Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào vero ở quy mô phòng thí nghiệm

Bên cạnh đó, việc thay đổi chính sách sử dụng vắcxin, ngừng sử dụng vắcxin thế hệ cũ rẻ tiền thay thế bằng vắcxin nhập ngoại sản xuất trên nuôi cấy tế bào đắt tiền hơn, làm giảm khả năng

Công ty Vắcxin và Sinh phẩm số 1

Báo cáo tổng kết đề tài:

Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ

sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero

ở quy mô phòng Thí nghiệm

Cnđt: Đỗ Tuấn Đạt

8514

Hà nội – 2010

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ABLV Lyssavirus dơi Úc (Australian Bat Lyssavirus)

BPL Β-propiolactone

CVS Chủng virút thử thách (Challenge Virus Standard)

EBLV Lyssavirus dơi châu Âu (European Bat Lyssavirus)

EP Dược điển châu Âu (European Pharmacopoeia)

IU Đơn vị quốc tế (International unit)

LAL Thử nghiệm xác định nội độc tố theo phương pháp LAL

(Limulus amoebocyte lysate)

LD50 Liều lượng gây chết 50% (Lethal Dose)

MEM Môi trường dinh dưỡng tối thiểu (Minimum Essential medium)

MNA Tế bào nguyên bào thần kinh chuột (Murine Neuroblastoma

cell)

MOI Multiplicity of Infection

MSV Chủng vi rút giống gốc (Master seed virus)

NIH Viện Sức khỏe Quốc gia Hoa Kỳ (National Institute of Health)

NMR Cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonance)

PPLO Pleuropneumonia - like organism

RFFIT Thử nghiệm ức chế điểm huỳnh quang nhanh (Rapid

fluorescent focus inhibition test)

SDS-PAGE Điện di trên gel acrylamide (Sodium dodecyl sulfate

polyacrylamide gel electrophoresis)

TCYTTG Tổ chức Y tế thế giới (WHO)

VABIOTECH Công ty Vắcxin và sinh phẩm số 1

VVSDT Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương

WCB Ngân hàng tế bào sản xuất (Working cell bank)

WSV Chủng vi rút giống sản xuất (Working seed virus)

2.1 Số lượng tế bào Vero thu được qua các đời cấy chuyển trong

quá trình nhân nuôi trên chai nuôi cấy một lớp

49 2.2 Kết quả nuôi cấy virút dại với các liều gây nhiễm khác nhau 51

2.3 Kết quả nuôi cấy virút dại theo ngày sau gây nhiễm virút vào

2.9 Kết quả kiểm tra chất gây sốt trong bán thành phẩm vắcxin

3.3 Kết quả nuôi cấy virút dại và thu hoạch nước nổi loạt 0109 97

3.4 Kết quả nuôi cấy virút dại và thu hoạch nước nổi loạt 0209 98

3.5 Kết quả nuôi cấy virút dại và thu hoạch nước nổi loạt 0309 99

3.6 Kết quả tinh sạch hỗn dịch virút của các loạt sản xuất thử

3.8 Kết quả cô đặc hỗn dịch virút của các loạt sản xuất thử

nghiệm

101

3.10 Kết quả pha bán thành phẩm cuối cùng của các loạt sản xuất

thử nghiệm

105 3.11 Kết quả sản xuất vắcxin thành phẩm của các loạt sản xuất thử

nghiệm

105 3.12 Kết quả kiểm tra chất lượng vắcxin thành phẩm tại cơ sở của

các loạt sản xuất thử nghiệm vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào

3.13 Kết quả kiểm tra chất lượng vắcxin thành phẩm tại cơ sở của

các loạt sản xuất thử nghiệm vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào

5.1 Kết quả kiểm tra an toàn đặc hiệu của vắcxin dại trên nuôi

5.2 Kết quả kiểm tra tính an toàn chung của vắcxin dại trên nuôi

5.3 Kết quả kiểm tra chất gây sốt của vắcxin dại trên nuôi cấy tế

5.4 So sánh đáp ứng miễn dịch của vắcxin dại trên nuôi cấy tế

bào Vero do VABIOTECH sản xuất với vắcxin Verorab

155

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

1.2 Nguồn gốc của các chủng dại cố định được sử dụng trong sản

2.1 Tóm tắt quy trình công nghệ sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy

2.4 Hình ảnh nhiễm virút dại vào tế bào Vero dưới kính hiển vi

2.5 Kết quả siêu ly tâm phân vùng bằng rotor zonal tinh chế virút

2.6 Hình ảnh điện di sản phẩm sau khi tinh chế virút dại theo

2.7 Hình ảnh siêu ly tâm phân vùng bằng rotor góc cố định tinh

2.8 Hình ảnh điện di các phân đoạn sau khi tinh chế virút dại theo

2.9 Phương pháp lai điểm xác định hàm lượng ADN tế bào tồn dư

3.1 Xác định hàm lượng ADN tế bào tồn dư trong các sản phẩm

3.2 Xác định hàm lượng ADN tế bào tồn dư trong các sản phẩm

3.3 Hình ảnh chạy điện di trên gel SDS-PAGE các sản phẩm của

loạt sản xuất vắcxin dại 0109

103 3.4 Hình ảnh chạy điện di trên gel SDS-PAGE các sản phẩm của

loạt sản xuất vắcxin dại 0209 và 0309

104

1.3 QUY TRÌNH SẢN XUẤT VÀ KIỂM TRA CHẤT LƢỢNG

VẮCXIN DẠI TRÊN NUÔI CẤY TẾ BÀO

20

1.4 ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC, TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ

SẢN XUẤT VẮCXIN DẠI TẠI VIỆT NAM

31

CHƯƠNG 2-XÂY DỰNG QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT

VẮCXIN DẠI TRÊN NUÔI CẤY TẾ BÀO Ở QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM

36

2.1.3 Kết quả quy trình nuôi cấy tế bào Vero trên chai tế bào một lớp 48

2.3.2 Kết quả nuôi cấy virút dại theo các điều kiện nhân nuôi khác

2.4 QUY TRÌNH TINH SẠCH HỖN DỊCH VIRÚT 74

2.7.1 Thử nghiệm phát hiện ADN tế bào Vero tồn dư trong các sản

phẩm của quy trình tinh chế vắcxin dại bằng phương pháp lai

CHƯƠNG 3-SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM VẮCXIN DẠI Ở QUY

MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM

94

3.10 KẾT QUẢ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG VẮCXIN THÀNH PHẨM

TẠI CƠ SỞ

105

CHƯƠNG 4 - XÂY DỰNG QUY TRÌNH KIỂM TRA CHẤT

LƯỢNG VÀ TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CHO VẮCXIN VẮCXIN DẠI TRÊN NUÔI CẤY TẾ BÀO

109

4.1.6 Thử nghiệm nhận dạng 125

4.2.3 Định lượng thimerosal trong vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào

Vero

131

4.2.4 Định lượng nhôm trong vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero

4.2.5 Xác định độ ẩm tồn dư trong vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào

Vero dạng đông khô

136 4.2.6 Kiểm tra tính chất vật lý vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero 139

5.3 XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CHO VẮCXIN DẠI TRÊN

NUÔI CẤY TẾ BÀO VERO

140

CHƯƠNG 5- ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN VÀ HIỆU LỰC

VẮCXIN TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM

143

5.1 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN VÀ ĐÁP

ỨNG MIỄN DỊCH CỦA VẮCXIN TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ

NGHIỆM

144 5.1.1 Các phương pháp đánh giá tính an toàn của vắcxin trên động

5.1.2 Các phương pháp đánh giá đáp ứng miễn dịch của vắcxin trên

5.2 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN VÀ HIỆU LỰC CỦA

VẮCXIN TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM

152 5.2.1 Tính an toàn của vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào trên động vật

MỞ ĐẦU

Tại trên 100 nước và vùng lãnh thổ, dại là một bệnh gây dịch trên động vật Bệnh dại ở chó là nguồn lây nhiễm chiếm đến 99% sang cho người và là nguy cơ đe dọa tính mạng trên 3,3 tỷ người, chủ yếu tại các nước châu Á và châu Phi Cùng với chó nuôi tại nhà, nhiều giống thú ăn thịt và dơi cũng có thể làm lây truyền bệnh dại sang cho người Khi đã có biểu hiện trên lâm sàng, phần lớn các ca bệnh dại đều tử vong do vậy việc tiêm phòng là biện pháp phòng bệnh cũng như điều trị bệnh dại cho hiệu quả cao nhất Gần 10 triệu người được tiêm phòng sau khi phơi nhiễm hàng năm chủ yếu tại các nước châu Á Tiêm phòng dại sau khi phơi nhiễm đã tránh được trên 300.000

ca tử vong hàng năm tại châu Á và châu Phi Chi phí toàn cầu hàng năm cho phòng bệnh dại ước tính khoảng trên 1 tỷ đô la Mỹ Chi phí này cũng như tỷ

lệ đi tiêm phòng sau khi phơi nhiễm dự tính sẽ tăng lên một cách đáng kể khi tất cả các nước thay thế vắcxin sản xuất từ mô thần kinh bằng vắcxin trên nuôi cấy tế bào

Trên 100 năm trước đây, Louis Pasteur và cộng sự đã phát triển vắcxin dại thô đầu tiên để tiêm phòng sau khi phơi nhiễm dựa trên việc bất hoạt virút trên mô thần kinh Từ đó trở đi một số loại vắcxin đã được phát triển và sử dụng trên thế giới Các vắcxin thế hệ thứ nhất đều sử dụng mô động vật để có được hỗn dịch chứa virút Các vắcxin này đã được sử dụng rộng rãi để phòng bệnh cho cả người và động vật Tuy nhiên, các vắcxin này có rất nhiều nhược điểm như còn virút sống tồn dư, hay gặp các phản ứng não tủy sau khi tiêm vắcxin và hàm lượng kháng nguyên cho một liều tiêm thấp đòi hỏi phải có một liệu trình điều trị kéo dài với một số lượng lớn các mũi tiêm Dù đã có những cải tiến bằng cách nhân nuôi virút trên não các động vật sơ sinh trước

khi myelin phát triển, các vắcxin bất hoạt sản xuất trên não động vật chưa dứt sữa vẫn có thể gây ra các phản ứng thần kinh không mong muốn Do vậy, các vắcxin thế hệ thứ hai sản xuất trên nuôi cấy tế bào đã ra đời nhằm khắc phục các nhược điểm của các dạng vắcxin cổ điển Vắcxin này có tính an toàn và công hiệu cao do đó được các nước phát triển lựa chọn để tiêm phòng cho người trước và sau khi phơi nhiễm với virút Đáp ứng miễn dịch và hiệu lực của vắcxin trên nuôi cấy tế bào đã được chứng minh trên động vật thí nghiệm

và thực địa lâm sàng trên người Ở cả phương pháp tiêm phòng trước và sau khi phơi nhiễm, các vắcxin này đều tạo được đáp ứng kháng thể ở trên 99% người được tiêm Sử dụng các vắcxin thế hệ mới kết hợp với xử lý vết cắn đúng cách và tiêm phòng globulin miễn dịch kháng dại đã tạo ra hiệu quả phòng bệnh dại là 100% thậm chí cả với những trường hợp bị cắn có nguy cơ mắc bệnh cao Do vậy việc nghiên cứu, phát triển, sản xuất và tiến tới đưa ra

sử dụng rộng rãi vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào là cần thiết Các quốc gia trên thế giới cần sớm có các chiến lược để sử dụng và triển khai rộng khắp loại vắcxin tiên tiến và cho hiệu quả cao này

Tại Việt Nam, trong những năm 1991-1995, bệnh dại là vấn đề y tế nghiêm trọng gây ảnh hưởng lớn đến sức khỏe, tính mạng và kinh tế của người dân Bệnh xảy ra quanh năm, lưu hành ở hầu hết các tỉnh, thành phố trên cả nước Nếu tính một người tiêm vắcxin dại phí tổn 300.000 đồng (gồm tiền thuốc, công lao động, tiền đi lại…) thì trong năm 1995 cả nước tốn gần

100 tỷ đồng Thêm vào đó, mỗi năm có trên dưới 500 người thiệt mạng do bệnh dại Trước tình hình nghiêm trọng của bệnh dại, năm 1996, Chính phủ

đã ban hành chỉ thị về việc tăng cường phòng chống bệnh dại và Bộ Y tế đã thành lập ban chỉ đạo Phòng chống bệnh dại Quốc gia Thành công của Chương trình là đến năm 2006 số ca tử vong do bệnh dại đã giảm 81% so với năm 1995 Tuy nhiên, trong năm 2007, số ca tử vong do bệnh dại đã lại tăng

lên đến trên 100 trường hợp Nguyên nhân có thể là do việc kiểm soát nguồn gây bệnh mà chủ yếu là chó - nguồn gây bệnh chính tại Việt Nam còn nhiều hạn chế Bên cạnh đó, việc thay đổi chính sách sử dụng vắcxin, ngừng sử dụng vắcxin thế hệ cũ rẻ tiền thay thế bằng vắcxin nhập ngoại sản xuất trên nuôi cấy tế bào đắt tiền hơn, làm giảm khả năng được tiếp cận với vắcxin phòng bệnh của các bệnh nhân nghèo, đặc biệt tại các vùng nông thôn, vùng sâu, vùng xa

Ở Việt Nam, trước năm 1974, vắcxin phòng bệnh dại cho người chủ yếu là vắcxin sản xuất từ não cừu, dê (Fermi, Semple) Các vắcxin này có chứa một lượng virút chưa bất hoạt và tính sinh miễn dịch thấp nên phải tiêm nhiều mũi cùng với liều tiêm lớn Từ năm 1974, Viện Vệ sinh dịch tễ học Hà Nội đã nghiên cứu sản xuất vắcxin dại trên não chuột ổ theo phương pháp của Fuenzalida-Palacios được chuyển giao kỹ thuật từ Viện Pasteur Paris (Pháp)

Ưu điểm chính của vắcxin này là không chứa hoặc chứa rất ít myelin của não nên ít gây các tai biến thần kinh hơn Hiệu giá virút thu hoạch từ não chuột ổ cao hơn do đó tính sinh miễn dịch tốt hơn do vậy làm giảm số liều tiêm Việc

sử dụng vắcxin dại trên não chuột ổ trong hơn 30 năm qua đã góp phần hạn chế nguy cơ tử vong do bệnh dại Theo kết quả báo cáo từ các Trung tâm Y tế

Dự phòng trên cả nước, trên 80% các trường hợp sau khi tiêm vắcxin Fuenzalida có các phản ứng không mong muốn, các phản ứng không mong muốn nghiêm trọng như viêm não tủy gây liệt vĩnh viễn và tử vong gặp với tỷ

lệ 1-2 trường hợp/10.000 mũi tiêm Do các phản ứng không mong muốn nghiêm trọng này, nên từ năm 2007, Bộ Y tế đã ra quyết định ngừng việc sử dụng vắcxin dại Fuenzalida trên toàn quốc thay thế bằng các vắcxin nhập ngoại sản xuất trên nuôi cấy tế bào trong đó chủ yếu là vắcxin Verorab của Hãng Aventis Pasteur Tỷ lệ bệnh nhân được tiêm phòng bằng vắcxin trên nuôi cấy tế bào được nhập ngoại trước đây chỉ chiếm 15% số người được tiêm

vắcxin dại và giá thành cho một liệu trình tiêm loại vắcxin này rất đắt (gần 800.000 đồng) do đó cơ hội để các bệnh nhân nghèo, vùng sâu, vùng xa được tiêm loại vắcxin này là rất hạn chế

Đứng trước yêu cầu cần sớm có được vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào được sản xuất trong nước nhằm làm giảm chi phí tiêm phòng cho bệnh nhân,

để nhiều người có cơ hội được tiêm phòng vắcxin dại từ đó giảm tỷ lệ tử vong

do bệnh dại, từ năm 2005 nhóm nghiên cứu của Công ty Vắcxin và sinh phẩm

số 1 (VABIOTECH) đã hướng đến việc nghiên cứu và phát triển vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero tại Việt Nam Nhận được sự hợp tác và giúp đỡ của của Trung tâm Kiểm soát bệnh tật và Dự phòng Hoa kỳ (CDC) trong việc cung cấp các chủng giống sản xuất vắcxin dại, nhóm nghiên cứu đã tiến hành các nghiên cứu ở cấp cơ sở và lựa chọn ra được chủng virút PV (Pasteur Virus) và môi trường nuôi cấy không huyết thanh đạt các yêu cầu cho sản xuất vắcxin Từ những thành công này, nhóm nghiên cứu bắt đầu tiến hành xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero ở quy mô phòng thí nghiệm Với kinh nghiệm trên 30 năm sản xuất và kiểm định chất lượng vắcxin dại sản xuất trên não chuột ổ, cùng với những kinh nghiệm và thành công trong việc phát triển các vắcxin mới, VABIOTECH

đưa ra các mục tiêu và nội dung trong Đề tài nghiên cứu này với mong muốn sớm có được sản phẩm vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào đạt tiêu chuẩn được

sản xuất tại Việt Nam

Các mục tiêu nghiên cứu của Đề tài

1 Xây dựng được qui trình công nghệ ổn định sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero ở qui mô phòng thí nghiệm

2 Sản xuất được các loạt vắcxin dại có chất lượng đạt yêu cầu của Tổ chức Y tế thế giới và tương đương với các vắcxin cùng loại của nước ngoài như vắcxin Verorab của Aventis Pasteur

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ BỆNH DẠI

1.1.1 Tác nhân gây bệnh và đặc điểm bệnh lý

Virút dại thuộc nhóm Rhabdoviridae, họ Lyssavirus Trong họ Lyssavirus, virút dại cổ điển (các chủng virút hoang dại ở chó, mèo… và các chủng virút dại cố định) thuộc genotype đầu tiên trong 7 genotype của nhóm Các virút thuộc các genotype còn lại thường gây bệnh ở động vật, tuy nhiên

đã có những trường hợp tử vong do nhiễm các virút này ở người như nhiễm Lyssavirus dơi Úc (ABLV) hay nhiễm Lyssavirus dơi châu Âu (EBLV) Hạt virút dại có hình viên đạn với chiều dài trung bình là 180 nm và đường kính là 75nm Mỗi hạt virút có chứa nucleocapsid xoắn bao quanh bởi lớp một vỏ lipid kép (Hình 1.1) Hệ gen là một ARN chuỗi đơn âm không phân đoạn có chiều dài 11,9 kb Bề mặt ngoài bao phủ bởi các gai có chiều dài khoảng 10

nm gắn vào lớp lipid Virút dại có 5 protein cấu trúc chính Phức hợp ribonucleoprotein hạt nhân xoắn chứa ARN hệ gen liên kết với 3 protein bên ngoài là enzyme ARN polymerase phụ thuộc ARN (L) (190kd), nucleoprotein (N) (55 Kd) và phosphoprotein (NS) (38 KD) Các protein này cùng với ARN tạo thành phức hợp ARN hoạt động kiểm soát cả quá trình phiên mã và nhân lên của virút Các protein cấu trúc khác là protein phức hợp (M) (26 kD) nằm

ở mặt trong vỏ của virút tạo thành cấu trúc ống và glycoprotein (G) (67K) tạo thành các gai trên bề mặt virút [46], [52]

Bệnh dại bản chất là bệnh thú y và lây nhiễm sang người qua vết cắn và vết cào xuyên da của động vật nhiễm Lây truyền cũng có thể xảy ra khi chất lây nhiễm thường là nước bọt xâm nhập trực tiếp vào niêm mạc hoặc tổn

thương da mới của nạn nhân Bệnh dại rất hiếm xảy ra do hít phải các chất tiết

có chứa virút hoặc cấy ghép phủ tạng nhiễm bệnh

Hình 1.1 Cấu trúc hạt virút dại

Đối với các ca bệnh ở người, giai đoạn ủ bệnh thường từ vài tuần đến vài tháng nhưng cũng có thể thay đổi từ dưới 1 tuần đến trên 1 năm Thời gian

ủ bệnh phụ thuộc vào nhiều yếu tố như lượng virút lây nhiễm, mức độ tổn thương và vị trí gần với thần kinh trung ương không của nơi virút xâm nhập [13], [55]

Virút lây nhiễm di chuyển vào hệ thống thần kinh trung ương qua các dây thần kinh ngoại vi, khi đến não bộ vi rút nhân lên và phát tán ngược trở ra

hệ thống thần kinh và nhiều phủ tạng khác nhau như tuyến nước bọt Virút dại lan truyền đến toàn bộ cơ thể thì bắt đầu các triệu chứng khởi phát tuy nhiên lúc đó cơ thể không có được đáp ứng miễn dịch với vi rút [52]

Hiện chưa có thử nghiệm nào được sử dụng để chẩn đoán bệnh dại ở người trước khi bệnh khởi phát trên lâm sàng Do vậy, chẩn đoán bệnh sẽ chỉ dựa trên tiền sử bệnh, các biểu hiện và triệu chứng có liên quan đến tình hình

Hệ gen ARN cuộn xoắn Nucleoprotein Phosphoprotein ARN polymerase

Phức hợp ribonucleoprotein hoặc nucleocapsid

Protein phức hợp

Màng lipid

từ vật chủ Glycoprotein

Vỏ bao ngoài

dịch tễ của bệnh trên động vật Biểu hiện đầu tiên của bệnh dại thường là sốt nhẹ, đau và dị cảm tại vết thương Khi virút lan truyền vào hệ thần kinh trung ương, viêm não tiến triển sẽ xuất hiện có các đặc trưng là sợ nước hoặc sợ gió, tăng động và mất ngủ, co giật toàn thân, sau đó một vài ngày sẽ ngừng thở ngừng tim Bệnh dại gây liệt có thể xảy ra ở 30% ca bệnh ở người, tiến triển ít trầm trọng hơn tuy nhiên kết cục cuối cùng cũng là tử vong Dạng bệnh dại này thường bị chẩn đoán nhầm là bệnh lý khác [55]

Các chất kháng virút, interferon và liều lượng cao huyết thanh kháng dại được sử dụng trong điều trị các ca bệnh ở người nhưng thường không tránh được nguy cơ tử vong Cho dù hiện đã có 1 trường hợp bệnh dại lây truyền từ dơi được cứu sống sau khi dùng các thuốc gây ức chế thần kinh và thuốc kháng virút nhưng liệu trình điều trị tích cực này lại gặp thất bại khi áp dụng trên một số bệnh nhân khác cũng bị nhiễm dại do dơi [52]

1.1.2 Đáp ứng miễn dịch với vi rút dại

Sau khi nhiễm, virút dại chủ yếu xâm nhập vào hệ thần kinh do dó kháng nguyên thường bị tách biệt ra khỏi hệ thống miễn dịch Đáp ứng kháng thể thường không được phát hiện ở người nhiễm trước 2 tuần đầu tiên của bệnh Các vắcxin trên nuôi cấy tế bào hiện nay cho kháng thể trung hòa virút với protein G cao và sớm [46]

Với vắcxin dại, không thể tiến hành các thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên có nhóm chứng và theo dõi dọc ở các nhóm so sánh không điều trị Do vậy, thông tin về hiệu quả vắcxin sẽ chủ yếu dựa trên các kết quả thực địa tiêm phòng sau phơi nhiễm ở người đã bị phơi nhiễm với chó có chẩn đoán chắc chắn mắc dại trong phòng thí nghiệm Đánh giá gián tiếp hiệu quả vắcxin có thể được tiến hành qua các nghiên cứu về tính sinh miễn dịch so sánh giữa hiệu giá kháng thể trung hòa virút sau khi tiêm vắcxin thử nghiệm

với kháng thể có được khi tiêm vắcxin đối chứng đã biết hiệu quả bảo vệ Thêm vào đó, mô hình động vật sẽ được sử dụng để chứng minh lợi ích của tiêm phòng vắcxin Tuy hiệu giá kháng thể trung hòa virút bảo vệ ở người chưa được thiết lập nhưng nồng độ tối thiểu là 0,5 IU/ml được coi là tương đương với khả năng bảo vệ Ở người khỏe mạnh sau khi tiêm vắcxin, nồng độ kháng thể có thể đạt được vào ngày thứ 14 của liệu trình tiêm sau phơi nhiễm không phụ thuộc vào độ tuổi [46], [55]

1.1.3 Tác động của bệnh dại đối với sức khỏe cộng đồng

Tại trên 100 nước và vùng lãnh thổ, dại là một bệnh gây dịch trên động vật Bệnh dại ở chó là nguồn lây nhiễm chiếm đến 99% sang cho người và là nguy cơ đe dọa tính mạng trên 3,3 tỷ người, chủ yếu tại các nước châu Á và châu Phi Cùng với chó nuôi tại nhà, nhiều giống thú ăn thịt và dơi cũng có thể làm lây truyền bệnh dại sang cho người [55]

Khi đã có biểu hiện trên lâm sàng, phần lớn các ca bệnh dại đều tử vong Tuy nhiên, các ca tử vong do bệnh dại còn ít được báo cáo tại một số nước có bệnh dại lưu hành đặc biệt ở nhóm tuổi nhỏ Số ca tử vong hàng năm ước tính

là 55.000 có thể là thấp hơn so với con số thực Châu Á và châu Phi chiếm phần lớn các ca tử vong do bệnh dại Tính riêng tại Ấn Độ, ước tính có khoảng 20.000 ca chết mỗi năm với tỷ lệ là 2 /100.000 dân; tại châu Phi con

số này cũng tương đương là 24.000 ca (hoặc 4 ca /100.000 dân) Cho dù tất cả các lứa tuổi đều có thể mắc bệnh nhưng trẻ dưới 15 tuổi là đối tượng thường mắc nhất với 30-50% số trường hợp được tiêm phòng sau khi bị cắn là trẻ từ 5-14 tuổi và phần lớn là con trai [55]

Khoảng 98% trường hợp bệnh dại ở người xảy ra tại những vùng nuôi nhiều chó mà đa phần được thả rông Bệnh dại ở người là một bệnh hiếm gặp tại các nước công nghiệp phát triển và ở phần lớn các nước Mỹ La tinh nơi

bệnh dại trên chó đã gần được loại trừ do giảm thiểu số lượng chó thả rông và tiêm phòng cho chó nuôi tại nhà Tại các nước như Thái Lan, việc triển khai tiêm phòng rộng rãi cho chó và tăng cường tiêm phòng sau khi bị cắn đã làm giảm đáng kể số ca chết do bệnh dại ở người

Gần 10 triệu người được tiêm phòng sau khi bị cắn hàng năm chủ yếu là tại Trung Quốc và Ấn Độ Tiêm phòng dại sau khi bị cắn đã tránh được 330.304 ca tử vong hàng năm tại châu Á và châu Phi Chi phí toàn cầu hàng năm cho phòng bệnh dại ước tính khoảng trên 1 tỷ đô la Mỹ Chi phí này cũng như tỷ lệ đi tiêm phòng sau khi bị cắn dự tính sẽ tăng lên một cách đáng

kể khi tất cả các nước thay thế vắcxin sản xuất từ mô thần kinh bằng vắcxin trên nuôi cấy tế bào hiện đại, an toàn và có hiệu lực cao [55]

1.1.4 Các khuyến cáo về tiêm phòng bệnh dại hiện nay

1.1.4.1 Tiêm phòng trước khi phơi nhiễm

Tiêm phòng trước phơi nhiễm được chỉ định cho những người có nguy

cơ phơi nhiễm cao với virút dại Những đối tượng này bao gồm nhân viên phòng thí nghiệm, nhân viên thú y, người nuôi giữ động vật, nhân viên bảo vệ động vật hoang dại thường xuyên phải tiếp xúc với những động vật có khả năng lây nhiễm cao cũng như các khách du lịch đến các khu vực có nguy cơ mắc bệnh dại cao Tuy nhiên, theo các nghiên cứu về độ tuổi mắc bệnh, nguy

cơ nhiễm bệnh cao nhất là trẻ em sống trong vùng động vật nhiễm bệnh dại tại các nước đang phát triển [13], [55]

Chỉ định tiêm bắp

Tiêm phòng vắcxin dại trước phơi nhiễm cần liều tiêm bắp 1 ml hoặc 0,5 ml tùy thuộc vào loại vắcxin, tiêm theo lịch 0, 7, 28 ngày (ngày thứ 28 được lựa chọn nhưng có thể tiêm sớm hơn vào ngày 21 nếu có giới hạn về

mặt thời gian)

Chỉ định tiêm trong da

Tiêm trong da 0,1 ml vào ngày 0, 7, 28 (ngày thứ 28 được lựa chọn nhưng có thể tiêm sớm hơn vào ngày 21 nếu có giới hạn về mặt thời gian) là một liệu pháp được lựa chọn thay thể đường tiêm bắp Tuy nhiên, tiêm trong

da đòi hỏi phải thực hành đúng kỹ thuật, cán bộ tiêm cần được đào tạo và đượcgiám sát tốt

Tiêm nhắc lại

Tiêm nhắc lại định kỳ chỉ dành cho các đối tượng thường xuyên và liên tục tiếp xúc với virút dại Trong các trường hợp này, liều nhắc cần được tiêm với khoảng cách phù hợp được dự tính tùy theo kết quả xét nghiệm kháng thể Các nhân viên phòng thí nghiệm có nguy cơ lây nhiễm vỉ rút dại cao cần được xét nghiệm 6 tháng một lần Hiệu giá kháng thể trung hòa virút ít nhất là 0,5 IU/ml được cho là có khả năng bảo vệ Ở những nơi không có điều kiện xét nghiệm huyết thanh học, tiêm phòng nhắc lại được tiến hành 5 năm một lần

1.1.4.2 Tiêm phòng sau khi phơi nhiễm

Chỉ định tiêm phòng sau phơi nhiễm kết hợp hoặc không kết hợp với huyết thanh kháng dại tùy thuộc vào mức độ tiếp xúc với động vật nghi dại:

Độ I - Sờ hoặc cho động vật ăn, liếm trên bề mặt da (không tiếp xúc)

Độ II - Ngậm, cắn trên da không tổn thương, các vết sây xướt hoặc trợt nhẹ không gây chảy máu

Độ III - Một hoặc nhiều vết cắn hoặc vết cào trên da, liếm trên da tổn thương, lây nhiễm niêm mạc với nước bọt, tiếp xúc với dơi

Đối với độ I không cần tiêm phòng, độ II tiêm vắcxin ngay lập tức, độ

II tiêm vắcxin kết hợp với huyết thanh Đối với độ II và độ III, rửa và sát xà phòng (trong khoảng 15 phút) toàn bộ vết thương và vết cắn ngay lập tức hoặc càng sớm càng tốt

Không tiếp tục tiêm phòng sau phơi nhiễm nữa nếu động vật nghi dại

đã được khằng định bằng các xét nghiệm là không nhiễm dại hoặc chó hoặc mèo nuôi vẫn khỏe mạnh sau 10 ngày theo dõi

Các yếu tố để quyết định xem có bắt đầu tiêm phòng sau phơi nhiễm hay không là mức độ nghi ngờ động vật mắc dại, mức độ tiếp xúc (độ I-III), đặc điểm lâm sàng của động vật cũng như khả năng xét nghiệm của phòng thí nghiệm Trong phần lớn các trường hợp tại các nước đang phát triển, tình trạng tiêm phòng vắcxin của động vật cũng là một trong những yếu tố cần được quan tâm đến [55]

Chỉ định tiêm bắp

Lịch tiêm phòng sau phơi nhiễm với liều tiêm bắp là 1 hoặc 0,5 ml tùy thuộc vào nhà sản xuất Liệu trình tiêm khuyến cáo bao gồm 4 hoặc 5 liều tiêm

- Liệu trình tiêm 5 liều là tiêm bắp 1 liều vào các ngày 0, 3, 7, 14, 28

- Liệu trình tiêm 4 liều là tiêm bắp 2 liều vào ngày 0 tiếp theo tiêm 1 liều vào ngày 7 và 21

Chỉ định tiêm trong da

Có thể tiêm theo liệu trình 2 vị trí hoặc 8 vị trí tùy thuộc theo khuyến cáo của nhà sản xuất

- Liệu trình tiêm trong da 8 vị trí là vào ngày 0, tiêm 8 vị trí (1 mũi vào mỗi bên cánh tay, 1 mũi vào mỗi bên đùi, 1 mũi vào mỗi bên vùng thượng đòn và 1 mũi vào mỗi bên vùng bụng dưới); vào ngày thứ 7, tiêm 1 mũi vào mỗi bên cánh tay và mỗi bên đùi và vào ngày 30 và 90, tiêm 1 mũi vào một bên cánh tay Một liều tiêm vào ngày 90 có thể thay thế bằng 2 liều tiêm ngày thứ 30

- Liệu trình tiêm trong da 2 vị trí là tiêm 1 mũi 0,1 ml tại 2 vị trí vào ngày 0, 3, 7 và 28

Đối với những đối tượng đã tiêm phòng đầy đủ trước phơi nhiễm hoặc

đã từng tiêm phòng sau phơi nhiễm với vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào hoặc hiện có hiệu giá kháng thể trung hòa virút ít nhất là 0,5 IU/ml, chỉ cần tiêm 2 liều tiêm bắp hoặc dưới da vào ngày 0 và 3 là đủ

1.1.4.3 Tiêm kháng huyết thanh phòng dại

Huyết thanh phòng dại được chỉ định cho phơi nhiễm độ III và phơi nhiễm độ II ở người suy giảm miễn dịch Do mức độ thải trừ tương đối chậm, globulin miễn dịch kháng dại ở người (HRIG) thường được lựa chọn đặc biệt trong trường hợp bị phơi nhiễm nghiêm trọng và đa vị trí Tuy nhiên, dạng HRIG rất hiếm, chỉ đủ sử dụng tại các nước công nghiệp phát triển Globulin miễn dịch ngựa tinh chế (ERIG) hoặc sản phẩm F(ab’) của ERIG cũng có thể được sử dụng Phần lớn các chế phẩm ERIG mới đều tốt, có độ tinh khiết cao,

an toàn và rẻ hơn so với HRIG Tuy nhiên, do có nguồn gốc khác loài nên khi tiêm ERIG sẽ có nguy cơ gặp phải các phản ứng quá mẫn

Huyết thanh kháng dại không được tiêm muộn quá 7 ngày sau khi bắt đầu tiêm phòng sau phơi nhiễm Liều lượng của HRIG là 20IU/kg cân nặng còn đối với ERIG và sản phẩn F(ab’) là 40IU/kg cân nặng Toàn bộ các sản

phẩm huyết thanh kháng dại cần được tiêm vào trong hoặc xung quanh vết thương Phần còn lại của huyết thanh phải được tiêm bắp vào vị trí xa chỗ tiêm vắcxin [55]

1.2 TỔNG QUAN VỀ VẮC XIN DẠI

Trên 100 năm trước đây, Louis Pasteur và cộng sự đã phát triển vắcxin dại thô đầu tiên để tiêm phòng sau khi bị cắn dựa trên việc bất hoạt virút trên

mô thần kinh Từ đây trở đi một số loại vắcxin đã được phát triển và sử dụng trên thế giới

1.2.1 Các vắcxin thế hệ thứ nhất

Các vắcxin thế hệ thứ nhất đều sử dụng mô động vật để có được hỗn dịch chứa virút Các vắcxin này đều đã được sử dụng rộng rãi cho cả người và động vật Các loại vắcxin dại chủ yếu thuộc thế hệ thứ nhất được sử dụng cho người và thú y được trình bày trong Bảng 1.1 [27], [36]

Bảng 1.1 Các loại vắc xin dại thế hệ thứ nhất

được sử dụng cho người và thú y

virút

Loại vắcxin

Phương pháp bất hoạt

Sử dụng cho người

Dạng vắcxin

Mô thần kinh: Cừu, dê Pasteur Bất hoạt Phenol (1 ngày) Có Dung dịch

Mô thần kinh: Thỏ, cừu,

dê

Pasteur Bất hoạt Phenol, 300C Có Dung dịch

Mô thần kinh: Cừu Pasteur Bất hoạt Ether-Phenol Có Dung dịch

Mô thần kinh: Cừu Pasteur Bất hoạt Phenol (14 ngày) Có Đông khô

Mô thần kinh: Cừu PV11 Bất hoạt  -propiolactone Có Đông khô Não chuột nhắt chưa

LEP

Giảm độc lực

sử dụng cho chó)

Đông khô

HEP

Giảm độc lực

dụng cho gia súc, mèo)

Đông khô

Dựa trên các loại mô được sử dụng để sản xuất khác nhau, các vắcxin

thế hệ thứ nhất có thể được xếp loại theo:

Vắcxin sản xuất từ mô thần kinh động vật trưởng thành

Các vắcxin này có rất nhiều các nhược điểm như:

- Còn virút sống tồn dư: các vắcxin như vắcxin Fermi thường có chứa virút sống do chưa được bất hoạt hoàn toàn bởi phenol nên được coi như là

vắcxin hỗn hợp có cả virút sống tồn dư và virút đã bất hoạt, do vậy vắcxin này nguy hiểm khi sử dụng

- Phản ứng não tủy sau khi tiêm vắcxin: một số vắcxin thuộc nhóm này như vắcxin Semple và vắcxin Hempt tuy đã được bất hoạt hoàn toàn và đáp ứng được yêu cầu về mặt công hiệu nhưng những phản ứng não tủy nghiêm trọng do tiêm vắcxin vẫn xảy ra trong hoặc sau khi tiêm phòng Phản ứng do yếu tố gây phản ứng trong não (một protein cơ bản liên quan đến myelin) tăng cao khi sử dụng các mô thần kinh động vật trưởng thành Những phản ứng này là các tai biến liệt thần kinh từ liệt nhẹ thoáng qua đến các thương tổn thần kinh vĩnh viễn và thậm chí là tử vong

- Hàm lượng kháng nguyên cho một liều tiêm thấp: đặc tính này đòi hỏi phải có một liệu trình điều trị kéo dài với một số lượng lớn các mũi tiêm Các vắcxin này thường được đóng dưới dạng dung dịch nên có tính ổn định thấp chỉ trong vòng gần 6 tháng [27]

Vắcxin sản xuất trên trứng có phôi

Thích ứng các chủng vắcxin dại trên trứng có phôi (chủng Pitman Moore) đã phát triển được các vắcxin dại sử dụng cho người an toàn hơn, giảm thiểu các phản ứng não tủy sau tiêm vắcxin Tỷ lệ có các phản ứng thần kinh thấp hơn (dưới 3/100.000 mũi tiêm) ở các vắcxin dùng cho người được sản xuất trên phôi vịt so với các vắcxin được sản xuất trên mô thần kinh Tuy nhiên các phản ứng tại chỗ lại rất hay gặp như có đến 70% gặp ở các liệu trình tiêm vắcxin dự phòng và 100% ở các liệu trình tiêm điều trị với 14 liều tiêm Tính sinh miễn dịch của loại vắcxin này cần được xem xét thêm do trong một số trường hợp lượng kháng thể đạt được rất thấp Các chủng virút

cố định Flury và Kelev đã thích ứng trên phôi gà được cấy chuyển nhiều đời (180 đối với Flury và 70 đối với Kelev) tạo ra các chủng virút giảm độc lực

Các vắcxin sản xuất với các chủng giảm độc lực trên phôi gà đã được sử dụng cho chó, mèo và bò

Trứng có phôi sử dụng trong sản xuất vắcxin đòi hỏi một chất lượng rất cao, phải đảm bảo loại trừ được tất cả virút ngoại lai (bệnh đốm trắng ở gia cầm) và vi khuẩn (Salmonella) [27], [36]

Vắcxin sản xuất từ não động vật chưa dứt sữa

Yếu tố gây phản ứng trong não là nguyên nhân của các tai biến thần kinh sau tiêm vắcxin có trong mô thần kinh động vật trưởng thành nhưng có không đáng kể hoặc không có ở trong các mô thần kinh của một số động vật chưa dứt sữa Thêm vào đó, một lượng lớn hơn virút có được khi nhân nuôi trên các mô thần kinh của động vật sơ sinh, do đó vắcxin dại đã được phát triển trên những động vật này Vắcxin đầu tiên thuộc loại này được phát triển bởi Fuenzalida và Palacios trên não chuột ổ với việc sử dụng 3 chủng virút dại cố định (CVS, 51 và 91) Dù đã có những cải tiến bằng cách nhân nuôi virút trên não các động vật sơ sinh trước khi myelin phát triển, các vắcxin bất hoạt sản xuất trên não động vật chưa dứt sữa vẫn có thể có các phản ứng thần kinh không mong muốn Khoảng 0,3 - 0,8 trên 1.000 cá thể được tiêm vắcxin có biểu hiện viêm não tủy nặng do trong vắcxin vẫn tồn dư các protein thần kinh Thêm vào đó, các vắcxin trên mô thần kinh có hiệu lực thấp hơn so với vắcxin trên nuôi cấy tế bào nên đòi hỏi một liệu trình tiêm phòng dài hơn Trong những năm gần đây, Ấn Độ và Nepal đã dần thành công trong việc ngừng sản xuất và sử dụng vắcxin trên mô thần kinh Tuy nhiên, với giá thành

rẻ và điều kiện kinh tế còn khó khăn, vắcxin trên mô thần kinh hiện vẫn được

sử dụng tại một số nước chủ yếu là tại vùng Đông Nam châu Á [36], [55]

1.2.2 Các vắcxin thế hệ thứ hai

Đây là các vắcxin được sản xuất trên nuôi cấy tế bào Vắcxin chứa virút bất hoạt sau khi nhân nuôi trên các dòng tế bào như tế bào lưỡng bội người, tế bào thận khỉ phôi thai, tế bào thận chuột đất vàng tiên phát, tế bào Vero, tế bào phôi gà… Các vắcxin này sử dụng tiêm phòng trước và sau phơi nhiễm [22], [34]

Vắcxin sản xuất trên tế bào lưỡng bội người là vắcxin được đưa vào sử dụng đầu tiên vào năm 1967 Vắcxin này có tính an toàn và công hiệu cao do

đó được các nước phát triển lựa chọn để tiêm phòng cho người trước và sau khi phơi nhiễm với virút [11] Với cố gắng tìm ra các vắcxin có giá thành thấp hơn và nhưng đặc tính lại tương đương với vắcxin sản xuất trên tế bào lưỡng bội người, trong những năm gần đây vắcxin tinh khiết trên tế bào phôi gà và vắcxin tinh khiết trên tế bào Vero đã được phát triển [30] Các vắcxin trên nuôi cấy tế bào đều sử dụng các virút cố định thuộc genotype 1 [36] Nguồn gốc của các chủng virút dại cố định chính được sử dụng để sản xuất vắcxin trên nuôi cấy tế bào được trình bày trong Hình 1.2

Đáp ứng miễn dịch và hiệu quả cả vắcxin trên nuôi cấy tế bào được chứng minh qua các nghiên cứu trên động vật thí nghiệm và các đánh giá lâm sàng trên người Đối với cả phòng trước và sau khi phơi nhiễm, vắcxin cho đáp ứng kháng thể ở trên 99% người được tiêm Sử dụng đúng thời điểm vắcxin mới kết hợp với việc xử trí vết thương đúng cách và tiêm huyết thanh kháng dại cho hiệu quả phòng dại gần 100% thậm chí đối với cả các trường hợp phơi nhiễm nguy cơ cao Tuy nhiên, việc tiêm phòng muộn hoặc không tiêm phòng đủ mũi đặc biệt với các tổn thương ở đầu, cổ, tay hoặc đa vết cắn

có thể vẫn bị tử vong do mắc bệnh dại [55]

Các vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào cũng được cho là các vắcxin có độ

an toàn cao Sau khi tiêm bắp vắcxin trên nuôi cấy tế bào lưỡng bội người, các phản ứng tại chỗ nhẹ và tự khỏi như đau, sưng tấy, đỏ tại chỗ tiêm xảy ra

ở 21-74% số người được tiêm Các phản ứng toàn thân nhẹ như sốt, đau đầu, chóng mặt, rối loạn tiêu hóa gặp ở 5-40% trường hợp Phản ứng quá mẫn xảy

ra ở 6% người được tiêm liều nhắc lại và rất ít gặp ở tiêm liều ban đầu [43] Khi thêm bước tinh chế, các phản ứng toàn thân đã hiếm gặp hơn Với vắcxin trên nuôi cấy tế bào Vero và tế bào phôi gà, tỷ lệ gặp các phản ứng tại chỗ và toàn thân nhẹ tương đương với vắcxin sử dụng tế bào lưỡng bội người, tuy nhiên không gặp các phản ứng quá mẫn hệ thống [34], [55]

Hình 1.2 Nguồn gốc của các chủng dại cố định đƣợc sử dụng để sản xuất

vắcxin trên nuôi cấy tế bào

Nuôi cấy tế bào phôi gà

Não gà

Phôi gà

SAD

Phôi gà

Kinh nghiệm 20 năm (1985-2005) sử dụng một trong các vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào, vắcxin Verorab, đã cho thấy vắcxin an toàn và cho hiệu quả phòng bệnh dại cao [45] Trên 40 triệu liều vắcxin Verorab đã được tiêm tại trên 100 quốc gia Không có phản ứng không mong muốn nghiêm trọng nào

do vắcxin Verorab được báo cáo trong thử nghiệm lâm sàng trên 3937 đối tượng và vắcxin này được cho là dung nạp tốt hơn so với vắcxin sản xuất trên

tế bào lưỡng bội người Tiêm phòng sau phơi nhiễm đã khẳng định khả năng sinh miễn dịch trên 1437 đối tượng bằng tất cả các đường tiêm với đáp ứng sớm sau liều nhắc lại; Verorab cho đáp ứng nhắc lại có hiệu quả ở các đối tượng đã được tiêm trước với vắcxin sản xuất trên tế bào lưỡng bộ người Không như dạng vắcxin sử dụng tế bào lưỡng bội người, Verorab không gây

ra các phản ứng quá mẫn huyết thanh ở người được tiêm nhắc lại 2183 đối tượng tại nhiều quốc gia ở châu Âu và châu Á trong đó có 874 đối tượng có nguy cơ cao đã được tiêm phòng sau phơi nhiễm và cho hiệu quả bảo vệ Verorab đã được tiêm phòng sau phơi nhiễm có hiệu quả và an toàn cho 251 phụ nữ có thai không làm tăng các dị tật bẩm sinh hoặc sảy thai tự nhiên Đối với trẻ em, tính an toàn và hiệu quả cũng được thấy trên 759 trẻ (từ 0-15 tuổi) [45] Liệu trình sử dụng Verorab tiêm trong da sau phơi nhiễm cho hiệu quả tốt và giảm giá thành tại các nước đang phát triển Từ các kết quả nghiên cứu lâm sàng sử dụng Verorab tiêm bắp và tiêm trong da trước và sau phơi nhiễm cho thấy vắcxin có hiệu quả bảo vệ tốt và an toàn trên người [3]

Với việc cho ra đời và sử dụng vắcxin trên nuôi cấy tế bào đã làm giảm đáng kể số các trường hợp tử vong ở người trên toàn thế giới mà phần lớn là tại các nước mà bệnh dại trên chó vẫn còn lưu hành phổ biến Một ví dụ điển hình nhất là tại Thái Lan, việc triển khai tiêm phòng vắcxin trên nuôi cấy tế bào cùng với việc giảm liều lượng tiêm bằng liệu trình tiêm trong da đã làm cho tỷ lệ mắc dại mới ở người giảm đến 80% trong vòng 15 năm Các kết quả

tương tự cũng được báo cáo tại nhiều nước khác khi vắcxin trên mô thần kinh được thay thế bằng vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Do vậy việc nghiên cứu, phát triển, sản xuất và tiến tới đưa ra sử dụng rộng rãi vắcxin dại trên nuôi cấy

tế bào là cần thiết, các nước cần sớm có các chiến lược để sử dụng và triển khai rộng khắp để tiêm phòng loại vắcxin tiên tiến và có hiệu quả cao này [22], [55]

1.3 QUY TRÌNH SẢN XUẤT VÀ KIỂM TRA CHẤT LƢỢNG VẮC

XIN DẠI TRÊN NUÔI CẤY TẾ BÀO

1.3.1 Quy trình sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào

Hiện nay, các vắcxin trên nuôi cấy tế bào được chia thành 3 nhóm chính tùy thuộc vào hệ thống tế bào được sử dụng trong sản xuất [36]:

- Nhóm 1: Nhóm này gồm các vắcxin sử dụng các dòng tế bào động vật có

vú nguyên phát như thận chuột đất vàng, thận chó, thận bê bào thai hoặc các nuôi cấy tế bào của gia cầm như phôi gà, phôi chim cút dựa theo phương pháp của Kissling

- Nhóm 2: Nhóm này gồm các vắcxin được sản xuất trên các dòng tế bào lưỡng bội chủ yếu có nguồn gốc từ người (W138, MRC5) và một số có

nguồn gốc động vật như bào thai khỉ Rhesus

- Nhóm 3: Nhóm này gồm các vắcxin được sản xuất trên các dòng tế bào thường trực như tế bào Vero

Các loại tế bào, các quy trình được sử dụng trong sản xuất và các phác

đồ tiêm phòng đối với từng loại vắcxin được trình bày trong Bảng 1.2

Hình 1.2 Các loại vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào và quy trình sản xuất

Tiêm phòng sau khi bị cắn

WI 38 PM 1503 Siêu ly tâm TNBP/tween-80 - 0, 7, 21, 28 0, 3, 7, 14,

30, 90 MRC-5 PM 1503 Siêu ly tâm  -propiolactone - 0, 28 0, 3, 7, 14,

30, 90 MRC-5 PM 1503 Ly tâm phân

vùng

 -propiolactone - 0, 30, 60 0, 3, 7, 14,

30, 90 MRC-5 SAD-60 Siêu ly tâm  -propiolactone - Thử nghiệm Thử nghiệm VERO PM 1503 Siêu ly tâm -

Ly tâm phân vùng

30, 90 DKC PM 1503 Siêu ly tâm –

Sepharose 6B

 -propiolactone AlPO4 0, 28, 180 0, 3, 5, 7,

14, 30, 90 FBKC PV11/RV

31

Siêu ly tâm -

Ly tâm phân vùng

 -propiolactone - 0, 21 Thử nghiệm

PCEC Flury HEP Siêu ly tâm -

Ly tâm

 -propiolactone hoặc tia cực tím

- 0, 28, 180 0, 2, 4, 6, 8,

14, 28 PCEC Flury LEP Siêu ly tâm -

Ly tâm

 -propiolactone - 0, 28, 180 0, 2, 4, 6, 8,

14, 28 HKC: Tế bào thận chuột đất vàng nguyên phát; DKC: Tế bào thận chó nguyên phát;

FBKC: Tế bào thận bào thai bê nguyên phát; PCEC: Tế bào phôi gà nguyên phát; TNBP:

Tri(n)-butyl-phosphate

Các bước chính của quy trình sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào

bao gồm:

- Nhân nuôi tế bào: Chai nuôi cấy tế bào một lớp hoặc hệ thống lăn chai

(roller bottle) là một trong những giải pháp được sử dụng để nhân nuôi tế

bào Để tăng hiệu suất và mở rộng quy mô sản xuất, các chai khuấy

(spinner flask) hoặc hệ thống nuôi cấy sinh khối (bioreactor) được sử dụng Các tiểu giá thể (microcarrier) trong hệ thống nuôi cấy sinh khối là một giải pháp tiên tiến cho phép tăng diện tích bề mặt bám dính của tế bào

từ đó làm tăng số lượng tế bào lên nhiều lần Đánh giá chính xác các chỉ số động học thông qua lượng các chất dinh dưỡng được tiêu thụ và lượng các chất gây độc sản sinh ra do quá trình chuyển hóa sẽ cho phép tìm ra các giải pháp làm tăng số lượng tế bào lên đến mức cần thiết để tạo ra một lượng kháng nguyên virút tối ưu [47], [48]

- Gây nhiễm và nhân nuôi virút: Gây nhiễm virút vào tế bào được tiến

hành đối với hỗn dịch tế bào hoặc trên tế bào đã được nuôi cấy một lớp

Để đạt được hiệu suất virút cao nhất cần lưu ý một số yếu tố liên quan đến việc kết hợp giữa tế bào và virút như nhiệt độ nuôi cấy, liều lượng virút gây nhiễm, thời gian và số lần thu hoạch Mối tương quan giữa mật độ tế bào và nồng độ kháng nguyên đạt được sau khi gây nhiễm là một vấn đề rất phức tạp Về mặt lý thuyết, khi điều kiện gây nhiễm đã được tối ưu, số lượng tế bào càng nhiều thì lượng virút được sản xuất ra càng cao Tuy nhiên, điều này không hoàn toàn đúng trong mọi trường hợp do tính không đồng nhất về tình trạng chuyển hóa đối với tất cả các tế bào

- Cô đặc và tinh khiết: Đối với các vắcxin sản xuất trên nuôi cấy tế bào, cô

đặc và tính khiết kháng nguyên virút là những quy trình thường xuyên được tiến hành Một vài phương pháp hiện được nhiều nhà sản xuất sử dụng là siêu ly tâm, ly tâm phân vùng và sắc ký lỏng Ở quy mô sản xuất lớn, các kỹ thuật thường được áp dụng là siêu ly tâm và ly tâm trong gradient tỷ trọng

- Bất hoạt virút: Quy trình bất hoạt là bắt buộc đối với các vắcxin sử dụng

cho người Nếu bất hoạt bằng các chất hóa học thì nhiệt độ và thời gian bất

hoạt cần được xác định đối với mỗi loại vắcxin Một trong những chất được sử dụng có hiệu quả đối với vắcxin trên nuôi cấy tế bào là -propiolactone do bất hoạt tốt virút dại và giảm lượng ADN tồn dư từ tế bào Nhược điểm của phương pháp này là giá thành còn cao và khá độc trước khi được xử lý nhiệt Tia cực tím cũng được sử dụng để bất hoạt virút Trong trường hợp này liều lượng và thời gian chiếu nên được xem xét kỹ để toàn bộ virút đều được bất hoạt mà không làm giảm đi lượng kháng nguyên

- Ổn định và đông khô: Phần lớn các vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào được

giữ ở dạng đông khô để có được tính ổn định cao Do vậy, thời hạn sử dụng của vắcxin dạng này kéo dài hơn nhiều so với vắcxin được giữ ở dạng dung dịch

Vắcxin sử dụng cho người thường được tiêm với mục đích điều trị sau khi đã phơi nhiễm với virút dại (5 liều tiêm hoặc nhiều hơn tùy thuộc vào loại vắcxin) hoặc là dự phòng do đó các vắcxin này phải đáp ứng được các yêu cầu nghiêm ngặt trong phát triển sản phẩm như:

- Virút phải được bất hoạt hoàn toàn

- Các dòng tế bào lưỡng bội hoặc thường trực được sử dụng để nhân nuôi virút không được có các chất gây ung thư hoặc bị chuyển dạng Do vậy, các dòng tế bào sử dụng trong sản xuất và hàm lượng ADN trong một liều tiêm cho người phải đáp ứng được yêu cầu của Tổ chức Y tế thế giới (TCYTTG) đối với các vắcxin sản xuất trên nuôi cấy tế bào dùng để tiêm cho người [36]

Xu hướng phát triển các vắcxin dại mới hiện nay là tìm kiếm các công nghệ có giá thành rẻ nhưng vẫn có hiệu quả tốt Một trong những xu hướng

được nhiều nhà sản xuất áp dụng là tiến hành nuôi cấy virút trên hệ thống nuôi cấy sinh khối với các tiểu giá thể nuôi cấy tế bào và sử dụng các môi trường không chứa huyết thanh (serum-free medium) [19], [59] Môi trường không chứa huyết thanh đã hạn chế được các nhược điểm của các môi trường

có huyết thanh như dễ gây ra các phản ứng quá mẫn ở người được tiêm, không có tính đồng nhất giữa các mẻ huyết thanh, dễ bị nhiễm bởi các tác nhân vi sinh vật (vi khuẩn, nấm, mycoplasma, virút ở động vật…) và giá thành cao hơn Bên cạnh đó, một số xu hướng áp dụng các công nghệ sinh học tiên tiến như phát triển vắcxin tái tổ hợp của protein G, vắcxin ADN cũng

đã được nghiên cứu, tuy nhiên hiện các nghiên cứu này chỉ được tiến hành với mục đích phát triển các vắcxin sử dụng cho động vật chứ không phải là các vắcxin để sử dụng cho người [22]

1.3.2 Kiểm tra chất lƣợng vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào

Kiểm tra chất lượng nguyên vật liệu gốc

Điều kiện cho nhân nuôi virút

Sử dụng tế bào lưỡng bội hoặc tế bào thường trực để sản xuất vắcxin dại cần dựa trên hệ thống tế bào giống Giống tế bào cũng như số lần cấy chuyển tối đa cần đạt các yêu cầu của TCYTTG và của kiểm định Quốc gia [54]

Thử nghiệm nhận dạng tế bào được tiến hành chủ yếu với ngân hàng tế bào giống gốc Các thử nghiệm được tiến hành bao gồm thử nghiệm sinh hóa

(phân tích isoenzyme), miễn dịch và gen tế bào

Môi trường nuôi cấy tế bào:

- Huyết thanh sử dụng để nhân nuôi tế bào phải được thử nghiệm để xác

định không nhiễm vi khuẩn, nấm, mycoplasma và các virút lây nhiễm từ động vật Bất kỳ thành phẩn nào có nguồn gốc từ bò, cừu hoặc dê sử dụng cho nuôi cấy tế bào cần đạt các yêu cầu của TCYTTG và của kiểm định Quốc gia Các thành phần này phải đáp ứng được các hướng dẫn hiện tại của TCYTTG liên quan đến spongiform gây bệnh lý não lây truyền ở động vật Huyết thanh người được sử dụng cũng phải kiểm soát về chất lượng

và quy trình sản xuất

- Các kháng sinh penicillin và thuộc họ beta-lactam khác không được sử dụng ở bất kỳ giai đoạn sản xuất nào Nồng độ tối thiểu của các kháng sinh như kanamycin hay neomycin cũng phải đạt theo các yêu cầu của TCYTTG và của kiểm định Quốc gia

- Trypsin có nguồn gốc động vật sử dụng để chuẩn bị nuôi cấy tế bào cũng cần phải thử nghiệm và không được có vi khuẩn, nấm, mycoplasma

và các virút lây nhiễm khác

Chủng virút

Chủng virút dại sử dụng trong sản xuất các loạt giống cần được xác định đặc tính Chủng cần có hồ sơ lý lịch ghi chép các thông tin và nguồn gốc đáp ứng được yêu cầu đối với việc sản xuất vắcxin bất hoạt an toàn và có hiệu quả miễn dịch Chủng giống virút sản xuất không được cấy chuyển quá 5 đời

từ chủng giống gốc Vắcxin cần được sản xuất từ loạt giống sản xuất mà không cấy chuyển thêm Chủng giống virút cần được bảo quản âm hoặc đông khô [54] Các thử nghiệm đối với chủng giống virút bao gồm:

- Thử nghiệm về vi khuẩn, nấm và mycoplasma

- Thử nghiệm về tác nhân ngoại lai trên chuột sữa, chuột trưởng thành và nuôi cấy tế bào

- Xác định hàm lượng virút bằng phương pháp gây nhiễm vào não chuột Hiệu giá tối thiểu của chủng giống được xác định tùy theo nhà sản xuất tùy thuộc vào sản phẩm, tế bào và chủng virút

Kiểm tra chất lượng quá trình sản xuất vắcxin

Kiểm tra nuôi cấy tế bào

Các thử nghiệm kiểm tra nuôi cấy tế bào bao gồm:

- Thử nghiệm về virút hấp phụ hồng cầu

- Thử nghiệm về tác nhân ngoại lai trong dung dịch nuôi cấy tế bào

- Thử nghiệm nhận dạng (dòng tế bào)

Kiểm tra mẻ gặt virút đơn và bán thành phẩm tinh chế

- Thử nghiệm vô khuẩn trên các mẻ gặt virút đơn

- Nhận dạng: mẻ gặt đơn chứa virút cần được xác định là virút bằng cách

sử dụng kháng thể đặc hiệu

- Hiệu giá virút: mỗi mẻ gặt đơn cần được xác định đặc tính lây nhiễm bằng thử nghiệm có độ nhạy cao Nhà sản xuất cần đưa ra các tiêu chuẩn đối với hiệu giá của các mẻ gặt đơn

- Xác định hàm lượng kháng nguyên: thử nghiệm xác định kháng nguyên glycoprotein được thiết lập để xác định lượng kháng nguyên trong bán thành phẩm cuối cùng Thử nghiệm này được sử dụng để theo dõi tính ổn định của sản xuất Các thử nghiệm được tiến hành theo phương pháp khuếch tán miễn dịch đơn (SRID) hoặc miễn dịch gắn men (EIA)

- Thử nghiệm về ADN tế bào tồn dư: đối với virút phát triển trên dòng tế bào thường trực, bán thành phẩm tinh khiết cần được thử nghiệm về ADN

tế bào tồn dư Quá trình tinh chế cần làm giảm được lượng ADN tế bào của vật chủ Theo quy định, lượng ADN tế bào tồn dư cần phải đạt dưới 10

ng cho 1 liều tiêm cho người [21], [56]

- Thử nghiệm về huyết thanh động vật tồn dư: nếu huyết thanh động vật được sử dụng trong quá trình sản xuất, nồng độ albumin huyết thanh bò (BSA) được sử dụng làm chỉ số đối với huyết thanh động vật trong bán thành phẩm tinh khiết và giá trị này không được vượt quá 50 ng cho một liều tiêm cho người [54]

- Thử nghiệm về các nguyên vật liệu tồn dư: nhà sản xuất phải cho thấy các nguyên vật liệu tồn dư khác sử dụng trong sản xuất phải giảm qua quá trình tinh chế đến mức có thể chấp nhận được theo yêu cầu của kiểm định Quốc gia [54]

Kiểm tra quá trình bất hoạt

Mỗi bán thành phẩm tinh khiết cần phải thử nghiệm theo những phương pháp thích hợp để đánh giá hiệu quả bất hoạt virút trước khi cho thêm chất bảo quản và các chất khác Độ nhạy của các thử nghiệm cần được xác định tùy theo chủng virút dại được sử dụng trong sản xuất và thử nghiệm có độ nhạy cao nhất sẽ được áp dụng Thử nghiệm cần tiến hành ngay sau khi kết thúc quá trình bất hoạt Các thử nghiệm được tiến hành để đánh giá sự có mặt của virút sống bao gồm thử nghiệm tiêm gây nhiễm trực tiếp vào não chuột và thử nghiệm nhân bội virút dại (amplification test) trên nuôi cấy tế bào [28] Bán thành phẩn đạt kết quả về bất hoạt nếu đáp ứng được yêu cầu không có các virút sống tồn lưu [54]

Kiểm tra bán thành phẩm cuối cùng

- Hàm lượng kháng nguyên của bán thành phẩm cuối cùng: thử nghiệm xác định kháng nguyên glycoprotein trong bán thành phẩm cuối cùng được tiến hành theo phương pháp khuếch tán miễn dịch đơn (SRID) hoặc miễn dịch gắn men (EIA)

- Thử nghiệm vô khuẩn

Kiểm tra chất lượng vắcxin thành phẩm

- Thử nghiệm nhận dạng: thử nghiệm nhận dạng được thực hiện với ít nhất 1 lọ cho mỗi loạt sản xuất Thử nghiệm công hiệu có thể được coi là một thử nghiệm nhận dạng

- Thử nghiệm vô khuẩn: thành phẩm cuối cùng cần được thử nghiệm vô khuẩn đối với nấm và vi khuẩn

- Thử nghiệm an toàn chung: mỗi loạt thành phẩm cần được thử nghiệm

về độc tính không mong muốn (độc tính bất thường) sử dụng các thử nghiệm an toàn chung theo yêu cầu của kiểm định Quốc gia

- Hàm lượng kháng nguyên: nếu không chưa được làm đối với bán thành phẩm cuối cùng, hàm lượng kháng nguyên cần được xác định và giá trị nằm trong giới hạn yêu cầu

- Thử nghiệm công hiệu vắcxin thành phẩm

Công hiệu của các loạt vắcxin thành phẩm cần được xác định Trước khi tiến hành thử nghiệm, vắcxin đông khô cần được hồi chỉnh dưới dạng có thể sử dụng được cho người

Thử nghiệm NIH được trình bày trong tài liệu Kỹ thuật phòng thí

nghiệm chẩn đoán dại [58], sử dụng để đánh giá độ ổn định sản xuất của vắcxin thử nghiệm Thử nghiệm này cũng được sử dụng để đánh giá mức độ

ổn định sản phẩm với mục đích xác định hạn sử dụng cũng như hiệu chỉnh chế phẩm chuẩn

Trong thử nghiệm này, chuột được tiêm miễn dịch sau đó thử thách với virút dại Thử nghiệm được tiến hành bởi các nhóm chuột tiêm 2 mũi vắcxin cách nhau 7 ngày với độ pha loãng thích hợp của vật liệu chuẩn đã được hiệu chỉnh với mẫu vắcxin dại chuẩn quốc tế và vắcxin thử nghiệm 7 ngày sau liều tiêm cuối, chuột được tiêm miễn dịch và nhóm chuột chứng được thử thách theo được tiêm não với > 5 LD50 chuẩn virút thử thách (CVS) Hiệu giá của virút thử thách cũng cần được khẳng định bằng cách gây nhiễm

ít nhất ở 3 độ pha loãng 10 lần trên chuột Chuột được theo dõi 14 ngày và liều hiệu quả 50% (ED50) của mẫu chuẩn và mẫu thử được xác định dựa trên

tỷ lệ chuột sống sót

Công hiệu của vắcxin thử nghiệm tính theo IU được xác định bằng cách

so sánh ED50 của mẫu vắcxin thử so với mẫu vắcxin chuẩn đã được hiệu chỉnh tính theo IU với mẫu vắcxin dại chuẩn quốc tế sử dụng phương pháp thống kê thích hợp

Thử nghiệm với tiêu chuẩn được xác định cho quy trình thử nghiệm và thẩm định, phương pháp thống kê cùng với số lượng tối thiểu các thử nghiệm được tiến hành để phân tích kết quả và xác định độ tin cậy của thử nghiệm (25-400%) đạt theo yêu cầu của kiểm định Quốc gia Đặc biệt, hiệu chỉnh mẫu chuẩn vắcxin theo chuẩn quốc tế cũng như việc sử dụng, bảo quản và vận chuyển CVS cũng cần được xác định trong quy trình thử nghiệm

Số lượng thử nghiệm đối với mỗi mẻ sản xuất phụ thuộc vào độ ổn định của thử nghiệm tại mỗi phòng thí nghiệm Nếu độ ổn định của thử

nghiệm trong phòng thí nghiệm tốt, chỉ cần một thử nghiệm là đủ Tuy nhiên, thử nghiệm bổ sung có thể làm tăng tính chính xác của công hiệu ước tính

Công hiệu cần đạt ít nhất là 2,5 IU cho một liều tiêm ở người

Nhà sản xuất cần đưa ra các dữ liệu hỗ trợ cho thử nghiệm công hiệu NIH qua các thử nghiệm in vitro xác định hàm lượng kháng nguyên để đảm bảo độ ổn định chắc chắn của quá trình sản xuất

- Độ ẩm tồn dư trong vắcxin đông khô: độ ẩm tồn dư trong mẫu của mỗi loạt vắcxin đông khô cần được xác định theo các phương pháp thích hợp Nói chung, lượng độ ẩm tồn dư cần thấp dưới 3%

- Thử nghiệm chất gây sốt: mỗi loạt thành phẩm cần thử nghiệm về chất gây sốt Thử nghiệm này cần được chấp thuận bởi kiểm định Quốc gia

- Thử nghiệm về protein huyết thanh động vật: mẫu của loạt thành phẩm được thử nghiệm về albumin huyết thanh bò trong vắcxin hồi chỉnh cuối cùng với lượng dưới 50 ng cho một liều tiêm cho người

- Chất bổ trợ: nếu một chất bổ trợ được cho vào vắcxin, hàm lượng chất này cần được xác định bằng phương pháp thích hợp Nếu các phức hợp nhôm được sử dụng thì nồng độ nhôm không được vượt quá 1,25 mg cho một liều tiêm ở người Nếu các chất khác được sử dụng như chất bổ trợ hoặc có tác dụng như chất bổ trợ, tiêu chuẩn về hàm lượng cần được đưa

ra Khi nhôm hydroxide được sử dụng làm chất bổ trợ, lượng hấp phụ trong bán thành phẩm cuối cùng không được ít hơn 95%

- Chất bảo quản: nếu chất bảo quản được cho vào vắcxin, hàm lượng chất này cần được xác định bằng phương pháp thích hợp Lượng chất bảo quản cho vào vắcxin không được làm mất đi hiệu quả của kháng nguyên

hoặc không làm giảm tính an toàn của vắcxin

- Kiểm tra cảm quan: mỗi lọ trong các loạt văc xin sau khi đóng lọ cần được kiểm tra cảm quan để loại bỏ các lọ bất thường

- Thử nghiệm đối với ADN tế bào tồn dư: thử nghiệm ADN tế bào tồn

dư được tiến hành với thành phẩm vắcxin nếu thử nghiệm này chưa được làm với bán thành phẩm cuối cùng

1.4 ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC, TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ

SẢN XUẤT VẮC XIN DẠI TẠI VIỆT NAM

Tại Việt Nam, trong những năm 1991-1995, bệnh dại là vấn đề y tế nghiêm trọng gây ảnh hưởng lớn đến sức khỏe, tính mạng và kinh tế của người dân Bệnh xảy ra quanh năm, lưu hành ở hầu hết các tỉnh, thành phố trên cả nước Theo thống kê chưa đầy đủ tại các Trung tâm Y tế dự phòng trên toàn quốc, trung bình mỗi năm có từ 300.000 đến gần 600.000 người bị súc vật cắn phải đi tiêm vắcxin phòng dại Nếu tính một người tiêm vắcxin dại phí tổn 300.000 đồng (gồm tiền thuốc, công lao động, tiền đi lại…) thì trong năm 1995 cả nước tốn gần 100 tỷ đồng Thêm vào đó, mỗi năm có trên dưới 500 người thiệt mạng do bệnh dại Trước tình hình nghiêm trọng của bệnh dại, năm 1996, Chính phủ đã ban hành chỉ thị về việc tăng cường phòng chống bệnh dại và Bô Y tế đã thành lập ban chỉ đạo Phòng chống bệnh dại Quốc gia.Theo thống kê của khoa Dịch tễ, Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương, trong vòng 11 năm (từ 1996 đến 2006) vẫn có trên 6 triệu người được tiêm vắcxin phòng dại sau khi bị súc vật cắn với tỷ lệ tiêm phòng là 652,6 /100.000 dân vào năm 1996 và 670,8/100.000 dân vào năm 2006 Cũng trong 11 năm này có tổng số 1116 trường hợp người chết vì bệnh dại (0,35/100.000 dân vào

năm 1996 và 0,09/100.000 dân vào năm 2006) Như vậy, số ca tử vong do bệnh dại vào năm 2006 đã giảm 81% so với năm 1995 Tuy nhiên, trong năm

2007, số ca tử vong do bệnh dại đã lại tăng lên đến trên 100 trường hợp Nguyên nhân có thể là do việc kiểm soát nguồn gây bệnh mà chủ yếu là chó - nguồn gây bệnh chính tại Việt Nam còn nhiều hạn chế Với số lượng ước tính

từ 6-8 triệu con chó, trong đó phần lớn là nuôi thả rông tại các vùng nông thôn, không được giám sát và tiêm phòng đầy đủ, sẽ là một nguy cơ làm gia tăng số ca bệnh dại Bên cạnh đó, việc thay đổi chính sách sử dụng vắcxin, ngừng sử dụng vắcxin thế hệ cũ rẻ tiền thay thế bằng vắcxin nhập ngoại sản xuất trên nuôi cấy tế bào đắt tiền hơn, làm giảm khả năng được tiếp cận với vắcxin phòng bệnh của các bệnh nhân nghèo, đặc biệt tại các vùng nông thôn, vùng sâu, vùng xa [4]

Ở Việt Nam, trước năm 1974, vắcxin phòng bệnh dại cho người chủ yếu

là vắcxin sản xuất từ não cừu, dê (Fermi, Semple) Các vắcxin này có chứa một lượng virút chưa bất họa và tính sinh miễn dịch thấp nên phải tiêm nhiều mũi (18-21 mũi) cùng với liều tiêm lớn (1,5-2,5 ml/mũi) Do vậy khi tiêm vắcxin dại không chỉ đưa vào 1 lượng kháng nguyên cần thiết mà còn đưa cả protein - myelin vào cơ thể Đây chính là nguyên nhân gây ra các tai biến viêm não tủy có thể dẫn tới liệt và tử vong [4]

Từ năm 1974, Viện Vệ sinh dịch tễ học Hà Nội đã nghiên cứu sản xuất vắcxin dại trên não chuột ổ theo phương pháp của Fuenzalida-Palacios được chuyển giao kỹ thuật từ Viện Pasteur Paris (Pháp) Sau khi đất nước thống nhất, nhằm đáp ứng kịp thời nhu cầu của nhân dân, việc sản xuất vắcxin dại

đã được triển khai tại cả Viện Vắcxin Nha Trang và Viện Pasteur Thành phố

Hồ Chí Minh Chủng giống sản xuất là chủng VP-13 (Pasteur Virút) do cơ quan kiểm định quốc gia cung cấp Chủng sản xuất được gây nhiễm trên não chuột nhắt trắng 1-4 ngày tuổi, bất hoạt bằng -propiolactone, bảo quản bằng