cạn kiệt thì quá trình sinh tổng hợp các axit amin có chứa lưu huỳnh mới bắt đầu diễn ra Hàm lượng H2S và SO2được sinh ra nhiều nhất, ở các ngày thứ hai và ba của quá trình lên men chính Có thể là

do, ở thời điểm này, nấm men bia sẽ sử dụng các axit amin có chứa lưu huỳnh Nấm men vẫn tiếp tục phát triển đồng thời với quá trình lên men (sự phân chia tế bào xảy ra đồng thời) và có vẻ như hàm lượng H2S cũng tăng tương ứng ở từng pha trong chu kỳ phát triển của nấm men cho tới thời điểm trước khi quá trình nảy chồi diễn ra Sự tạo thành một lượng lớn H2S và SO2 trong khi lên men, có thể do các điều kiện lên men gây ra do chúng ức chế sự phát triển của nấm men Cung cấp thêm một lượng oxy thích hợp cho nước dịch đường hoá trước khi tiếp giống có thể là một nhân tố quan trọng tác động đến

sự có mặt của H2S và SO2 trong bia Do cả hai hợp chất này đều là những chất bay hơi, có nghĩa là trong điều kiện nghiêm ngặt, CO2 được giải phóng ra từ quá trình lên men có thể lôi cuốn H2S và SO2 ra khỏi bia thành phẩm

Cấu tạo của thiết bị lên men cũng có ảnh hưởng tới nồng độ của các hợp chất này trong bia Dioxyt sunphua ngoài vai trò góp phần tạo hương còn có một số chức năng khác trong bia, kể cả các loại đồ uống khác Bởi vì, nó có thể hoạt động như một chất kháng sinh, một chất chống oxy hoá và đặc biệt là tác dụng làm chậm quá trình mất mùi thơm của bia Tuy nhiên, để có thể biểu hiện được hoạt tính kháng sinh thì nồng độ của các hợp chất này phải từ 50mg/l trở lên Ngoài ra sự có mặt của SO2 có thể làm chậm quá trình mất mùi của bia đi hai lần

Khi có mặt oxy, SO2 bị chuyển thành lưu huỳnh và cả bisulphit, các chất này sẽ liên kết thuận nghịch với các hợp chất cacbonyl, một trong những hợp chất đó sẽ tạo mùi giấy hoặc bìa cát tông trong bia bị hỏng Các hợp chất sulphit này đều không có mùi đặc trưng Trong nhiều năm , người ta thường bổ sung Na2SO3 và K2SO3 vào trong bia trong quá trình tàng trữ để ổn định hương thơm của bia.Vì vậy, những chất bisulphit gây dị ứng cho người uống bia nên hiện nay chúng bị hạn chế sử dụng vì thế mà hiện nay trung tâm

kỹ thuật Carlsberg các nhà khoa học đang cải tiến một chủng nấm men có khả năng tạo

SO2 lớn hơn bằng phương pháp di truyền Những kết quả sơ bộ thu được khi sử dụng chủng giống nấm men này đã chỉ ra rằng chúng có khả năng tạo ra loại bia có hương thơm

ổn định hơn Dimethyl sunfit (DMS) là một trong những chất giữ hương chính trong bia lên men chìm ở châu Âu

DMS chủ yếu được tạo ra bởi nấm men và 80% hàm lượng DMS được sinh ra từ DMSO Trong quá trình lên men, hàm lượng DMS bay hơi có thể thay đổi trong khoảng 0

- 0,5% trong suốt quá trình hình thành của nó Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ DMSO trong dịch nước mạch nha đến sự tạo thành DMS trong khi lên men, các nhà khoa học đã quan sát thấy rằng có mối quan hệ giữa tỷ lệ nồng độ của các hợp chất này vào thời điểm cuối của quá trình lên men và tại bất cứ giai đoạn nào trong quá trình lên men Chủng loại malt được sử dụng có ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng DMSO tạo ra và do ảnh hưởng gián tiếp đến lượng DMS trong bia Nếu DMSO có mặt trong dịch nước mạch nha tại thời điểm tiếp men giống cao thì nồng độ DMS trong bia thành phẩm cũng sẽ tăng

1.2 Một số yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng bia

1.2.1 Ảnh hưởng của chủng nấm men

Chủng nấm men có vai trò quyết định đến hàm lượng rượu bậc cao trong bia Trong cùng điều kiện giống nhau một số chủng nấm men có khả năng lên men tạo ra hàm lượng rượu etylic cao gấp nhiều lần chủng khác Bia lên men nổi tạo hàm lượng rượu bậc

cao cao hơn bia lên men chìm Các chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae đột biến

tạo ra rượu izobutyl alcohol và isoamyl alcohol bậc cao lớn hơn so với các chủng tự nhiên

Mỗi chủng nấm men có khả năng hình thành các este với hàm lượng khác nhau, một số chủng tạo nhiều este hơn các chủng khác

Trong quá trình lên men diaxetyl được tạo thành mạnh nhất tại thời điểm nấm men tăng cường các hoạt động trao đổi chất và sau đó hàm lượng diaxetyl giảm dần nhờ sự hấp thụ lại của nấm men để khử thành axetoin Hàm lượng diaxetyl phụ thuộc phần lớn

vào số lượng tế bào nấm men còn lại trong dịch lên men ở giai đoạn khử Vì vậy khả năng lên men và tính chất kết lắng của nấm men là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến sự

tạo thành diaxetyl trong bia Trong cùng điều kiện lên men thì S carbergensis sinh ra nhiều diaxetyl hơn S cerevisiae, mặc dù vậy hàm lượng diaxetyl trong bán thành phẩm của S cereviaisae cao hơn S carlbergensis, nguyên nhân do khả năng kết lắng ở cuối giai đoạn lên men chính của S carlbergensis cao hơn so với S cerevisiae rất nhiều

1.2.2 Ảnh hưởng của thành phần dịch đường

Thành phần dịch đường có ý nghĩa đặc biệt quan trọng đối với sự hình thành các chất thơm Các hợp chất cacbonhydrat là cơ chất để chuyển hoá thành CO2, cồn, glycerol

và axít hữu cơ Thành phần lipit quyết định đến hàm lượng este, các axít béo mạch nhánh trong sản phẩm Các axít amin hình thành rượu bậc cao, các keto axít, SO2, H2S trong khi

đó nồng độ diaxetyl, axetoin trong bia lại chịu ảnh hưởng của cả hàm lượng cacbonhydrat

và axít amin trong dịch đường

Trong quá trình lên men, gần 80% axít amin của dịch đường bị nấm men tiêu thụ

Sử dụng nguyên liệu thay thế có thể ảnh hưởng đến hàm lượng axit amin của dịch đường

và ảnh hưởng đế sự tạo thành rượu bậc cao, mức độ ảnh hưởng phụ thuộc vào loại và chất lượng nguyên liệu thay thế được sử dụng

Sự tạo thành các hợp chất bay hơi phụ thuộc vào nồng độ của các loại đường trong dịch hèm Bổ sung thêm hydratcacbon vào dịch hèm có thể làm tăng sự tạo thành của rượu bậc cao Nhằm mục đích làm giảm chi phí cho quá trình sản xuất bia, nhiều nước trên thế giới, đặc biệt là các nước châu Á đã bổ sung đường sacaroza vào dịch hèm trước khi cấy giống Tuy nhiên, khi bổ sung đường sacaroza vào dịch hèm cũng ảnh hưởng đến

sự phát triển của giống nấm men, hiệu suất lên men, hàm lượng cồn và các sản phẩm phụ tạo thành Thêm L-leucin vào môi trường thì rượu bậc cao tăng tỷ lệ thuận với lượng leucin đưa vào cho tới 223 µg/ml mặc dầu hiệu suất chuyển hoá chỉ là 50% (leucin -> iso pentanol) Dịch hèm giàu glucoza dẫn đến sự tạo thành nhiều izobutanol và izoamyl alcohol nhưng ít n-propanol hơn so với lên men dịch hèm có độ đường ban đầu cao hơn nhưng chứa nồng độ glucoza thấp hơn, tuy nhiên điều này cũng còn phụ thuộc vào chủng nấm men Khi làm thay đổi thành phần dịch đường bằng cách bổ sung thêm glucoza thì nấm men nổi làm giảm hàm lượng amyl alcohol, tyrosol và 2-phenyletanol, trong khi đó nấm men chìm lại làm tăng các hàm lượng rượu bậc cao tương ứng Khi sử dụng 15-30% đường làm nguyên liệu thay thế thì có sự tăng lên chút ít của đa số các este

Sự tạo thành este có thể bị kích thích nếu như các chất chứa nitơ trong dịch đường tăng lên Sự ức chế tạo thành este khi nhiệt độ đường hóa cao làm giảm quá trình thủy phân protein trong nồi nấu Các axit béo không no làm giảm đáng kể sự tạo thành este trong quá trình lên men

Công nghệ lên men nồng độ đường cao (high gravity) đang được các nhà sản xuất bia trên thế giới quan tâm vì đây là một giải pháp tăng sản lượng bia một cách hiệu quả, chi phí thấp về đầu tư thiết bị Tuy nhiên, dịch đường nồng độ cao (từ 14-200Bx) có thể tác động tiêu cực tới hoạt lực của nấm men, hiệu suất lên men cũng như sự hình thành các sản phẩm phụ Nguyên nhân là trong môi trường nồng độ đường cao, nấm men phải chịu

áp suất thẩm thấu lớn và nồng độ etanol cao Tóm lại, khi lên men trên môi trường nồng

độ dịch hèm cao, hàm lượng các chất tạo hương gia tăng rất nhiều Muốn cho chất lượng của bia nồng độ cao (200Bx) tương đương với bia truyền thống lên men 110Bx thì phải sản sinh ra một dịch hèm phù hợp, trong đó việc bổ sung maltoza là rất quan trọng trong việc điều chỉnh hàm lượng etyl axetat Việc cung cấp một lượng oxy cần thiết cho dịch hèm hoặc chế độ lên men ở nhiệt độ cao cũng góp phần làm cho nấm men thực hiện quá trình trao đổi chất được tốt hơn, quá trình lên men được triệt để hơn, sự khử diaxetyl được hoàn toàn hơn Những điều kiện này sẽ góp phần làm cho bia lên men trên môi trường dịch hèm cao sẽ có hương vị tương đương bia truyền thống

Các este được tạo thành chủ yếu trong quá trình lên men chính và chỉ thay đổi rất nhỏ trong quá trình tàng trữ Nồng độ chất hòa tan còn lại tại thời điểm chuyển từ lên men chính sang lên men phụ và điều kiện tàng trữ có ảnh hưởng rất lớn

1.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men

Để rút ngắn chu kỳ sản xuất người ta đã chú ý rất nhiều đến yếu tố nhiệt độ và sự hình thành các sản phẩm phụ khi thay đổi nhiệt độ lên men Việc nâng cao nhiệt độ lên men và tàng trữ dẫn tới việc tăng tốc độ các quá trình sinh hoá vì các quá trình này xảy ra nhanh hơn trong môi trường có nhiệt độ cao

Sự tạo thành rượu bậc cao phụ thuộc vào nhiệt độ của quá trình lên men Sự tăng lên của nhiệt độ sẽ dẫn tới sự tăng lên của hàm lượng rượu bậc cao trong bia Tuy nhiên ảnh hưởng này phụ thuộc lớn vào khối lượng và loại hợp chất chứa nitơ trong dịch hèm

và ngoài ra các chủng nấm men khác nhau thể hiện độ nhạy cảm khác nhau đối với sự thay đổi của nhiệt độ

Nhiệt độ trong quá trình lên men càng cao thì thúc đẩy sự tạo thành diaxetyl càng nhiều, lên men ở nhiệt độ 21oC thì diaxetyl tạo thành cao gấp đôi ở 13oC Thực tế có thể tăng nhiệt độ ở giai đoạn đầu lên men để kích thích biến đổi α-axetolactat thành diaxetyl Tuy nhiên nhiệt độ không được cao quá nếu không diaxetyl tạo thành quá nhiều sẽ đòi hỏi thời gian dài để khử nó xuống thấp dưới ngưỡng cho phép

1.2.3 Ảnh hưởng của phương pháp lên men:

Phương pháp Wellhoner:

Dịch nha làm lạnh, lọc trong, sục khí, tiếp giống đặc biệt Nhiệt độ lên men cao hơn bình thường một chút Quá trình lên men diễn ra dưới áp lực khác nhau cao nhất là 2kg/cm2 Thời gian lên men chính là 5 ngày Sau đó tách cặn men, đưa bia non qua máy lạnh nhanh vào thùng lên men phụ và giữ 7 ngày Sau đó lọc đóng chai

Phương pháp Lietz:

Dịch nha làm lạnh, lọc trong, tiếp giống tỷ lệ cao ở 7oC Sau đó lê men 48 giờ ở nhiệt độ 8-8,5oC , lấy đi một nửa chuyển sang thùng khác và cho dần dịch nha tới đầy tiếp tục lên men Nhiệt độ và áp suất tăng dần Nhiệt độ tới 9 – 9,50C Thời gian lên men là 5 -6 ngày Sau đó làm lạnh xuống 3,50C và bơm qua thùng tàng trữ Sau 24 giờ hạ dần áp lực xuống tới mức tương đương với lượng CO2 cần có trong bia Giữ ở đây 3 ngày sau đó lọc đóng chai

Phương pháp Kieninger:

Dịch nha làm lạnh, lọc trong tiếp giống tỷ lệ 0,5% Sau vài giờ bơm qua thùng lên men chính Nhiệt độ lên men khoảng 140C Sau khi đạt độ lên men 64% ( 3 ngày) đẻ áp suất trong thùng lên tới1,5kg/cm2 Sau khi lên men đạt 74% ( sau 5 ngày) thì làm lạnh xuống 40C , bơm qua thùng lên men phụ để ở đó 8 ngày rồi lọc

Phương pháp Kranb và Sommer:

Sau khi khảo sát kỹ các mối quản hệ giữa nhiệt độ lên men, tỷ lệ nấm men và dịch nha, các tác giả gợi ý lên men chính ở nhiệt độ cao hơn bình thường tới 10 -120C, dưới áp suất 0,5 – 1,0 kg/ cm2 , có khuấy trộn rồi lên men chính phụ ở hai thanh nhiệt độ khác nhau trên cùng một thiết bị lên men Giai đoạn đầu ở nhiệt độ ấm cho tới khi diaxetyl giảm tới giới hạn cho phép, giai đoạn 2 ở 1 -20C, kết thúc quá trình lên men lọc bia sản phẩm có chất lượng tương tự theo phương páhp lên men cũ và tổng thời gian không vượt qua 14 ngày

Phương pháp Drews, Specht và Trenel: