Nghiên cứu một số tác dụng sinh học của flavonoit chiết xuất từ lá nhãn (dimocarpus longan luor ) và lá vải (litchi chinensis sonn )

Tên đề tài: “Nghiên cứu một số tác dụng sinh học của các hợp chất Flavonoit chiết xuất từ lá Nhãn Dimocarpus Longan Lour và lá Vải Litchi Chinensis Sonn” 2.. Đào Thị Kim Nhung Chức v

Liªn hiÖp c¸c Héi Khoa häc vµ Kü thuËt ViÖt Nam

ViÖn Nghiªn cøu §µo t¹o vµ T− vÊn Khoa häc C«ng nghÖ

7508

15/9/2009

MỤC LỤC

Tóm tắt thông tin về đề tài

Các ký hiệu viết tắt trong đề tài

Mở đầu

1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Cây vải thiều

1.2 Cây nhãn cùi

1.3 Nhóm hợp chất Flavonoit

2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng thực vật

2.1.2 Đối tượng động vật

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Chiết xuất và định lượng Flavonoit tổng số theo phương pháp của

B.C Talli

2.2.2 Phân tích thành phần Flavonoit bằng sắc ký lớp mỏng, phổ quét và

quang phổ hấp phụ tử ngoại

2.2.3 Xác định hoạt độ peroxydaza trong máu theo E C Xavron

2.2.4 Xác định hoạt tính chống oxy hóa in vitro của các chế phẩm

flavonoit thông qua quá trình peroxy hóa lipit tế bào gan chuột theo

phương pháp của C G Blagodorov và cộng sự

2.2.5 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của chế phẩm Flavonoit chiết xuất

từ lá Vải và lá Nhãn

2.2.6 Nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn của các chế phẩm Flavonoit

2.2.7 Xác định độc tính cấp của các chế phẩm Flavonoit theo phương

pháp của A Wallace Hayes

2.2.8 Bào chế, phân tích, kiểm nghiệm và xây dựng tiêu chuẩn cho sản

phẩm chức năng Agot – G (sản phẩm có sử dụng chế phẩm Flavonoit từ lá

Nhãn – FN)

2.2.9 Khảo sát tác dụng bảo vệ gan của sản phẩm Agot – G khi gây độc

gan chuột bằng Ethanol

2.2.10 Nghiên cứu ảnh hưởng của sản phẩm chức năng Agot – G lên hoạt

độ của một số enzym tiêu hoá tuyến tuỵ chó (Amylaza, lipaza, proteaza)

phương pháp của A Wallace Hayes

2.2.12 Xử lý số liệu theo phương pháp thống kê sinh học

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ HOÁ HỌC CỦA CÁC CHẾ PHẨM FLAVONOIT

3.1.1 Chiết xuất và định lượng Flavonoit tổng số từ lá Nhãn và lá Vải

3.1.2 Phân tích thành phần Flavonoit tổng số thu được bằng sắc ký lớp mỏng và phổ tử ngoại

3.1.3. Khảo sát test chống oxy hoá của các chế phẩm FN, FNT, FV, FVT

thông qua hiệu lực kìm hãm phản ứng oxy hoá indigocarmin của enzym peroxydase máu người

3.2 NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG SINH HỌC

3.2.1 Nghiên cứu tác dụng chống oxy hoá (Antioydant)của các chế phẩm

Flavonoit chiết xuất từ lá Nhãn và lá Vải

3.3.2 Nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn của chế phẩm FV và FN

3.3.3 Nghiên cứu độc tính cấp của chế phẩm FV và FN

3.3.4 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của chế phẩm FN và FV

3.3 KIẾN NGHỊ VỀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CÁC CHẾ PHẨM FLAVONOIT CHIẾT XUẤT TỪ LÁ NHÃN (FN) VÀ TỪ LÁ VẢI (FV)

3.3.1 Nghiên cứu sử dụng chế phẩm FN để hình thành sản phẩm Agot – G

3.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của chế phẩm Agot - G lên hoạt động của các enzym tiêu hoá tuyến tuỵ chó (amylaza, lipaza, proteaza)

3.3.3 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của sản phẩm Agot – G trên chuột gây độc gan bằng Ethanol

3.3.4 Thử độc tính cấp của sản phẩm chức năng Agot – G

3.3.5 Phân tích, kiểm nghiệm và xây dựng tiêu chuẩn cho sản phẩm chức năng Agot – G (sản phẩm có sử dụng chế phẩm Flavonoit từ lá Nhãn – FN)

TÓM TẮT THÔNG TIN VỀ ĐỀ TÀI

1 Tên đề tài: “Nghiên cứu một số tác dụng sinh học của các hợp chất

Flavonoit chiết xuất từ lá Nhãn (Dimocarpus Longan Lour) và lá Vải (Litchi

Chinensis Sonn)”

2 Cơ quan quản lý đề tài: Liên hiệp các hội khoa học và kỹ thuật Việt Nam

Địa chỉ: 53 Nguyễn Du, quận Hai Bà Trưng, Hà Nội

3 Cơ quan thực hiện: Viện Nghiên cứu, Đào tạo và Tư vấn khoa học công nghệ

Địa chỉ: Số 201 A – B, phố Đội Cấn, quận Ba Đình – Hà Nội

Điện thoại: (04) 37222233

Fax: (04) 37222277

4 Chủ nhiệm đề tài: TS Đào Thị Kim Nhung

Chức vụ: Phó Viện trưởng Viện Nghiên cứu, Đào tạo và Tư vấn khoa học công nghệ

Địa chỉ: Số 9, phố Đội Cung, quận Hai Bà Trưng, Hà Nội

Điện thoại: (04) 39761106

5.Mục tiêu của đề tài

Nghiên cứu, hướng tới khai thác và ứng dụng các hợp chất Flavonoit chiết xuất từ lá Vải và lá Nhãn làm nguyên liệu mới dùng trong lĩnh vực Bảo vệ sức khoẻ cộng đồng

6 Nội dung chính của đề tài: gồm 3 phần

Phần 1: Chiết xuất, định lượng và phân tích thành phần hoá học của các chất Flavonoit thu nhận được từ các nguyên liệu là lá Nhãn, lá Vải tươi và khô

Phân tích sàng lọc hoạt tính chống oxy hoá của các chế phẩm Flavonoit thu

được

Phần 2: Nghiên cứu một số tác dụng sinh học của chế phẩm Flavonoit từ lá Vải và lá Nhãn

-Nghiên cứu tác dụng chống oxy hoá

-Nghiên cứu về tính an toàn (độc tính cấp)

-Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn

- Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan

Phần 3: Kiến nghị về khả năng ứng dụng các chế phẩm Flavonoit chiết xuất

-Phân tích, kiểm nghiệm, xây dựng tiêu chuẩn cho sản phẩm chức năng Agot- G

7 Thời gian thực hiện: 24 tháng, từ 05/ 2007 đến 05/ 2009

9 Danh sách cán bộ tham gia đề tài

Ths Trần Quỳnh Hoa Trung tâm nghiên cứu và phát triển

CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT TRONG ĐỀ TÀI

FV: chế phẩm Flavonoit chiết xuất từ lá Vải khô

FVT: chế phẩm Flavonoit chiết xuất từ lá Vải tươi

FN: chế phẩm Flavonoit chiết xuất từ lá Nhãn khô

FNT: chế phẩm Flavonoit chiết xuất từ lá Nhãn tươi

TLK: Trọng lượng khô tuyệt đối

ASTN: Ánh sáng tự nhiên

COOH: Chất chống oxy hoá

HĐ: Hoạt độ

POL: Quá trình peroxy hoá lipit

HTCO: Hoạt tính chống oxy hoá

DAM: dialdehyl manonyl

SKLM: Sắc ký lớp mỏng

DMSO: Dimethyl sulphoxide

MIC: Nồng độ ức chế tối thiểu ( Minimal inhibitory concentration)

MTT: 3 – (4,5 – dimethylthiazol – 2 - yl ) – 2,5 – diphenyl tetrazolium bromide

IC50: Nồng độ ức chế 50% lượng vi sinh vật (Inhibitory concentration 50%)

LD50: Liều gây chết 50% động vật thí nghiệm (Lethal dose 50%)

AST: Alanin amino transferase

ALT: Aspartate amino transferase

ACD: dung dịch Axit citrate dextrose

MỞ ĐẦU

Các hợp chất Flavonoit thiên nhiên có nhiều tác dụng sinh - dược học giá trị, được phân bố rộng rãi trong thế giới thực vật, ít độc đối với cơ thể đang thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới Việc nghiên cứu về cấu trúc hoá học, các đặc điểm lý – hoá – sinh học và khả năng ứng dụng của Flavonoit vào các lĩnh vực khác nhau của đời sống (y dược, thực phẩm, mỹ phẩm, sinh học phân tử ) đã trở thành một trường phái mạnh ở nhiều quốc gia phát triển (Mỹ, Anh, Nga, Hàn Quốc, Trung Quốc ) Người ta đã tìm thấy hơn

4000 chất Flavonoit thực vật cùng hoạt tính sinh học của chúng liên quan đến khả năng phòng ngừa và điều trị nhiều bệnh khác nhau ở người

Năm 2006 Viện Nghiên cứu, Đào tạo và Tư vấn Khoa học Công Nghệ

đã công bố công trình nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hoá (antioxydant) của Flavonoit ở 48 cây trồng và cây mọc hoang dại; trong đó lá Vải và lá Nhãn là những đối tượng nghiên cứu được chọn vào nhóm nguyên liệu có nhiều triển vọng cho việc khai thác và ứng dụng

Cây Vải (Litchi Chinensis Sonn) và cây Nhãn (Dimocarpus Longan Lour) cùng thuộc họ Bồ hòn Sapindaceae, là những cây ăn quả lâu năm trồng phổ biến

ở miền Bắc Việt Nam Hàng năm, sau mỗi vụ thu hoạch quả (Vải từ tháng 5 →

7, Nhãn từ tháng 8 →10) người trồng cây thường đốn lá để bắt đầu quy trình chăm bón cây cho mùa vụ năm sau Khối lượng khổng lồ lá bỏ đi có thể trở thành nguồn nguyên liệu rất phong phú nếu được khai thác và sử dụng hợp lý

Vì vậy, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu trên đối tượng này với mong muốn phát hiện một số tác dụng sinh học của các hợp chất Flavonoit chiết xuất từ lá Nhãn

và lá Vải góp phần hướng tới mục đích chăm sóc và bảo vệ sức khoẻ cộng

đồng

Những nội dung chính của đề tài

Phần 1: Chiết xuất Flavonoit và phân tích hoá học

-Chiết xuất, định lượng và thu 4 chế phẩm Flavonoit tổng số từ lá Nhãn và lá Vải (gồm hai loại lá tươi và khô)

-Dùng các phương pháp sắc ký và quang phổ để so sánh, đánh giá sự khác biệt giữa các cặp Flavonoit tách ra từ nguyên liệu tươi và khô Sơ bộ nhận dạng thành phần Flavonoit chủ yếu (aglycon) của các chế phẩm Flavonoit thu được -Phân tích sàng lọc hoạt tính chống oxy hoá của các chế phẩm Flavonoit thu

được

Phần 2: Nghiên cứu một số tác dụng sinh học của chế phẩm Flavonoit từ lá Vải và lá Nhãn

-Nghiên cứu tác dụng chống oxy hoá

-Nghiên cứu về tính an toàn (độc tính cấp)

-Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn

-Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan

Phần 3: Kiến nghị về khả năng ứng dụng các chế phẩm Flavonoit chiết xuất

1 TỔNG QUAN Tài liệu

1.1 Cây vải thiều

Cây Vải thiều có tên khoa học là Litchi chinensis Sonn thuộc họ bồ hòn

Sapindaceae Cây Vải được trồng ở khắp Việt Nam và còn thấy ở Cămpuchia,

Lào, Trung Quốc, Thái Lan, phía bắc ấn Độ Vải là một cây to, có thể cao tới 10

m Cành thường mọc ngang, lá kép chẵn, gồm 3 đến 4 đôi lá chét hình mác, hay thuôn dài, hai đầu tù, dai, mặt trên bóng, mặt dưới mờ Hoa mọc thành chuỳ tận cùng, trên cành mang hoa phủ đầy lông nâu nhạt Hoa không cánh, 5 lá đài dính nhau Quả hình cầu, vỏ quả khô và mỏng, sần sùi chứa một hạt to bao bọc bởi một áo hạt (cùi vải) trắng, mẫm, nhiều nước, thơm ngọt và chua, ăn được Quả vải thường thu hoạch vào tháng 5 -7 dùng ăn tươi hay sấy khô hoặc đóng hộp dùng dần Hạt vải thái mỏng phơi hay sấy khô dùng làm thuốc với tên lệ chi hạch

Thành phần hoá học của cây vải: trong áo hạt (tử y) ta thường gọi là cùi

vải có chất đường (chủ yếu là glucoza) 66%; protein 1,5%; chất béo 1,4%; vitamin C (trung bình 40mg trong 100g dịch áo hạt); ngoài ra còn có các vitamin

A và B (2 loại vitamin này thường chỉ thấy trong áo hạt tươi, khô thì thường mất

đi); axit xitric

Công dụng: cùi vải được dùng để ăn và làm thuốc áo hạt có vị ngọt, chua,

tính bình hay ôn, không có độc, có tác dụng nuôi huyết, làm hết phiền khát, tiêu thũng, chữa những bệnh mụn nhọt Hạt vải (lệ chi hạch) cũng là một vị thuốc

được dùng từ lâu đời và theo đông y thì lệ chi hạch có vị ngọt, chát, tính ôn, không có độc, có tác dụng tán hàn, thấp kết khí, là thuốc chữa âm nang sưng đau (thoát vị), chữa ỉa chảy ở trẻ con Ngoài ra người ta còn dùng hoa, vỏ thân và rễ của cây Vải sắc lấy nước súc miệng chữa bệnh viêm họng, đau răng Hạt vải chữa đau dạ dày, ruột non, đau tinh hoàn (sắc uống ngày 6 -10g/ngày); vỏ quả vải chữa đau bụng đi ngoài; lá vải dùng trị các vết cắn của động vật

1.2 Cây Nh∙n cùi

Cây Nhãn cùi có tên khoa học là Dimocarpus longan Lour thuộc họ bồ

hòn Sapindaceae là cây ăn quả lâu năm, được trồng và mọc hoang ở khắp nơi

trong nước ta: Hưng yên, Phú thọ, Vĩnh phú, Nghệ an Cây nhãn cao 5 -12m,

thân gỗ to, cứng, vỏ xù xì, nhiều cành, nhiều lá um tùm, quanh năm xanh tốt Lá kép lông chim, mọc so le, gồm 5 -9 lá chét, dài 7 -9 cm, rộng 2-4 cm, hình bầu dục dài, mép nhăn Hoa nhỏ mọc thành chùm, màu vàng nhạt Mùa hoa tháng 3-

4 Cây trồng từ 4 – 5 năm thì có quả, mùa quả thường từ tháng 7 – 10; quả to bằng hòn bi, hay hơn (đường kính có khi tới 3 cm), vỏ ngoài hơi nháp, trong có

áo hạt mọng bao, bọc một hạt đen nhánh bên trong

Thành phần hoá học : cùi nhãn tươi có các thành phần sau %: nước 77%;

chất béo 0,13 %; protein 1,47%; hợp chất có chứa ni tơ tan trong nước 20,55%; ngoài ra còn có các vitamin A và B Cùi nhãn khô chứa nước 0,85%; chất tan trong nước 79,77%; chất không tan 19,39% ; tro 3,36% Trong phần tan trong nước có chứa glucose 26,91%, saccharose 0,22; hợp chất có ni tơ 6,309% Hạt nhãn chứa tinh bột, saponin, chất béo và tanin Lá nhãn có chứa quercetin, quercetrin, tanin

Cụng dụng: theo y học cổ truyền quả nhón cho cựi ăn hoặc đem chế biến

thành long nhón; cựi nhón dung chữa trớ nhớ suy giảm hay quờn, mất ngủ, thần kinh suy nhược, yếu gan, tỳ kộm, mỏu xấu, rong kinh, suy nhược cơ thể; lỏ nhón ngừa sởi, cảm lạnh, sốt rột, viờm ruột, trị một số bệnh ngoài da, chữa bệnh về thận; vỏ cõy và vỏ quả dựng chữa bỏng, đau răng (đốt tỏn thành bột hay nấu cao

để dựng); hạt quả trị đau dạ dày, thoỏt vị, mụn nhọt, bỏng, chảy mỏu (dựng uống hoặc bụi ngoài) Rễ thường dựng để chữa dưỡng chấp niệu, bạch đới, thống phong

Các kết quả nghiên cứu của dự án “Khảo sát một số loại cây cỏ giàu

Flavonoit có hoạt tính chống oxy hoá - antioxydant cao để định hướng khai thác làm thuốc phòng chữa bệnh” do các cán bộ của Viện Nghiên cứu, Đào tạo và Tư

vấn khoa học công nghệ thực hiện, nghiệm thu năm 2006 đã cho thấy trong lá Vải và lá Nhãn tích luỹ khá nhiều các hợp chất Polyphenol, trong đó hàm lượng các hợp chất Flavonoit chiếm một tỷ lệ tương đối cao; các chế phẩm Flavonoit này có hoạt tính chống oxy hoá (HTCO) rất tốt – là tiêu chuẩn cần thiết đối với một hoạt chất tự nhiên có hoạt tính sinh – dược

1.3 Nhóm hợp chất Flavonoit

Flavonoit là một nhóm hợp chất polyphenol, đa dạng về cấu trúc hóa học

và tác dụng sinh học Chúng có hầu hết ở các bộ phận của cây, đặc biệt trong các

tế bào thực vật quang hợp Các Flavonoit không được tổng hợp ở người và động vật; chúng được tìm thấy ở động vật là do động vật ăn thực vật mà có

-Flavonoit được cấu tạo bởi khung cacbon C6-C3-C6, gồm 2 vòng Benzen (vòng A và B) và một vòng pyron (vòng C); trong đó vòng A kết hợp với vòng C tạo thành khung Chroman

3 4 5

6

7 8

1'

2' 3'

4' 5' 6'

Khung cacbon của Flavonoit -Trong thực vật Flavonoit tồn tại ở 2 dạng: dạng tự do (gọi là aglycon) và dạng liên kết với đường (glycozit) Các glycozit khi bị thủy phân bằng axit hoặc enzym sẽ giải phóng ra đường và aglycon Tùy theo mức độ oxy hóa của mạch 3 cacbon, sự có mặt hay không của nối đôi giữa C2 - C3 và nhóm cacbonyl ở C4 mà phân loại các aglycon của Flavonoit thành các nhóm phụ sau:

+Flavon, Flavonol, Flavanon, Flavanonol, Catechin, Leucoanthoxyanidin, Anthoxyanidin, Chalcon, Auron

+Ngoài ra còn có các dẫn xuất

Izoflavonoit (vòng B nối với vòng C ở vị trí C3)

Neoflavonoit (vòng B nối với vòng C ở vị trí C4

Biflavonoit (2 phân tử Flavonoit liên kết với nhau)

-Mỗi vòng A, B, C của phân tử Flavonoit đều có mức độ hydroxyl hóa, methoxyl hóa khác nhau; vì vậy hoạt tính sinh hóa của các Flavonoit và các chất chuyển hóa của chúng phụ thuộc vào cấu trúc hóa học và sự định hướng của các phần tử khác nhau trên phân tử Cấu trúc của các Flavonoit là nền tảng của nhiều giả thuyết về tác động sinh lý của chúng

1.3.1 Tính chất hoá học

Flavonoit đa dạng về cấu trúc hoá học, vì vậy khả năng phản ứng hoá học của chúng rất lớn Hoá tính của flavonoit phụ thuộc vào nhiều yếu tố: các nhóm hydroxyl, nhóm cacbonyl, nối đôi C2 - C3, sự có mặt và vị trí các nhóm thế trong phân tử Cấu trúc lập thể cũng quyết định rất lớn tính chất hoá học của chúng

Khả năng tham gia nhiều phản ứng đặc hiệu đã tạo nên hoạt tính sinh học đa dạng của lớp chất này

Flavonoit là một polyphenol, do đó chúng có đủ các tính chất hoá học của phenol, ngoài ra, chúng còn có thêm một số tính chất do cấu tạo đặc thù tạo nên

* Phản ứng của nhóm hydroxyl (OH)

-Phản ứng tạo phức với kim loại

Các flavonoit có nhóm cacbonyl ở vị trí C4 và nhóm hydroxyl ở vị trí C3hoặc C5 đều dễ tạo phức với kim loại

Flavonoit có hai nhóm hydroxyl ở vị trí C3' và C4' cũng tạo phức với kim loại

Tính hoạt động hóa học cao của các Flavonoit biểu hiện ở ái lực khi kết hợp với các Polymer sinh học, các ion kim loại nặng cũng như khả năng xúc tác cho sự vận chuyển điện tử và bẫy các gốc tự do (Antioxydant) Những Flavonoit

có hoạt tính sinh học được gọi là Bioflavonoit

Dưới đây là một số dẫn liệu về tác dụng sinh - dược học tiêu biểu của Flavonoit đã được công bố trên các kênh thông tin quốc tế (sách chuyên ngành, tạp chí, hội nghị )

1.3.2 Hoạt tính sinh học của Flavonoit

(1) Tác dụng chống oxy hóa (antioxydant)

Một trong những cơ sở sinh hóa quan trọng nhất để Flavonoit thể hiện

được hoạt tính sinh học của chúng là khả năng kìm hãm các quá trình oxy hóa

dây chuyền sinh ra bởi các gốc tự do hoạt động Hoạt tính này thể hiện mạnh hay yếu phụ thuộc vào đặc điểm cấu tạo hóa học của từng chất Flavonoit cụ thể

Bình thường các gốc superoxyt (O ) được sinh ra trong quá trình hô hấp •2

tế bào chuyển thành nước (H2O) theo phản ứng của các enzym superoxyt dismutaza (SOD), catalaza hoặc glutathion peroxydaza Từ anion gốc superoxyt (O2•-) được sinh ra ban đầu sẽ sản sinh ra hàng loạt gốc: 1O2, •OH, và các gốc

tự do khác Các gốc này được gọi là các dạng oxy hoạt động: chúng ít bền và có khả năng phản ứng rất lớn, là thủ phạm gây bệnh tật Phản ứng của gốc tự do là nguyên nhân sinh ra quá trình peroxy hóa các chất hữu cơ Các gốc •OH và oxy

đơn bội 1O2 thường là tác nhân khơi mào phản ứng Tiếp đó các gốc thứ cấp phản ứng với các phân tử mới khác ở gần tạo ra phản ứng dây chuyền , cứ thế nhân mãi lên, không dừng lại và kéo dài cho tới khi tiêu tốn hết cơ chất (không có enzym tham gia) ứng với thời kỳ này, các cơ quan tổ chức bị phá hoại nghiêm trọng, gây nên những biến đổi bệnh lý như ung thư, hoại tử, rối loạn chuyển hóa Đến giai đoạn dập tắt mạch, các gốc phản ứng với nhau tạo ra những sản phẩm bền, trung tính

Thí dụ: R1 + R1• → R1-R1 Hậu quả là xảy ra quá trình polyme hóa Thí dụ, ở người già, các tổ chức

bị xơ chai, không mềm mại, bởi vì phản ứng gốc tự do đã làm cho các gốc liên hợp lại với nhau Như vậy, sự tăng số lượng các gốc tự do hoạt động trong tế bào làm cho các phân tử sinh học bị biến đổi, những protein bất thường xuất hiện trong cơ thể, đó là nguyên nhân phát sinh nhiều bệnh nguy hiểm và sự già của cơ thể

Ngoài các gốc tự do sinh ra trong quá trình sinh lý bình thường, cơ thể còn

bị ảnh hưởng của các dạng oxy hoạt động phát sinh bởi các yếu tố từ bên ngoài như tia phóng xạ, tia cực tím, bức xạ mặt trời, thuốc trừ sâu diệt cỏ, các chất nitro hữu cơ, các phẩm nhuộm, các chất độc hướng gan như CCl4, hydrocacbon

đa vòng, các chất màu azo, các stress…

Các gốc tự do độc hại lại liên quan đến nhiều bệnh hiểm nghèo như bệnh

tim mạch, ung thư, thần kinh, thoái hoá, lão hoá, rối loạn chuyển hoá cơ bản…

Những trạng tháI bệnh lý chính liên

quan đến Gốc tự do

Để chống lại tác hại gây ra bởi các gốc tự do đó, mỗi cơ thể sống có những hệ thống chống oxy hóa nội sinh, ngoài ra còn có những chất antioxydant khác được đưa vào cơ thể theo dạng thức ăn, thức uống Ngày nay, nhiều nhà hóa - sinh học cho rằng Flavonoit là chất antioxydant lý tưởng đối với con người

Do bản chất cấu tạo polyphenol nên Flavonoit ở trong tế bào thực vật hoặc trong cơ thể động vật và người chịu tác động của các biến đổi oxy hóa- khử, bị oxy hóa từng bước và tồn tại ở các dạng hydroquinon, semiquinon, quinon Những Flavonoit có các nhóm hydroxyl sắp xếp ở vị trí ortho dễ dàng bị oxy hóa

Xơ cứng cột bờn teo cơ Alzheimer

Khớp

Tờ thấp Thể thao

Mạch

Vữa xơ Tăng huyết ỏp

Stress oxy hoỏ gốc tự do

Ruột

Viờm tuỵ Loột Bệnh Crohn Thiếu mỏu cục bộ

Xơ nang tuỵ

Da

Bỏng Lóo hoỏ Vẩy nến Ung thư

Hồng cầu

Thiếu mỏu Sốt rột

dưới tác dụng của các enzym polyphenoloxydaza và peroxydaza có trong tế bào

động, thực vật; phản ứng như sau:

1 O2 + Flavonoit (khử) ⎯polyphenol⎯ ⎯ ⎯xydaza⎯ →

Flavonoit (bị oxy hóa) + H2O (Hydroquinon) (Semiquinon hoặc Quinon)

2 H2O2 + Flavonoit (khử) ⎯ ⎯peroxydaza⎯ ⎯ →

Flavonoit (dạng bị oxy hóa) + H2O

Semiquinon hoặc quinon là những gốc tự do bền vững, có thể nhận điện tử

và hydro từ những chất cho khác nhau để trở lại dạng hydroquinon Các chất này

có khả năng phản ứng với các gốc tự do hoạt động để triệt tiêu chúng

Như vậy, khi đưa Flavonoit vào cơ thể sẽ sinh ra gốc tự do bền vững hơn các gốc tự do được hình thành trong quá trình bệnh lý (viêm nhiễm, ung thư, lão hóa ), chúng có khả năng giải tỏa các điện tử trên mạch vòng của nhân thơm và

hệ thống nối đôi liên hợp, làm triệt tiêu các gốc tự do hoạt động Các gốc tự do tạo nên bởi Flavonoit phản ứng với các gốc tự do hoạt động và trung hòa chúng nên không tham gia vào dây chuyền phản ứng oxy hóa tiếp theo Vì vậy

Flavonoit được gọi là "Những tác nhân thu dọn và hủy diệt" các gốc tự do độc

hại

Ngoài cơ chế trên, Flavonoit còn kìm hãm sự phát sinh các gốc tự do hoạt

động do có khả năng tạo phức với các ion kim loại chuyển tiếp như Fe++, Cu++

để chúng không thể xúc tác cho phản ứng Fenton sinh ra các gốc hoạt động như

(2) Tác dụng đối với enzym

Các Flavonoit có khả năng tác động đến hoạt động của nhiều hệ enzym

động vật trong các điều kiện in vitro và in vivo Khả năng tương tác với protein

là một trong những tính chất quan trọng nhất của các hợp chất phenol, quyết

định hoạt tính sinh học của chúng Phản ứng xảy ra giữa nhóm oxyphenolic và oxycacbonyl của các nhóm peptit để tạo thành liên kết hydro

(3) Tác dụng kháng sinh, chống viêm nhiễm

Tác dụng chống viêm nhiễm và kháng khuẩn của Flavonoit đã được nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới chứng minh Một số tác giả nghiên cứu tác dụng

của 24 anthoxyanin, leucoanthoxyanin và axit phenolic lên Salmonella (vi khuẩn

thương hàn) và thấy có tác dụng kìm hãm rõ rệt Hầu hết các chất này đều có khả năng kìm hãm sự hô hấp hay phân chia của vi khuẩn khi có mặt glucoza Tác dụng kháng virut của Flavonoit cũng đã được khẳng định; Chang-Qi Hu và cộng

sự đã nghiên cứu khả năng ức chế virut HIV ở các tế bào H9 của 35 Flavonoit chiết xuất từ thực vật và tổng hợp - đã thấy rằng các hợp chất có nối đôi ở vị trí

C2 = C3 và có nhóm OH ở C6 và C4 thể hiện hoạt tính cao hơn

Cơ chế tác dụng kháng sinh của Flavonoit còn rất ít được nghiên cứu, các tác giả đưa ra một số giả thuyết sau:

- Flavonoit ức chế enzym transpeptidaza làm cho mucopeptit - yếu tố đảm bảo

cho thành tế bào vi khuẩn vững chắc không tổng hợp được

- Gắn lên màng bào tương của vi khuẩn, làm thay đổi tính thấm chọn lọc của màng nguyên sinh chất Vì vậy làm một số chất cần thiết cho đời sống vi khuẩn

như nucleotit, pyrimidin, purin lọt qua màng bào tương ra ngoài

-Tác động lên quá trình tổng hợp protein của vi khuẩn theo 2 kiểu: phong bế mạch peptit của vi khuẩn bằng cách phong bế enzym transferaza chuyển axit amin từ ARN vào mạch làm mạch không kéo dài thêm được hoặc tạo ra protein

bất thường vô dụng với đời sống của vi khuẩn làm chúng không sử dụng được

- ức chế tổng hợp axit nucleic

- Flavonoit có thể tác động vào ADN khuôn, ức chế tổng hợp ARN của vi khuẩn

(4) Tác dụng đối với các bệnh tim mạch

Tác động bảo vệ của các Flavonoit đối với tim mạch có thể do khả năng của chúng trong việc ngăn ngừa sự oxy hóa các lipoprotein tỷ trọng thấp, phòng ngừa sơ vữa động mạch, chặn sự kết tụ huyết khối, điều hòa nhịp tim, ngăn ngừa

bệnh mạch vành và nhồi máu cơ tim, điều hòa huyết áp

O

H

NH

Các Flavonoit có tác dụng làm bền thành mạch tương đương với hoạt tính vitamin P Năm 1936, Szent Gyorgy và cộng sự đã tìm thấy một số dấu hiệu của bệnh chảy máu và vitamin C đơn thuần không cầm được, nhưng lại được chữa khỏi bằng nước chanh Szent Gyorgy đã tách chiết chất này và đặt tên là citrin

Đó là một hỗn hợp các dẫn xuất Flavonoit; chúng không tác dụng lên bệnh Scocbut nhưng có tác dụng trên thành mạch Về sau, chất citrin này được đặt tên

là Vitamin P (Vitamin de Permiabilite) Lavollay, Neumann, Porrot đã chứng

minh: catechin có tác dụng mạnh hơn vitamin C trong việc giữ bền thành mạch Tiếp sau đó, các tác giả phát hiện rằng vitamin P là tập hợp của nhiều loại sắc tố thực vật gốc Flavonoit Đại diện điển hình là catechin và leucoanthoxyan, rồi đến

Flavonol (rutin, quercetin), flavanon (hesperidin) và một số chalcon Những

Flavonoit trên có tác dụng làm tăng sức bền và tính đàn hồi của thành mao mạch, chủ yếu là do khả năng điều hòa, làm giảm tính thấm mao mạch, ngăn cản không cho protein của máu thẩm dịch qua các mô khác; có tác dụng dự phòng vỡ mao mạch, gây xuất huyết, gây phù thũng

(5) Tác dụng bảo vệ gan

Tính chất chống oxy hoá của Flavonoit đóng vai trò rất quan trọng trong

sự ngăn chặn quá trình huỷ hoại cấu trúc và chức năng của gan trong nhiều trạng thái bệnh lý, làm tăng nhanh quá trình tái sinh và phục hồi chức năng của tế bào gan Flavonoit đóng vai trò chủ yếu trong những liệu pháp phức tạp để điều trị viêm gan cấp và mạn tính, sơ gan

Trong y văn, có rất nhiều tài liệu nghiên cứu hoạt tính bảo vệ gan của một Flavolignan là cilibinin (cilimarin) trong những mô hình bệnh lý thực nghiệm Chất này ngăn cản sự peroxi hoá lipit màng tế bào gan, ngăn cản sự tạo thành quá thừa các axit béo và cholesteron, tăng cường quá trình sửa chữa các sai lệch, loại trừ tác dụng ức chế của galactosamin trong sự tổng hợp protein của microsom và glycoprotein của gan, và đẩy nhanh quá trình acetyl hoá chất này Trong trường hợp viêm gan ở chuột tạo nên bởi CCl4, cilibinin ngăn cản sự tích luỹ trong gan các hợp chất dien liên hợp – maloyl dialdehyd và các base Schifs, làm hoạt hoá hệ thống oxy hoá tự nhiên của gan và ổn định màng các vi thể

Trong viêm gan chuột do CCl4, chế phẩm convaflavin (flavonoit toàn phần

của cây huệ chuông Convallaria majalis L), chế phẩm caleflon (hỗn hợp các

tác dụng của các chế phẩm đó là sự điều hoà sinh tổng hợp glycogen, điều hoà chuyển hoá lipit và điều hoà hoạt độ các enzyme của gan

Khi nghiên cứu so sánh tác dụng bảo vệ gan của các chế phẩm Flavonoit:

liquiriton, ascortin, quercetin và cả bột hoa cây dâm bụt giấm (Hibiscus

sabdarifla L) mà thành phần chủ yếu là các glycoside cyanidin và đelfinidin và

các Flavonoit: quercetin, hibiscin, myricitin, gossipetin, gossipetrin, sapdaretin, hibiscetin Trên mô hình viêm gan chuột do CCl4, người ta thấy có sự khác nhau

rõ rệt giữa tác dụng của các chế phẩm đó qua các chỉ tiêu: hàm lượng các lipid trong máu, sự đọng lipit ở tổ chức gan và sự huỷ hoại tế bào ở gan Về chỉ tiêu hạ thấp hoạt độ aminotransferase và hàm lượng lipit trong huyết tương và trong gan thì từng chế phẩm nói trên đều không thua kém cilimarin Điều đó nói lên là với mục đích điều trị, điều trị hợp lý là không dùng riêng từng Flavonoit mà là dùng hỗn hợp nhiều Flavonoit một lúc

(6) Tác dụng đối với ung thư

Các nghiên cứu trên động vật thực nghiệm và các số liệu dịch tễ đã chỉ ra rằng các nhân tố thức ăn đóng một vai trò quan trọng đối với sức khỏe động vật

và con người liên quan tới sự phát triển của một số bệnh kể cả ung thư Quả và rau tươi giàu vitamin A, C, E, β - caroten, Flavonoit và các thành phần khác đã

được nghiên cứu như các nhân tố ngăn ngừa ung thư Nhiều mô hình tế bào nuôi cấy và động vật thực nghiệm đã chỉ ra rằng hoạt tính chống ung thư mạnh của một số polyphenol gián tiếp thông qua một số cơ chế khác nhau Khi đưa ra một

số chất Flavonoit vào vật chủ mang khối u thì người ta thấy chúng có tác dụng như những tác nhân hóa trị liệu nhưng hầu như không độc hại (với liều lượng xác

định) Các chất này có tác dụng kìm hãm các enzym oxy hóa khử, kìm hãm quá trình glycolyse và hô hấp, kìm hãm quá trình giảm phân, hạn chế sự phá vỡ cân bằng của các quá trình trao đổi chất bình thường trong tế bào

L.B Kukushkina và cộng sự đã thử nghiệm dùng chất ionol và propylgalat

điều trị cho chuột gây ung thư báng nước và ung thư gan bằng chủng tế bào ung thư 22a Phương pháp điều trị bằng cách cho uống và tiêm trực tiếp thuốc vào khoang bụng Kết quả được đánh giá thông qua theo dõi lâm sàng và phương pháp đánh dấu L- C14 aminoaxit để theo dõi quá trình tổng hợp protein Dung dịch Serrer và Darell được dùng để nghiên cứu ARN từ những tế bào u báng Kết

quả chứng minh khả năng kìm hãm sự phát triển của khối u phụ thuộc nồng độ thuốc Sự phụ thuộc ấy liên quan chặt chẽ với hiệu lực kìm hãm tổng hợp protein

và ARN ở tế bào u

Các công trình nghiên cứu của Racker và cộng sự cho biết các tế bào ác tính gây bởi virut (kiểu Rous sarcoma virus) có liên quan đến tác dụng của các kinaza Khi ủ các tế bào ung thư nuôi cấy với Flavonoit, các tế bào ác tính trở lại thành các tế bào bình thường do Flavonoit đã làm thay đổi hoạt tính của các kinaza

Với nỗ lực nhằm nghiên cứu khả năng chống ung thư của các hợp chất

Flavonoit, gần đây nhiều tác giả trên thế giới đã tiếp tục thử nghiệm tác dụng in

vitro và in vivo của Flavonoit lên các dòng tế bào ung thư khác nhau, Dyung-Zun

Ahn và Gyn-Yong Song đã nghiên cứu tác dụng của 46 flavon tổng hợp lên các dòng tế bào ung thư khác nhau và rút ra nhận xét các hợp chất 2'-benzyloxy-5 metoxyflavon, 2'-benzoloxy - 5,7-dimetoxyflavon, 2'-benzyloxy - 5,7,8 - trimetoxyflavon, 2'-benzyloxy - 5 – hydroxyflavon thể hiện tính gây độc tế bào

đối với dòng tế bào LI 210 và HL- 60 Tác dụng chống khối u gây bởi dòng tế bào ung thư S -180 trên chuột đối với 5'2'-dihydroxy - 6, 7, 8, 6' -

tetrametoxyflavon chiết xuất từ Scutellaria baicallensis đã được chứng minh bởi

B Ahnn và cộng sự

(7) Tác dụng đối với chuyển hóa và trên lâm sàng

Các Flavonoit được hấp thụ theo đường dạ dày - ruột ở người và động vật,

và được bài tiết nguyên dạng hoặc dưới dạng chất chuyển hóa của chúng qua nước tiểu và phân Một vài Flavonoit dạng glycozit bị deglycosyl hóa bởi các enzym trong các loại mô của người trong khi các chất còn lại không bị biến đổi Tốc độ và phạm vi deglycosyl hóa phụ thuộc vào cấu trúc Flavonoit và vị trí, bản chất của gốc đường bị thay thế Phép đo khả năng chống oxy hóa của huyết tương và nước tiểu sau khi tiêu hóa Chè xanh đã cho thấy sự hấp thụ các chất oxy hóa trong chè xanh diễn ra nhanh, các chất chống oxy hóa đi vào vòng tuần hoàn ngay sau khi uống vào làm cho lượng chất chống oxy hóa trong huyết tương tăng lên đáng kể Benzie và cs (1999) đã cho thấy rằng sự tăng hàm lượng Flavonoit chè xanh trong huyết tương có thể làm giảm sự thiệt hại do oxy hóa

gây ra và vì thế làm giảm nguy cơ mắc ung thư

Các Flavonoit có tác động sâu sắc lên chức năng của các tế bào miễn dịch

và tế bào viêm Trongcác nghiên cứu trên động vật hai este methyl EGCG tách chiết từ Chè ôlong gây kìm hãm đáng kể lên các phản ứng dị ứng trên chuột Gaby (1998) đã chỉ ra rằng quercetin có thể có giá trị trong điều trị hen suyễn và

tốt cho các bệnh nhân tiểu đường và nhiễm HIV (human immunodeficiency

virus) Flavonoit baicalin trong các nghiên cứu gần đây cho thấy có hoạt tính

chống viêm và chống HIV - 1 theo cơ chế gây cản trở sự tương tác giữa các protein vỏ của HIV-1 với các receptor và ngăn chặn HIV-1 tấn công vào các tế

bào đích

(8) Một số ứng dụng của bioFlavonoit trong y học

- Bảo vệ thành mạch, phòng chống nguy cơ chảy máu

- Chống dị ứng

- Chống viêm loét, kháng khuẩn

- Điều trị các bệnh gan, mật

- Phòng và chữa một số bệnh liên quan đến chuyển hoá

- Bệnh tim mạch: huyết áp, cholesterol và triglyxerol trong máu cao, điều hoà nhịp tim, điều hoà chuyển hoá canxi

- Một số bệnh liên quan đến nội tiết và điều hoà cân bằng sinh học của cơ thể

- Hỗ trợ cơ thể khi dùng nhiều kháng sinh hoặc sống trong môi trường có nhiều bức xạ ion

- Miễn dịch: kích thích lympho bào sản xuất interferon, chống virut xâm nhập vào cơ thể và kìm hãm sự nhân lên của virut

- Giảm đau do tác dụng chống co thắt, giãn cơ trơn Làm giảm các đám xuất huyết nhỏ trong bệnh đái đường

- Một số Flavonoit có tác dụng chống khối u lành và ác tính

- Làm tăng tạo máu do làm tăng tổng hợp axit folic của vi khuẩn đường ruột, tăng số lượng hồng cầu và tỷ lệ hemoglobin

- Loại trừ rối loạn thần kinh cơ do thiếu vitamin C

Với cơ sở sinh học trên, nhiều chất Flavonoit được sử dụng như những chế phẩm thuốc đặc trị cho một số bệnh và được thế giới công nhận là một trong những hợp chất tự nhiên có tác dụng làm chậm sự hoá già của cơ thể

và chống đột biến tế bào

1.4 Một số công trình nghiên cứu trong nước về flavonoit

Việt Nam có thảm thực vật nhiệt đới phong phú về chủng loại, có điều kiện sinh thái thuận lợi (nhiều ánh nắng) cho quá trình sinh tổng hợp các chất Flavonoit Đấy là nguồn tài nguyên vô cùng lớn lao cần được nghiên cứu khai

thác để phục vụ dân sinh và phát triển kinh tế - xã hội ở nước ta việc nghiên cứu về các hợp chất Bioflavonoit còn rất ít; chỉ những năm gần đây mới xuất hiện một số công trình nghiên cứu của trường Đại học Dược Hà Nội, Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, Viện Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên, Viện Dược liệu, Viện

Y học Cổ truyền, Viện Nghiên cứu Đào tạo và Tư vấn KHCN (thuộc Liên hiệp hội) Tuy nhiên, các nghiên cứu còn lẻ tẻ chưa có hệ thống; Các nhà nghiên cứu và sản xuất chưa quan tâm đúng mức đến giá trị và tầm quan trọng của việc nghiên cứu khai thác nhóm chất này từ thiên nhiên để phục vụ tích cực cho đời sống cộng đồng (có thể sử dụng Flavonoit trong nhiều lĩnh vực như y - dược, thực phẩm, mỹ phẩm, hóa công nghiệp)

-Công trình nghiên cứu của Vũ Quỳnh Trang, Trần Thị Long và Nguyễn Quốc Khang (Đại học Khoa học Tự Nhiên) đã chiết xuất thu các chế phẩm Polyphenol, Flavonoit, Alkaloit của lá cam canh vùng đồng bằng và vùng đồi Tiến hành khảo sát tác dụng kháng khuẩn của các chế phẩm này trên 7 chủng vi sinh vật kiểm nghiệm các kết quả thu được bước đầu cho thấy: các chế phẩm đều thể hiện hoạt tính kháng khuẩn tốt, và

thể hiện hoạt tính mạnh nhất đối với Shigella flexneri, yếu nhất đối với Escherichia Coli (Báo cáo hội nghị khoa học Hoá Sinh Y Dược năm 2006)

-Công trình nghiên cứu của Hà Thị Thanh Bình, Nguyễn Quốc Khang (2002) đã khảo sát tác dụng hạn chế sự phát triển ung thư cơ đùi chuột bởi dòng tế bào ung thư S-180 của chế phẩm Flavonoit từ lá chè Tân Cương (Tạp chí Dược học, số 8, tr 23-24/30) Tác nhân gây bệnh là chủng tế bào ung thư Sarcoma - 180 Kết quả cho thấy có sự hạn chế phát triển u đùi, hạn chế di căn ung thư tới gan và phổi rõ ràng

-Các nghiên cứu (2006) của Trần Thị Thanh Hương (Viện 69 – Bộ tư lệnh Lăng) và Nguyễn Thị Hà, Tạ Thành Văn (Bộ môn Hóa – Hóa Sinh ĐH Y HN) cho thấy: bột chiết polyphenol và Flavonoit (EGCG) chè xanh có tác dụng ức chế sự phát triển tế bào của dòng tế bào ung thư phổi LU-1 và dòng tế bào ung thư gan Hep – G2, tác dụng rõ nhất trên dòng LU – 1 với giá trị IC50 là 3,84 àM của EGCG chè xanh Bước đầu phát hiện sự tăng hoạt độ của enzym caspase – 3 trên dòng tế bào LU -1 được bổ sung EGCG chè xanh vào môi trường nuôi cấy…

- Năm 2006 nhóm cán bộ khoa học của Viện Nghiên cứu, Đào tạo và Tư vấn Khoa học

Công nghệ đã nghiên cứu thành công đề tài "Khảo sát một số loại cây cỏ giàu Flavonoit có hoạt tính chống oxy hóa (antioxydant) cao để định hướng khai thác làm thuốc phòng chữa bệnh" (đề tài cấp Bộ - Liên hiệp hội); Các tác giả đã nghiên

cứu có hệ thống về thành phần Flavonoit ở 48 loài cây; định tính, định lượng, chiết xuất, dùng các phương pháp sắc ký và quang phổ để phân tích Flavonoit, xác định đặc

điểm Flavonoit đặc trưng của từng loài; sử dụng phương pháp invitro và invivo trên

động vật thực nghiệm để đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của Flavonoit từng cây

nghiên cứu, trên cơ sở đó đã chọn ra 10 loại có triển vọng nhất, trong đó có lá vải và lá nh∙n Đặc biệt lá Vải và lá Nhãn lá những đối tượng đặc biệt giàu Flavonoit, có nguồn nguyên liệu lớn có thể khai thác trên quy mô rộng và là đối tượng nghiên cứu còn khá

2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1 Đối tượng thực vật

Đối tượng thực vật dùng để nghiên cứu trong đề tài:

- Cây Nhãn cùi (Dimocarpus Longan Luor): bộ phận sử dụng là lá bánh tẻ Thu

hái vào tháng 8- 10, tại Hải Dương

- Cây Vải thiều (Litchi Chinensis Sonn): bộ phận sử dụng là lá bánh tẻ Thu hái

vào tháng 5 – 7, tại Lục Ngạn - Bắc Giang

Mẫu được thu hái vào các thời điểm thích hợp với từng loại cây, sau đó được sấy khô ở 600C và tán nhỏ mẫu thu bột nguyên liệu và bảo quản trong lọ đựng mẫu kín

Cây Vải thiều – Litchi chinensis Sonn Cây Nhãn cùi – Dimocarpus longan Luor

2.1.2 Đối tượng động vật

a Máu người: máu tươi toàn phần của người khoẻ mạnh được chống đông bằng ADC do khoa huyết học của bệnh viện Việt - Đức cung cấp Dùng cả 4 nhóm máu A, B, AB, O

b Động vật

- Chuột nhắt trắng Swiss: do Viện Vệ sịnh dịch tễ cung cấp, 6 tuần tuổi, trọng

lượng từ 20 – 22 gam, trạng thái sinh lý bình thường

- Các chủng Vi khuẩn kiểm định: do Viện Vệ sinh dịch tễ cung cấp

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Chiết xuất và định lượng Flavonoit tổng số theo phương pháp của B.C Talli [20]

a Qui trình chiết (B.C Talli)

Tách chiết Flavonoit tổng số theo qui trình của B.C Talli, các bước trong qui trình được mô tả chi tiết dưới đây

Hình 1: Qui trình B.C Talli

b Định lượng Flavonoit tổng số

Chiết bằng Ethanol

96 0 trên máy siêu âm

Hoạt chất trong dịch chiết nước

Chiết bằng nước cất nóng (chỉnh pH = 3 - 4)

Dịch chiết Ethylaxetat

Chiết bằng Ethylaxetat

Chiết bằng clorofooc (loại tạp)

Dùng Ethanol 96 0 hoà tan Chế phẩm Flavonoit hoà

tan trong Ethanol (dùng

để nghiên cứu )

Cân chính xác 10g bột nguyên liệu, chiết bằng clorofooc trên máy siêu âm; chiết trong 3 giờ để loại hết nhựa, chất béo, caroten và clorofooc Lấy phần bột nguyên liệu ra, sấy cho bay hết clorofooc rồi tiếp tục chiết bằng Ethanol 960trên máy siêu âm đến khi dịch chiết không còn cho phản ứng Shinoda Dịch chiết Ethanol được xác định thể tích chính xác và bảo quản trong bình thuỷ tinh màu nâu có nút nhám kín

Lấy 50 ml dịch chiết Ethanol 960 đem cô cạn ở điều kiện áp suất thấp trên máy cất quay chân không, sau đó chiết lại bằng nước cất nóng Dịch chiết nước sau khi đã lọc và chỉnh pH = 3 – 4 được cho vào phễu chiết, dùng Ethylaxetat chiết nhiều lần, sau đó đuổi kiệt dung môi trên máy cất quay chân không tới trọng lượng không đổi Cân xác định trọng lượng Flavonoit tổng số

Hàm lượng Flavonoit chứa trong mẫu phân tích được tính theo công thức:

X % = [(M2 – M1) x V/v x 10] / 100

Trong đó:

V: thể tích dịch chiết Ethanol từ 10 g bột nguyên liệu

v: thể tích dịch chiết Ethanol lấy ra để định lượng (50 ml)

M2: trọng lượng khi cân cặn Flavonoit cả bì

- Bản mỏng Silicagel F 254 của Merk

- Chạy sắc ký một chiều từ dưới lên với hệ dung môi triển khai TEAF (Toluen: Ethylaxetat: Axeton: Axit Focmic = 5: 2: 2:1)

- Quan sát sắc ký đồ ở các điều kiện khác nhau như: ở ánh sáng tự nhiên;

phun các thuốc thử đặc trưng (FeCl 3 , NaOH, KOH, AlCl 3 , Willson, Diazo, Vanillin, NH 4 OH ); quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 và 365 nm

b Đo phổ quét trên máy Shimazu CS – 9001 PC – Chromatogram (đo ở bước sóng 270 nm)

c Đo phổ tử ngoại trên máy Shimazu CS – 9001 PC – Spectrum (đo phổ liên tục từ bước sóng 200 đến 400 nm)

2.2.3 Xác định hoạt độ peroxydaza trong máu theo E C Xavron [ 20]

-Dựa trên nguyên tắc: xác định tốc độ của phản ứng oxy hoá cơ chất

indigocarmin bởi H 2 O 2 trong môi trường axit yếu khi có sự tham gia của enzym peroxydaza Hoạt tính enzym peroxydaza được tính bằng thời gian phản ứng

oxy hóa indigocarmin Thời gian càng nhanh hoạt tính enzym càng cao và ngược lại Hoạt tính enzym peroxydaza ở mẫu đối chứng (không có mẫu thử) là 100%, khi có mẫu thử hoạt tính enzym sẽ thay đổi Nồng độ mẫu thử (trong thí nghiệm này là chế phẩm Flavonoit) càng cao thì thời gian phản ứng càng kéo dài, nghĩa là hoạt độ enzym bị giảm.Thí nghiệm được tiến hành trên cả 4 nhóm

máu O, A, B, AB với các nồng độ flavonoit thay đổi khác nhau

- Nguyên liệu thí nghiệm:

Bốn nhóm máu (A, B, AB, O) người khoẻ mạnh, do khoa huyết học và truyền máu - bệnh viện Việt Đức cung cấp

Mẫu thử là các chế phẩm Flavonoit chiết xuất từ lá Vải và lá Nhãn

2.2.4 Xác định hoạt tính chống oxy hóa in vitro của các chế phẩm flavonoit thông qua quá trình peroxy hóa lipit tế bào gan chuột theo phương pháp của C G Blagodorov và cộng sự [ 7, 10]

- Nguyên tắc: Bằng các thí nghiệm in vitro hoặc in vivo để đánh giá khả năng chống

oxy hoá của một chất nào đó thông qua quá trình peroxy hoá lipit tế bào gan chuột dựa trên nguyên tắc: các gốc tự do của oxy sinh ra trong gan chuột là những tác nhân chính gây ra phản ứng peroxy hóa các chất hữu cơ (chủ yếu là các axit béo chưa no ở màng

tế bào) Một trong những sản phẩm của quá trình này là dialdehyt malonyl (DAM) Chất này phản ứng với axit thiobarbituric tạo ra phức có màu hồng bền ở λ =532 nm

Đo cường độ màu của phức (OD) có thể biết lượng DAM sinh ra nhiều hay ít Hoạt tính chống oxy hóa (HTCO) là tỷ lệ % lượng DAM giảm đi ở mẫu thử so với mẫu đối chứng Thí nghiệm được tiến hành với các nồng độ Flavonoit khác nhau

-Nguyên liệu động vật: Gan tươi của chuột nhắt trắng chủng Swiss khoẻ mạnh,

nặng 22 ± 2 g

-Hoá chất: Đệm Tris, FeSO4, axit ascorbic, TCA, axit thiobacbituric

-Tiến hành: Mổ lấy gan chuột nhắt Cân chính xác 100mg gan chuột làm

homogennat trong cối sứ ở điều kiện 40 C với 5 ml đệm Tris 0,04 M, pH = 7,4

và 10 ml H2O Ly tâm ở 600 vòng / phút trong 10 phút Sau đó lấy 3 ml dịch ly tâm cho vào hỗn hợp gồm: 0,4 ml FeSO4 10-3 M; 0,4 ml dung dịch axit ascorbic

10-2 M Ủ hỗn hợp ở 370 C trong 1 giờ, lấy hỗn hợp ủ ra Thêm 2 ml dung dịch axit thiobacbituric 0,25% Đun sôi cách thuỷ khoảng 15 phút, để nguội Đo màu

Nguyên tắc: Gây tổn thương gan chuột thực nghiệm bằng cách tiêm i.p

CCl4 với liều 4ml/kg Sau đó cho chuột nhắt trắng uống mẫu thử theo các liều dự định Đánh giá tác dụng bảo vệ gan của các chế phẩm cần thử qua việc khảo sát khả năng ức chế quá trình peroxy hoá lipid (POL) và đồng thời thăm dò tác dụng điều hoà chức năng gan thông qua sự thay đổi hoạt tính các enzym AST, ALT trong huyết thanh chuột

Mô hình thí nghiệm: thí nghiệm được tiến hành trên chuột và được chia

Sau 72 giờ tất cả các chuột thí nghiệm đều bị giết lấy gan để quan sát tổn thương thực thể của gan và xác định DAM theo phương pháp C.G.Blagodorov

Lấy máu, tách huyết thanh để định lượng enzym theo phương pháp của Reitruan và Fran Kil trên máy phân tích sinh hóa tự động Asmes SEAC CH –

100, hoá chất xét nghiệm được hãng Span Diagnostic Ltd cung cấp

2.2.6 Nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn của các chế phẩm Flavonoit chiết xuất từ lá Vải và lá Nhãn [2,12,18]

Các thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp: khuyếch tán trên môi

trường đặc và phương pháp pha loãng đa nồng độ

a.Phương pháp khuếch tán trên môi trường đặc

*Nguyên tắc: Dựa trên đường kính vòng vô khuẩn, có thể đánh giá khả năng

kháng khuẩn của các mẫu nghiên cứu

* Mẫu thử: chế phẩm Flavonoit chiết xuất từ lá Vải và lá Nhãn, nồng độ thử của

các chế phẩm là: 1,2 mg/ml

* Môi trường nuôi cấy:

- Môi trường canh thang thường: 5g cao thịt + 10g pepton bột + 5g muối tinh khiết (NaCl) + 1000 ml nước cất Đun nóng, khuấy đều cho tan hết các chất Điều chỉnh pH = 7,4 – 7,6 rồi lọc Chuyển vào ống nghiệm ф16, mỗi ống 5ml, hấp khử trùng 1100C trong 30 phút

- Môi trường Mueler Hinton: 5g cao thịt + 10 g pepton bột + 5g muối tinh khiết + 18 – 20g thạch sợi + 1000ml nước cất Đun sôi cho các chất hoà tan hoàn toàn Điều chỉnh pH = 7,4 – 7,6 Đựng trong bình cầu, mỗi bình cầu 250ml, hấp khử trùng 1100 C trong 30 phút

- Môi trường Sabauraud (môi trường nuôi cấy nấm men, nấm mốc): 5g cao thịt + 10g pepton bột + 20g thạch sợi + 10g glucose + 1000ml nước cất Điều chỉnh

+ Vi khuẩn Gram (+): Staphylococcus aureus (Sa) ATCC 13709; Bacillus subtilis (Bs) ATCC 6633; Lactobasillus fermentum N4; Enterococus faecium

B650

+ Nấm Candida albicans (Ca) ATCC 10231

b Phương pháp pha loãng đa nồng độ

-Nồng độ chế phẩm FV và FN được pha loãng như sau: chế phẩm ban đầu được pha trong DMSO có nồng độ là 40 mg/ml sẽ được pha loãng thành các nồng độ

khác nhau: 256 µg/ ml;156 µg/ ml; 64 µg/ml; 16 µg/ ml; 4µg/ml; 1µg/ml để thử

hoạt tính với các chủng vi sinh vật kiểm định ở trên

- Tiến hành: chuẩn bị dung dịch vi sinh vật hoặc nấm với nồng độ 5 105, lấy 10

µl dung dịch mẫu thử theo các nồng độ đã được pha loãng thêm 200 µl dung dịch vi sinh vật hoặc nấm

- Ủ ở 370 C sau 24 giờ đọc giá trị MIC bằng mắt thường sau khi bổ sung 50 µl MTT (1mg/ml) vào các giếng thử, giá trị MIC được xác định tại giếng có nồng

độ chất thử thấo nhất không chuyển hoá MTT thành MTT formazan cho màu tím đậm IC 50 được tính toán dựa trên số liệu đọc độ đục tế bào bằng máy Tecan (Genios) và phần mềm tính giá trị IC 50 Raw data program

2.2.7 Xác định độc tính cấp theo phương pháp của A Wallace Hayes [ 5, 17, 21]

- Dựa theo nguyên tắc và phương pháp thử độc tính cấp của Wallace Hayes

- Đối tượng động vật là chuột nhắt trắng chủng Swiss, trọng lượng 20 ± 2 g Chuột được nhịn ăn 15 giờ trước khi thí nghiệm, uống nước theo nhu cầu Kiểm tra cân nặng trước khi thử nghiệm Chuột đạt các yêu cầu về cân nặng được đưa vào thử nghiệm

- Mẫu thử là các chế phẩm Flavonoit chiết xuất từ lá Vải và lá Nhãn Mẫu thử được pha thành các dung dịch có nồng độ tăng dần rồi cho chuột uống

- Đưa mẫu thử dưới dạng hỗn dịch theo đường uống Lấy thể tích mẫu thử theo qui định đưa thẳng vào dạ dày chuột bằng kim cong đầu tù Dựa trên kết quả thăm dò trong thử nghiệm sơ bộ, tiến hành thử nghiệm chính thức trên 40 chuột,

chia thành 4 nhóm gồm 1 nhóm chứng dùng nước cất và 3 nhóm thử theo mức

liều đã dự tính

* Đối với chế phẩm FV: nồng độ dung dịch thử (dd FV) là 21,15 mg chế

phẩm FV/ 1,5 ml nước cất, mức liều thử khởi đầu là: 282 mg hoạt chất / kg

chuột thí nghiệm

* Đối với chế phẩm FN: nồng độ dung dịch thử (dd FN) là 20,12 mg chế

phẩm FN/ 1,5 ml nước cất, mức liều thử khởi đầu là: 268 mg hoạt chất / kg

a Bào chế sản phẩm Agot – G và Agot – G 1

b Phân tích và kiểm nghiệm sản phẩm chức năng Agot – G theo các chỉ tiêu sau:

- Chỉ tiêu cảm quan theo TCVN

- Hàm lượng kim loại nặng (As, Pb, Cd, As) theo TCVN

- Chỉ tiêu dịnh dưỡng (hàm lượng gluxit, protein, chất xơ, tro tổng số) theo TCVN

- Chỉ tiêu vi sinh vật (tổng số vi sinh vật hiếu khí, coliforms, E Coli, St Aureus,

B cereus, tổng số nấm men - mốc, Cl perfringenst) theo TCVN

- Hoá chất không mong muốn theo TCVN

c Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho sản phẩm chức năng Agot – G (dựa trên kết quả phân tích và kiểm nghiệm các chỉ tiêu kể trên)

2.2.9 Khảo sát tác dụng bảo vệ gan của sản phẩm Agot – G khi gây độc gan

chuột bằng Ethanol (theo phương pháp đánh giá gián tiếp dựa vào tác dụng của thuốc bị chuyển hoá) [ 3]

Nguyên tắc của phương pháp: Cho chuột nhắt trắng uống Ethanol 960 với liều hàng ngày 4 ml/kg (trước khi uống pha loãng Ethanol 960 với nước cất) liền trong 45 ngày, gan sẽ bị tổn thương Khi gan bị tổn thương sẽ làm cho chuyển hoá thuốc giảm nên tác dụng của thuốc sẽ kéo dài

Mô hình thí nghiệm: dùng các lô chuột như sau

* Lô 1 - đối chứng (-): chuột nuôi bình thường, không cho uống Ethanol 960

* Lô 2 - đối chứng (+): cho uống Ethanol 960 trong 45 ngày

* Lô 3A - cho uống Ethanol 960 đến ngày thứ 30 thì cho uống thêm các hoạt chất cần thử tác dụng bảo vệ gan theo liều đã định (trong thí nghiệm này chất thử là sản phẩm Agot – G) cho đến ngày thứ 45 thì ngừng thí nghiệm

* Lô 3B - cho uống Ethanol 960 đến ngày thứ 30 thì cho uống thêm các hoạt chất cần thử tác dụng bảo vệ gan theo liều đã định (trong thí nghiệm này chất thử là sản phẩm Agot – G1) cho đến ngày thứ 45 thì ngừng thí nghiệm

Dùng thuốc ngủ Hexobarbital natri tiêm dưới da cho chuột ở lô 2, lô 3A,

lô 3B với liều 75mg/kg Theo đõi thời gian (giây) ngủ của chuột ở các lô thí nghiệm Chuột ở các lô thí nghiệm ngủ càng lâu so với chuột ở lô đối chứng (-) chứng tỏ mức độ tổn thương gan càng lớn Nếu mẫu thử có tác dụng bảo vệ gan tốt thì thời gian ngủ của chuột ở lô thí nghiệm sẽ tiến gần đến độ dài thời gian của giấc ngủ ở lô chuột đối chứng (-)

2.2.10 Nghiên cứu ảnh hưởng của sản phẩm chức năng Agot – G lên hoạt động của một số enzym tiêu hoá tuyến tuỵ chó [8,14]

a Xác định hoạt động của enzym Amylaza tuyến tuỵ chó theo phương pháp của Folin – Wu

+ Dựa trên nguyên tắc: xác định lượng tinh bột còn lại không bị thuỷ

phân sau phản ứng enzym Hoạt độ của enzym được xác định theo lượng tinh bột bị thuỷ phân bởi enzym trong thời gian 30 phút

+ Tiến hành thí nghiệm:

- Mổ chó lấy tuyến tuỵ, loại bỏ các cơ và mỡ xung quanh tuyến tuỵ Nghiền dịch đồng thể tuyến tuỵ trong điều kiện lạnh và trong đệm Photphat 0,1 M; pH = 7,2 Ly tâm thu dịch tuỵ trong để làm thí nghiệm

- Thí nghiệm được tiến hành với các lô bình thí nghiệm: bình đối chứng,

bình kiểm tra, bình thí nghiệm Lần lượt cho vào các bình thí nghiệm các hoá

chất sau: 1 ml tinh bột 2% + 1,4 [ml đệm photphat + chất thử với các nồng độ thay đổi (chất thử trong thí nghiệm này sản phẩm Agot – G)] + 1 ml dịch tuỵ Tổng thể tích phản ứng V = 3,4 ml

Để các bình thí nghiệm đó trong tủ ấm ở điều kiện 370 trong 30 phút

Ngừng phản ứng bằng 0,4 ml HCl 0,1 N Ly tâm lấy dịch trong để làm phản ứng màu Lấy 0,02 ml dịch ly tâm + 4 ml nước cất + 0,05 ml dung dịch Iot 0,1N và thêm nước cất đến đủ thể tích 5 ml So màu OD ở λ = 660 nm, dựa vào đường chuẩn tinh bột để xác định hàm lượng tinh bột còn lại, ghi kết quả thí nghiệm

+Xây dựng đồ thị chuẩn tinh bột:

m g tinh bot

Đồ thị 1: Đồ thị chuẩn tinh bột

+Phương trình tuyến tính c ủa đồ thị chuẩn tinh bột: Y = 0,0321 X + 0,0308

Trong đó: Y là mật độ quang học (OD); X là mg tinh bột

b Xác định hoạt động của enzym Lypaza tuyến tuỵ chó theo phương pháp Tietz

Nguyên tắc: phương pháp này dựa trên cơ sở chuẩn độ các axit béo tạo ra

bằng dung dịch kiềm Hoạt độ của enzym lypaza được xác định theo hàm lượng axit béo được giải phóng ra từ lipit trong thời gian 1 giờ

Chuẩn bị dịch enzym từ tuyến tuỵ chó: lấy tuyến tuỵ của chó vừa mổ, loại

bỏ màng bám quanh, thấm khô bằng giấy lọc, nghiền thành dịch đồng thể với đệm Axetat natri pH = 6,8 theo tỷ lệ 1g tuyến tuỵ / 10 ml dung dich đệm

Tiến hành: dùng bình tam giác 100 ml, cho vào từng bình thí nghiệm các thành phần sau: 7 ml dịch chiết tuỵ + 1 (đệm Axetatnatri + chất thử) + 2 ml dầu đậu nành Tổng thể tích của phản ứng V = 10ml Cho vào tủ ấm 370 trong 60 phút Sau đó lấy ra làm ngừng phản ứng enzym bằng cách đun bình phản ứng trong nồi cách thuỷ sôi 5 phút Song song với các bình phản ứng làm bình kiểm tra (làm ngừng hoạt động của enzym ngay từ đầu) Sau đó cho vài giọt phenolphtalein và chuẩn độ axit béo giải phóng ra bằng KOH 0,05 N đến khi xuất hiện màu hồng bền Tính lượng KOH đã chuẩn độ để xác định hoạt động của enzym Lipaza

c Xác định hoạt động của enzym proteaza tuyến tuỵ theo phương pháp Anson cải tiến

Nguyên tắc: enzym proteaza có trong dịch đồng thể của tuyến tuỵ sẽ thuỷ

phân cơ chất protein (ở đây protein là cazein) để giải phóng ra axit amin trong

đó có tyrozin Xác định hoạt độ phân giải protein của proteaza tuyến tuỵ dựa trên cơ sở định lượng sản phẩm được tạo thành (tyrozin) bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin – Ciocalteau Dựa vào đồ thị chuẩn tyrozin sẽ tính được hàm lượng tyrozin được tạo ra sau phản ứng

Chuẩn bị dịch enzym từ tuyến tuỵ chó: lấy tuyến tuỵ của chó vừa mổ, loại bỏ

màng bám quanh, thấm khô bằng giấy lọc, nghiền thành dịch đồng thể với đệm Dung dịch đệm Axetatnatri 1M, pH = 8,0 theo tỷ lệ 1g tuyến tuỵ / 10 ml dung dịch đệm

Hoá chất:

(1) Dung dịch đệm Axetatnatri 1M, pH = 8,0

(2) Dung dịch cơ chất cazein: cân 2 g cazein tinh khiết, cho vào bình định mức 100 ml hoà tan trong 20 ml NaOH 0,1N; khuấy và đun trên nồi cách thuỷ cho tan hết, dùng nước cất dẫn đến 100 ml khi dùng pha loãng 10 lần

(3) Dung dịch Tricloaxetic 8% (TCA)

(4) Dung dịch chuẩn tyrozin: dùng tyrozin tinh khiết pha thành dung dịch 0,01% trong Na2CO3 6%

(5) Thuốc thử Folin - Ciocalteau

Bố trí thí nghiệm như sau:

Bảng 2: Bố trí thí nghiệm xác định hoạt độ của proteaza trong tuyến tuỵ

chó (in vitro), V = 4 ml

tuyến tuỵ (ml) cazein dd dd mẫu thử

Đệm Axetatnatri (ml) Ghi chú

Ống đối chứng 2 và các ống thí nghiệm 1,2,3,4,5: sau khi cho đủ thành phần

phản ứng, đem ủ ở tủ ấm 370C trong 60 phút; sau đó thêm vào mỗi ống 2 ml TCA, lắc đều để lắng ở nhiệt độ phòng trong thời gian 30 phút Sau đó ly tâm, lấy 0,1 ml dịch ly tâm + 4 ml NaOH 0,5N + 1 ml CuSO4 + 0,5 ml thuốc thử

Folin – Ciocalteau + 1,4 ml nước cất So màu ở bước song 660 mn Dựa vào đường chuẩn tyrozin để tính được hàm lượng tyrozin gải phóng ra sau phản ứng

Đồ thị chuẩn tyrozin:

Bảng 3: Đồ thị chuẩn tyrozin

Tyrozin chuẩn STT

0 0.05

0.1 0.15

0.2 0.25

0.3 0.35

0.4 0.45

Đồ thị 2: Đồ thị chuẩn tyrozin

+Phương trình tuyến tính c ủa đồ thị chuẩn Tyrozin: Y = 13,914 X - 0,012

Trong đó: Y là mật độ quang học (OD); X là mg tyrozin

2.2.11 Xác định độc tính cấp của sản phẩm chức năng Agot – G theo phương pháp của A Wallace Hayes

Cách tiến hành giống như đã mô tả ở phần 2.2.7 chỉ thay thế mẫu thử ở đây là bột sản phẩm Agot - G

2.2.12 Xử lý số liệu theo phương pháp thống kê sinh học

3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ HOÁ HỌC

- Chiết xuất và định lượng Flavonoit tổng số từ lá Nhãn và lá Vải (tươi và

khô)

- Phân tích các chế phẩm Flavonoit bằng sắc ký lớp mỏng và phổ tử ngoại

3.1.1 Chiết xuất và định lượng Flavonoit tổng số từ lá Nhãn và lá Vải

- Từ các mẫu nguyên liệu là lá bánh tẻ của cây Vải và cây Nhãn, chúng tôi tiến

hành xử lý theo các chế sau:

(1) Lá tươi, được rửa sạch, để ráo nước, thấm khô, cân xác định trọng

lượng tươi Nghiền nhỏ thành dạng nhuyễn đồng thể rồi chuyển vào bình nút

nhám màu nâu và cố định mẫu ngay bằng cồn 960

(2) Lá tươi đã được xác định trọng lượng được sấy ở 600C cho đến khi

khô giòn Xay thành bột, thu bột nguyên liệu và bảo quản trong lọ nút nhám và

giữ trong bình hút ẩm

-Xác định trọng lượng khô tuyệt đối của nguyên liệu: Cân chính xác 100g mẫu

nguyên liệu, sấy khô kiệt ở 1000C, cân xác định đến khi trọng lượng không đổi

(thí nghiệm được lặp lại 5 lần) Trọng lượng khô tuyệt đối của lá Nhãn = 49,5

% (năm 2007) Trọng lượng khô tuyệt đối của lá Vải = 50% (năm 2007)

-Tiến hành phá mẫu và chiết mẫu trên máy siêu âm Power Sonic 410, chiết

xuất và định lượng Flavonoit tổng số theo quy trình B.C.Talli Các kết quả

Kết quả ở bảng 4 cho thấy:

*Hàm lượng Flavonoit của mẫu nguyên liệu thu ở mùa vụ năm 2007 và 2008 gần như tương đương nhau

*Hàm lượng Flavonoit tổng số của lá Nhãn và lá Vải đều chiếm một tỷ lệ tương đối cao Điều này cho thấy đây là những nguyên liệu giầu Flavonoit có thể hướng tới khai thác ứng dụng vào thực tiễn

*Hàm lượng Flavonoit của lá Nhãn tươi là: 1,89 % (năm 2007) và 1,792% (năm 2008); khi quy đổi ra theo hàm lượng khô là 3,818 % và 3,620 % Hàm lượng Flavonoit của lá Vải tươi là: 2,703 % (năm 2007) và 2,739% (năm 2008); quy đổi ra theo hàm lượng khô là 5,406 % và 5,478 %

Bảng 5: So sánh hàm lượng Flavonoit tổng số (%) của lá Nhãn và lá Vải chiết

xuất từ nguyên liệu khô và từ nguyên liệu tươi quy đổi theo trọng lượng khô

Hàm lượng Flavonoit tổng số (%)

dổi theo trọng lượng khô

bị thay đổi

Để tiện cho các công việc nghiên cứu tiếp theo chúng tôi ký hiệu các mẫu thu được như sau:

FV: chế phẩm Flavonoit chiết xuất từ lá Vải khô

FV T : chế phẩm Flavonoit chiết xuất từ lá Vải tươi FN: chế phẩm Flavonoit chiết xuất từ lá Nhãn khô

FN T : chế phẩm Flavonoit chiết xuất từ lá Nhãn tươi

Từ các chế phẩm Flavonoit thu được chúng tôi tiến hành kiểm tra các phản ứng định tính đặc trưng của nhóm chất Flavonoit kết quả được trình bày ở bảng 6

Bảng 6: Các phản ứng định tính của các chế phẩm Flavonoit thu được

Tên mẫu P/u NaOH 10% P/u FeCl 3 5% P/u Shinoda P/u Diazo

FV Vàng nâu 4+ Xanh đen 4+ Đỏ nâu 4+ Vàng cam 4+

FV T Vàng nâu 4+ Xanh đen 3+ Đỏ nâu 4+ Vàng cam 3+

FN Vàng nâu 4+ Xanh đen 4+ Đỏ 4+ Đỏ cam 4+

FN T Vàng nâu 4+ Xanh đen 3+ Đỏ 3+ Đỏ cam 3+

Các kết quả thu được ở bảng 6 cho thấy các phản ứng định tính đặc trưng của nhóm chất Flavonoit rất điển hình: phản ứng FeCl3 cho màu xanh đen đặc trưng đã cho thấy sự có mặt của những Flavonoit có cấu tạo orthodiphenol; phản ứng Shinoda có màu đỏ đậm đặc chỉ ra sự có mặt các chất Flavonoit mang nhóm cacbonyl (>C = 0) ở vị trí C4 Đặc điểm cấu tạo hoá học này là một trong những yếu tố cơ bản cần có đối với một Bioflavonoit (các chất Flavonoit có hoạt tính sinh học)

3.1.2 Phân tích thành phần Flavonoit tổng số thu được bằng sắc ký lớp mỏng và phổ tử ngoại

* Việc phân tích thành phần Flavonoit tổng số bằng sắc ký lớp mỏng và phổ tử ngoại được tiến hành đồng thời trên bốn chế phẩm Flavonoit thu được: FN,

FNT, FV, FVT Để phân tích thành phần Flavonoit trên bản mỏng chúng tôi sử dụng nhiều phương pháp phối hợp:

- Sắc ký lớp mỏng một chiều, chạy từ dưới lên với hệ dung môi triển khai TEAF (Toluen: Etylaxetat: Axeton: Axit Focmic = 5: 2: 2:1); phun các

thuốc thử đặc hiệu của nhóm chất Flavonoit: FeCl 3 , NaOH, KOH, AlCl 3 , Willson, Diazo, Vanillin, NH 4 OH ; quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng

* Các kết quả thu được trình bày ở bảng 7, 8, ảnh 1, 2 3, 4 và hình 2a, 2b,3,4a, 4b,5 Từ các kết quả thu được cho thấy:

+Trên ảnh sắc ký đồ (ảnh 1,2,3,4) thu được cho thấy: sắc ký đồ của chế phẩm FN và FNT hoàn toàn giống nhau, đều xuất hiện 11 vết, với giá trị Rf của các vết tương đương nhau; tương tự như thế sắc ký đồ của chế phẩm FV và

FVT cũng hoàn toàn giống nhau, gồm 10 vết với giá trị Rf của các vết tương đương nhau Căn cứ trên sắc ký đồ có thể nhận xét: quá trình xử lý từ mẫu tươi thành mẫu khô hầu như không ảnh hưởng đến thành phần định tính của các chế phẩm Flavonoit

Sắc ký đồ được quan sát ở các điều kịên khác nhau [cột (5) đến cột (16)

của bảng 7 và 8]: ở ánh sáng thường, dưới đèn tử ngoại λ = 365 nm, phun các thuốc thử đặc trưng để sơ bộ nhận dạng Flavonoit; các kết quả thu được cho

biết các vết tách ra trên sắc ký đồ đều là những chất Flavonoit

+ Cũng từ bản sắc ký lớp mỏng đó chúng tôi tiến hành đo phổ quét ở bước sóng 270 nm, để có thể xác định tương đối tỷ lệ % của mỗi vết so với mẫu tổng số [cột (3) của bảng 7 và 8] Kết quả ở hình 3 và 5 cho thấy đây là những đỉnh hấp thụ tương ứng với các vết tách ra trên sắc ký đồ Đặc biệt, ở chế phẩm FN vết số 2 và số 8 có đỉnh hấp phụ tương đối lớn cho thấy 2 vết này

chiếm một tỷ lệ tương đối cao (vết số 2 chiếm 24,913% và vết số 8 chiếm

tử ngoại đặc trưng của từng vết

- Ở chế phẩm FN vết số 1,2,3,4,6,7,9 có phổ tử ngoaị nằm trong giải II (hấp phụ cực đại ở bước sóng 220 -280 nm) còn vết số 8 có phổ tử ngoại nằm trong giải I (hấp phụ cực đại ở bước sóng > 290 nm) Ở chế phẩm FV vết số 2,3,4,8,9 có phổ tử ngoaị nằm trong giải II (có giải hấp phụ cực đại ở bước sóng 220 -280 nm) còn vết số 5,6,7 có phổ tử ngoại nằm trong giải I (có giải hấp phụ cực đại ở bước sóng > 290 nm Như vậy, hầu hết các chất tách ra trên sắc ký đồ đều được hấp phụ trong giải hấp thụ đặc trưng của Flavonoit (trừ những vết có tỷ lệ nhỏ quá không tiến hành đo phổ tử ngoại được)

Iod (8)

1 0.05 5,634 Ð 277,90 ; 226,74 Vàng sáng 3+ Vàng nâu 4+ Nâu 4+ Vàng cam 4+

4 0.27 12,182 Ð 260,46 ; 350 Vàng sáng 4+(to) Vàng nâu 4+ Nâu 4+ Vàng nâu 4+

6 0.42 12,358 Ð 276,74 ; V 218,60 Vàng cam 4+ (to) 4+(to) Vàng Nâu 4+ Vàng cam 4+

9 0.64 2,795 Ð 280,23 ; V 223,25 Vàng cam 4+ Vàng nâu 3+ Nâu 4+ Nâu nhạt 3+

Ghi chú: Cột 2 xem hình 2a và 2b; cột 3 xem hình 2; cột 4 xem phụ lục

và phổ quét của Flavonoit chiết xuất từ lá cây Nhãn

FeCl 3 5%

(9)

KOH/cồn λ=365nm (10 )

Xanh

Xanh đen 4+

PQ Vàng xanh

0,48 0,42 0,38 0,27 0,20 0,12