Nghiên cứu tổng hợp và sử dụng một số chất có nguồn gốc tự nhiên làm tăng hiệu lực sinh học của thuốc trừ sâu BT

2 Đề khắc phục hiện tượng kháng thuốc và tăng hiệu quả sử dụng của thuốc người ta thường hỗn hợp Bt với các thuốc BVTV khác có khả năng diệt nhanh hơn hoặc gia công hỗn hợp với các chất

VIỆN HOÁ HỌC CÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ SỬ DỤNG MỘT SỐ CHẤT CÓ NGUỒN GỐC TỰ NHIÊN LÀM TĂNG HIỆU LỰC SINH HỌC CỦA THUỐC TRỪ SÂU BT

CNĐT: HOÀNG THÂN HOÀI THU

9016

HÀ NỘI – 2011

1

MỞ ĐẦU

Hiện nay do sự phát triển dân số cùng với tốc độ đô thị hóa nhanh đất canh tác, nền nông nghiệp nước ta đang áp dụng các biện pháp thâm canh cao, với việc sử dụng ngày càng nhiều phân bón, thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) có nguồn gốc hóa học nhằm tăng năng suất và chất lượng nông phẩm Tuy nhiên,

sự thâm canh nông nghiệp đã làm cho đất đai ngày càng thoái hóa, hệ sinh thái mất cân bằng dinh dưỡng, hệ vi sinh vật trong đất bị phá hủy, tồn dư các chất độc hại trong đất ngày càng cao, nguồn bệnh tích lũy trong đất ngày càng nhiều dẫn đến phát sinh một số dịch hại không báo trước

Trong lĩnh vực phòng trừ dịch hại, do sâu bệnh kháng thuốc nhanh nên nông dân thường tăng nồng độ sử dụng, dẫn đến dư lượng thuốc BVTV trong sản phẩm nông nghiệp ngày càng cao, mất an toàn cho người sử dụng, ảnh hưởng xấu tới môi trường và sức khỏe cộng đồng Ngoài ra, các sản phẩm làm ra không thể xuất khẩu được nên ảnh hưởng lớn đến thu nhập của nông dân Đây cũng là một thách thức lớn cho nông dân Việt Nam khi gia nhập WTO

Để giảm thiểu tác động xấu của thuốc BVTV đến môi trường và cộng đồng, xu hướng sử dụng các chế phẩm có nguồn gốc sinh học thay thế dần thuốc hóa học ngày càng phát triển Các thuốc BVTV có nguồn gốc sinh học làm một trong những lĩnh vực mà Hóa học xanh quan tâm và hướng tới

Trong đó, thuốc trừ sâu vi sinh Bt (Bacillus thuringiensis) hiện đang chiếm

phần lớn thị trường thuốc trừ sâu sinh học ở Việt Nam cũng như trên thế giới

Chế phẩm sinh học Bt không gây ô nhiễm môi trường, an toàn với người và động vật có ích, không để lại dư lượng trong nông sản, nên được sử dụng rất nhiều đặc biệt trong sản xuất nông nghiệp sạch

Tuy nhiên, sử dụng Bt có nhược điểm lớn nhất là tác động chậm, 48 tiếng sau khi ăn độc tố thì sâu mới chết; thuốc dễ bị phân hủy khi có tia cực tím của ánh sáng mặt trời và đặc biệt dễ gây hiện tượng kháng thuốc (quen thuốc) của côn trùng Vì vậy, tác dụng của thuốc Bt không đem lại hiệu quả phòng trừ

2

Đề khắc phục hiện tượng kháng thuốc và tăng hiệu quả sử dụng của thuốc người ta thường hỗn hợp Bt với các thuốc BVTV khác có khả năng diệt nhanh hơn hoặc gia công hỗn hợp với các chất co tác dụng hiệp đồng (synergist) Tuy nhiên, sử dụng các chất synergist hỗn hợp với thuốc BVTV nói chung và với thuốc trừ sâu Bt nói riêng có ưu điểm là không cần dùng thêm các loại thuốc khác độc hại Bản thân các chất synergist thường không độc hoặc ít độc với môi trường và cộng đồng, vì vậy sản phẩm hỗn hợp ít độc hại hơn mà hiệu lực sinh học có thể tăng lên gấp nhiều lần so với Bt dùng đơn

Nhằm mục đích giảm hiện tượng kháng thuốc và nâng cao hiệu quả sử dụng của thuốc trừ sâu Bt, trung tâm Hữu cơ – Viện Hóa học Công nghiệp

Việt Nam đã thực hiện đề tài « Nghiên cứu tổng hợp và sử dụng một số chất

có nguồn gốc tự nhiên làm tăng hiệu lực sinh học của thuốc trừ sâu vi sinh Bt» Sản phẩm sẽ được áp dụng phòng trừ sâu khoang và sâu tơ hại rau cho

sản xuất nông nghiệp sạch

3

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu về thuốc trừ sâu có nguồn gốc sinh học

1.1.1 Hiểu biết về thuốc BVTV có nguồn gốc sinh học

Theo Cơ quan Bảo vệ môi trường Mỹ (US EPA), Thuốc BVTV có nguồn gốc sinh học là những chế phẩm có tác dụng phòng trừ, diệt các côn trùng gây hại Hoạt chất là các vi sinh vật (nấm, vi khuẩn, virus), thảo mộc hoặc các hợp chất hóa sinh

Thuốc trừ sâu vi sinh (còn gọi là thuốc trừ sâu có nguồn gốc vi khuẩn)

là một dạng thuốc BVTV có nguồn gốc sinh học Trên thị trường thuốc trừ sâu vi sinh trên thế giới thì sản phẩm chứa Bt chiếm 90% số lượng

Đặc điểm ưu việt của thuốc BVTV có nguồn gốc sinh học so với các

thuốc BVTV thông thường là:

- Ít độc hơn đối với người, gia súc và không ảnh hưởng tới các loài có ích như chim, cá và các thiên địch

- Tính chọn lọc và hiệu lực sinh học cao (liều lượng sử dụng thấp)

- Phân hủy sinh học nhanh, ít để lại dư lượng trong môi trường và nông phẩm nên thuốc rất thân thiện với môi trường và thường được thay thế các thuốc BVTV thông thường trong các chương trình quản lý dịch hại tổng hợp (IPM)

Do vậy, các thuốc sinh học là đối tượng quan tâm của Hóa học xanh và thường được khuyến cáo sử dụng trong các lĩnh vực sản xuất nông nghiệp sạch nói riêng và nền nông nghiệp bền vững nói chung

Nhược điểm

- Tác động của thuốc trừ sâu vi sinh chậm nên hiệu quả chậm bởi vì thuốc trừ sâu vi sinh thường có quá trình gây bệnh và nhiễm bệnh khi vào cơ thể sâu thì thời gian ủ bệnh phải mất 1-3 ngày Do đó hiệu quả ban đầu không cao

- Phổ tác dụng hẹp do tính chọn lọc cao

4

1.1.2 Tình hình sử dụng thuốc trừ sâu có nguồn gốc sinh học [5]

Thị trường tiêu thụ thuốc BVTV thế giới đã có những thay đổi trong thời gian gần đây Do tính chất độc hại và tồn lưu lâu trong môi trường, ảnh hưởng tới sức khỏe con người và cộng đồng, do tính kháng thuốc của sâu bệnh đối với những sản phẩm sử dụng nhiều lần, thời gian gần đây đã xuất hiện những chế phẩm mới với những phương thức tác động mới, hiệu quả phòng trừ cao

và ít ảnh hưởng tới môi trường và con người

Bảng 1.1 Dự báo tăng trưởng thị trường thuốc phòng trừ dịch hại năm 2011

Khu vực Thuốc trừ cỏ trừ sâu Thuốc Thuốc trừ bệnh Các loại khác Tổng số

Sản phẩm sinh học

Hình 1.1 Dự báo thị trường thuốc BVTV thế giới đến năm 2014

Trên rau và lúa, nông dân đã đầu tư nhiều cho thuốc trừ sâu có nguồn gốc sinh học Họ đã nhận thấy được lợi ích của loại thuốc này, là biện pháp chủ yếu để sản xuất rau an toàn, lương thực, thực phẩm sạch Vì thế, thuốc sinh học tuy giá thành hơi cao nhưng vẫn được ưa chuộng

Tình hình sử dụng thuốc BVTV có nguồn gốc sinh học trên rau được thể hiện ở bảng 1.2 dưới đây :

Bảng 1.2 Tình hình sử dụng thuốc trừ sâu sinh học trên rau

(Nguồn : Báo cáo của Viện Môi trường Nông nghiệp 2009)

Số thuốc sinh học đăng ký qua các năm được thể hiện qua bảng 1.3 dưới đây :

Bảng 1.3 Số lượng thuốc sinh học đăng ký qua các năm

Số lượng đăng ký Năm Sinh học Hóa học

(Nguồn : Số liệu Cục Bảo vệ Thực vật -2011)

1.2 Thuốc trừ sâu vi sinh Bacillus thuringiesis

1.2.1 Giới thiệu chung

Lần đầu tiên vào năm 1870, nhà bác học Pasteur người Pháp đã phát hiện một loài vi khuẩn gây bệnh cho con tằm và đặt tên là Bacillus bombycis Sau đó vào năm 1911, nhà côn trùng học người Đức là Berline đã phát hiện loài vi khuẩn này trên loài sâu xám ở Thuringia vùng Địa Trung Hải và đặt

tên là Bacillus thuringiensis (Bt)

Sau đó đến khoảng giữa thế kỷ 20, người ta đã phát hiện nhiều chủng

Bt ký sinh trên nhiều loài sâu khác nhau như sâu xanh, sâu keo, sâu róm thông Từ đó vi khuẩn Bt đã được chế tạo thành thuốc trừ sâu sử dụng trong nông nghiệp ở nhiều nước, mở đầu cho công nghệ thuốc trừ sâu sinh học

Với những thành tựu của di truyền học và công nghệ sinh học, người ta

đã phát hiện nhiều chủng Bt có khả năng ký sinh mạnh, sản xuất ra những chế phẩm có hàm lượng độc tố và tính ổn định cao để tăng hiệu lực diệt sâu và mở rộng phổ tác dụng trên nhiều loài sâu hại thuộc nhiều bộ côn trùng ở các vùng khí hậu khác nhau Từ đó đến nay đã xác định có tới trên 150 loài sâu hại bị nhiễm các chủng Bt, trong đó bao gồm hầu như toàn bộ đều có ở Việt Nam Hiện nay thuốc trừ sâu từ vi khuẩn Bt đã chiếm phần lớn thị trường thuốc trừ sâu sinh học trên thế giới cũng như ở nước ta Ngoài việc dùng làm thuốc trừ sâu, hiện nay người ta đã tách một số gen từ vi khuẩn Bt ghép vào

hệ thống gen cây để tạo ra các giống cây kháng sâu như giống bông kháng sâu xanh, lúa kháng sâu đục thân, sâu cuốn lá, giống ngô kháng sâu…[7]

Bt là vi khuẩn sinh bào tử hiếu khí, gram dương, kích thước 3-6µm, có phủ tiêm mao không dày Tế bào đứng riêng rẽ và xếp thành từng chuỗi, chứa

7

tinh thể độc có khả năng diệt sâu Bt phát triển trong điều kiện nhiệt độ

15-450C nhưng thích hợp nhất từ 29-300C Tế bào vi khuẩn Bt bao gồm các tinh thể (crystal) và bào tử (spore) Bào tử dạng hình ovan hoặc hình trứng dài 1,2-1,6 µm, có thể nảy mầm sinh dưỡng khi gặp điều kiện thuận lợi (Hình 1.2,

Có 4 loại tinh thể độc

+ Ngoại độc tố: α-exotoxin hay phospholipase

Hình 1.2.Vi khuẩn Bt

Hình 1.4 Bào tử Bt và tinh thể protein tiền độc tố

Hình 1.3 Tế bào vi khuẩn Bt với tinh thể (crystal) và bào tử (spore)

8

+ Ngoại độc tố: β-exotoxin hay ngoại độc tố bền nhiệt

+ Ngoại độc tố: γ-exotoxin hay độc tố tan trong nước

+ Nội độc tố: δ-endotoxin (đây chính là tinh thể độc), chiếm chủ yếu trong 4 loại độc tố (trên 90%) và có khả năng diệt sâu cao nhất

Độc tố này là những hợp chất đạm cao phân tử không bền vững trong môi trường kiềm, môi trường axit mạnh và dưới tác động của một số loại enzym; không tan trong nước và trong nhiều dung môi hữu cơ nhưng không bền trong dung dịch kiềm có độ pH từ 10 trở lên, tan trong dịch ruột của ấu trùng sâu bọ cánh vẩy Độ lớn của tinh thể độc tố từ 0,5-2 mµ α – exotoxin (α ngoại độc tố) có hiệu lực cao đối với ấu trùng bộ cánh vảy, cánh cứng, cánh màng và cánh thẳng β - exotoxin (β ngoại độc tố) có hiệu lực cao đối với sâu non bộ hai cánh, δ– endotoxin (δ nội độc tố) có hiệu lực cao đối với ấu trùng

bộ cánh vẩy Đặc tính chọn lọc chủng Bt của côn trùng phụ thuộc vào pH của ruột giữa các loài khác nhau Ví dụ, ở ruột giữa bộ cánh phấn có pH 8-10, rất thuận lợi cho endotoxin của Bt phát huy tác dụng; trong khi đó ở châu chấu

pH 6,2-7,1, endotoxin không hòa tan nên châu chấu không bị diệt

Bt hầu như không độc với người và động vật máu nóng, không độc với

cá và ong LD50 > 5000mg/kg với chuột Vì vậy có thể dùng trong các lĩnh vực khác nhau mà không gây ảnh hưởng đến cộng đồng và môi trường Hiện nay, Bt là một trong những sản phẩm chủ yếu sử dụng trong các chương trình phòng trừ tổng hợp IPM ở một số nước [4]

1.2.3 Hoạt tính sinh học và ứng dụng

Bt là loại thuốc vị độc, không có hiệu lực tiếp xúc và xông hơi Trong ruột, các đạm tinh thể với khối lượng phân tử lớn bị bẻ gãy bởi dịch kiềm và các enzym thành phân tử nhỏ có hoạt tính như tiền độc tố Ở liều gây chết, các tiền độc tố này sẽ phá hoại các nếp nhăn của ruột giữa, làm hoạt tính của màng ruột bị ngừng trệ và giảm dần, gây tử vong cho côn trùng Vi khuẩn Bt còn gây cho côn trùng tính chán ăn hay ngừng ăn Vì vậy, tuy hiệu lực diệt sâu của Bt chậm nhưng ngay sau khi phun thuốc, sâu đã ngừng gây hại Có hai loại thuốc Bt, loại chứa tinh thể độc tố và bào tử (khoảng 107 bào tử/mg)

và loại thuốc Bt chỉ chứa tinh thể độc tố Sau khi phun, tinh thể độc tố gây hiệu lực ngay và sau đó phân hủy giải độc còn bào tử thì có thể tồn tại lâu (1- 2năm)

9

Cơ chế tác động của tinh thể độc:

- Khi được phun lên lá cây, protein độc tố dưới dạng tinh thể sẽ diệt những loại sâu hại nhất định Cụ thể là sau khi sâu hại ăn phải các tinh thể tiền độc tố, dưới tác dụng của một loại enzym tiêu hoá trong dịch ruột của sâu, tiền độc tố bị hoà tan thành những phân tử nhỏ có hoạt tính độc Các độc

tố này bám vào màng vi mao trong ruột, tạo ra các lỗ rò để cho nước chảy vào, làm sâu mọng nước, ngừng ăn và chết (Hình 1.6)

-Bằng con đường tiêu hoá sâu ăn thức ăn có lẫn Bt chỉ sau khoảng thời gian 1-6 h sâu non bị tê liệt toàn thân

- Sau 2-3 ngày sâu bị chết có màu đen, toàn thân khô cứng (Hình 1.5)

Quá trình từ khi nhiễm Bt cho đến chết thì sâu non có thời gian ủ bệnh, ở những sâu tuổi nhỏ, thời gian tiềm ẩn 1-2 ngày, sâu tuổi lớn thời gian ủ bệnh kéo dài 4-5 ngày Tùy từng độ tuổi sâu mà khả năng chết cũng khác nhau [6]

Hình 1.5 Sâu chết do trúng độc từ thuốc trừ sâu Bt

Hình 1.6 Cơ chế tác động của tinh thể độc đối với sâu

10

Thuốc Bt loại chứa bào tử và tinh thể độc tố được gia công thành dạng bột thấm nước 16000UI/mg, dung dịch đặc 4000 UI/mg Thuốc Bt bột thấm nước được dùng từ 300-2000g/ha để trừ sâu tơ hại rau; sâu xanh hại ngô, bông; sâu đo hại đay; sâu róm hại thông, bọ gậy

Thuốc Bt hỗn hợp được với hầu hết các loại thuốc trừ sâu khác Chế phẩm không chứa bào tử có thể hỗn hợp với nhiều loại thuốc trừ nấm bệnh nhưng không hỗn hợp được với các loại thuốc có tính kiềm mạnh như vôi + lưu huỳnh, vôi + phèn xanh và phân bón hóa học Thuốc Bt rất mẫn cảm với nhiệt độ cao và tia cực tím, do đó cần bảo quản nơi mát [7]

Trong danh mục thuốc BVTV được phép lưu hành tại Việt Nam, năm

2004 có 18 sản phẩm, năm 2010 có 38 sản phẩm đăng ký liên quan đến thuốc trừ sâu Bt [1] Như vậy, xu hướng sử dụng Bt ở Việt Nam ngày càng tăng

Một số thuốc phổ biến như: An huy (8000 IU/mg) WP (Công ty TNHH Trường Thịnh), Biobit 16 H WP, 32 B FC (Forward Int Ltd), Biocin 16 WP,

8000 SC (Cty TTS Sài Gòn), Baolus 50000 IU/mg WP (Công ty TNHH Thuốc BVTV DV TM Nông Thịnh), Comazol (16000 IU/mg) WP (Công ty

CP Nicotex), Vi - Bt 16000 WP, 32000 WP (Cty Thuốc sát trùng Việt

Nam)…

Tại Việt Nam, sử dụng các thuốc Bt để trừ các loài sâu hại sau đây:

- Trừ sâu tơ, sâu ăn tạp, sâu xanh da láng, sâu khoang, trên rau cải, cà chua, dưa leo, đậu cô ve, hành

- Trừ sâu xanh, sâu xanh da láng, sâu khoang, sâu đục hoa, đục quả trên đậu xanh, đậu nành, lạc

- Trừ sâu xanh, sâu ăn tạp, sâu đo, sâu loang, sâu hồng trên thuốc lá, bông vải, đay

1.2.4 Ưu điểm và hạn chế khi sử dụng thuốc trừ sâu Bt

a Ưu điểm

- Không gây ô nhiễm môi trường

- Bt có hiệu lực cao đối với sâu đã kháng các loại thuốc gốc lân, cacbamat…

11

- Tinh thể độc do Bt tạo ra không hoà tan trong dịch dạ dày của người nên thuốc hoàn toàn không độc đối với người cũng như với các động vật có ích khác như cá, ong và các loài thiên địch

- Thời gian cách ly ngắn

b Hạn chế

- Dễ gây hiện tượng kháng thuốc

- Chỉ diệt được sâu non khi chúng ăn lá, không diệt được trứng, nhộng và bướm

- Dễ bị phân huỷ bởi tia cực tím có trong ánh mặt trời

- Chỉ có tác dụng vị độc, không có tác dụng nội hấp, tiếp xúc

- Hạn chế lớn nhất của thuốc trừ sâu Bt là phát tác chậm, 48 tiếng sau khi

ăn độc tố thì sâu mới chết

1.2.5 Các biện pháp làm tăng hiệu quả phòng trừ của thuốc trừ sâu Bt

1.2.5.1 Khắc phục hạn chế bằng điều chỉnh cách sử dụng

- Nên chú ý phun sớm ngay khi cây trồng bị sâu phá hại, thích hợp nhất

là sâu còn non từ 1 đến 3 ngày tuổi Do sâu thường gối lứa nên sau khi phun

5-7 ngày, khi cần thiết phải phun lại một lần nữa để diệt sâu non mới nở

- Nên phun thuốc vào lúc chiều mát, lúc này sâu dễ dàng trúng độc do thường bò lên ăn vào ban đêm Tránh phun thuốc khi trời đang nắng gắt hoặc sắp mưa Sau khi tưới hãy phun thuốc và 1 ngày sau đó có thể tưới trở lại Không sử dụng thuốc trừ sâu Bt trên cây dâu dùng nuôi tằm

- Cần phun ướt đều hai mặt lá nhất là mặt dưới và các bộ phận của cây

mà sâu thích ăn; có thể thêm một ít mật rỉ đường để tăng sự bám dính thì hiệu quả diệt sâu sẽ cao hơn

1.2.5.2 Hỗn hợp Bt với các thuốc BVTV

- Hỗn hợp Bt và Clodimeform (N ’ -(4-clo-o-tolyl)-N,N-dimetyl formamidine)

Hàng loạt thí nghiệm được thực hiện để so sánh hiệu lực của Bt dùng

đơn và Bt hỗn hợp với Clodimeform khi trừ sâu đo (Trichoplusia ni) và sâu bướm (Spodoptera frugiperda) trên cải bắp [13] Robert Kingsbury Clark và

các cộng sự đã nhận thấy rằng khi sử dụng Bt dạng bột thấm nước với liều

12

dùng 2,0l/hecta hiệu quả thấp hơn khi so sánh với Bt hỗn hợp với Clodimeform với tỉ lệ 1:1

- Hỗn hợp Bt với thuốc trừ nhện clo hữu cơ 1,1-bis-(p-clorophenyl)

etanol (DMC); clorophenyl) sulfide (DDDS); clorophenyl) metan (Neotran)

1,1-bis-(p-Tadahary Kitagaki và các cộng sự [19] đã nhận thấy rằng nếu Bt hỗn hợp với các thuốc trừ nhện clo hữu cơ như trên với tỉ lệ 0,5:1 đến 2,0:1, gia công ở dạng bột, bột thấm nước hay nhũ dầu, phòng trừ sâu bệnh trên lá đậu tương thì tỉ lệ sâu chết tăng lên rõ rệt so với Bt chỉ dùng đơn

- Hỗn hợp Bt với thuốc trừ sâu thảo mộc Pyrethrum

Theo tài liệu của nhóm tác giả Edward B Westall [24], khi phối trộn Bt với thuốc trừ sâu thảo mộc pyrethrum với tỉ lệ 12:1 đến 1:20 thì tăng hiệu quả phòng trừ côn trùng chích hút, miệng nhai và ấu trùng

Bt loại 25 000UI/mg được sử dụng để thử nghiệm Pyrethrum được tổng hợp bằng cách sử dụng dung dịch 20% trộn với hạt bentonit sau đó sấy khô tạo hạt Sản phẩm có chứa 50% bentonit và 50% pyrethrum Hỗn hợp Bt và pyrethrum được phối trộn theo tỉ lệ 2:1, 1:1 và 1:2 được xác định LD50

14

Hỗn hợp trên được tiến hành thử hiệu lực sinh học với côn trùng miệng nhai và chích hút trên cải bắp, liều lượng sử dụng 1,12kg/ha Kết quả thu được như sau:

- Hỗn hợp Bt và một số muối vô cơ

Lui Ming Qiu và cộng sự tại đại học Nông nghiệp Huazhong [20] đã nghiên cứu 5 loại muối vô cơ Na2CO3, K2CO3, CaCl2, MgSO4, MgCl2 ở 4 nồng độ khác nhau 0,01; 0,025; 0,05; 0,1% hỗn hợp với Bt ở dạng dầu để

đánh giá hiệu quả phòng trừ P.xylosterlla và Heliothis Kết quả cho thấy cả 5

muối kim loại trên đều có hiệu quả synergist cho Bt

Khi thử nghiệm hiệu lực sinh học trên P.xylosterlla thấy MgCl2 ở nồng

độ 0,1 và 0,01% tăng hiệu lực Bt lên 1,56 và 1,54 lần Na2CO3 0,025% và MgSO4 0,1% tăng hiệu lực lên 1,44 và 1,43 lần

Khi thử nghiệm trên Heliothis thấy rằng Na2CO3 0,025% và MgSO4

0,125% tăng hiệu lực Bt lên 1,69 và 1,59 lần

- Hỗn hợp Bt với Natri benzoat và một số muối của EDTA

Một số phương pháp sinh hóa được sử dụng để tăng hiệu lực phòng trừ

của Bt var entomocidus khi xử lý sâu ăn lá trên cây bông Spodoptera

littoralis [18] Hàng loạt thử nghiệm khác nhau được tiến hành để đánh giá

khả năng tăng hiệu lực của nội độc tố endotoxin Kết quả chỉ rằng một số tác nhân tạo nhũ với chất béo, tác nhân làm bền protein làm tăng hiệu lực của nội độc tố từ 2,7 đến 21,7 lần Một số muối được sử dụng như natri benzoat, muối

Ca, Zn, Cu của EDTA tăng hiệu lực lên 19 đến 21 lần Vì vậy khi kết hợp với

Bt làm hoạt chất có hiệu lực cao ở nồng độ thấp khi hỗn hợp với các chất này

15

- Hỗn hợp Bt với virus

Nhóm tác giả Nguyễn Thúy Hà, Phạm Thị Thùy [3] đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của hỗn hợp chế phẩm sinh học Bt và virus đến khả năng diệt sâu trên cây su hòa vụ đông xuân sớm năm 200 tại Thái Nguyên Kết quả thấy rằng, ở thí nghiệm dùng thuốc trừ sâu sinh học Bt hỗn hợp với virus để trừ sâu hại rau su hào đã khống chế được sự phát triển của sâu hại rau, giúp cây phát triển một cách thuận lợi, nâng cao năng suất su hào Ngoài ra các chỉ tiêu về sinh trưởng, các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất cao hơn đối chứng chỉ

sử dụng Bt Năng suất su hào đạt 22,5 tấn / ha tương đương với công thức phun theo địa phương 23 tấn/ha Phân tích nhanh dư lượng thuốc BVTV bằng Test kit cho thấy, ở các công thức xử lý bằng chế phẩm sinh học không có dư lượng thuốc BVTV còn công thức phun theo địa phương đã phát hiện là dư lượng ở mức không an toàn

- Hỗn hợp BT với dầu khoáng (mineral oil)

Năm 2007, B Amiri Besheli làm việc tại Phòng thí nghiệm Độc học,

Bộ môn BVTV, Khoa nghiên cứu Hóa nông, trường ĐH Tổng hợp Mazandaran, Iran đã sử dụng dầu khoáng làm chất synergist cho thuốc trừ

sâu Bt để diệt loài sâu đục cành cam Phyllocnistis citrella Stainton

(Lepidptera: Gracillariidae) [11] Vai trò của dầu khoáng có thể làm tăng

khả năng thẩm thấu thuốc Bt vào lớp biểu bì của cây

Ngoài ra, một số hợp chất hóa học được thêm vào làm tăng họat tính cho Bt bao gồm axit formic (0,5%), maleic axit (0,5%), CaCl2 (0,5%), citric axit (1%), nurcap metanol (0,5%), ure (0,5%), K2CO3 (0,1%) [27]

Như vậy, vai trò của các chất synergist cho Bt rất quan trọng vì vậy đã

có nhiều công trình đã được nghiên cứu và áp dụng vào thực tế sản xuất

16

đồng trong hỗn hợp gia công và áp dụng ngoài đồng ruộng là biện pháp mang lại lợi ích kinh tế xã hôi to lớn vì không phải tăng lượng thuốc sử dụng mà hiệu quả phòng trừ vẫn tốt, giảm thiểu sự ô nhiễm môi trường

Các chất có tác dụng hiệp đồng là những chất hóa học có hoặc không

có hoạt tính độc với sâu bệnh, nhưng khi kết hợp với một chất BVTV trong sử dụng sẽ làm thay đổi quá trình chuyển hóa trong cơ thể côn trùng nhằm tăng độc tính của thuốc đối với côn trùng đó Hiện tượng đó gọi là hiện tượng hiệp đồng tác dụng

Ưu điểm chính trong việc sử dụng các chất synergist là rất hiệu quả đối với hiện tượng kháng thuốc của côn trùng Sự có mặt của các chất synergist trong thành phần hỗn hợp của thuốc loại trừ khả năng kháng thuốc của sâu bệnh, thậm trí tăng độ độc của hoạt chất lên nhiều lần, do vậy liều lượng sử dụng của hoạt chất giảm đáng kể Kết quả vừa có ý nghĩa về kinh tế, vừa giảm thiểu ô nhiễm môi trường [4]

1.3.1.2 Cơ chế tác động của các chất synergist

Mặc dù hiện tượng synergist được khám phá cách đây trên 60 năm và

số lượng các chất được sử dụng như những synergist cho đến nay đã lên đến hàng nghìn, việc nghiên cứu cơ chế tác động còn tốn nhiều công sức và thời gian vì quá trình chuyển hóa trong cơ thể côn trùng rất phức tạp [5]

Gần đây do nhu cầu, các chất synergist được nghiên cứu và áp dụng vào thực tế tăng lên Với nhiều thiết bị hiện đại và phương pháp nghiên cứ tiên tiến các nhà khoa học đã có thể đi sâu vào tìm hiểu cơ chế tác động, sự chuyển hóa trong cơ thể côn trùng dẫn đến khả năng phòng trừ sâu bệnh của các chất BVTV

Cơ chế tác động của các chất synergist có thể được giải thích theo nhiều cách:

- Cơ chế sinh học: các chất synergist tác dụng lên hệ thống các enzym chuyển hóa của côn trùng

- Cơ chế hóa học: cấu trúc hóa học của các chất synergist dự trữ một năng lượng liên kết dư, có khả năng tham gia vào hiện tượng cộng hưởng năng lượng với cấu trúc hóa học của các chất BVTV, làm tăng độc tính của chúng lên hoặc làm giảm sự phân hủy của hoạt chất trong cơ thể côn trùng

17

- Cơ chế lý hóa : các chất synergisi có khả năng làm thay đổi quá trình xâm nhập các chất độc vào cơ thể côn trùng hoặc làm thay đổi quá trình đào thải chất độc ra khỏi cơ thể chúng

Trong cơ thể côn trùng, các chất synergist có tác dụng:

-Làm ức chế hoạt động của các enzym gây kháng thuốc, từ đó hạn chế

sự giải độc của côn trùng, không còn hiện tượng quen thuốc Ví dụ: S,S,S – tributylphosphotrithoat ức chế enzym esterase, piperonyl butoxide ức chế enzym mixed fuction oxidase (MFO), SKF-525-A ức chế enzym monooxygenase (MM), dimetyl maleat ức chế enzym MFO, triphenyl-phosphat ức chế enzym carboxylesterase…

-Kìm hãm quá trình chuyển hóa, vận chuyển các chất cần thiết nuôi dưỡng cơ thể côn trùng như oxy, glucose

-Xúc tác cho quá trình phản ứng giữa thuốc với một số enzym (ví dụn enzym colinesterase), gây ức chế hoạt động của các enzym này, ngăn cản khả năng cảm thụ của các tế bào thần kinh, làm ngưng trệ hoạt động chức năng của các cơ quan côn trùng Vì vậy quá trình ngộ độc xảy ra nhanh hơn

Ngoài ra trong một số trường hợp, có một số synergist tác dụng theo những cơ chế riêng khác

1.3.1.3 Kỹ thuật sử dụng các chất synergist trong gia công thuốc BVTV [6]

Việc hỗn hợp hai hay nhiều chất hóa học với nhau trong gia công nông dược nhằm mang lại hiệu quả cao phụ thuộc vào nhiều yếu tố:

-Tính chất lý hóa của synergist, hoạt chất và các phụ gia cho gia công (chất mang, chất hoạt động bề mặt, chất ổn định…) vì nó quyết định khả năng hỗn hợp, gia công để tạo ra chế phẩm bền và tốt

-Tỷ lệ hỗn hợp giữa synergist và hoạt chất hoặc giữa các chất với nhau -Hoạt tính của hệ thống các enzym tham gia vào quá trình chuyển hóa

và giải độc của cơ thể côn trùng

Vì vậy khi chọn và sử dụng các chất synergist cần lưu ý một số kỹ thuật sau:

1 Mỗi một chất synergist chỉ có thể phù hợp với một hoạt chất nhất định, cũng như chỉ có hiệu quả đối với một số đối tượng sâu bệnh nhất định, thậm chí cùng một đối tượng sâu bệnh nhưng chỉ vào giai đoạn sinh trưởng nhất

3 Cách hỗn hợp: tốc độ thẩm thấu qua thành tế bào và phân bố lượng chất synergist trong cơ thể côn trùng cho đến khi ức chế được enzym giải độc đối với từng cá thể khác nhau và quyết định việc sử dụng synergist đồng thời với các hoạt chất hay không để đạt được hiệu quả cao nhất Từ đó xác định cách

hỗn hợp và gia công cho từng loại chế phẩm

1.1.3.4.Giới thiệu một số chất synergist phổ biến [5]

Các chất synergist đầu tiên được phát hiện là những hợp chất có nguồn gốc tự nhiên được tách ra từ các chất có trong dầu thực vật Sau đó dựa vào cấu trúc hóa học của các chất này, người ta đã tìm cách tổng hợp các chất

tương tự Do vậy có thể chia thành hai nhóm như sau :

a Chất synergist có nguồn gốc tự nhiên

STT Tên chất Công thức hóa học Nguồn gốc Hiệu quả tác dụng

dầu vừng

Hỗn hợp với pyrethrin thì hoạt tính trừ sâu tăng 2-5 lần

2 Hynochinin H 2 CO

CH2O

OCO

CH2 CH2 Tách từ cây

ChamalcyparisTusa

Tương đương với sesamin

3 Piperin Alcaloid trong cây hạt tiêu

19

b Một số synergist tổng hợp

Từ những năm 80 của thế kỷ trước, do vấn đề ô nhiễm môi trường đã trở nên trầm trọng, hàng loạt các công trình được công bố sử dụng các chất synergist có nguồn gốc tự nhiên hỗn hợp với thuốc trừ sâu nhằm tăng hiệu

lực phòng trừ của thuốc và giảm hàm lượng hoạt chất sử dụng

1.3.2 Các chất synergist có nguồn gốc tự nhiên

1.3.2.1 Giới thiệu chung

Lịch sử phát triển của các chất synergist bắt đầu bằng những công trình nghiên cứu về sử dụng hiệu quả và ổn định hoạt chất pyrethrum tách từ hoa

cúc Chrysanthemum mọc ở Kenya để diệt ruồi, muỗi và các côn trùng y tế

khác

Trong quá trình sử dụng, đã có nhiều công trình nghiên cứu về các chất synergist ứng dụng vào thực tế, trong đó các chất có nguồn gốc tự nhiên ngày càng được quan tâm do thân thiện với môi trường và nguồn nguyên liệu tái tạo phong phú Các synergist tự nhiên bao gồm:

a) Các synergist có nguồn gốc dầu béo

Trong số các nguyên liệu tự nhiên, người ta quan tâm đến các dầu thực vật như dầu đậu nành, dầu thầu dầu, dầu họ cam chanh, hương nhu, dầu quế, đinh hương, dầu vừng, ngũ cốc, dầu bông, hạt tiêu, chè, xoan…vì một

số chất có hoạt tính sinh học đối với côn trùng y tế (ruồi, muỗi, kiến, gián)

Đã có nhiều công trình nghiên cứu được công bố, cụ thể:

20

- Ngay từ năm 1940, Craig Eagleson và Fruidale Tex đã nhận thấy khi

thêm dầu vừng (sesame oil) từ cây vừng (Seasamum indicum) vào các

thuốc trừ sâu tự nhiên pyrethrin thì hoạt tính sinh học của chúng tăng đáng

kể so với khi không có dầu vừng Từ đó người ta đã đi sâu nghiên cứu về dầu vừng và đã tách được chất sesamin và sesamolin [15]

Sesamin và sesamolin đều không có tác dụng trừ sâu Nhưng khi hỗn hợp với pyrethrin thì hoạt tính trừ sâu của pyrethrin tăng lên 2 - 5 lần

- Tương tự như các sản phẩm từ dầu vừng, Sesamex được M Boroza xác định như chất synergist đối với các chất pyrethrin và pyrethroid vào

năm 1956 Hãng Shulton Inc đăng ký dưới tên thương mại là Sesoxane

Sản phẩm được điều chế từ phản ứng ngưng tụ sesamol (thu được từ piperonal khi xử lý với axit peraxetic) với vinyl-etyl ete của etylenglycol

Từ những năm 80 của thế kỷ trước, do vấn đề ô nhiễm môi trường đã trở lên trầm trọng, hàng loạt các công trình được công bố sử dụng các chất synergist có nguồn gốc các dầu thực vật, hỗn hợp với thuốc trừ sâu nhằm tăng hiệu lực phòng trừ của thuốc và giảm hàm lưQợng hoạt chất sử dụng Sau đây là một số ví dụ:

- Năm 1990, Puritch, George, S đã đăng ký công trình nghiên cứu với tên là “Thuốc trừ sâu thân thiện môi trường”, trong đó ông cũng sử dụng muối Natri hoặc Kali của 2 axit oleic và linoleic như chất synergist, hỗn hợp với các thuốc trừ sâu dãy pyrethroid như Fenvalerate, Permetrin, Cypermetrin để tạo ra sản phẩm “xà phòng an toàn” chống các côn trùng như rệp, ruồi [22]

- Gần đây nhất, năm 2010, Byron I Reid và cộng sự đã công bố công trình nghiên cứu một cách tương đối toàn diện về sử dụng các synergist khác nhau trong gia công thuốc trừ côn trùng y tế như gián, kiến…Các synergist sử dụng là axit oleic, axit linoleic (1%), metyl oleat, metyl linoleat, metyl palmitat (5%)…, còn thuốc trừ sâu là Imidacloprid [12]

- Dạng gia công bả (bait) sử dụng trong công tác phòng trừ côn trùng y

tế rất thuận tiện vì dễ dùng, ít gây ô nhiễm môi trường xung quanh Vì vậy, lĩnh vực này cũng được quan tâm từ lâu Năm 1998, Barcay và công sự đã nghiên cứu thành công bả trừ gián, kiến, rệp, ruồi, trong đó sử dụng hỗn hợp chủ yếu là axit boric, dầu đậu nành, đường mía hoặc dịch chiết từ

b) Các synergist có nguồn gốc tự nhiên khác

Ngoài nguyên liệu ban đầu từ dầu béo (sau đó chuyển hóa tiếp) hoặc dùng trực tiếp làm các chất synergist cho thuốc trừ sâu, các nguyên liệu có nguồn gốc tự nhiên khác cũng được nghiên cứu trong thời gian qua

Axit kojic [5-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-4-pyrone], một sản phẩm phụ của quá trình lên enzym lúa mạch để sản xuất rượu sake ở Nhật Bản, sử dụng

chủng enzym Aspergillus oryzae (người Nhật gọi là enzym koji) và các dẫn

xuất este đã được sử dụng làm chất synergist cho một số thuốc trừ sâu pyrethroid và carbamat Chúng có thể thay thế cho chất synergist piperonyl butoxide [21]

Mặt khác, nguồn dầu mỡ cá cũng là nguyên liệu tiềm tàng để tạo các chất synergist cho thuốc BVTV Tác giả David Keen và Stuart, Fl đã giới thiệu hỗn hợp mỡ cá mòi dầu với dầu vừng, lecithin với các loại thuốc trừ sâu, trừ nấm khác nhau để tạo sản phẩm trừ một số côn trùng hại cam như nhên đỏ, tuyến trùng đất, rệp…rất hiệu quả Hỗn hợp dầu mỡ cá và dầu vừng có tác dụng như những chất mang cho gia công, vừa đóng vai trò là chất synergist cho thuốc [16]

Như vậy, các chất có nguồn gốc tự nhiên sử dụng trong gia công thuốc BVTV rất đa dạng và đa dụng Chúng đóng vai trò như những chất synergist, nhưng cũng đồng thời là chất mang, phụ gia cho hoạt chất, tạo sản phẩm có hiệu lực sinh học cao hơn, đồng thời rất thân thiện với môi trường Hiện nay, ngày càng có nhiều công trình nghiên cứu và ứng dụng

1.3.2.2 Một số synerigst tự nhiên dùng cho thuốc trừ sâu Bt

a Các axit béo không no và muối của nó

Gaudet và cộng sự đã công bố công trình sử dụng muối của các axit béo không no C18 như axit oleic, linoleic làm chất synergist cho thuốc trừ

sâu vi sinh Bt phòng trừ sâu Halisidota argentata [17] Kết quả giảm đáng

kể hàm lượng Bt sử dụng đồng thời giảm thời gian knock out, làm cho sâu chết nhanh hơn, khắc phục nhược điểm của thuốc trừ sâu Bt

b Dầu chiết từ cây ngải thân đỏ (Artemisia scoparia) synergist với Bt để phòng trừ ấu trùng bướm trên cây cải bắp

Hòa trộn dịch dầu thô chiết xuất từ cây ngải thân đỏ (Artemisia scoparia) với Bt để diệt trừ ấu trùng bướm trắng trên cải bắp với tỉ lệ 1:8,8 (Bt loại 1,5x109 UI/mg) trong cùng điều kiện ánh sáng Kết quả hệ số synergist thu được là 208,4 Sau 72h, tỉ lệ ấu trùng chết đạt 76,3% [18]

c Hợp chất avidin và Bt trừ sâu trên cây bông

Việc sử dụng cây bông có gen Bt trở nên phổ biến Ngày nay, nhằm nâng cao hiệu quả và giảm sự kháng côn trùng của Bt, người ta sử dụng avidin như là một chất synergist cho Bt Avidin là một protein trong lòng trắng trứng Avidin là một protein trong lòng trắng trứng, có thể liên kết với biotin (vitamin H) làm mất hoạt tính của biotin nhưng an toàn với động vật bậc cao Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, sự có mặt của avidin trong thức ăn

có thể giảm sự tăng trưởng của côn trùng bộ cánh phấn Vì avidin là protein

có hoạt tính sinh học nên khi kết hợp với Bt, gen của nó được chèn vào bộ gen của cây bông hay xếp chồng lên nhau với các gen của Bt Zhu, Yu Cheng và các cộng sự đã xác định tỉ lệ tử vong của 3 loài côn trùng bộ cánh

phấn Helicoverpa zea (Boddie), Spodoptera exigua (Hübner), and Anticarsia

gemmatalis (Hübner) khi có mặt của avidin Các thử nghiệm được tiến hành

vào giai đoạn côn trùng mới nở hoặc hóa nhộng, người ta thấy rằng, ở liều lượng 10ppm avidin không có tác dụng nhưng ở nồng độ 100ppm thì 100%

23

côn trùng bị chết Khi hỗn hợp Bt + Avidin thì tỉ lệ tử vong tăng lên 57% so với 21,6% khi chỉ dùng Bt [25]

d Dầu neem hỗn hợp với Bt trừ sâu xanh và sâu tơ [2]

Nhằm mục đích tăng khả năng tác dụng nhanh và hiệu quả, nhóm tác giả Vũ Văn Độ và cộng sự đã tiến hành phối trộn dầu neem và Bt và khảo sát

hiệu quả gây chết của chế phẩm này trên sâu xanh (Heliothis armigera) và sâu

tơ (Plutella xylostella)

Các thí nghiệm được thiết kế theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại Đối với sâu xanh các nghiệm thức bao gồm 15 chế phẩm đuợc bố trí ở

3 nồng độ 5%, 10%, 15% và đối chứng không xử lý Đối với sâu tơ: các thí nghiệm bao gồm 15 chế phẩm được bố trí ở 3 nồng độ 2,5%; 5%; 7,5% và đối chứng không xử lý Kết quả cho thấy rằng chế phẩm phối trộn giữa dầu neem

và Bt gây chết sâu xanh và sâu tơ mạnh hơn so với chế phẩm chỉ chứa dầu neem hoặc Bt Các chế phẩm phối trộn có tác động chậm, cần đỏi hỏi thời gian nhất định để đạt hiệu lực gây chết đối với sâu tơ (1 đến 2 ngày) và sâu xanh (5-6 ngày)

1.3.3 Lựa chọn chất synergist hỗn hợp với Bt trừ sâu trên rau

Qua các tài liệu tổng quan trên ta thấy, tùy thuộc vào mục đích sử dụng khác nhau có thể lựa chọn các synergist phù hợp cho thuốc trừ sâu Bt Đối tượng phòng trừ lựa chọn là một số loài sâu hại rau có tính kháng thuốc cao như sâu khoang và sâu tơ Sử dụng thuốc trừ sâu vi sinh Bt phù hợp với vùng sản xuất rau sạch, vì vậy đề tài lựa chọn nội dung nghiên cứu tổng hợp chất synergist cho thuốc trừ sâu Bt là hỗn hợp muối kali của axit oleic và linoleic (được chiết tách từ dầu thực vật) do:

- Không độc, không ô nhiễm môi trường

- Hầu hết các dầu thực vật sẵn có ở Việt Nam đều chứa hàm lượng khá cao hai axit trên Quá trình tách chúng không quá phức tạp

- Các hợp chất này không độc, dễ phân hủy sinh học, không để lại dư lượng trong nông phẩm và môi trường, rất phù hợp cho đối tượng sử dụng

1.3.4 Các phương pháp chiết tách axit béo từ dầu thực vật

Trên thế giới hiện nay thường sử dụng các phương pháp sau để tạo các sản phẩm axit béo có hoạt tính sinh học cao:

24

Hình 1.7 Sơ đồ các phương pháp chiết axit oleic và linoleic từ dầu thực vật

-Phương pháp 1: Sử dụng các phương pháp hóa học để tinh chế axit

oleic và linoleic

-Phương pháp 2: Tách trên cột Silicagen, tráng bạc AgNO3 Phương pháp này phù hợp với quy mô nghiên cứu nhỏ cho phân tích thí nghiệm, không phù hợp với quy mô sản xuất vì AgNO3 có giá thành rất cao

-Phương pháp 3: Dùng sắc kí lỏng cao áp pha đảo C18 Phương pháp

này tiêu tốn lượng lớn dung môi tinh khiết, chi phí lớn dẫn tới giá thành sản phẩm sẽ cao

- Phương pháp 4: Sử dụng hệ enzym đặc hiệu Lipaza để phân lập các

axit béo oleic và linoleic Phương pháp này đòi hỏi phải có các kỹ thuật với công nghệ vi sinh tiên tiến, không phù hợp với điều kiện Việt Nam

Lựa chọn phương án công nghệ chiết tách axit oleic và linoleic

Xét trên phương diện hiệu quả kinh tế và điều kiện thực tiễn, các phương pháp 2,3,4 đều sử dụng các phương tiện thiết bị hóa chất chuyên dụng, đắt

tiền bởi vậy ở điều kiện cụ thể tại Việt Nam, phương pháp 1 (phân lập và tinh

chế bằng phương pháp hóa học) sẽ được chọn là phương pháp để tách chiết

và phân lập axit oleic và linoleic cho các thử nghiệm tiếp theo

Sau quá trình thủy phân dầu thực vật, thu được axit béo tổng chứa các axit béo no và không no Để loại bỏ axit béo no và làm giàu axit béo không

no, đề tài tiến hành các phương pháp tinh chế axit oleic và linoleic

1.3.5 Lựa chọn phương pháp làm giàu (tinh chế) axit oleic và linoleic

Có nhiều phương pháp làm giàu axit béo không no như: tách phân đoạn bằng ly tâm phân tử, kết tinh phân đoạn ở nhiệt độ thấp, chưng cất chân

- Phương pháp tạo phức với urê: dựa trên khả năng của urê khi tạo phức với các axit béo no và không no dựa trên nguyên lý axit béo no và không no một nối đôi sẽ tạo thành phức kết tủa với urê Trong khi đó các axit béo không no đa nối đôi (linoleic) không tạo phức như vậy Để thực hiện phản ứng triệt để thường sử dụng dung môi hữu cơ để hòa tan, thông thường là cồn Trong quá trình thực hiện phản ứng các axit béo no, và một phần không no một nối đôi sẽ tạo thành phức, kết tủa xuống trong khi các axit béo không no

đa nối đôi sẽ ở lại trong dịch Kỹ thuật tạo phức với urê là công cụ hữu hiệu

để làm sạch các axit béo đa nối đôi từ nguồn nguyên liệu dầu thực vật

Lựa chọn phương pháp tạo phức với urê để làm giàu axit béo không no Quá trình này được thực hiện như sau: Tạo hỗn hợp đồng nhất giữa axit béo

và urê Sau đó làm lạnh để kết tủa urê Lúc này axit béo no và một phần axit béo không no 1 nối đôi sẽ hình thành phức với urê và kết tủa xuống Tinh thể urê khi kết tinh dạng hình lục giác có lỗ rỗng ở giữa Với lỗ rỗng này, một số axit có thể lọt vừa khít vì vậy được lọc và loại bỏ ra khỏi dung dịch Axit béo

no mạch thẳng hình thành phức dễ dàng nhưng axit béo không no do có nối đôi làm tăng độ phức tạp của cấu trúc vì thế khố kết tinh hoặc không thể kết tinh Khi quá trình kết tinh hoàn thành, axit béo no và một phần axit béo không no một nối đôi tạo phức trong nhưng axit béo không no đa nối đôi sẽ ở lại trong dung dịch Vì vậy sẽ làm giàu hàm lượng axit béo không no đa nối đôi

26

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM

2.1 Phương pháp và nội dung nghiên cứu

2.1.1 Phương pháp nghiên cứu

- Trên cơ sở các tài liệu đã công bố về thành phần các dầu thực vật sẵn

có ở Việt Nam, đề tài lựa chọn loại dầu có hàm lượng hai axit oleic và linoleic

có thành phần phù hợp để nghiên cứu chiết tách bằng phương pháp và trang thiết bị thông thường trong phòng thí nghiệm Sau đó tách, làm giàu các axit béo không no ra khỏi hỗn hợp axit béo thu được Chuyển hóa thành muối kali

để tạo hỗn hợp synergist cho Bt

- Để đánh giá khả năng tăng hiệu lực của thuốc trừ sâu Bt, chúng tôi lựa chọn 2 đối tượng sâu khoang và sâu tơ trên rau để khảo nghiệm các công thức hỗn hợp thuốc với synergist Từ đó xác định công thức hỗn hợp tối ưu cho từng đối tượng phòng trừ

- Tiến hành khảo nghiệm sinh học của sản phẩm, qua đó xác định khả năng tăng hiệu lực đối với thuốc trừ sâu Bt, so sánh với sản phẩm không có synergist

- Khảo nghiệm sinh học của sản phẩm được tiến hành tại Viện Bảo vệ Thực vật bằng các phương pháp qui định

- Ngoài ra, trong quá trình nghiên cứu có sử dụng phương pháp qui hoạch hóa thực nghiệm để xác định các thông số tối ưu

2.1.2 Nội dung nghiên cứu

2.1.2.1 Khảo sát lựa chọn dầu thực vật làm nguyên liệu ban đầu

Xác định thành phần và hàm lượng axit oleic và linoleic trong dầu thực vật, lựa chọn dầu thực vật có thành phần phù hợp yêu cầu Theo các tài liệu

tham khảo tỉ lệ hỗn hợp axit oleic : axit linoleic là 54%:43% [12]

2.1.2.2 Khảo sát quá trình thủy phân dầu để tách các axit béo và làm giàu axit béo oleic và linoleic

Từ nguyên liệu dầu thực vật, hai axit oleic và linoleic được tách như sau:

- Bước 1: Thu axit béo tổng bằng cách thủy phân dầu thực vật:

27

Phản ứng thủy phân dầu thực vật bằng dung dịch KOH/C2H5OH ở nhiệt

độ 70-800C trong 2 giờ Kiểm tra phản ứng bằng SKLM silicagen cỡ hạt 40µm (bản 6×6 cm), hệ dung môi benzen, hiện hình bằng dung dịch H2SO4

10-10%/ CH3OH Sau phản ứng, để nguội rồi trung hòa bằng dung dịch H2SO4

10% đến pH = 1-2, sau đó rửa bằng nước cất đến trung tính (pH=7) Chiết tổng axit béo bằng n-hexan, lớp n-hexan ở trên chứa các axit béo Dịch chiết n-hexan được làm khan bằng Na2SO4 và cất chân không ở nhiệt độ t < 400C nhận được axit béo tổng Phân tích chỉ số axit của hỗn hợp axit béo thu được, tính toán hiệu suất thủy phân Hiệu suất quá trình thủy phân dầu thực vật đượctính như sau:

Trong đó: H: Hiệu suất quá trình thủy phân

m: Khối lượng axit béo tổng thu được sau quá trình thủy phân (g) M: Khối lượng dầu ban đầu (g)

- Bước 2 : Làm giàu axit không no linoleic bằng cách phân lập axit oleic

và linoleic ra khỏi các axit no bằng phương pháp tạo phức với urê

Cho axit béo tổng thu được sau quá trình thủy phân vào hỗn hợp urê và cồn theo các tỉ lệ khác nhau Khuấy và gia nhiệt ở 800C cho đến khi hỗn hợp tan hoàn toàn, sau đó tiếp tục đun ở nhiệt đô thích hợp trong 2h Sau đó làm lạnh sâu trong 12 giờ Tiếp theo, đem lọc bỏ bã, dung dịch thu được đem cất loại dung môi đến thể tích còn lại bằng 1/3 thể tích ban đầu Trung hoà bằng axit H2SO4 10% (pH=4), sau đó chiết bằng n-hexan Cuối cùng làm khan bằng Na2SO4, thu được hỗn hợp hai axit, đem phân tích trên GC

Hiệu suất quá trình làm giàu axit béo:

Trong đó: m: Khối lượng axit béo tổng (g)

m1: Khối lượng axit béo thu được sau khi làm giàu (g)

28

2.1.2.3 Phương pháp qui hoạch hoá thực nghiệm bậc 2 tâm xoay

Phương pháp mô hình hoá thực nghiệm bậc hai tâm xoay được áp dụng

để khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình làm giàu axit béo không no Phương trình hồi quy bậc hai tâm xoay có dạng tổng quát như sau:

Trong đó :

- Y: Hàm mục tiêu, mô hình nghiên cứu mô tả qui luật tìm được

- xi: Yếu tố ảnh hưởng lên hàm mục tiêu

- bi: Hệ số hồi qui bậc 1, mô tả ảnh hưởng của xi lên hàm mục tiêu

- bij: Hệ số hồi qui bậc 1, mô tả ảnh hưởng đồng thời của hai yếu tố xi và

xj lên hàm mục tiêu

- bii: Hệ số hồi qui bậc hai miêu tả ảnh hưởng bậc hai của xi

Hệ số hồi qui b của phương trình hồi qui cho ta biết về mức độ ảnh hưởng

và chiều hướng ảnh hưởng lên hàm mục tiêu Nguyên tắc tìm các hệ số hồi qui là có bao nhiêu ẩn số (hệ số hồi qui b) thì ít nhất phải có bấy nhiêu phương trình

Phương trình hàm mục tiêu (phương trình hồi qui) nhằm mô tả ảnh hưởng của tất cả các yếu tố lên quá trình bằng một phương trình Khi tìm được hàm mục tiêu mô tả đúng thực nghiệm, chúng ta sẽ tính trước được giá trị của hàm mục tiêu, tức là tính được kết quả nghiên cứu mà không cần làm thực nghiệm Phương pháp qui hoạch hóa thực nghiệm gồm các bước sau :

Lập bảng qui hoạch hóa thực nghiệm

Làm thí nghiệm theo bảng

Xây dựng hàm mục tiêu

Dựa vào hàm mục tiêu tìm điều kiện tối ưu

29

Phần mềm MODDE 5.0 được sử dụng để xây dựng mô hình qui hoạch hoá thực nghiệm bậc 2 tâm xoay trong báo cáo này

2.1.2.4 Khảo sát quá trình tạo muối kali của hai axit oleic và linoleic

Tạo dung dịch axit béo 10% trong nước Khấy trộn sao cho axit béo phân tán đều trong nước và đun cách thủy đến nhiệt độ cần khảo sát Sau đó bắt đầu nhỏ giọt dung dịch KOH tới khi pH =8,5 Tiếp tục khuấy đến khi về nhiệt độ phòng rồi ổn định qua đêm Hàm lượng muối kali oleat và kali linoleat được xác định thông qua hàm lượng axit còn lại trong sản phẩm

2.1.2.5 Lựa chọn công thức hỗn hợp

Sau khi tham khảo tài liệu, sản phẩm cuối cùng được hỗn hợp và gia công với thuốc trừ sâu Bt theo những tỷ lệ khác nhau Thử sơ bộ hiệu lực sinh học, có so sánh với đối chứng thuốc Bt nhằm chọn công thức gia công hỗn hợp thích hợp có tác dụng phòng trừ cao nhất

2.1.2.6 Khảo nghiệm hoạt tính sinh học của sản phẩm trên một số đối tượng sâu bệnh

Với mục đích tổng hợp muối kali của axit oleic và linoleic dùng tăng hiệu lực của thuốc trừ sâu Bt và giảm tính kháng thuốc của sâu bệnh, sau khi nghiên cứu qui trình tổng hợp, sản phẩm được thử nghiệm tại Viện Bảo vệ Thực vật Qui trình khảo nghiệm và xử lý số liệu được thực hiện theo qui định hiện hành của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn

Sâu khoang (Spodoptera litura) và sâu tơ (Plutella xylostella) là những

đối tượng gây hại đối với nhiều loại cây trồng nông nghiệp quan trọng như bông, đay, bắp cải, rau…Để phòng trừ hai đối tượng này, đặc biệt là sâu khoang, người ta chủ yếu sử dụng các biện pháp hóa học Tuy nhiên, việc nghiên cứu các biện pháp kiểm soát sâu hại có tính an toàn và thân thiện với môi trường trong đó có biện pháp sinh học đang được quan tâm ở nhiều quốc gia trên thế giới Bt là một trong những vi khuẩn có mặt tự nhiên trong đất và phân bố rộng khắp Tuy nhiên Bt có hạn chế như thời gian tác dụng kéo dài,

dễ bị phân hủy do tác động của ngoại cảnh, thậm chí bị kháng thuốc Nhằm mục đích tăng khả năng tác dụng nhanh và hiệu quả, nhóm đề tài đã tiến hành phối trộn synergist và Bt và khảo sát hiệu quả gây chết của chế phẩm này trên

sâu khoang (Spodoptera litura) và sâu tơ (Plutella xylostella)