Nghiên cứu ứng dụng quy trình tách, bảo quản DNA và lymphocyte người mường việt nam

đáo cáo ngiưệm thu Dé tai PHAN A: TOM TAT CAC KET QUA CHINH CUA DE TAI 1 Kết quả chủ yếu đạt được của đề tài: Xuất phát từ nhu cầu cân có DNA và lymphocyte để phục vụ cho một số côn

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

CẤP QUẢN LÝ ĐỀ TÀI: BỘ Y TẾ

CƠ QUAN CHỦ TRÌ : TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU ỨNG ĐỤNG QUY TRÌNH TÁCH,

BAO QUAN DNA VA LYMPHOCYTE NGƯỜI MƯỜNG VIỆT NAM

Chủ nhiệm đề tài : PGS.TS Văn Đình Hoa

Trưởng Bộ môn Miễn dịch-Sinh lý bệnh Thư ký đề tài : TS Nguyễn Thị Vinh Hà

Những người thực hiện chính:

1.PGS.TS Văn Đình Hoa - Trường Đại học Y Hà nội

2 TS Nguyén Thị Vinh Hà - Trường Đại học Y Hà nội

3 BS Hồ Quang Huy - Trường Đại học Y Hà nội

4 BS Lê Ngọc Anh - Trường Đại học Y Hà nội

5 TS Ta Thi Tinh - Vién Sét rét-Ky sinh tring-Cén tring TW

Với sự tham gia kỹ thuật:

1 KS Tạ Thị Mến

2 KTV Phan Mai Hoa

3 KTV Nguyễn Thị Minh Huyền

Thời gian thực hiện để tài: Từ tháng 08/2002 đến tháng 09/2003

Tổng kinh phí được cấp : 100.000.000 đồng

5JÐ2-

MỤC LỤC

MỤC LỤC

PHẦN A Tóm tắt các kết quả chính của đề tài

PHAN B Nội dung báo cáo chỉ tiết kết quả nghiên cứu

2.1.3 Một số tính chất quan trọng của DNA

2.1.4 DNA tham gia cấu tạo Chromosom

2.1.5 Tổng hợp acid deoxyribonucleic

2.2 Chiết tách, tỉnh khiết, bảo quản DNA

2.2.1 Nguyên liệu chiết tách DNA

2.2.2 Chiết tách DNA từ bạch cầu

2.2.3 Chiết tách DNA từ tế bào của các mô

2.2.4 Chiết tách DNA từ huyết thanh

2.3 Sử dụng DNA chiết tách

2.4 Lymphocyte

3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng nghiên cứu

3.1.1 Đối tượng chiết tách DNA

3.1.2 Đối tượng tách, bảo quản lymphocyte

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Quy trình kỹ thuật chiết tách DNA từ bạch cầu

3.2.2 Kỹ thuật tách, bao quan lymphocyte

4 KẾT QUÁ NGHIÊN CỨU

4.1 Hoàn chỉnh kỹ thuật

4.1.1 Hoàn chính kỹ thuật chiết tách DNA

4.1.2 Tach lymphocyte

4.2 Kết quả nghiên cứu

4.2.1 Két qua kiém tra lymphocyte sau khi bao quan

4.2.2 Két qua chiét tach DNA người Mường

4.2.3 Kết quả kiểm tra DNA sau 12 tháng bảo quản ở -70°C

5.1 Tách và bảo quản lymphocyte

5.2 Chiết tách, bảo quản DNA

6 KẾT LUẬN

ĐỀ NGHỊ

7 HIỆU QUÁ NGHIÊN CỨU

TÀI LIỆU THAM KHẢO

(đáo cáo ngiưệm thu Dé tai

PHAN A:

TOM TAT CAC KET QUA CHINH CUA DE TAI

1) Kết quả chủ yếu đạt được của đề tài:

Xuất phát từ nhu cầu cân có DNA và lymphocyte để phục vụ cho

một số công trình nghiên cứu trước mất và lâu dài về “Đặc điểm sinh học và bệnh lý của các gen bình thường và bệnh lý ở một số dân tộc nước ta”, bảo quản DNA phục vụ cho quỹ gen (Gene Bank), chúng tôi tiến hành nghiên cứu dé tài “Nghiên cứu, xây dựng quy trình tách, bao quan DNA va

lymphocyte người Mường” với 2 mục tiêu:

- Hoan chỉnh kỹ thuật chiết tách DNA, tách và bảo quan lymphocyte

từ máu ngoại vi trong điều kiện trang thiết bị hiện có

-_ Chiết tách, bảo quản DNA của một số con em dân tộc Mường tỉnh

Hoà Bình

1.1 Đóng góp mới của đề tài:

DNA có trong hầu hết tế bào của các mô ở dạng tươi hoặc bảo quản

(máu, gan, lách, hạch, xương, tóc, móng tay chân .) trong các dịch sinh

học (huyết thanh, dịch não tuý, nước ối và các dịch tiết khác), tồn tại lâu trong các mẫu vật Tuỳ theo nguyên liệu, tuỳ theo yêu cầu và mục đích sử

dụng mà áp dụng các phương pháp chiết tách khác nhau

Ở người, DNA có nhiều trong nhân và ty lạp thể của các tế bào có nhân Bạch cầu máu ngoại vi: vừa phong phú DNA, vừa dé dàng lấy > là

nguyên liệu khá thuận lợi cho việc chiết tách để phục vụ để tài nghiên cứu

tính đa dạng gen học của con người và bảo quản lưu giữ

1.1.1 Chọn phương pháp kỹ thuật chiết tách DNA từ bạch cầu máu ngoại vi:

Căn cứ vào trang thiết bị hiện có, các hoá chất sẵn có dễ nhập, dựa vào tài liệu của hội thảo quốc tế về hoà hợp mô lần thứ XIH năm 2002 tại

Seatile (Mỹ) chúng tôi chọn phương pháp Phenol/Chloroform, Salting out

Phương pháp dùng muối trimethylammonium bromide và dùng kit QIA

amp mà hội thảo nêu ra: không nhập được hoá chất, kít quá đắt nên không thể triển khai.

Từ các kết quả thu được về mật độ quang (OD) và điện di trên thạch

agarose 0,7% thì phương pháp Salting out cải tiến đáp ứng yêu cầu về chất

lượng DNA (OD 260/OD 280 = 1,81; điện đi cho một vạch)

Phương pháp này được sử dụng chiết tách DNA bạch cầu máu ngoại

vi của 107 người Mường và cũng được áp dụng để chiết tách DNA của

người Thái tại Sơn La (Dự án của GS Vũ Triệu An)

Sau một năm bảo quản ở -70°C, chất lượng của DNA vẫn xấp xỉ như

khi mới chiết tách

1.1.2 Hoàn chỉnh phương pháp kỹ thuật tách, bảo quản lymphocyte:

- _ Tách lymphocyte bằng Ficoll

- Bao quản lymphocyte theo 2 quy trình: Bằng máy Nicool-10 và NÑitơ

lỏng

1.2 Kết quả cụ thể:

- Chọn được phương pháp chiết tách DNA phù hợp với điều kiện thực tế

- Bằng điều tra, phỏng vấn trực tiếp đã chọn được 107 người Mường trong tổng số gần 420 học sinh trường phổ thông dân tộc tỉnh Hoà Bình

- Bảo quản được 107 mẫu DNA của người Mường có chất lượng tốt,

đáp ứng với kỹ thuật PCR: sau 1 năm bảo quản ở -70°C, chất lượng và số

lượng DNA vẫn xấp xi với khi mới chiết tách, hiện vẫn bảo quản

- DNA tách được đã sử dụng:

+ Nghiên cứu đột biến gen G6PD, các kháng nguyên HLUA của các đối tượng thiếu GóPD (phục vụ dự án của GS Vũ Triệu An và PGS.TS Trần Thị Chính) để: Phát hiện các đột biến gen G6PD của các trường hợp thiếu enzym G6PD, tần suất của các kháng nguyên HLA chủ yếu của các đối tượng thiếu G6PD

+ Phân tích alen của các locus DaS;¡s¡, D„S;;o, D,;S:¡; bằng kỹ thuật PCR-STR phát hiện các đoạn Nucleotid lặp lại ngắn

+ DNA bảo quản: Nguyên liệu nghiên cứu tính đa dạng gen học của

một số sắc tộc nước ta, tần suất các gen hay gặp Bảo quản lưu giữ DNA phục vụ cho dự án “Nghiên cứu đặc điểm sinh học và bệnh lý của các gen

bình thường và gen bệnh của một số dân tộc nước ta”

- Bảo quản lymphocyte trong NHơ lỏng: Sau 1 tháng, tỷ lệ

lymphocyte sống 50%

đáo cáo nghiệm tua (ĐÈ tài

1.3 Hiệu quả về đào tạo:

~_ Một luận văn tốt nghiệp bác sĩ y khoa

-_ Cung cấp thêm một số huyết thanh người Mường cho học viên cao học nghiên cứu

1.4 Hiệu quả kinh tế:

Nghiên cứu thuộc lĩnh vực cơ bản, do vậy không tính được hiệu quả

Kinh tế cụ thể

1.5 Hiệu quả về xã hội:

- Làm được một số xét nghiệm: Phát hiện ký sinh trùng sốt rét, phát

hiện các trường hợp thiếu enzym GóPD, phát hiện những người mang

kháng nguyên viêm gan B để có những lời khuyên về phòng bệnh cho họ

- Tiêm phòng viêm gan B cho 107 học sinh có HBsAg (-), anti

HBsAg (-) bằng vacxin Engerix B, đủ liều và đúng quy trình tiêm chủng Kết quả: sau 3 lần tiêm vacxin, 87% có đáp ứng tạo kháng thể chống viêm

gan ở mức tốt (> 10mU/m)): có khả năng phòng bệnh viêm gan B

1.6 Các hiệu quả khác:

- _ Cung cấp DNA cho 3 đề tài nghiên cứu

-_ Giữ DNA người Mường phục vụ cho đự án “Nghiên cứu về đặc điểm

sinh học và bệnh lý của các gen bình thường và gen bệnh của một số

dân tộc”

2) Áp dụng cho thực tiễn:

Quy trình phương pháp Salting out chiết tách DNA đã được ứng dụng

để chiết tách DNA của người Thái tại Sơn La và sẽ ứng dụng chiết tách

DNA người Tày, Nùng tại Cao Bằng vào tháng 2 năm 2004

Bảo quần DNA ở -70PC trong điều kiện nước ta là phù hợp

Lymphocyte: Có thể lưu giữ trong một thời gian cần thiết bằng Nitơ

(đáo cáo ngiuệm thu Dé tai

+ Tháng 7 năm 2002 được phân bổ kinh phí nghiên cứu

+ Tháng 8 nam 2002 đến tháng 9 năm 2003 triển khai nghiên cứu:

Hoàn chỉnh lựa chọn kỹ thuật và triển khai tại thực địa (tỉnh Hoà Bình)

+ Tháng 10 đến tháng 12 năm 2003 viết báo cáo nghiệm thu

Đảm bảo đúng tiến độ

3.2 Thực hiện mục tiêu nghiên cứu:

Thực hiện đầy đủ 2 mục tiêu đề ra

3.3 Sản phẩm tạo ra so với dự kiến của đề cương:

Đủ số lượng, chất lượng cũng như việc bảo quản DNA như bản đề cương dự kiến

Giữ được lIymphocyte trong Nitơ lỏng với tỷ lệ sống 50% đúng với yêu cầu khoa học dự kiến của đề cương

4) Đánh giá việc sử dụng kinh phí:

+ Tổng kinh phí được duyệt cấp: 100.000.000đ

+ Kinh phí sự nghiệp khoa học cấp 100%

+ Toàn bộ kinh phí đã, đang được thanh toán và sẽ quyết toán kết thúc cùng với nghiệm thu vào cuối tháng 12 năm 2003

5) Các ý kiến để xuất:

- Với kinh phí như được cấp thì chỉ thực hiện được các đề tài khoa học ở các cơ sở đã có sẵn trang thiết bị

- Vì sự phát triển và hiệu quả to lớn của công nghệ sinh học, đề nghị

các cơ quan quản lý khoa học công nghệ cho nhập các máy móc phục vụ các để tài nghiên cứu ở mức phân tử như máy PCR, phân tích trình tự

(Sequence) và các thiết bị máy móc phụ trợ ., đào tạo chuyển giao kỹ thuật sinh học phân tử cho các cán bộ trẻ

2đáo cáo aghiim thu Dé tai

PHAN B:

NOI DUNG BAO CAO CHI TIET KET QUA NGHIEN CUU

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Sự phát triển ngày càng chuyên sâu của công nghệ sinh học, trong đó

có sinh học phân tử ở những thập kỷ cuối của thế ký XX là một trong những

động lực to lớn thúc đẩy sự phát triển nhanh chóng của nhiều lĩnh vực kinh

tế và xã hội

Sinh học phân tử (Molecular Biology) nghiên cứu cấu trúc và chức

năng sinh học các phân tử, mối liên quan giữa các gen và chức năng đặc

trưng của các sản phẩm đặc thù mà chúng mã hoá tạo ra Để nghiên cứu đặc

điểm sinh học của các loài sinh vật nói chung và con người nói riêng thì vấn

để quan trọng hàng đầu là nghiên cứu DNA (acid deoxyribonucleic)

DNA là cơ sở thông tin di truyền của mọi sinh vật trừ thực khuẩn thể

(Bactcriophage) và các virus loại RNA Các thông tin này được bảo tồn qua

quá trình phân chia tế bào vì DNA được tổng hợp theo cách tái bản bán bảo tồn DNA chứa đựng hệ thống các gen quy định các tính trạng của cơ thể sống và truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác Mô hình đầu tiên về phân tử DNA được R.Franklin và M.Wilkins mô tả vào năm 1950 qua phương pháp

nghiên cứu nhiễu xạ tia X, sau đó Chargaff khám phá ra quy luật về đôi

base bổ sung và một số đặc tính của DNA, tiếp đến Watson và Crick công

bố về cấu trúc không gian của phân tử DNA (gồm 2 chuỗi polynucleotid

xoắn quanh một trục theo chiều ngược nhau) [27],[301,[31] Từ đó, hàng

loạt các công trình nghiên cứu về cấu trúc, chức năng của DNA được công bố:

DNA có trong hầu hết các tế bào của các mô (máu, gan, lách, hạch,

xương, tóc .), trong các dịch sinh học (huyết thanh, dịch não tuỷ, dịch tiết

) DNA tồn tại lâu trong các mẫu vật bị chôn vùi trong môi trường thiên

nhiên, không bị huỷ trong các bệnh phẩm được xử lý như trong các khối

Béo edo nghiim thu Dé tai

đúc paraffin, trong các tiêu bản lưu trữ [5],[11) Chiết tách DNA cũng

như tỉnh khiết, bảo quản chúng đã được tiến hành ở nhiều labo với nhiều phương pháp khác nhau tuỳ theo nguyên liệu và mục đích sử dụng

DNA là nguyên liệu chủ yếu được sử dụng nghiên cứu ở các labo sinh học của nhiều lĩnh vực khoa học thuộc các ngành sinh học động, thực

vật, y được Với sản phẩm DNA, nhờ các kỹ thuật hiện đại như: phản

ứng khuếch đại chuỗi (PCR: polymerase chain reaction), phan tich trinh tr

chudi nucleotid (sequence): k¥ thuat lai DNA ., cdc công trình nghiên cứu

ở mức tế bào và phân tử đã và đang thu được nhiều thành quả có giá trị về

khoa học và thực tiễn cho các ngành nông lâm, ngư nghiệp, khoa học hình

sự, nhân chủng học Những tiến bộ đạt được về ghép mô, tính chính xác

của khoa học hình sự và pháp y, sự hiểu biết về cơ chế bệnh sinh của một số

bệnh có tính chất di truyền hoặc do đột biến là nhờ phân tích các gen HLA

(Human leucocyte antigen), phân tích bộ gen của nhân các tế bào

1151.161, [1212

Nhiều nước trong khu vực và trên thế giới đã có các ngân hàng bảo quản mô, bảo quản tế bào, lưu giữ các nguồn gen, có chương trình quốc gia nghiên cứu tính đa dạng gen học (Human Diversity Programme), có ngân

hàng đữ liệu nguồn gen (Data Bank, Gene Bank)

Để có nguyên liệu phục vụ trước mất và lâu dài cho công tác nghiên cứu “Đặc điểm sinh học và bệnh lý của các gen bình thường và gen bệnh của các cộng đồng dân tộc nước ta”, chúng tôi tiến hành nghiên cứu hoàn chỉnh quy trình chiết tách DNA bạch cầu, tách và bảo quản lymphocyte từ

máu ngoại vị, triển khai ứng dụng với hai mục tiêu:

Báo cáo agiuệm thu Dé tai

2 TONG QUAN

2.1 DNA:

DNA 1a polymer của các đeoxyribonucleotid, một trong hai acid của

acid nucleic DNA bao gồm nhiều đoạn gọi là các gen chứa các thông tin di

truyền, mã hoá tổng hợp các sản phẩm (protein) có đặc tính riêng về cấu

trúc và chức năng DNA cơ sở vật chất di truyền, quyết định cấu trúc và

chức năng đặc hiệu của protein được tổng hợp Đặc tính này được chứng

minh qua công trình nghiên cứu của O.T.Avery và cs Tác giả trộn DNA tách bằng nhiệt của một chủng phế cầu với một chủng phế cầu không độc

hại Sau khi nuôi cấy đã tạo phế cầu độc hại gây bệnh Tính độc gây bệnh

của chủng phế cầu này được truyền lại cho các thế hệ sau [13],[14],[28] 2.1.1 Cấu trúc khái quát của DNA-

Phân tử DNA gồm 2 chuỗi polynucleotd xoắn quanh một trục: mỗi nucleotid có ba thành phần cơ bản:

Base nito (Adenine: A; Guanine: G; Thymine: T; Cytosine: C)

Dudng Pentose (Deoxyribose)

Acid Phosphoric

Base nitơ nối với dung deoxyribose bang liên kết glucoside tao nucleoside Acid phosphoric liên kết với nucleoside bằng liên kết este ở vị trí 5` của đường deoxyribose tạo ra nucleotid Các nucleotid nối với nhau qua cầu nối 3-5” phosphodieste giữa 5` bydroxyl của pentose này và 3”

hydroxyl của pentose bên cạnh để tạo thành polynucleoud: nhóm 5”

hydroxy] cha nucleotid nay lién két với nhóm 3` hydroxyl của nucleotid bên cạnh thông qua phân tử acid phosphoric Do vậy, người ta quy ước cách viết

cấu trúc chuỗi đơn của phân tử DNA từ đầu tận 5` ở bên trái kéo dài tới 3' (5 - 3) Các polynucleotdid ngắn (dưới 50 nucleotiđ) gợi là Oligonucleotid

[30]

Hai chuỗi polynucleotid liên kết với nhau qua các cầu nối hydro giữa các base nitơ Base của chuỗi này liên kết với base của chuỗi kia trên cùng

Bao cáo ngiưệm thu Dé tai

một mặt phẳng theo nguyên tắc đôi base bổ sung của chargaff: guanine liên

kết với cytosine bằng 3 cầu hydro (G = C), adenine liên kết với thymine

bằng 2 cầu hyđro (A = T) Theo cấu trúc này thì các base nằm sát trục xoắn,

tiếp đến là đường deoxyribose và ngoài cùng là acid phosphoric Trật tự các

base trong chuỗi thứ nhất khác với chuỗi thứ hai: base của chuỗi 1 là adenin

thì base đối xứng ở chuỗi 2 là thymin, guanin ở chuỗi 1 thì cytosin ở chuỗi 2

Hình 2.1: Cấu trúc ĐNA theo Watson - Crick

2.1.2 Một số dạng DNA:

Tuỳ theo cách xoắn trong không gian của hai sợi polynucleotid mà

có một số dạng khác nhau của phân tử DNA

Hai sợi polynucleotid xoắn quanh trục theo chiều từ trái sang phải, mỗi chu kỳ xoắn từ 2,3 dén 3,6 nm, gồềm 10 - 11 cặp base: đó là dạng A và

B

Hai sợi polynucleotid xoắn quanh trục theo chiều từ phải sang trái, mỗi chu kỳ xoắn 3,7nm gồm 12 cặp base, thường có sự xen kế giữa purin

và pyrimidin: đó là dạng Z Dạng Z thường có 12 - 24 nucleotid nằm ở vùng

gen điều hoà

DNA trong tế bào của một số loài có kích thước khác nhau

E.coli: 4,4.10?pg

Nấm: 1,7.10?

Bạch cầu người: 3,4

đáo cáo nghiim thu Dé tai

DNA cé thé & dang soi don hoc dang xoan kép Tuy theo s6 luong

và cách sắp xếp các base nitơ trong nội bộ mà một số đoạn trong phân tử

DNA có các cấu trúc hình cong, hình kẹp tóc, hình chữ thập [27],{30]

2.1.3 Một số tính chất quan trọng của DNA:

- Biến tính thuận nghịch: Các liên kết hydro giữa các base nitơ rất dễ

bị phá huỷ khi đột ngột tăng nhiệt độ lên tới 90 - 95°C hoặc khi pH quá kiểm hoặc quá acid làm cho hai sợi xoắn kép của phân tử DNA tách thành 2 chuỗi đơn

XOXE™OK TOIT

|

=a

Hình 2.2: Tháo xoắn và tái xoắn cia DNA

Hai soi don polynucleotid này có thể liên kết với nhau trở lại để tạo

thành đạng xoắn kép như cũ khi đưa nhiệt độ hoặc pH về mức bình thường

Trong quá trình nghiên cứu, từ một đoạn DNA chiết tách được thì ta

có thể tiến hành tháo xoắn nó để tách thành 2 sợi đơn và nhân nó lên nhiều lần sau khi gắn với một đoạn mồi thích hợp (primer) Chu trình nhân lên

được bắt đầu là đầu 3”, các nucleotid gắn vào nhờ Tag-polymerase Các chu trình được thực hiện theo nguyên tắc nhân đôi Do vậy từ một đoạn DNA

áo cáo agiuiệm thu Dé tai

khuôn mẫu ban đầu rất bé nhỏ đã được nhân lên đến tỷ lần giúp cho việc phát hiện sự có mặt, nguồn gốc của các DNA khi chúng chỉ có một lượng rất ít hoặc chỉ còn dấu vết trong mẫu vật Tính chất biến tính thuận nghịch

của DNA đã được ứng dụng và đem lại nhiều thành quả quan trọng trong

việc nghiên cứu sinh học phân tử (kỹ thuật PCR) {61,[8],191.{111.115],116], [1711201.1241

- Tính chất lai: Hai DNA của hai loài khác nhau, nếu có trật tự các nucleotid sắp xếp tương ứng với nhau thì có thể tạo được một phân tử DNA

lai Tạo phân tử DNA lai được tiến hành theo trình tự: tháo xoắn các phân tử

DNA gốc để có được các sợi đơn Trộn lẫn các sợi đơn ở nhiệt độ và pH

thích hợp để chúng liên kết với nhau tạo nên các phân tử DNA lai

- Thương tổn DNA: Trong quá trình sao chép tái bản, DNA có thể bị

thương tổn do các tác nhân bên ngoài (nhiệt độ, bức xạ ion hoá, hoặc do các

biến đổi hoá học trong bản thân phân tử DNA) Đa số các thương tổn nhất

là các thương tổn do biến đổi về mặt hoá học đều nhanh chóng được khắc

phục nhờ các enzym sửa chữa (DNA - Repair nuclease) Các biến đổi hoá

học của DNA thường gặp như: xuất hiện các mạch carbon dài (benzopyren)

do liên kết các dimer (T=T, C=C, T=C), gẫy liên kết N - glycosyl - deoxyribose, khử amin các base (adenine biến thành hypoxanthin, cy†osine

biến thành uracil ) tạo thành các liên kết đồng hoá trị (khi hai base thymine đứng gần nhau) [27],{31],132]

2.1.4 DNA tham gia cấu tạo chromosom (nhiễm sắc thô:

Thành phần chính của chromosom tế bào có nhân là chất nhiễm sắc

(chromatin) Chromatin chứa protein và DNA Trong chromatin DNA liên kết với 5 loại protein histon Hai sợi xoắn kép của DNA quấn quanh histon

tạo thành nucleosom Nucleosom là hạt cơ bản của chromatin Các hạt

nucleosom cuộn lại thành sợi 30 nm, sợi này chứa khoảng 100 khúc cuộn

DNA Soi 30 nm nay cuộn lại thành vòng xoắn, sáu vòng xoắn hình thành 1

rosetie Khoảng 30 rosette tạo thành một cuộn lớn và 10 cuộn lớn này là

một chromatid (nhiễm sắc tử) Hai chromatid liên kết lại thành chromosom

{13],[30]

Bae cáo nghiệm thu DE tai

2.1.5 Tổng hop acid deoxyribonucleic (DNA):

Các tế bào của cơ thể tự tổng hop acid nucleic cha ching (DNA,

RNA) DNA được tổng hợp trong giai đoạn tế bào đang phân chia phát

triển Thông tin di truyền của DNA được bảo tồn trong suốt quá trình phân

bào, có nghĩa là các DNA con cháu (hậu duệ) được tái bản một cách chính

xác về cấu trúc và mang nguyên vẹn các thông tin di truyền từ DNA mẹ Thông tin được đi truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác nhờ các quá trình:

Tái bản (replication) : DNA > DNA

Sao chép (transcription) : DNA > RNA,

RNA,, > protein

Mỗi sợi của phân tử DNA là một khuôn để tổng hợp tạo ra một sợi bổ

sung Phương thức tái bản của DNA như thế gọi là tái bản bán bảo tổn

(semiconservative replication) Bằng kỹ thuật tự chụp hình phóng xạ, người

ta thấy quá trình tái bản DNA được bắt đầu ở một vùng và đi chuyển theo

chiều đài của sự tháo xoắn kép DNA mẹ Hai sợi DNA con được tổng hợp nhờ một hệ théng enzym (DNA polymerase DNA helicase, RNA primase, DNA ligase .) [30],{31]

DNA được tái bản, RNA„ được tổng hợp bằng cách sao chép trên khuôn DNA theo đúng quy luật đôi base bổ sung và ra ngoài nhân mang

theo thông tin của DNA đến nơi tổng hợp protein Quá trình tổng hợp

protein xẩy ra ở bào tương và ở ty lap thé (Mitochondria) Nhu vay, Mitochondria cũng có nhà máy tổng hợp protein riêng (có RNA polymerase, aminoacyl RNA synthetase, RNAt va các ribosom) Tuy nhiên, người ta thấy ở Mitochondria có số lượng RNAI ít hơn, ribosom bé hon, RNA, ngắn hơn so với bào tương Có một số mã khác nhau giữa bào tương

va Mitochondria: trong bao tương UAU mã cho 1soleucin, trong

Mitochondria lại mã cho methionin, trong bào tương CA mã cho Leucin, trong Mitochondria lại mã cho Threonm Do vậy, việc giải mã hệ thống

gen của Mitochondria cũng đã và đang được các labo sinh học phân tử quan

tâm nghiên cứu [23]

11

(đáa cáa nghiệm thu Dé tai

2.2 Chiết tách, tỉnh khiết, bảo quản DNA:

DNA là nguyên liệu cơ bản sử đụng trong nhiều kỹ thuật hiện đại để

phát hiện, phân tích các hiện tượng cũng như các quy luật sinh học bình

thường hoặc bị biến đổi của động thực vật ở mức phân tử, phục vụ sự phát

triển kinh tế xã hội, nâng cao tăng năng suất vật nuôi, cây trồng DNA là

nguyên liệu để phân tích một cách chính xác nhất về nguồn gốc, sự phát triển của các loài, tính đi truyền và biến đị, dấu vết các cá thể [7],

{10]1,1221

2.2.1 Nguyên liệu chiết tách DNA:

DNA được chiết tách từ nhiều loại tế bào của các mô ở dạng tươi

hoặc ở dạng bao quan, từ các dịch sinh học Ở người, DNA được chiết

tách từ các tế bào ở các mô: máu, gan, hạch, tóc, xương, móng tay chân ., huyết thanh, địch não tuỷ

Tuy theo muc dich sử dụng mà lượng DNA cần có va d6 tinh khiết của DNA thu được có khác nhau Lượng DNA sử dụng trong kỹ thuật PCR phát hiện các genom của vi khuẩn, virus thì chỉ cần một lượng bé (ng, pg)

là đủ và độ tinh khiết không đồi hỏi tuyệt đối lắm Lượng DNA phục vụ cho việc lưu giữ nguồn gen (Genebank), phân tích di truyền (Genetic Analyzer):

trình tự gen (ADN sequencer) thì phải có được một lượng DNA nhiều hơn (mg) và phải có độ tỉnh khiết cao [18],[191,{25],{261.1291

Do sự khác nhau về tính chất, trạng thái các tế bào của các mô sử

dụng để chiết tách DNA nên quy trình chiết tách DNA có khác nhau ở một

số công đoạn Mặt khác, khoa học kỹ thuật ngày càng phát triển, trang thiết

bị máy móc ngày càng được cải tiến và tự động hoá, do đó đã và đang có nhiều phương pháp kỹ thuật chiết tách tinh khiết DNA ngày càng được cải

tiến và hoàn thiện

Trong tế bào của cơ thể con người DNA có nhiều trong nhân và ty

lạp thể của các tế bào có nhân Do vậy, trong quá trình chiết tách DNA ở người có một số bước chung cho tất cả các phương pháp kỹ thuật

(đáo cáo ngiưệm tuc “Đề tài

2.2.2 Chiết tách DNA từ bạch cầu:[25]

Máu toàn phân chống đông bang EDTA (Ethylen Diamine Tetraacetic) hoac ACD (Citrate) EDTA 14 chat chéng dong thích hợp nhất

vì EDTA còn tạo phức với một số lon kim loại hoá trị JI (Mg, Ca, Zn) có tác dụng ức chế tác nhân hoạt hoá Nuclease

* Loại bỏ hồng cầu: Lầm tan và loại bỏ hồng cầu bằng đệm ly giải hồng cầu (Red Cell Lysis Buffer: RCLB), chỉ giữ lại các tế bào có nhân

(bạch cầu)

* Phá màng tế bào và màng nhân của bạch cầu: Dùng đệm ly giải bạch cầu (White Cell Lysis Buffer: WCLB) DNA được giải phóng nhưng còn lẫn với một số thành phan khác: RNA, protein

* Loại protein: Loại protein còn lẫn trong dịch chiết DNA bằng

proteinase K hoặc phenol Proteinase K phân huỷ được hầu hết các protein lẫn trong dịch chiết Phenol có tác dụng làm biến tính protein, loại bỏ

proteinase K còn thừa trong dịch (nếu trước đó đã dùng proteinase K), đồng

-_ thời phenol còn cho DNA được chiết tách tinh khiết hơn Tuy nhiên, phenol

lại có tác dụng ức chế các enzym sẽ được sử dụng trong các kỹ thuật PCR

sau này Do vậy, ở giai đoạn cuối cùng phải loại phenol thừa bằng

chloroforme hoặc hỗn hop chloroforme/isoamyl alcohol

* Loại RNA: RNA„ và RNA, rất đễ bị phân huỷ, RNA, khá bền vững

và thường tồn tại trong dịch chiết DNA Để phá huỷ RNA, thường ding

Ribonuclease (R Nase) đã khử D Nase Cuối cùng, loại R.Nase thừa, RNA

biến tính bằng phenol

* Tủa, thu hồi DNA: Sau khi loại bỏ protein, RNA, dịch nổi chứa DNA được thu hồi vào các dụng cụ thích hợp Tủa DNA bằg Ethanol (tuyệt

đối) hoặc Isopropanol lạnh Rửa tuả 1 - 2 lần bằng Ethanol 70%, pH thích

hợp để DNA tủa: 4,8 - 5,2 Do vậy trước khi tủa nên điều chỉnh pH của dịch

chiết về khoảng pH trên đây bằng acetat Na hoặc acetat K 3M

* Hoà tan tủa DNA: Hoà tan DNA trong dung dịch TE (tris-

HCL+EDTA) hoặc nước cất 2 lần khử 1on

13

Bao edo nghiém thu De tai

* Kiểm tra chất lượng DNA:

Đo mật độ quang (OD: optical density) ở bước sóng 260 va 280 nm

trên máy quang phổ tử ngoại Đây là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện để

kiểm tra chất lượng (độ tình khiết) và nồng độ DNA chiết tách duoc DNA được hấp phụ cực đại ở bước sóng 260nm, protein ở bước sóng 280nm Nếu OD260/OD280 = 1,7 - 2,0 thì dịch chiết tách DNA đạt độ tỉnh khiết, dưới

1,7 là còn lẫn protein Ở bước séng 260nm ma OD = 1 thi trong Iml dich

chiết tách có 50kg

Điện di DNA: Điện di DNA trên gel thạch agarose 0,7 - 0,8% Phương pháp này có ưu điểm: phát hiện được các đoạn DNA bị gẫy trong

quá trình chiết tách, có nghĩa là phát hiện được các đoạn DNA đài ngắn

khác nhau, phát hiện được RNA còn sót lại trong dịch chiết Tuy nhiên

phương pháp này đòi hỏi phải có: gel thạch agarose, dung dịch dẫn đường

(loading buffer), DNA size marker, thuốc nhuộm DNA (ethidium bromide),

đèn soi tử ngoại

PCR tìm gen đặc hiệu luôn có mặt trong phân tử DNA : hCYCLO, HLA-DQœ Đây là phương pháp hiện đại có độ chính xác cao, phát hiện được DNA dù chỉ có một lượng rất ít trong dịch chiết tách nhưng đòi hỏi

trang thiết bị và sinh phẩm chuyên dụng, đắt tiền

* Bảo quản:

Bảo quản DNA là một công việc rất cần thiết và hết sức quan trọng phục vụ cho các nghiên cứu trước mắt và lâu dài khi có điều kiện trang thiết

bị hiện đại và trình độ kỹ thuật được phát triển , nâng cao Tuỳ theo mục

dich ma bao quan DNA 6 4°C, -20°C, -80°C, nito lỏng, lý tưởng nhất là đưới

hình thức plasmid

2.2.3 Chiét tach DNA từ tế bào của các mô:

Để tiến hành chiết tách DNA trong tế bào của các mô ở dạng tươi

hoặc ở đạng bảo quản trong đông lạnh, trong khối đúc paraffin ., trước hết

phải cắt nhỏ, nghiên tán các tổ chức đó trong các đệm chiết tách thích hợp

(Extration Buffer-Digestive Buffer) để có được một hỗn dịch thuần nhất,

Bao cáo ngiưệm thu Dé tai

sau đó tiến hành thu hồi dịch nổi chứa DNA Các công đoạn tiếp theo sau

đó tương tự như chiết tách DNA từ bạch cầu

2.2.4 Chiết tách DNA từ huyết thanh:

Khâu đầu tiên là phân huỷ các protein khác của huyết thanh bằng các

dung dịch có hoạt tinh protease nhu proteinase K, DS (Triton X-100 + Proteinase K + Tris-HCl + EDTA), sau d6 loai cdc protein da bi bién tinh va proteinase K thừa bằng phenol hoặc các hoá chất khác có tác dụng tương tự Tiến hành tủa, rửa tủa DNA bằng Ethanol và các công đoạn hoà tan DNA

cũng tương tự như đối với kỹ thuật chiết tách DNA từ bạch cầu

2.3 Sử dụng DNA chiết tách:

DNA là nguyên liệu đã và đang được sử dụng trong nhiều kỹ thuật sinh học phân tử trong các labo của nhiều ngành sinh học Phản ứng khuếch

đại chuỗi (PCR) và phân tích trình tự DNA (Sequence) là hai kỹ thuật đã và

đang đem lại nhiều phát hiện mới cho khoa học và nhiều lợi ích to lớn trong thực tiễn

Troff“v-học, với các phương pháp SSO (Sequencer specific oligo- nueleotide), SSP (Sequencer specific primer), PCR léng (nested PCR) cla

kỹ thuật PCR đã đem lại nhiều thành công có giá trị phục vụ thực tiễn Một trong những thành tựu có giá trị to lớn là phát hiện hệ thống gen hoà hợp

m6 (MHC: Major Histocompatibility Complex) Hệ thống hoà hợp mô ở người là hệ thống kháng nguyên trên bạch cầu: HLA (Human Leucocyte

Antigen) Hệ thống này rất đa dạng về sinh học và có vai trò rất quan trọng trong bệnh lý học Thành công của ghép mô đồng loài đị gen phụ thuộc vào mức độ phù hợp giữa các kháng nguyên HLA của người cho và người nhận

Do tính đa dạng của hệ thống này nên cứ 2-3 năm lại có hội nghị, hội thảo

quéc té (IHWC: International Histocompatibility Workshop and Conference)

để báo cáo những phát hiện mới, thảo luận những vấn đề về tính đa dạng

gen học của bộ gen người [2],[4].[71.112].1211

Phát hiện sự liên quan giữa hệ thống HLA và bệnh tật cũng là một

thành công lớn của y học Người ta đã xác định được một số bệnh do các

gen thuộc vùng HLA (bệnh nhiễm sắc tố sắt mô: Hemochromatosis, bệnh

quá sản tuyến thượng thận bẩm sinh .) Các công trình nghiên cứu cũng

15

đã phát hiện được hàng trăm các bệnh có liên quan đến sự thay đổi tần suất

của một số phenotyp HLA giữa người bệnh và người bình thường Tần suất kháng nguyên B27 ở bệnh nhân viêm khớp đốt sống xơ cứng cao hơn 10 lần

so với người bình thường, DR5Š ở bệnh nhân viêm đa khớp dang thấp có tần suất gấp 3 lần người bình thường, tần suất DR3 ở bệnh nhân Lupus ban đỏ gấp 2,5 lần ở người khoẻ mạnh, tần suất DR3 và DR4 ở bệnh nhân đái đường phụ thuộc Insulin gấp đôi người bình thường [6],[25]

Cũng nhờ kỹ thuật PCR mà đã phát hiện được sự có mặt của nhiều vi

sinh vật gây bệnh trong cơ thể con người ngay ở thời kỳ không triệu chứng

hoặc người lành mang mầm bệnh: phát hiện genom HBV, HCV, HIV,

BK

Phân tích trình tự gen (DNA Sequencer) còn mang lại nhiều thành

tựu 1o lớn hơn nhiều: Phát hiện nguồn gốc, dấu vết cá thể, các đột biến Tính ưu việt của kỹ thuật này đang được ứng dụng có hiệu quả trong nhiều

ngành khoa học: nghiên cứu động thực vật, y học, nhân chủng học, khoa

học hình sự, quy luật di truyén, bién di

dưỡng, bảo quản được lymphocyte lâu dài thì sẽ có nguồn dự trữ DNA còn

nguyên vẹn trong tế bào để phục vụ cho nhiều nghiên cứu phân tử chuyên sâu trong tương lai Tuy nhiên công tấc lưu giữ được các lymphocyte sống

lâu dài rất tốn kém và đòi hỏi nhiều điều kiện và trang thiết bị

Giữ các loại tế bào nói chung, giữ lymphocyte nói riêng cần đầu tư labo chuyên trách bảo quản tế bào với các trang thiết bị đồng bộ hiện đại

(Báo cáo ngitệm thu Dé tai

3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng nghiên cứu:

3.1.1 Đối tượng chiết tách DNA:

3.1.1.1 Đối tượng hoàn chỉnh kỹ thuật để ứng dụng chiết tách DNA:

15 người bình thường khoẻ mạnh tuổi từ 20 - 45 là cán bộ của Bộ

môn Miễn dịch - Sinh lý bệnh và người cho mấu tại Viện Huyết học -

Truyền máu, bệnh viện Bạch Mai

3.1.1.2 Đối tượng lấy máu tách, bảo quản DNA:

107 hoc sinh dân tộc Mường sinh từ năm 1983 - 1987 tại các huyện

Đà Bắc, Yên Thuỷ, Lạc Sơn, Tân Lạc, Cao Phong, Kỳ Sơn, Kim Bôi, Lương

Sơn và Lạc Thuỷ hiện đang theo học lớp 10, 11, 12 tại Trường phổ thông Dân tộc nội trú tỉnh Hoà Bình Các đối tượng này đều được tuyển chọn để

“thu thập DNA fñeb tiêu chuẩn: `

+ Đều là dân tộc Mường, có nguồn gốc ít nhất là 2 thế hệ trước đó:

ông bà nội ngoại, bố mẹ của đối tượng là người Mường căn cứ vào phiếu điều tra và phỏng vấn trực tiếp các đối tượng (có phụ lục kèm theo)

+ Các đối tượng khoẻ mạnh không mắc các dị tật bẩm sinh (được xác

định qua khám sức khoẻ)

+ Tìm ký sinh trùng sốt rét

+ Kiểm tra xác định kháng nguyên bề mặt viêm gan B

+ Tiêm vacxin viêm gan B

+ Xác định enzym G6PD

3.1.2 Đối tượng tách, bảo quản lymphocyte:

15 người cho máu khoẻ mạnh tại Viện Huyết học và truyền máu

trung ương, không phân biệt tuổi giới.

3.2 Phương pháp nghiên cứu:

3.2.1 Quy trình kỹ thuật chiết tách DNA từ bạch cầu:

* Kỹ thuật chiết tách DNA từ bạch cầu mán ngoại vi bao gồm các bước

chính sau:

- Nguồn nguyên liệu: Máu toàn phần chống đông bằng EDTA

- Phá vỡ hồng cầu giữ lại các tế bào có nhân (bạch cầu)

- Phá vỡ màng tế bào và màng nhân bạch cầu

- Tủa và loại bỏ protein, giữ lại phần nước mặt có chứa DNA

- Tủa thu hồi DNA

* Kiểm tra chat luong DNA:

- Kiểm tra chất lượng và nồng độ DNA bằng cách đo mật độ quang trên

máy quang phổ tử ngoại Dung dịch DNA thường được pha loãng bằng đệm

TE rồi đo ở bước sóng 260 và 280nm Dựa vào mật độ quang (OD: Optical Density) ở hai bước sóng trên sẽ xác định được độ tỉnh khiết và nồng độ:

+ Độ tỉnh khiết đạt yêu cầu khi OD 260/280 = 1,7 - 2,0

+ Nồng độ DNA được tính dựa vào mật độ quang ở bước sóng 260nm, khi OD = 1 tương ứng với nồng độ DNA = 50pg/ml

- Kiểm tra chất lượng DNA bằng điện di: Thường dùng thạch agarose 0,7%

+ 8HI dung dịch DNA được trộn với 2ml dung địch dẫn đường

(oading buffer), rồi cho vào các lỗ đã đục sẵn trên thạch

+ Chạy điện di ở hiệu điện thế 100V/30 - 45 phút

+ Nhuộm bản thạch bang ethidium bromide, DNA gan ethidium bromide sẽ phát sáng dưới ánh sáng tử ngoại

* Dụng cụ, hoá chất chung cho cả 3 kỹ thuật:

- Máy ly tâm

- Tủ ấm nước có điều chỉnh nhiệt độ

- Ta am 37°C

Béo eis nghiéim thu Dé tai

- May lac (Vortex)

- Máy điện di

- Tủ lạnh thường và tủ lạnh sâu (-70°C)

- Thiết bị soi tử ngoại

- Hod chat: EDTA (Ethylen Diamin Tetra Acetic), cén tuyét d6i, proteinase

K, agarose, ethidium bromide, dung dich TE

- PCI (Phenol - Chloroform - isoamylalcohol) với tỷ lệ:

3V Phenol: 1V Chloroform - isoamylalcohol (24:1)

- SDS 10%

* Các bước tiến hành:

- 5ml máu chống đông bởi EDTA, ly tâm 1500 v/phút x 5 phút > chat bd

phần huyết tương

- Phá hồng cầu: Cho thêm vào 5ml dung dịch RCLB, trộn đều

- Ly tâm 1500v/ phút x 10 phút -> loại bỏ nước mật

- Cho 1,5ml dung dịch WCLB vào cặn thu được để phá bạch cầu

- Thêm 25H1 SDS 10% và 25H] proteinase K 10mg/mI

19

Bao cio nghiém thu Dé tai

+ Chuyển sang falcon 15ml

~ Tủa bang isopropanol:

+ Thêm 30u1 NaCl 5M

+ Thêm 0,6V isopropanol, lắc nhẹ để tạo tủa

+ Chuyển tủa DNA sang falcon 5ml

+ Rửa tủa bằng 3ml cồn 70° x 3 lần

+ Làm khô DNA, sau đó hoà tan DNA bằng TE

- Kiểm tra DNA bằng cách đo OD hoặc điện di trên thạch agarose Cất giữ

2Öáo cáo ngiưệm thu Dé tai

- Ly tâm 10000 - 12000v/ phút x 5 phút Loại nước mặt

- Thêm 10ml dung dịch RCLB lắc trong 30 giây, ly tầm 10000 - 12000v/

phút x 5 phút, loại bỏ nước mặt > Trong ống còn lại cặn màu trắng (có thể lặp lại bước này nếu cặn thu được vẫn còn màu hồng)

- Thêm vào ống chứa cặn 0,2 ml dung dich Nuclei lysis va 50u1 SDS 10%, đánh tan cặn bằng Vortex đến khi tạo thành bọt trắng như bọt xà phòng

- Thêm tiếp 1501 dung dich Nuclei lysis, lac bang Vortex

- Thêm 250M1 proteinase K (2mg/m]) trộn đều (không lắc)

- Ủ cách thủy 65°C x 2 giờ

- Thêm 4351 NaCl 5,3M Ly tâm 10000-12000v/phút x 15 phút

- Chuyển nước mặt sang ống nghiệm khác, sau đó thêm 5ml cồn lạnh 100%

để tạo tủa DNA

- Chuyển tủa sang eppendorff, rita tha DNA bang cén 75°

- Để khô DNA bằng cách mở nắp, sau đó thêm 306 - 400ul nước vô trùng,

để cách thuỷ 65°C/ 15 phút (hoà tan DNA)

- Kiểm tra DNA, cất giữ ở 4°C, - 20C, - 80°C

3.2.1.3 Kỹ thuật Salting out cải tiến:

Bao cáo ughiém thu Dé tai

+ Sodium azide: 0,05%

* Các bước tiến hành:

- Máu chống đông (5ml máu) bang EDTA 0,4M 1251

- Cho vào ống 10ml] dung dịch phá hồng cầu (RCLB) trộn đều nhiều lần

- Ly tâm 2500 v/phút x 10 phút

- Loại bỏ nước mặt (có màu hồng của hemoglobin), giữ lại cặn (tủa tế bào mầu trắng)

- Lặp lại 3 bước trên thu được cặn trắng tế bào bạch cầu

- Lầm tan cặn tế bào bằng cách đùng máy lắc Vortex

- Cho tiếp vào ống chứa cặn tế bào 1800H1 dung dịch phá bạch cầu (WCLB)

phá vỡ tế bào bằng cách đánh tan cặn (Có thể tách ngay DNA hoặc bảo

quản ở 4°C trong một vài tuần)

- Cho tiếp vào ống 125 pl dung dich proteinase K 2mg/ml lac déu trong 5

- Chuyển dịch nổi chứa DNA sang ống khác

- Tủa DNA bằng cồn tuyệt đối: 1V dịch nổi + 2V cồn

- Lắc nhẹ nhàng bằng cách nghiêng ống cho tới khi xuất hiện tủa DNA

- Chuyển tủa DNA sang eppendorf chứa sẵn 500M1 TE

- Kiểm tra chất lượng DNA: Để sảnphẩm ở 37°C cho DNA tan hoàn toàn

Đo OD hoặc chạy điện di

- Bao quan DNA & 4°C, -20°C, - 70°C tuỳ thời gian cần lưu giữ

Bao edo nghiém thu Dé tài

3.2.2 K¥ thudt tach, bdo quản lymphocyte: Được tiến hành theo các bước sau:

3.2.2.1 Tach lymphocyte tt máu ngoại vi:

- Lấy 15 ml máu chống đông bang Heparin theo ty lé 30UI/ml

- Pha loãng máu bằng dung dịch RPMI theo tỷ lệ 1V máu + 1V RPMI

- Chuẩn bị trước vào ống nghiệm 1V ficoll (tỷ trọng 1,077), sau đó cho nhẹ nhàng 2V máu đã pha loãng ở trên ly tâm ở 2000 vòng/phút x 20 phút

- Dùng pipette Parteur hút lấy vòng ]ymphocyte (màu trắng đục) cho sang một ống nghiệm khác

- Rửa sạch khối tế bào trên 2 lần bằng môi trường RPMI > ly tam 1200v/phút x 10 phút

- Khối tế bào trên được điều chỉnh về nồng độ 107 tế bào/mm” và xác định

ty lệ sống chết của hỗn dịch lymphocyte bằng xanh Trypan 0,2%

3.2.2.2 Chuan bi hén dich lymphocyte dé bao quan:

- Dat 6ng nghiém chita hén dich lymphocyte vào khay nước đá Chuẩn bị

một ống khác có thể tích tương đương gồm: RPMI + 40% FCS (Fetal - Cap) + 15% DMSO và đặt vào trong nước đá

- Nhỏ từng giọt dung dịch DMSO trên vào hỗn dich lymphocyte (vita nhỏ vừa lắc)

- Hút hỗn địch trên vào các ống mao quản, dùng chất bịt kín các mao quản, 3.2.2.3 Quy trinh bao quan lymphocyte:

* Quy trình 1: Bằng máy Nicool - 10

- Cho máy Nicool -10 hoạt động theo chương trình sau:

+ Chế độ 3 trong 15 phút

+ Clế độ 10 trong 10 phút

23

Bao cio nghiéim thu Dé tai

- Với quy trình trên tốc độ làm lạnh các lymphocyte theo thang nhiệt độ sau:

- Sau đó cho mẫu vào nitơ lỏng cất g1ữ

* Quy trình 2: Làm lạnh từ từ bằng hơi nitơ lỏng

- Cho các mao quản (chứa lymphocyte) vào ống cất giữ

- Do khoảng cách từ mặt nitơ lỏng đến miệng bình nitơ

- Đặt các ống cất giữ trên vào bình nitơ sao cho các mao quản cách mặt nitơ lỏng 20cm

- Thả từ từ các mao quản xuống khoảng 3 cm/5 phút

- Khi mao quản đã chìm vào trong nitơ lỏng thì thả hẳn xuống

3.2.2.4 Quy trình giải đông các Iymphocyte từ nitơ lỏng:

- Lấy các mao quản từ nitơ lỏng ra cho ngay vào nước 370C

- Rửa tế bào 3 lần bằng RPMI (1y tâm 2000 v/phút x 10 phút)

- Loại bỏ phần nước nổi chứa DMSO thu lại cặn tế bào

- Kiểm tra tỷ lệ sống chết các Iymphocyte bằng xanh Trypan 0,2%

3.2.3 Các xét nghiệm phụ trợ khác:

- Tìm ký sinh trùng sốt rét bằng kỹ thuật giọt đặc

- Kiểm tra xác định kháng nguyên bể mặt viêm gan B bằng kỹ thuật test

Bao cio nghiim thu De tai

4.1 Hoan chinh kf thuat:

4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

4.1.1 Lựa chọn, hoàn chỉnh kỹ thuật chiết tách DNA:

Bảng 4.1: Kết quả tách DNA bằng 3 phương pháp khác nhau

¬

Paya) < 9,05 Paya > 0,05

Pp Paya) < 9,05 _ Payay> 0,05

Peyay> 0,05 Poya) < 9,05

Ghi cht: + Phương pháp I: Phenol/chloroform

+ Phương pháp H: Salting out + Phương pháp II: Salting out cải tiến

1.85 f T[m op2eor2ao 18 1200 EINONG DO} 4946.5 1.8 100077 3

Do tinh khiét DNA Hàm lượng DNA (ug/ml)

Biểu đồ 4.1: Độ tinh khiết và hàm lượng DNA của 3 phương pháp

25

Bao cio nghiéim thu Dé tai

Nhận xét:

- Chiết tách DNA bằng phương pháp Salting out cải tiến cho lượng

DNA nhiéu hon và tỉnh khiết

Lấy ngẫu nhiên 5 mẫu của 3 phương pháp trên kiểm tra DNA bằng

điện di trên Agarose 0,7% ở hiệu điện thế 100V/30 phút

DNA

Ảnh 4.1: Điện đi kiểm tra DNA sau khi chiết tách

Trong đó: Mẫu số 1: Phương pháp Phenol/Chloroform

Mẫu số 2, 3: Phương pháp Salting out Mẫu số 4, 5: Phương pháp Saltng out cải tiến

26

đáo cio nghiém thu Dé tai

Tỷ lệ chết trung bình của lymphocyte sau khi tách ra khỏi máu toàn

phần: 1,44 + 0,59 Tỷ lệ chết của lymphocyte ở tất cả các mẫu < 5%: đủ

điều kiện để tiến hành bảo quản

27

Béo edo aghiém thu Dé tai

4.2 Kết quả nghiên cứu:

4.2.1 Két qua kiém tra lymphocyte sau khi bdo qudn:

* Kết quả kiểm tra lymphocyte sau 1 tháng ở nitơ lỏng:

Bảng 4.3: Tỷ lệ chết của tế bào sau 01 tháng

4.2.2 Kết quả chiết tách DNA người Mường:

Bảng 4.4: Kết quả chiết tách DNA của 107 mẫu người dân tộc Mường

Dé tinh khiét (OD260/280) | 107 1,70 + 0,16

Ham luong (ug/ml) 107 197,40 + 145,59

Chú thích:

Hàm lượng DNA ở trên là của dung dịch đã được pha loãng 5 lần Nhận xét: Chất lượng DNA chiết tách tốt, đáp ứng yêu cầu của kỹ thuật PCR và lưu giữ

4.2.3 Kết quả kiểm tra DNA sau 12 tháng bảo quản ở -70°C:

Bảng 4.5: Kết quả kiểm tra 20 mẫu sau thời gian bảo quản 12 tháng

Trong số 107 mẫu DNA bảo quản, kiểm tra ngẫu nhiên 4 mẫu 3, 35,

57, 86 bằng điện di trên Agarose 0,7%,

29

Béo eho nghiém thu Dé tai

Đối tượng nghiên cứu là người dân tộc Mường ở vùng sâu và xa thị

xã đã được điều tra phỏng vấn chọn lựa Để góp phần nhỏ phục vụ con em

dân tộc, đồng thời tranh thủ thời gian và vật liệu để đóng góp thêm cho các

đề tài nghiên cứu khác, chúng tôi tiến hành xác định tỷ lệ mang HBsAg (+),

có anti HBsAg, tiêm chủng vacxin phòng bệnh viêm gan B, tỷ lệ mang ký sinh trùng sốt rét, tỷ lệ thiếu enzym G6PD

Lop 10 Lop 11 Lop 12 Tong

Biểu đồ 4.2: Tỷ lệ mang HBsAg ở học sinh dân tộc Mường

Nhận xét:

Tỷ lệ có HBsAg (+) của 115 học sinh phổ thông dân tộc tỉnh Hoà Bình: 17,4 %, xấp xi với các kết quả nghiên cứu của một số tác g1ả trong nước

4.3.2 Đáp ứng với vacxin chống HEV (Engerix-B):

Bảng 4.7: Kết quả đáp ứng với vacxin viêm gan B ở học sinh dân tộc Mường

Đáp ứng không tốt Đáp ứng tốt

- Đáp ứng tốt khi nồng d6 anti HBsAg 2 1OmUI/ml

- Đáp ứng không tốt khi nồng d6 anti HBsAg < 1O0mUI/ml, trong dé:

+ Dap tmgkém_ : 1 < [anti HBsAg] < 10 mUI/ml + Không đáp ứng : [anti HBsAg] < ImUI/ml

31

(đáa cáo nghiệm thu Dé tai

Không phát hiện được trường hợp nào mang ký sinh trùng sốt rét

trong máu của 376 học sinh dân tộc tỉnh Hoà Bình

Béo cio nghiétm thu Dé tài

Nhận xét:

- Trong số 376 học sinh dân tộc tỉnh Hoà Bình được xét nghiệm: Có

9,3% thiếu GóPD

4.4 Sử dụng DNA chiết tách được của dân tộc Mường:

- Xác định các kháng nguyên HLA, xác định các alen của 3 locus: D5S8181, D7S820, D13S317 bằng PCR-STR (Short Tandem Repeat)

Kết quả sẽ được báo cáo trong Dự án Quỹ gen của GS.Vũ Triệu An -_ Xác định đột biến gen G6PD: Sẽ được tổng hợp báo cáo trong kết quả

của Đề tài nghiên cứu cấp Bộ về GóPD của PGS.TS Trần Thị Chính

- DNA của các đối tượng thiếu G6PD cũng đang được nghiên cứu về HUA tìm tần suất các alen có tỷ lệ cao của bệnh sẽ được báo cáo trong Dự án

của GS.Vũ Triệu An

33